JPS6051484B2 - 酵素固定化用担体の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素固定化用担体の製造方法に関する。

従来、酵素反応は一般に酵素の水溶液に基質を反応させ
ることによつて行なわれているが、この方法には多くの
欠点がある。

特に、反応終了後に反応生成物と酵素とを分離するのが
容易ではなく、通常は、酵素が尚活性を有している場合
でも、これを変性して生成物と分離する方法が採用一
Ｉｖ沖＾Ａ−−ｆ、Ｊ、′ −■ Ｊ−ｆＰ９１ム士ブ
あるから、生産性にも劣る。このため、近年、酵素を担
体に固定して水不溶化し、反応生成物と酵素との分離を
容易にすると共に、酵素反応を連続的に行なう方法が提
案されている。

この酵素の固定化については、既に種々の方法が提案さ
れているが、いずれも得られる固定化酵素における酵素
と担体との結合力や酵素の活性が十分ではなく、更に用
いる担体の製造に複雑な工程を要する等の種々の問題が
あつた。本発明は上記の問題を解決するためになされた
ものであつて、物理的強度にすぐれると共に、共有結合
法、イオン結合法等によつて高い活性で酵素を固定化す
ることができる酵素固定化用担体の簡便な製造方法を提
供することを目的とする。本発明による酵素固定化用担
体の製造方法は、酢酸ビニル単位２０〜９踵量％よりな
るエチレンー酢酸ビニル系共重合体の酢酸ビニル単位の
８０モル％以上がケン化されている重合体に、一分子中
に少なくとも２個のアルデヒド基を有するポリアル）デ
ヒドを反応させて架橋し、次に、この架橋重合体が有す
る遊離アルデヒド基に一分子中に少なくとも２個の１級
アミノ基を有するポリアミンを反応させることを特徴と
する。本発明において用いる重合体はエチレン−酢酸丁
ビニル系共重合体ケン化物（以下、ＥＶＡ系共重合体と
いう。

）は、エチレン単位３〜８０重量％、好ましくは５〜印
重量％と、酢酸ビニル単位２０〜９踵量％、好ましくは
４０〜９５重量％よりなるエチレンー酢酸ビニル系共重
合体の酢酸ビニル単位の８０モル％以上がケン化されて
いるものである。尚、本発明においては、エチレン単位
の一部がアクリル酸、無水マレイン酸等のエチレン性不
飽和酸等で置換された三元共重合体も用いることができ
、ＥＶＡ系共重合体なる用語はかかる三元共重合体を含
むものである。このようなＥＶＡ系共重合体において、
エチレン単位が３重量％より少ないときは、共重合体の
水に対する安定性が悪くなり、例えば、共重合体を膜状
に成形後に水又は水性有機溶剤中にてポリアルデヒドと
反応させた際に、成形物の形状が破壊されるおそれがあ
り、一方、ａ重量％より多いとき、及び／又はエチレン
ー酢酸ビニル系共重合体のケン化度が８０モル％以下の
ときは、ＥＶＡ系共重合体中の水酸基数が十分に多くな
く、従つて、ポリアルデヒドと反応させた後の遊離アル
デヒド基数が十分に多くなく、後に説明するポリアミン
の反応量が少なく、結果として担体の単位重量又は単位
面積当りの酵素固定化量が少なくなる。更に、ＥＶＡ系
共重合体の親水性が十分でなく、従つて、一般に水性雰
囲気で行なわれる酵素反応に適しなくなるためであ−る
。本発明においては、ＥＶＡ系共重合体を適宜の溶剤、
例えばジメチルスルホキシドや水−ｎ−プ０／ぐノール
混合溶剤等に溶解し、酸触媒の存在下にポリアルデヒド
と反応させてゲル化し、これを．ホモジナイザー等の適
宜手段にて微粒子状にした後にポリアミンを反応させ、
又はＥＶＡ系共重合体のみを従来知られている任意の方
法にて適宜形状に成形した後、この成形物の形状を破壊
しない溶剤、例えば水、メタノール等に浸漬し、この溶
！剤中にて酸触媒の存在下にポリアルデヒドと反応させ
、更にこの後にポリアミンを反応させて、担体を得るこ
とができる。

尚、成形物の形状は特に制限されず、例えば、粒状、ペ
レット状、シート状、繊維状、中空系状、多孔体、発泡
体等であつ４てもよい。いずれの方法においても、ＥＶ
Ａ系共重合体とポリアルデヒドとの反応には塩酸、硫酸
、ｐ−トルエンスルホン酸等の酸触媒が好ましく用いら
れる。本発明において、ポリアルデヒドとは、一分子中
に少なくとも２個の遊離のアルデヒド基を有する化合物
（高分子化合物を含む。

）を意味し、具体的にはグリオキサール、マロンジアル
デヒド、マレインジアルデヒド、コハク酸ジアルデヒド
、アジピンジアルデヒド、グルタルジアルデヒド、ピメ
リンジアルデヒド、スベリンジアルデヒド、テレフタル
ジアルデヒド等のジアルデヒド化合物や、ジアルデヒド
デンプン、ポリアクロレイン等ノの高分子ポリアルデヒ
ドを用いることができる。本発明においては、ＥＶＡ系
共重合体にポリアルデヒドを反応させて架橋する際に、
生成する架橋共重合体中に遊離アルデヒド基を残存させ
る必要がある。従つて、ジアルデヒド化合物を用いた場
合には、一部が、一方のアルデヒド基は共重合体をアセ
タール化しているが、他方のアルデヒド基は未反応のま
まて残つていなければならない。また、一分子中に３個
以上のアルデヒド基を有するポリアルデヒドを用いた場
合には、その一部が、少なくとも一つのアルデヒド基に
より共重合体に結合しており、一方、共重合体を架橋し
ていても、していなくともよいが、少なくとも一つのア
ルデヒド基は未反応のままに残つていなければならない
。ポリアルデヒドの所要量は、ポリアルデヒドとＥＶＡ
系共重合体との反応方法に応じて、実験的に容易に求め
ることができる。

一般に、一定量のＥＶＡ系共重合体にポリアルデヒドを
反応させるとき、ポリアルデヒドがある量以上になると
、架橋共重合体中の遊離アルデヒド量はほぼ一定となる
。本発明においては、このように架橋共重合体中のアル
デヒド基がほぼ一定となる量少量近傍のポリアルデヒド
を共重合体に反応させればよいが、通常、過剰量のアル
デヒド溶液中で共重合体を反応させて架橋共重合体を得
ればよい。この架橋共重合体に反応させるポリアミンは
一分子中に少なくとも２個の１級アミノ基を有すること
を要し、かかるポリアミンとしてはエチレンジアミン、
プロピレンジアミン、ブチレンジアミン、ヘキサメチレ
ンジアミン、ポリエチレンイミン等の脂肪族ポリアミン
、フェニレンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル、
ジアミノジフェニルメタン、ジアミノジフェニルスルホ
ン、ジアミノジフェニルアミン、ベンジジン、キシリレ
ンジアミン、トリアミノベンゼン、トリアミノトルエン
等の芳香族ポリアミン等を例示することができる。

ポリアミンが水溶性であるとき、架橋共重合体とポリア
ミンとの反応は水中で行なうのが好都合である。

しかし、４，４″−ジアミノジフェニルエーテルのよう
に水に難溶性のときは、アミン塩酸塩として酸性下で架
橋共重合体に反応させてもよく、また、上記アミンを溶
解する適宜の有機溶剤中で反応させてもよい。架橋共重
合体に反応させるポリアミンの量は、架橋共重合体中の
遊離アルデヒド基と等モル量であるが、通常、過剰量を
反応させればよい。

尚、架橋共重合体とポリアミンによつて形成されるシッ
フ塩基のアゾメチン基は例えば水素化ホウ素ナトリウム
のような還元剤で還元し、安定化してもよい。次に、こ
のようにして得られた担体に酵素を固定化するために、
好ましくは共有結合法又はイオン結合法が採用される。

共有結合法としては、例えば担体にグルタルジアルデヒ
ドのように一分子中に２個以上のアルデヒド基を有する
架橋試薬を反応させ、生成したシッフ塩基の遊離アルデ
ヒド基に酵素のアミノ基を結合させる方法、担体にＯ−
ブロモアセチルーＮ−ヒドロキシスクシンイミドを反応
させた後、酵素を反応させ、固定する方法、担体に無水
コハク酸を反応させた後、水溶性カルボジイミドの存在
下に酵素を結合させる方法等が用いられる。また、イオ
ン結合法としては、担体に４−（ジエチルアミノ）ベン
ツアルデヒドを反応させた後、酵素をイオン結合させる
方法、担体に３−ジエチルアミノプロピルクロリドを反
応させた後、酵素をイオン結合させる方法等が用いられ
る。このように、本発明の担体には種々の方法にて酵素
を結合することができるが、特に架橋試薬としてグルタ
ルジアルデヒドを用いる共有結合法によれは遊離アミノ
基を有する酵素を好適に固定することができる。

また、この方法においては、架橋共重合体にｐ一又はｍ
ーキシリレンジアミンを反応させてシッフ塩基とした担
体を用いると好ましい結果が得られる。本発明の担体に
固定化できる酵素は、担体のアミノ基を利用する結合法
にて固定化される酵素であれば特に制限されないが、好
ましくは前記したように、グルタルジアルデヒドを架橋
試薬として結合させ得る遊離アミノ基を有する酵素てあ
る。

このような酵素の具体例としてグルコースオキシダーゼ
、カタラーゼ等の酸化還元酵素、アスパラギン酸塩アミ
ノトランスフアラーゼ、ヒスタミントランスフアラーゼ
等の転移酵素、リパーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラ
ーゼ、ウレアーゼ、αーキモトリプシン等の加水分解酵
素、グルコースイソメラーゼ、アラニンラセマーゼ等の
異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタミンシン
ターゼ等のリガーゼ等を挙げることができる。以上のよ
うにして担体に共有結合によつて酵素を固定化した固定
化酵素は、緩衝液のような反応媒体から洒過、遠心分離
等の手段によつて簡単に分離することができ、これを洗
滌、乾燥し、又は緩衝液中に低温で保存すればよい。本
発明の方法によれば、以上のように、ＥＶＡ系共重合体
をポリアルデヒドにより架橋させるから、得られる担体
は物理的強度及び安定性、耐久性等にすぐれ、更に、架
橋共重合体の有する遊離アルデヒド基にポリアミンを結
合させて、酵素をこのスペーサ基を介して共重合体主鎖
に結合させるから、得られる固定化酵素において酵素は
自由度が大きく高活性である。

以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例に限定されるものではない。

実施例１ エチレンー酢酸ビニル共重合体（エチレン単位Ｊ含量１
鍾量％、日本合成化学工業（株）ソアレツクスＦＨ）の
９８モル％ケン化物２０ｇを水１０ｍＬ−アセトン２０
ｍ１−ジメチルスルホキシド７０ｍ１混合溶剤に溶解し
、ガラス板上に厚さ３００ｐに塗布した後、５０℃の水
中に１時間浸漬して凝固、膜化させ、ガラ７ス板から剥
離して十分に水洗した。

次に、６０℃においてへ塩酸１００ＴｒＬ１に２５重量
％グルタルジアルデヒド水溶液２５Ｔｆ１１を混合し、
この溶液中に上記膜を２？間浸漬した後、水、メタノー
ルの順で十分に洗滌し、架橋ＥＶＡ系共重合体膜フを得
た。

この架橋膜を５鍾量％ｍーキシリレンジアミン水溶液中
に６０′Ｃで１時間浸漬した後、メタノール、水の順に
十分に洗滌して担体を得た。

０．１Ｍリン酸塩緩衝液にてＰＨ６．Ｏに調整した５重
量％グルタルジアルデヒド水溶液に上記膜状担体を室温
で１．時間浸漬、反応させた後、リン酸塩緩衝液（イ）
．１Ｍ．．ＰＨ７．０）で十分に洗滌した。

次に、このアルデヒド処理した担体を、ＳｔｒｅｐｔＯ
ｍｙｃｅｓ属起源の部分精製グルコースイソメラーゼ１
ｍ１（活性６０００Ｕ／ｍｌ）をリン酸塩緩衝液（２０
ｒＴ１Ｍ．．ｐＨ７．０）２０ｍ１に溶解した水溶液に
室温で２（２）間浸漬し、グルコースイソメラーゼを担
体に固定化した。

０．１Ｍマレイン酸、０．１Ｍトリス、０．１ＭＭｙＳ
０４・７Ｈ２０及び２ｒｒ１ＭＣ０Ｃ１２、ＰＨ７．５
となるように力性ソーダで調整したトリスマレイン酸塩
緩衝液で上記固定化酵素を十分に洗滌した。

この固定化酵素の活性は２０５Ｕ／Ｖ一担体であつた。

活性の測定方法は次のとおりである。即ち、上記トリス
マレイン酸塩緩衝液にグルコースを？濃度に溶解させて
基質溶液とし、この基質溶液５ｍ１を温度６０℃で３紛
間、固定化酵素と反応させ、１分間当りにフラクトース
１μＭ生成させる活性を単位活性Ｕとした。尚、フラク
トース濃度はシステインー硫酸一カルバゾール法にて測
定した。比較例１ 実施例１て得た架橋共重合体膜を担体として用い、実施
例１で用いたのと同じグルコースイソメ５ラーゼＬｍｌ
をリン酸塩緩衝液に溶解した水溶液に室温にて（イ）時
間浸漬し、グルコースイソメラーゼを架橋共重合体膜に
固定化した。

この固定化酵素の活性は、実施例１と同様に測定すると
、１２Ｕ／ダであつた。実施例２ 実施例１で用いたのと同じＥＶＡ系共重合体膜を０．踵
量％テレフタルアルデヒド水溶液のへ塩酸水溶液に６０
℃で３時間浸漬させ、反応させて架橋共重合体膜を得、
洗滌後実施例１と同様にしてｍーキシリレンジアミン水
溶液で処理した。

更に、氷冷下、０．１重量％水素化ホウ素ナトリウム水
溶液でアゾメチン基を還元し、担体とした。ノ この担
体を実施例１と全く同様にしてグルタルジアルデヒド処
理した後、グルコースイソメラーゼを固定した。この固
定化酵素膜をポリエチレン網に重ね、ガラス棒を芯材と
してその周囲にらせん巻きした後、直径１２ｗｎ１長さ
３０Ｃ７ｎの円筒カラムに同軸に充填し、実施例１と同
じグルコース基質水溶液を６０℃の温度で空間速度１ｈ
ｒ１で通過させて、フラクトースへの転換率を測定した
。結果を図面に示す。比較例２ 実施例２で得た架橋共重合体膜を担体とし、比較例１と
同様にしてグルコースイソメラーゼを固定化した。

この固定化酵素を用いて実施例２と全く同様にしてフラ
クトースへの転換率を求めた。結果を図面に示す。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明による担体にグルコースイソメラーゼを固
定化した固定化酵素のグルコースのイソメラーゼへの転
換率を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酢酸ビニル単位２０〜９７重量％よりなるエチレン
   −酢酸ビニル系共重合体の酢酸ビニル単位の８０モル％
   以上がケン化されている重合体に、一分子中に少なくと
   も２個のアルデヒド基を有するポリアルデヒドを反応さ
   せて架橋し、次に、この架橋重合体が有する遊離アルデ
   ヒド基に一分子中に少なくとも２個の１級アミノ基を有
   するポリアミンを反応させることを特徴とする酵素固定
   化用担体の製造方法。 ２ ポリアルデヒドがグルタルジアルデヒド又はテレフ
   タルアルデヒドであり、ポリアミンがキシリレンジアミ
   ンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   酵素固定化用担体の製造方法。