DE69012610T2

DE69012610T2 - Selektiv permeable Membran, deren Herstellungsverfahren und deren Anwendung bei einer Elektrode.

Info

Publication number: DE69012610T2
Application number: DE69012610T
Authority: DE
Inventors: Yoshio Hashizume; Ryuzo Hayashi; Akio Kariyone
Original assignee: New Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1995-03-09
Anticipated expiration: 2010-03-09
Also published as: DE69012610D1; EP0386763B1; EP0386763A1; US5242793A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine selektive permeable Membran und eine Elektrode, die sich derselben bedient, um beispielsweise in einer immobilisierten biokatalytischen Elektrode in einem System zum Nachweis einer Bildung oder eines Verbrauchs einer elektrochemisch nachweisbaren Substanz vorteilhaft verwendet werden zu können.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Der mit der selektiven permeablen Membran in Beziehung stehende Stand der Technik wird im folgenden zusammen mit der zugrundeliegenden Technologie ihres Anwendungsgebiets beschrieben.
Jüngst werden dank der Fortschritte in der Biochemie und weiteren Untersuchungen die bisher unbekannten Bioreaktionen nach und nach offenbart, um in den Gebieten der chemischen Industrien angewendet zu werden.
Der Anwendungsraum der durch Zellen und Enzyme katalysierten biochemischen Reaktionen ist breit, wobei insbesondere die Beachtung auf das sogenannte Biosensoring konzentriert ist, das dazu dienen soll, die biochemische Reaktion als Maßnahme zum Nachweis von Substanzen einzusetzen. Durch dieses Biosensoring können die bisher nicht meßbaren Substanzen oder Substanzen, die zuviel Zeit und Anstrengung zu ihrer Messung erforderten, ohne Schwierigkeiten bestimmt werden, wobei es in der Praxis auf den Gebieten der Umweltmessung, Nahrungsmittelanalyse und medizinischen Analyse eingesetzt wird.
Im allgemeinen umfassen die Biokatalysatoren, beispielsweise Enzyme, viele Vorteile, einschließlich:
1. einer hohen Spezifität der Reaktion,
2. einer Fähigkeit zur Bestimmung unter milden Bedingungen und
3. einer hohen Empfindlichkeit zur Bestimmung von Spurensubstanzen.
Da biologische Materialien als die Katalysatoren verwendet werden, sind gleichzeitig auch die folgenden Nachteile bekannt:
1. Biokatalysatoren, beispielsweise Enzyme, sind teuer,
2. Reaktionsbedingungen, wie die Temperatur und pH-Wert, sind eingeschränkt und
3. die katalytische Funktion von Biokatalysatoren, beispielsweise Enzymen, geht durch die verschiedensten Faktoren verloren, d.h. eine Inaktivierung tritt auf.
Zur Lösung derartiger Probleme wird die Immobilisierung der Biokatalysatoren vorgeschlagen. Dafür wurden bisher zahlreiche Verfahren vorgestellt. Unter ihnen ist das Verfahren einer Immobilisierung des Biokatalysators unter Verwendung eines eine kovalente Bindung eingehenden Vernetzungsmittels im Rahmen einer Vernetzungsreaktion für eine praktische Verwendung aufgrund seiner festen Bindung im Vergleich zu einer Adsorption oder Ionenbindung bevorzugt.
Bei der Verwendung eines derartigen immobilisierten Biokatalysators bei einer Bestimmung einer Substanz wird ein Biokatalysator in Kombination mit der Nachweisvorrichtung zum Nachweis einer Bildung einer Substanz oder eines Verbrauchs einer Substanz in Abhängigkeit von ihrer biochemischen Reaktion verwendet. Als eine derartige Nachweisvorrichtung kann ein elektrochemischer Detektor, ein fluoreszierender Detektor, ein thermischer Detektor o.dgl. eingesetzt werden. Insbesondere das elektrochemische Nachweisverfahren eines Verbrauchs von Sauerstoff oder einer Bildung von Wasserstoffperoxid bei einer biochemischen Reaktion durch ein immobilisiertes Enzym findet aufgrund der Einfachheit des Apparaturaufbaus, der hohen Nachweisempfindlichkeit und der hohen Reaktionsgeschwindigkeit in breitestem Rahmen Verwendung.
Wenn jedoch die Wasserstoffperoxidelektrode verwendet wird, werden nicht nur das durch eine biochemische Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid, sondern auch in der Probe enthaltende unerwünschte Substanzen, wie Ascorbinsäure, nachgewiesen, wodurch die Zuverlässigkeit der Bestimmung bekanntermaßen verringert wird. Um dieses Problem zu lösen, wird versucht, eine selektive permeable Membran zwischen der immobilisiertes Enzym aufweisenden Membran und der Wasserstoffperoxidelektrode anzuordnen. Das heißt, nahe der Oberfläche der Wasserstoffperoxidelektrode werden eine selektive permeable Membran zur Begrenzung einer Permeation von von der zu untersuchenden Substanz verschiedenen Substanzen und eine immobilisiertes Enzym aufweisende Membran in dieser Reihenfolge in einer Pufferlösung o.dgl. angeordnet oder eine selektive permeable Membran und eine immobilisiertes Enzym aufweisende Membran werden direkt in dieser Reihenfolge auf der Elektrodenoberfläche ausgebildet. Als Ergebnis kann unter gleichzeitiger Erhöhung der Bestimmungsgenauigkeit ein Nachweis unerwünschter Substanzen verhindert werden.
Üblicherweise wurde eine derartige selektive permeable Membran, beispielsweise Acetylcellulose, verwendet (vgl. JP-A- 60-56254) . Zur Herstellung einer derartigen selektiven permeablen Membran ist es jedoch zwingend notwendig, ein organisches Lösungsmittel, das schwierig zu handhaben ist, einzusetzen. Darüber hinaus müssen zur Herstellung einer gewünschten selektiven Permeabilität die Trocknungszeit und weitere Bedingungen genau eingestellt werden. Dies erfordert sehr viel Zeit und ein kompliziertes Vorgehen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben vormals ein Verfahren zur Ausbildung einer selektiven permeablen Membran einfach durch Verwenden eines Proteins und Vernetzungsmittels vorgeschlagen (JP-A-63-182559). Ohne Einschränkung auf selektive permeable Membranen weisen die unter Verwendung von Protein und eines Vernetzungsmittels gebildeten, immobilisiertes Protein aufweisenden Membranen im allgemeinen jedoch eine niedrige physikalische Festigkeit auf, sind schwer zu handhaben und besitzen eine minderwertige Haltbarkeit.
Das Problem einer derartigen physikalischen Festigkeit einer immobilisiertes Protein aufweisenden Membran läßt sich selbst bei Immobilisieren des Proteins auf einem Träger mit einer hohen physikalischen Festigkeit, beispielsweise aufgrund der Tatsache, daß die immobilisiertes Protein aufweisende Membran selbst brüchig ist und sich teilweise ablösen kann, nicht grundlegend lösen.
Somit bleiben die Probleme der selektiven permeablen Membran zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch ungelöst, ohne daß es einen Vorschlag für irgendeine effektive Lösung gibt. Im allgemeinen - nicht auf dem Gebiet der selektiven permeablen Membran - ist das Verfahren zur Erhöhung der Festigkeit einer durch Immobilisieren des Proteins, bei dem es sich um einen Biokatalysator, beispielsweise ein Enzym, handelt, gebildeten, immobilisiertes Protein aufweisenden Membran bekannt (vgl. beispielsweise JP-A-58-49821) . Bei diesem Verfahren wird das Enzym als Biokatalysator zusammen mit Amino- und Iminohochpolymeren immobilisiert, wobei die physikalische Festigkeit der immobilisiertes Enzym aufweisenden Membran erhöht wird. Wenn dieses Verfahren bei einer selektiven permeablen Membran angewendet wird, können jedoch die Eigenschaften des immobilisierten Proteins verändert werden, so daß es schwierig ist, eine gewünschte selektive Permeabilität zu erreichen.
Des weiteren ist aus der JP-A-62-32352 ein Verfahren zur Verstärkung der Festigkeit einer immobilisiertes Enzym aufweisenden Membran durch Immobilisieren des Enzyms, bei dem es sich um ein Protein auf einem Polyestertuch handelt, bekannt. Bei diesem Verfahren nimmt jedoch die Dicke der Proteinmembran zu, wobei bei einer Anwendung bei der Bildung einer selektiven permeablen Membran die Meßempfindlichkeit und -geschwindigkeit der immobilisiertes Enzym aufweisenden Elektrode verschlechtert werden.
Im folgenden wird der mit der immobilisiertes Enzym aufweisenden Membran in Beziehung stehende Stand der Technik zusammen mit der zugrundeliegenden Technologie ihres Anwendungsgebietes beschrieben.
Die Verfahren zur Immobilisierung von Enzym können grob wie folgt eingeteilt werden:
1. Das Absorptionsverfahren zur Immobilisierung durch physikalisches Absorbieren auf einem wasserunlöslichen Träger;
2. Das Vernetzungsverfahren zur Herbeiführung einer Unlöslichkeit durch eine Vernetzungsreaktion zwischen dem Enzym und einem weiteren Enzym oder Protein unter Verwendung eines multifunktionelle Gruppen aufweisenden Reagenses;
3. Das Einschlußverfahren zum Einschließen des Enzyms in einem feinen Gitter eines hochmolekularen Gels oder zur Beschichtung mit einer Kapsel einer semipermeablen hochmolekularen Membran.
Unter diesen Verfahren wird das Vernetzungsverfahren relativ weitläufig verwendet, da das Enzym fest immobilisiert ist und die Durchführung einer Immobilisierung von Enzym relativ leicht ist. Insbesondere Aldehyde, beispielsweise Glutaraldehyd, weisen eine hohe Enzymreaktivität auf, wobei das Enzym unter relativ moderaten Bedingungen immobilisiert werden kann. Folglich können sie in breitem Rahmen verwendet werden.
Beim Enzymimmobilisierverfahren unter Verwendung von Aldehyden wird beispielsweise im voraus ein Lösungsgemisch aus dem zu immobilisierenden Enzym und dem Aldehyd hergestellt. Anschließend wird das Lösungsgemisch auf den Träger aufgebracht oder dieser Träger in das Lösungsmittelgemisch (Eintauchverfahren) eingetaucht, wobei eine immobilisiertes Enzym aufweisende Membran gebildet wird. Beim Eintauchverfahren ist es jedoch schwierig, die Lösungsmenge auf der Trägeroberfläche genau zu steuern, so daß es schwierig ist, die Menge an immobilisiertem Enzym genau zu steuern.
Wenn andererseits ein spezielles Volumen eines Lösungsgemisches auf den Träger zur Immobilisierung von Enzym mit hoher Reproduzierbarkeit aufgetragen wird, werden das Enzym und sein Aldehydvernetzungsmittel einleitend vermischt, worauf in dem Lösungsgemisch die Vernetzungsreaktion nach und nach abläuft. Folglich kann im Falle einer kontinuierlichen Massenproduktion der verschiedensten immobilisierten Enzyme das Lösungsgemisch in der Mitte des Produktionsverfahrens immobilisiert werden. Beispielsweise wird gemäß dem Vorschlag in der JP-A-61-245051 im Falle einer Bildung mehrerer immobilisiertes Protein aufweisender Membranen durch kontinuierliches Emittieren eines Lösungsgemisches aus Protein und Aldehyd aus der Düse die Viskosität des Lösungsgemisches von Protein und Aldehyd stufenweise erhöht, so daß es schließlich zu einer Immobilisierung kommt. Dadurch wird eine in einem gewissen Maße kontinuierliche Bildung der immobilisiertes Protein aufweisenden Membranen schwierig.
Folglich ist es zur homogenen Immobilisierung des Enzyms mit hoher Reproduzierbarkeit zweckmäßig, anfänglich ein Lösungsgemisch aus Enzym und Aldehyd in einem speziellen Verhältnis herzustellen, es auf den Träger zu applizieren und eine Vernetzungsreaktion zu starten. Bei diesem Verfahren wird eine ausgezeichnete Enzymelektrode erhalten, es besteht jedoch infolge der Erhöhung des Viskosität und der Härtung des Lösungsgemisches beim Herstellungsverfahren das Problem einer Verringerung der Arbeitseffizienz.
Aus der US-A-4 659 665 sind Membranen für Enzymelektroden, die eine hochmolekulare Substanz (substituiertes oder nicht substituiertes Acrylamid/Methacrylamid-Copolymer), die mit einem Vernetzungsmittel (Glyoxal) vernetzt ist, umfassen und ein biologisch aktives Enzym enthalten, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Membranen, wobei das Vernetzungsmittel auf die vorgeformte, luftgetrocknete Membran aus einer hochmolekularen Substanz und einem biologisch aktiven Enzym appliziert wird, bekannt.

Zusammenfassung der Erfindung

Primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, eine selektive permeable Membran, die eine gewünschte selektive Permeabilität und ausgezeichnete physikalische Festigkeit aufweist und leicht herzustellen ist, und eine sich dieser bedienende Elektrode zur Lösung der oben aufgeführten technischen Probleme bereitzustellen.
Um diese Aufgabe zu lösen, liefert die vorliegende Erfindung eine selektive permeable Membran, die durch Ausbreiten eines ein Protein, mindestens einen Typ eines Vernetzungsmittels und mindestens einen Typ einer mit dem Vernetzungsmittel reagierenden hochmolekularen Substanz neben dem Protein umfassenden Lösungsgemisches in Form einer Membran und Immobilisieren des Proteins durch Vernetzungsreaktion hergestellt ist, wobei sie dadurch gekennzeichnet ist, daß das Protein mindestens einen Typ eines globulären Proteins, das Vernetzungsmittel ein mit einer Aminogruppe reagierendes Vernetzungsmittel und die hochmolekulare Substanz ein entweder Aminogruppen oder Derivate davon oder beides aufweisendes lineares Polysaccharid enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Zuammensetzungsverhältnis Protein/lineares Polysaccharid auf Gew.-Basis in einem Bereich von 1000/1 bis 1000/10, während das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Vernetzungsmittel auf Gew. - Basis vorzugsweise in einem Bereich von 100/5 bis 100/50 liegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Protein mindestens ein solches, das aus Albumin, Globulin und Prolamin ausgewählt ist, das Vernetzungsmittel besteht aus Glutaraldehyd und/oder Hexamethylendiisocyanat und bei dem linearen Polysaccharid handelt es sich um Chitosan.
Die Erfindung liefert ferner einer Elektrode mit der selektiven permeablen Membran, die auf der Oberfläche oder in der Nähe einer elektrisch leitenden Grundlage angeordnet ist.
Bei einer derartigen Elektrode kann eine immobilisiertes Enzym aufweisende Membran mit mindestens einem Enzym, vorzugsweise Oxidase, auf der Oberfläche oder in der Nähe der selektiven permeablen Membran auf der gegenüberliegenden Seite der elektrisch leitenden Grundlage angeordnet sein.
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wird eine Elektrode angegeben, bei der die immobilisiertes Enzym aufweisende Membran aus einer durch Trocknen oder Erwärmen eines Lösungsgemisches aus mindestens einem Typ eines Enzyms, mindestens einem Typ einer Carbonsäure oder eines Carboxylats und einem Aldehyd als Vernetzungsmittel gebildeten Membran besteht. Während des Herstellungsverfahrens dieser Elektroden werden infolge der Gegenwart der Carbonsäure oder des Carboxylats eine unerwünschte Vernetzung und Aushärtung in der Mitte des Membranherstellungsverfahrens verhindert.
Die Erfindung umfaßt des weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer selektiven permeablen Membran gemäß Patentanspruch 13.
Wenn entsprechend der obigen Ausführungen in Beziehung mit der Beschreibung des Standes der Technik Protein auf oder nahe der Oberfläche einer elektrisch leitenden Grundlage immobilisiert und als selektive permeable Membran verwendet wird, sowie eine immobilisiertes Enzym aufweisende Membran des weiteren zur Bildung einer immobilisiertes Enzym aufweisenden Elektrode ausgebildet wird, beeinflußt die physikalische Festigkeit der selektiven permeablen Membran in starkem Maße die Lebensdauer der immobilisiertes Enzym aufweisenden Elektrode.
Die erfindungsgemäße selektive permeable Membran wird im folgenden beschrieben.
Im allgemeinen reicht es zur Erhöhung der physikalischen Festigkeit einer immobilisiertes Protein aufweisenden Membran aus, die Konzentration des Vernetzungsmittels in der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran zu erhöhen. Im Falle der Ausbildung der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran als selektive permeable Membran ändern sich jedoch aufgrund einer hohen Konzentration des Vernetzungsmittels die physikalischen Eigenschaften der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran, so daß die selektive Permeabilität verringert werden kann, was nicht bevorzugt bzw. günstig ist.
Ferner ist es bekannt, die Festigkeit der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran durch Koexistenz eines Verstärkungsmittels, das mit dem Vernetzungsmittel in der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran reagiert, zu erhöhen. Bei einem derartigen herkömmlichen Verfahren beeinträchtigt jedoch die verstärkende Substanz die physikalischen Eigenschaften der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran in widriger Weise. Ferner kann die intrinsische Funktion der selektiven permeablen Membran, d.h. die Selektivität, "geopfert" werden.
Demzufolge führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Experimente insbesondere hinsichtlich einer Koexistenz einer verstärkenden Substanz, die mit dem Vernetzungsmittel in der selektiven permeablen Membran aus Protein und Vernetzungsmittel reagiert, durch und untersuchten verstärkende Substanzen mit der Fähigkeit zur Erhöhung der physikalischen Festigkeit der selektiven permeablen Membran, ohne die physikalischen Eigenschaften der selektiven permeablen Membran in widriger Weise zu beeinträchtigen. Ferner suchten sie nach Herstellungsbedingungen dafür. So gelangten sie schließlich zur vorliegenden Erfindung.
Die für eine derartige verstärkende Substanz erforderlichen Eigenschaften können die folgenden umfassen:
1. Die Substanz sollte in der Lösung des zu immobilisierenden Proteins oder in einem Lösungsgemisch dieses Proteins und eines Vernetzungsmittels gelöst sein.
2. Eine geringe Menge der Substanz sollte die physikalische Festigkeit der selektiven permeablen Membran erhöhen können, ohne daß die physikalischen Eigenschaften der selektiven permeablen Membran in widriger Weise beeinträchtigt werden.
3. Die Substanz sollte mit dem Vernetzungsmittel im selben Maße wie das zu immobilisierende Protein reagieren können und durch die Vernetzungsreaktion unlöslich gemacht werden.
Folglich suchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung nach einer Substanz, die in einem Lösungsgemisch von Protein und Vernetzungsmittel daneben vorliegen kann, mit dem Vernetzungsmittel reagiert und keine widrigen Einflüsse auf die selektive Permeabilität der selektiven permeablen Membran aufweist.
Beispielsweise wurde unter Verwendung von Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel und destilliertem Wasser oder einer Pufferlösung als Lösungsmittel ein Lösungsgemisch von Protein und Vernetzungsmittel in einer speziellen Konzentration hergestellt, worauf verschiedene Substanzen in dieses Lösungsgemisch zur Durchführung einer Vernetzungsreaktion mit Glutaraldehyd eingebracht wurden. Dabei wurden immobilisiertes Protein aufweisende Membranen hergestellt. Durch Untersuchen der physikalischen Festigkeit und selektiven Permeabilität der so erhaltenen immobilisiertes Protein aufweisenden Membranen lassen sich die Substanzen mit der Fähigkeit zur Erhöhung der physikalischen Festigkeit der selektiven permeablen Membran, die die selektive Permeabilität nicht in widriger Weise beeinträchtigen, auffinden.
Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die physikalische Festigkeit der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran ohne Beeinträchtigung der selektiven Permeabilität der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran durch Verwendung eines mindestens einen Typ eines globulären Proteins umfassenden Proteins, einer mit einer Aminogruppe vernetzenden Verbindung als Vernetzungsmittel und eines Aminogruppen, Derivate von Aminogruppen oder beides umfassenden linearen Polysaccharids als die in dem Lösungsgemisch daneben vorliegende Verbindung erhöht werden kann.
Erfindungsgemäß läßt sich ohne Schwierigkeiten eine ausgezeichnete selektive permeable Membran herstellen. Insbesondere ist es ohne Schwierigkeiten möglich, die selektive permeable Membran direkt auf der Oberfläche einer elektrisch leitenden Grundlage anzuordnen, wobei darüber hinaus durch Ausbilden einer immobilisiertes Enzym aufweisenden Membran auf der selektiven permeablen Membran im Rahmen des im folgenden beschriebenen Verfahrens eine immobilisiertes Enzym aufweisende Elektrode hergestellt wird.
Erfindungsgemäß werden die verschiedensten Vernetzungsmittel verwendet. Insbesondere Glutaraldehyd, Hexamethylendiisocyanat und weitere Vernetzungsmittel weisen eine hohe Bindungsfestigkeit auf und werden vorzugsweise verwendet. Unter allen ist Glutaraldehyd bevorzugt.
Das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Vernetzungsmittel auf Gew.-Basis liegt aus dem Blickwinkel der selektiven Permeabilität der erhaltenen selektiven permeablen Membran vorzugsweise in einem Bereich von 100/5 bis 100/50.
Das in der selektiven permeablen Membran der vorliegenden Erfindung verwendete Protein umfaßt mindestens einen Typ eines globulären Proteins, beispielsweise Albumin, Globulin und Prolamin.
Die hochmolekulare Substanz, die mit dem dem Lösungsgemisch aus Protein und Vernetzungsmittel zugesetzten Vernetzungsmittel reagiert, besteht aus einem Aminogruppen, Aminogruppenderivate oder beides umfassenden linearen Polysaccharid, beispielsweise aus Kompositionseinheiten von Aminozuckern, wie Glucosamin und Galactosamin und ihren Derivaten, bestehenden Polysacchariden. Derartige Beispiele können Peptidoglycan von Bakterien, teilweise deacetylierte Hyaluronsäure, teilweise deacetyliertes Chondroitinsulfat und Chitosan umfassen. Das ohne Schwierigkeiten verfügbare Chitosan wird als derartige hochmolekulare Substanz bevorzugt verwendet.
In der erfindungsgemäßen selektiven permeablen Membran liegt das Zusammensetzungsverhältnis Protein/lineares Polysaccharid auf Gew.-Basis vorzugsweise in einem Bereich von 1000/1 bis 1000/10. Wenn das Zusammensetzungsverhältnis lineares Polysaccharid/Protein auf Gew. -Basis 1000/10 übersteigt, wird die Selektivität der selektiven permeablen Membran in gewissem Maße verringert. Der Grund für die Verschlechterung der Selektivität ist unbekannt, im Falle einer Erhöhung des Zusammensetzungsverhältnisses lineares Polysaccharid/Protein auf Gew.-Basis unter in Relation zum Protein erfolgender Verringerung der Konzentration an Vernetzungsmittel kommt es jedoch zu einer unzureichenden Vernetzungsreaktion mit dem Protein. Folglich wird die immobilisiertes Protein aufweisende Membran brüchig und es treten hinsichtlich der Bindung an der Oberfläche der elektrisch leitenden Grundlage, hinsichtlich Haftung und Bindung zwischen Proteinen widrige Einflüsse auf. Ferner wird die Dichte der Membran nicht beibehalten. Wenn das Zusammensetzungsverhältnis auf Gew.-Basis weniger als 1000/1 beträgt, kann die Verbesserung der Membranfestigkeit nicht ausreichend sein.
Erfindungsgemäß werden zur Herstellung der selektiven permeablen Membran zuerst Protein und Vernetzungsmittel in destilliertem Wasser oder Pufferlösung gelöst, anschließend die hochmolekulare Substanz zugegeben, worauf die Lösung beispielsweise auf die Oberfläche einer elektrisch leitenden Grundlage aufgetragen wird. Als Ergebnis wird in dem die hochmolekulare Substanz enthaltenden Lösungsgemisch die Vernetzungsreaktion gefördert, wobei eine immobilisiertes Protein aufweisende Membran gebildet wird. Die so hergestellte selektive permeable Membran weist eine ausgezeichnete Haltbarkeit gegen physikalische Stöße, beispielsweise die Erschütterung durch eine Ultraschallbehandlung, auf. Darüber hinaus wird durch die Zugabe einer hochmolekularen Substanz eine Beeinträchtigung der selektiven Permeabilität vermieden.
Durch Anordnen der erfindungsgemäßen selektiven permeablen Membran auf oder oberhalb einer elektrisch leitenden Grundlage entsteht eine Elektrode zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid. Ferner ist es möglich, die selektive permeable Membran nahe der elektrisch leitenden Grundlage unter Zuhilfenahme einer Pufferlösung o.dgl. anzuordnen, es ist jedoch auch andererseits möglich, die selektive permeable Membran direkt auf der elektrisch leitenden Grundlage auszubilden. Durch Immobilisieren mindestens eines Enzymtyps, vorzugsweise einer Oxidase, auf der gegenüberliegenden Seite der selektiven permeablen Membran auf der elektrisch leitenden Grundlage wird eine immobilisiertes Enzym aufweisende Elektrode hergestellt. Eine derartige immobilisiertes Enzym aufweisende Elektrode weist eine hohe physikalische Festigkeit auf und besitzt eine ausgezeichnete Haltbarkeit und Selektivität für die nachzuweisende Substanz.
Inzwischen kann die erfindungsgemäße selektive permeable Membran auch für eine selektive Trennung des Reaktionsprodukts oder selektive Trennung lediglich der Rohmaterialien in einem Bioreaktor verwendet werden.
Ein Immobilisieren von Enzym in bevorzugten Ausführungsformen wird im folgenden beschrieben.
Wenn entsprechend der obigen Ausführungen in der Beschreibung des Standes der Technik ein Enzym durch Induzieren einer Vernetzungsreaktion unter Verwendung eines Vernetzungsmittels immobilisiert wird, ist es zur Steuerung des Zusammensetzungsverhältnisses Enzym/Vernetzungsmittel und zur homogenen Durchführung der Vernetzungsreaktion zweckmäßig, ein Lösungsgemisch mit einem speziellen Zusammensetzungsverhältnis Enzym/Vernetzungsmittel herzustellen und zu verwenden. Daneben ist es zur quantitativen Immobilisierung von Enzym auf der Oberfläche des Trägers o.dgl. notwendig, eine spezielle Menge des Lösungsgemisches zu applizieren.
Wenn Aldehyde als das Vernetzungsmittel verwendet werden, wird die Vernetzungsreaktion jedoch vom Zeitpunkt einer Herstellung des Lösungsgemisches aus Enzym und Vernetzungsmittel gestartet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung suchten im Rahmen eines Verfahrens einer einleitenden Herstellung eines Lösungsgemisches aus Enzym und Aldehyd und einer Immobilisierung des Enzyms auf der Oberfläche des Trägers nach einem Verfahren, das eine unerwünschte Verfestigung des Lösungsgemisches bei Applizieren einer speziellen Menge eines Lösungsgemisches auf der Oberfläche des Trägers zur quantitativen Immobilisierung des Enzyms verhindert. Schließlich kamen sie zu der vorliegenden Erfindung.
Es wurde festgestellt, daß es ausreicht, wenn in einem Lösungsgemisch aus Enzym und Aldehyd mindestens ein Typ von Carboxylaten enthalten ist. Das heißt, Carboxylate bilden mit Enzym, Aldehyd oder Komponenten in einer Pufferlösung keine Niederschläge. Ferner wurde festgestellt, daß die Vernetzungsreaktion bis zum Zeitpunkt eines Trocknens oder einer Wärmebehandlung des das Carboxylat umfassenden Lösungsgemisches verhindert wird.
Als Carbonsäuretyp im Carboxylat ist eine Verbindung eines Molekulargewichts von 300 oder weniger zweckmäßig. Wenn das Molekulargewicht diesen Bereich übersteigt, wird die Carboxylatlöslichkeit gering und es (das Carboxylat) kann bei Zugabe zu dem Lösungsgemisch aus Enzym und Aldehyd nicht vollständig gelöst werden, oder bei einer Auflösung kann die Hemmwirkung einer Vernetzung gering sein.
Carboxylat, das in dem Lösungsgemisch aus Enzym und Aldehyd unter Verwendung von Wasser oder Pufferlösung als Lösungsmittel koexistieren bzw. daneben vorliegen kann, kann Salze von Acrylsäure, Ascorbinsäure, Isovaleriansäure, Isobuttersäure, Ameisensäure, Valeriansäure, Citronensäure, Glyoxalsäure, Hydroxyessigsäure, 2,3-Dihydroxypropionsäure, 1,3- Propandicarbonsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Thioessigsäure, Milchsäure, Vinylacetat, Brenztraubensäure, Propionsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Mandelsäure, Essigsäureanhydrid, Phthalsäureanhydrid, Mesooxalsäure, Buttersäure, Äpfelsäure, Ölsäure und Benzoesäure umfassen. Es können auch mehrere Typen dieser Carboxylate kombiniert werden. Als die Salztypen sind im Hinblick auf die Löslichkeit und geringen Wirkungen auf die Struktur des Enzyms das Natriumsalz, Kaliumsalz und Magnesiumsalz bevorzugt.
Der pH-Wert des derartige Carboxylate enthaltenden Lösungsgemisches aus Enzym und Aldehyd liegt vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 8. Im allgemeinen kann das Enzym in extrem sauren oder alkalischen Bedingungen seine intrinsische höhergradige Struktur kaum beibehalten, wobei die Vernetzung mit Aldehyden verringert wird. Somit ist es zweckmäßig, den pH-Wert auf den obengenannten Bereich einzustellen.
Wenn die Konzentration dieser Carboxylate zu gering ist, kann die gewünschte Wirkung nicht erreicht werden. Wenn die Konzentration zu hoch ist, kann das Enzym abgebaut werden. Somit ist ein Bereich von 10 mM bis 200 mM zweckmäßig.
Als das ein Vernetzungsmittel bildende Aldehyd können Formaldehyd, Glutaraldehyd, Bernsteinsäurealdehyd, Dialdehydstärke und andere verwendet werden. Unter ihnen ist im Hinblick auf eine Vermeidung widriger Einflüsse, beispielsweise einen Proteinabbau und eine Verringerung der Enzymaktivität, Glutaraldehyd am meisten bevorzugt.
Durch die Koexistenz eines derartigen Carboxylats in einem Lösungsgemisch aus Enzym und Aldehyd wird die Förderung einer Vernetzungsreaktion von Enzym und Aldehyd in dem Lösungsgemisch verhindert, wobei das Lösungsgemisch von Enzym und Aldehyd durch Trocknen oder Erwärmen vernetzt wird.
Die Carbonsäure wird manchmal als Bestandteilskomponente der Pufferlösung verwendet, wobei im Hinblick auf die Tatsache, daß die starke Pufferfähigkeit (derselben) in einem Bereich eines pH-Werts von 4 oder weniger liegt, ihr pKa-Wert nahezu 4 oder weniger beträgt. Folglich liegt die Carbonsäure in dem gewünschten pH-Bereich der Erfindung nahezu in einem disoziierten Zustand vor. Andererseits scheint die auf der Oberfläche des Enzyms vorliegende und mit dem Aldehyd reagierende Aminogruppe protoniert zu sein. Wenn eine derartige Verbindung im Wasser daneben vorliegt, treten zwischen der Aminogruppe auf der Oberfläche des Proteinmoleküls und der Carbonsäure ionische Wechselwirkungen auf, wodurch scheinbar eine Reaktion des Aldehyds mit der Aminogruppe verhindert wird. Wenn das Wasser verdampft wird, verbindet sich die Carbonsäure jedoch mit den ursprünglich gepaarten Ionen, beispielsweise Natriumionen, und kristallisiert aus und wird aus dem System entfernt. Im Anschluß daran kommt es zu einer Reaktion der Aminogruppe auf der Enzymoberfläche mit dem Aldehyd unter Induzierung einer Aushärtung durch Vernetzung. Daneben ist die Wirkung in Abhängigkeit vom Molekulargewicht der Carbonsäure unterschiedlich. Als Grund dafür wird angenommen, daß mit zunehmendem Molekulargewicht eine Annäherung an die Oberfläche des Enzyms schwieriger wird, so daß eine Wechselwirkung mit höherer Wahrscheinlichkeit mit einem ein relativ niedrigeres Molekulargewicht aufweisenden Aldehyd, beispielsweise Glutaraldehyd, erfolgt. Es wird angenommen, daß die Intensität dieser Wechselwirkung bei der Carbonsäure auf der Seite niedrigeren Molekulargewichts bei einer Grenze eines Molekulargewichts von etwa 300 stärker ist als bei einem Aldehyd auf der Seite höheren Molekulargewichts.
Erfindungsgemäß kann das Enzym auf einem in breitem Maße für immobilisierte Biokatalysatoren verwendeten Träger in wirksamer Weise immobilisiert werden. Insbesondere wenn eine Immobilisierung eines Enzyms in Form einer Membran, beispielsweise bei einer immobilisiertes Enzym aufweisenden Elektrode, erforderlich ist, können die Arbeitseffizienz erhöht und eine kontinuierliche Massenproduktion realisiert werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung sowie die Merkmale und Vorteile hiervon lassen sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen besser verstehen und würdigen. In den Zeichnungen bedeuten:
Fig. 1 eine schematische Ansicht einer in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform und in einem Referenzbeispiel verwendeten Meßvorrichtung vom Strömungstyp.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die bevorzugten Ausführungsformen werden im folgenden zu eingehenderen Beschreibung der vorliegenden Erfindung dargestellt. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die Erfindung nicht auf diese Ausführungsformen alleine begrenzt ist. In der folgenden Beschreibung steht % für Gew.-%.

Meßvorrichtung

In diesem Beispiel wurde die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp verwendet. Die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Fließtyp umfaßt einen Injektor 3 für eine Hochgeschwindigkeitsflüssigchromatographie mit der Fähigkeit zur Injektion einer Probe in einer Menge in der Größenordnung von ul und eine Elektroden E1 bis E6 mit der selektiven permeablen Membran gemäß der vorliegenden Erfindung (die Elektroden C1 bis C6 wurden für Vergleichszwecke verwendet) , eine Ag/AgCl-Elektrode 8 als Referenzelektrode und eine Leitung aus nichtrostendem Stahl als Gegenelektrode enthaltende Meßzelle 5. Beispielsweise verbindet eine Verdünnungsleitung 4 aus Teflon eines Innendurchmessers von 0,5 mm und einer Länge von 1,5 m den Injektor 3 mit der Meßzelle 5. Das Innenvolumen der Meßzelle 5 beträgt 40 ul. In der Meßzelle sind die Elektroden E1 bis E6 (C1 bis C6) und die Ag/AgCl-Elektrode 8 gegenüberliegend bezüglich der Leitung der Pufferlösung angeordnet. In bezug auf die Ag/AgCl- Elektrode 8 wird durch einen Potentiostaten 9 an die Elektroden E1 bis E6 (C1 bis C6) eine Spannung von +0,60 V angelegt.
Ein derartiger Aufbau befindet sich in einem thermostatischen Ofen 12, wobei die Temperatur in den thermostatischen Ofen 12 bei 37ºC gehalten wird. Zur Zufuhr der Pufferlösung 1 bedient man sich einer Pumpe 2 für eine Hochgeschwindigkeitsflüssigchromatographie, wobei die Pufferlösung mit einer Rate von 1,0 ml/min abgeschickt wird. Die die Probe nach Bestimmung enthaltende Pufferlösung wird in einem Abwasserflüssigkeitsgefäß 11 gesammelt. Der gemessene Wert wird mit Hilfe einer Aufzeichnungsvorrichtung 10 aufgezeichnet.

Beispiel 1

Zur Ausbildung der selektiven permeablen Membran der vorliegenden Erfindung wurden als Protein Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma Co.), als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd und als die mit dem von dem Protein verschiedenen Vernetzungsmittel reagierende Substanz Chitosan (hergestellt von Tokyo Kasei Kogyo Co.) verwendet.
Chitosan wurde in einer wäßrigen Lösung von 100 mM Chlorwasserstoffsäure gelöst, wobei eine 0,5%ige Chitosanlösung hergestellt wurde.
In einem Wassermann-Teströhrchen wurden eine 5%ige wässrige Lösung von Rinderserumalbumin (400 ul), eine 25%ige wäßrige Lösung von Glutaraldehyd (20 ul), eine 0,5%ige Chitosanlösung (20 ul) und destilliertes Wasser (560 ul) vermischt, wobei ein Lösungsgemisch mit den folgenden Endkonzentrationen:
2% Rinderserumalbumin, 0,5% Glutaraldehyd, 0,01% Chitosan hergestellt wurde.
Das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Chitosan dieses Lösungsgemisches auf Gew.-Basis betrug 1000/5. Das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Vernetzungsmittel auf Gew.-Basis betrug 100/25.
Andererseits wurde die Seitenfläche eines Platindrahts eines Durchmessers von 2 mm, der eine elektrisch leitende Grundlage bildete, mit einem wärmeschrumpfbaren Teflon beschichtet, worauf die Oberseite des Platindrahts mit einem Schleifpapier einer Feinheit von 1600 poliert wurde. Auf die polierte Oberfläche wurden mit Hilfe einer Mikrospritze 5 ul des Lösungsgemisches aufgebracht, worauf bei 40ºC getrocknet wurde. Dabei wurde auf der Platinelektrode direkt eine Proteinmembran ausgebildet. Damit war die Herstellung der Elektrode E1 zum Nachweis von Wasserstoffperoxid beendet.
Die aus der so mit einer Proteinmembran beschichteten Platinelektrode hergestellte Elektrode E1 wurde in die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode 8, angelegt wurde. In diesem Zustand betrug bei Injizieren von 5 mM Wasserstoffperoxid aus dem Injektor 3 der nachgewiesene Strom 218 nA. Wenn eine Lösung von 5 mM Ascorbinsäure injiziert wurde, betrug der nachgewiesene Strom 2,9 nA. Folglich betrug der Anteil an nachgewiesenem Strom infolge einer Ascorbinsäureinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, 1,3% (vgl. Tab. 1). Tabelle 1 Wasserstoffperoxid Ascorbinsäure Beispiel Ref.Beispiel
Die so hergestellte Elektrode E1 wurde 10 min lang in einer Ultraschallbehandlungsvorrichtung behandelt und anschließend wieder in die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut. Bei Injektion von 5 mM Wasserstoffperoxid betrug der nachgewiesene Strom 218 nA. Bei Injektion einer Lösung von 5 mM Ascorbinsäure betrug der nachgewiesene Strom 2,9 nA.
Dieses Ergebnis ist zusammen mit dem Ergebnis vor einer Ul- traschallbehandlung in Tabelle 2 dargestellt. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß bezüglich der Empfindlichkeit der Elektrode E1 gegenüber Wasserstoffperoxid und Ascorbinsäure vor und nach einer Ultraschallbehandlung keine Veränderung auftritt. Tabelle 2 Nachgewiesener Strom vor einer Ultraschallbehandlung (nA/mM) Beisp. 1 Wasserstoffperoxid Ascorbinsäure Ref.Beisp. 4

Beispiel 2

Als Protein wurde Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma Co.), als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd und als die mit dem vom Protein verschiedenen Vernetzungsmittel reagierende Substanz wurde Chitosan (hergestellt von Tokyo Kasei Kogyo Co.) verwendet.
Chitosan wurde in einer wäßrigen Lösung von 100 mM Essigsäure gelöst, wobei ein 0,5%ige Chitosanlösung hergestellt wurde.
In einem Wassermann-Teströhrchen wurden eine 5%ige wäßrige Rinderserumalbuminlösung (400 ul), eine 25%ige wäßrige Glutaraldehydlösung (20 ul), eine 0,5%ige Chitosanlösung (20 ul) und destilliertes Wasser (560 ul) vermischt, wobei ein Lösungsgemisch mit den folgenden Endkonzentrationen hergestellt wurde:
2% Rinderseruinalbumin
0,5% Glutaraldehyd und
0,01% Chitosan.
Das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Chitosan dieses Lösungsgemisches auf Gew.-Basis betrug 1000/5. Das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Vernetzungsinittel auf Gew.-Basis betrug 100/25.
Andererseits wurde die Seitenfläche eines Platindrahts eines Durchmessers von 2 mm, der eine elektrisch leitende Grundlage bildete, mit einem wärmeschrumpfbaren Teflon beschichtet, worauf die Oberseite des Platindrahts mit einem Schleifpapier einer Feinheit von 1600 poliert wurde. Auf die polierte Oberfläche wurden mit Hilfe einer Mikrospritze 5 ul Lösungsgemisch aufgebracht und bei 40ºC getrocknet. Dabei wurde auf der Platinelektrode direkt eine Proteinmeinbran ausgebildet. Damit war die Herstellung der Elektrode E2 zum Nachweis von Wasserstoffperoxid beendet.
Die aus der so mit einer Proteinmembran beschichteten Platinelektrode hergestellte Elektrode E2 wurde in die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode 8, angelegt wurde. In diesem Zustand betrug bei Injektion von 5 mM Wasserstoffperoxid aus dem Injektor 3 der nachgewiesene Strom 220 nA. Bei Injektion einer Lösung von 5 mM Ascorbinsäure betrug der nachgewiesene Strom 2,9 nA. Folglich betrug entsprechend der Darstellung in Tabelle 1 der Anteil des nachgewiesenen Stroms infolge einer Ascorbinsäureinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, wie in Beispiel 1 1,3%. Wenn darüber hinaus die Elektrode E2 durch Ultraschallbehandlung behandelt wurde, trat keine Veränderung bei der Empfindlichkeit gegenüber Wasserstoffperoxid und Ascorbinsäure auf. Folglich kann die wäßrige Lösung zur Auflösung von Chitosan entweder Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure sein, sofern sie eine saure Lösung ist.

Beispiel 3

Als Protein wurden Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma Co.), als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd und als die mit dem vom Protein verschiedenen Vernetzungsmittel reagierende Substanz Chitosan (hergestellt von Tokyo Kasei Kogyo Co.) verwendet.
Chitosan wurde in einer wäßrigen Lösung von 100 mM Chlorwasserstoffsäure gelöst, wobei ein 0,5%ige Chitosanlösung hergestellt wurde.
In einem Wassermann-Teströhrchen wurden eine 5%ige wäßrige Rinderserumalbuminlösung (400 ul), eine 25%ige wäßrige Glutaraldehydlösung (20 ul), eine 0,5%ige Chitosanlösung (200 ul) und destilliertes Wasser (380 ul) vermischt, wobei ein Lösungsgemisch mit den folgenden Endkonzentrationen hergestellt wurde:
2% Rinderserumalbumin
0,5% Glutaraldehyd und
0,005% Chitosan.
Das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Chitosan dieses Lösungsgemisches auf Gew.-Basis betrug 1000/25. Das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Vernetzungsmittel auf Gew.-Basis betrug 100/25.
Andererseits wurde die Seitenfläche eines Platindrahts eines Durchmessers von 2 mm, der eine elektrisch leitende Grundlage bildete, mit einem wärmeschrumpfbaren Teflon beschichtet, worauf die Oberseite des Platindrahts mit einem Schleifpapier einer Feinheit von 1600 poliert wurde. Auf die polierte Oberfläche wurden mit Hilfe einer Mikrospritze 5 ul Lösungsgemisch aufgebracht und bei 40ºC getrocknet. Dabei wurde eine Proteinmembran direkt auf der Platinelektrode ausgebildet. Damit war die Herstellung der Elektrode E3 für einen Nachweis von Wasserstoffperoxid beendet.
Die aus der so mit einer Proteinmembran beschichteten Platinelektrode hergestellte Elektrode E3 wurde in eine in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode 8, angelegt wurde. In diesem Zustand betrug bei Injektion von 5 mM Wasserstoffperoxid aus dem Injektor 3 der nachgewiesene Strom 219 nA. Bei Injektion einer Lösung von 5 mM Ascorbinsäure betrug der nachgewiesene Strom 6,8 nA. Folglich betrug gemäß der Darstellung in Tabelle 1 der Anteil an dem nachgewiesenen Strom infolge einer Ascorbinsäureinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, 3,1%. Verglichen mit den Beispielen 1 und 2 war die selektive Permeabilität etwas geringer, jedoch für die Praxis ausreichend. Wurde die Elektrode E3 durch Ultraschall behandelt, trat keine Veränderung bei der Empfindlichkeit gegenüber Wasserstoffperoxid und Ascorbinsäure auf.

Referenzbeispiel 1

Die Seitenfläche eines Platindrahts eines Durchmessers von 2 mm wurde mit einem wärmeschrumpfbaren Teflon beschichtet, worauf die Oberseite des Platindrahts mit einem Schleifpapier einer Feinheit von 1600 zur Herstellung einer Platinelektrode C1 poliert wurde.
Diese Platinelektrode C1 wurde in eine Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode 8, angelegt wurde. Bei Injektion von 5 mM Wasserstoffperoxid betrug der nachgewiesene Strom 530 nA. Bei Injektion von 5 mM Ascorbinsäurelösung betrug der nachgewiesene Strom 333 nA. Folglich betrug gemäß der Darstellung in Tabelle 1 der Anteil an dem nachgewiesenen Strom infolge einer Ascorbinsäureinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, 62,9%. Es wurde somit festgestellt, daß die Ascorbinsäure enthaltende Probe bei der Platinelektrode C1 ohne selektive permeable Membran einen großen Ascorbinsäureeinfluß ausübt.

Referenzbeispiel 2

Als Protein wurden Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma Co.), als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd und als die mit dem vom Protein verschiedenen Vernetzungsmittel reagierende Substanz 1,4-Diaminobutan verwendet.
In einem Wassermann-Teströhrchen wurden eine 5%ige wäßrige Rinderserumalbuminlösung (400 ul), eine 25%ige wäßrige Glutaraldehydlösung (20 ul), eine 0,5%ige 1,4-Diaminobutanlösung (20 ul) und destilliertes Wasser (560 ul) vermischt, wobei ein Lösungsgemisch mit den folgenden Endkonzentrationen hergestellt wurde:
2% Rinderserumalbumin
0,5% Glutaraldehyd und
0,01% 1,4-Diaminobutan.
Andererseits wurde die Seitenfläche eines Platindrahts eines Durchmessers von 2 mm, der eine elektrisch leitende Grundlage bildete, mit einem wärmeschrumpfbaren Teflon beschichtet, worauf die Oberseite des Platindrahts mit einem Schleifpapier einer Feinheit von 1600 poliert wurde. Auf die polierte Oberfläche wurden mit Hilfe einer Mikrospritze 5 ul eines Lösungsgemisches aufgebracht und bei 40ºC getrocknet. Dabei wurde eine Proteinmembran direkt auf der Platinelektrode ausgebildet. Damit war die Herstellung der Elektrode C2 für einen Nachweis von Wasserstoffperoxid beendet.
Diese aus der mit einer Proteinmembran beschichteten Platinelektrode hergestellte Elektrode C2 wurde in eine in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode 8, angelegt wurde. In diesem Zustand betrug bei Injektion von 5 mM Wasserstoffperoxid aus dem Injektor 3 der nachgewiesene Strom 296 nA. Bei Injektion einer Lösung von 5 mM Ascorbinsäure betrug der nachgewiesene Strom 144 nA. Folglich betrug gemäß der Darstellung in Tabelle 1 der Anteil an nachgewiesenem Strom infolge einer Ascorbinsäureinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, 48,5%. Die durch Zugabe von 1,4- Diaminobutan erhaltene selektive perineable Membran war bezüglich der selektiven Permeabilität minderwertig. Ferner wurde festgestellt, daß die Ascorbinsäure enthaltende Probe als verhindernde Substanz in der Elektrode C2 nicht gemessen werden konnte. Darüber hinaus wurde die Selektivität durch eine Ultraschallbehandlung weiter verringert. Somit war auch bekannt, daß die physikalische Festigkeit auch minderwertig war.

Referenzbeispiel 3

Als Protein wurden Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma Co.), als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd und als die mit dem vom Protein verschiedenen Vernetzungsmittel reagierende Substanz Triethylentetraamin verwendet.
In einem Wassermann-Teströhrchen wurden eine 5%ige wäßrige Rinderserumalbuminlösung (400 ul), eine 25%ige wäßrige Glutaraldehydlösung (20 ul) , eine 0,5%ige Triethylentetraaminlösung (20 ul) und destilliertes Wasser (560 ul) vermischt, wobei ein Lösungsgemisch mit den folgenden Endkonzentrationen hergestellt wurde:
2% Rinderserumalbumin
0,5% Glutaraldehyd und
0,01% Triethylentetraamin.
Andererseits wurde die Seitenfläche eines Platindrahts eines Durchmessers von 2 mm, der eine elektrisch leitende Grundlage bildete, mit einem wärmeschrumpfbaren Teflon beschichtet, worauf die Oberseite des Platindrahts mit einem Schleifpapier einer Feinheit von 1600 poliert wurde. Auf die polierte Oberfläche wurden mit Hilfe einer Mikrospritze 5 ul eines Lösungsgemisches aufgebracht und bei 40ºC getrocknet. Somit wurde auf der Platinelektrode direkt eine Proteinmembran ausgebildet. Damit war die Herstellung der Elektrode C3 für einen Nachweis von Wasserstoffperoxid beendet.
Diese aus einer mit einer Proteinmembran beschichteten Platinelektrode hergestellte Elektrode C3 wurde in die in der Zeichnung dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode 8, angelegt wurde. In diesem Zustand betrug bei Injizieren von 5 mM Wasserstoffperoxid aus dem Injektor 3 der nachgewiesene Strom 426 nA. Bei Injizieren einer Lösung von 5 mM Ascorbinsäure betrug der nachgewiesene Strom 104 nA. Folglich betrug gemäß der Darstellung in Tabelle 1 der Anteil an nachgewiesenem Strom infolge einer Ascorbinsäureinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, 24,4%. Die durch Zugabe von Triethylentetraamin hergestellte selektive permeable Membran war bezüglich der selektiven Permeabilität minderwertig. Ferner wurde festgestellt, daß es unmöglich war, die Ascorbinsäure enthaltende Probe als Hemmsubstanz mit der Elektrode C3 zu messen. Bei einer Ultraschallbehandlung wurde die Selektivität weiter verringert, so daß auch bekannt war, daß die physikalische Festigkeit minderwertig war.

Referenzbeispiel 4

Als Protein wurden Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma Co.) und als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd verwendet.
In einem Wassermann-Teströhrchen wurden eine 5%ige wäßrige Rinderserumalbuminlösung (400 ul), eine 25%ige wäßrige Glutaraldehydlösung (20 ul) und destilliertes Wasser (580 ul) vermischt, wobei ein Lösungsgemisch mit den folgenden Endkonzentrationen hergestellt wurde:
2% Rinderserumalbumin und
0, 5% Glutaraldehyd.
Andererseits wurde die Seitenfläche eines Platindrahts eines Durchmessers von 2 mm, der eine elektrisch leitende Grundlage bildete, mit einem wärmeschrumpfbaren Teflon beschichtet, worauf dieser Bereich mit einem Schleifpapier einer Feinheit von 1600 poliert wurde. Auf die polierte Oberfläche wurden mit Hilfe einer Mikrospritze 5 ul eines Lösungsgemisches aufgebracht und bei 40ºC getrocknet. Dabei wurde auf der Platinelektrode direkt eine Proteinmembran ausgebildet. Damit war die Herstellung der Elektrode C4 für einen Nachweis von Wasserstoffperoxid beendet.
Diese aus einer mit einer Proteinmembran beschichteten Platinelektrode hergestellte Elektrode C4 wurde in die in der Zeichnung dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode 8, angelegt wurde. In diesem Zustand betrug bei Injektion von 5 mM Wasserstoffperoxid aus dem Injektor 3 der nachgewiesene Strom 219 nA. Bei Injektion einer Lösung von 5 mM Ascorbinsaure betrug der nachgewiesene Strom 2,6 nA. Folglich betrug gemäß der Darstellung in Tabelle 1 der Anteil an dem nachgewiesenen Strom infolge einer Ascorbinsäureinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, 1,2%. Somit zeigte die aus lediglich Protein und Vernetzungsmittel bestehende selektive permeable Membran eine ausgezeichnete selektive Permeabilität.
Diese Elektrode C4 wurde 10 min lang in einer Ultraschallbehandlungsvorrichtung behandelt, worauf sie abermals in die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut wurde. Bei Injektion von 5 mM Wasserstoffperoxid betrug der nachgewiesene Strom 262 nA. Bei Injektion einer Lösung von 5 mM Ascorbinsäure betrug der nachgewiesene Strom 6,6 nA.
Dieses Ergebnis ist zusammen mit dem Ergebnis vor einer Ultraschallbehandlung in Tabelle 2 dargestellt. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß die Empfindlichkeit der Elektrode C4 gegenüber Wasserstoffperoxid und Ascorbinsäure nach einer Ultraschallbehandlung erhöht ist, wobei die selektive Permeabilität verschlechtert ist. Folglich ist bei einer derartigen Elektrode C4 die physikalische Festigkeit nicht ausreichend. Ferner zeigt es sich, daß die Haltbarkeit minderwertig ist.

Beispiel 4

Die Seitenfläche eines Platindrahts eines Durchmessers von 2 mm wurde mit einem wärmeschrumpfbaren Teflon beschichtet, worauf die Oberseite des Platindrahts mit einem Schleifpapier einer Feinheit von 1600 poliert wurde. Auf dieser Oberfläche wurde mit den Materialien gemäß Beispiel 1 und entsprechend dem Vorgehen in Beispiel 1 eine selektive permeable Membran ausgebildet. Auf diese Membran wurde mit Hilfe einer Mikrospritze ein Lösungsgemisch von 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 1 mg/ml Glucoseoxidase (Typ II, hergestellt von Sigma Co.) und 0,2% Glutaraldehyd, das in 100 mM Natriumphosphatpufferlösung (pH-Wert 6,0) gelöst war, in einer Menge von 3 ul aufgetropft, worauf 15 min lang auf 40ºC erwärmt wurde. Dabei wurde eine Schicht aus immobilisiertem Enzym ausgebildet. Dabei wurde eine Elektrode E4 erhalten.
Diese Elektrode E4 wurde in die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 eine Spannung von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode 8, angelegt wurde. Bei Injektion von 5 ul wäßriger Glucoselösung einer Konzentration von 30 mM aus dem Injektor 3 betrug der nachgewiesene Strom 393 nA. Bei Injektion desselben Volumens einer wäßrigen Ascorbinsäurelösung in einer Konzentration von 30 mM betrug der nachgewiesene Strom 11,2 nA. Das heißt, der nachgewiesene Wert bei einer Ascorbinsäureinjektion, bezogen auf den Wert für eine Glucoseinjektion in derselben Konzentration, betrug 2,8%. Dies bedeutet einen geringen Ascorbinsäureeffekt, der in der Praxis vernachlässigt werden könnte.
Nach Ausbau dieser Elektrode E4 aus der Meßvorrichtung vom Strömungstyp wurde diese 10 min lang in einer Ultraschallbehandlungvorrichtung behandelt und anschließend abermals in die Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut. Wie vor einer Ultraschallbehandlung wurden 5 ul jeweils einer 30 mM Glucose bzw. Ascorbinsäure enthaltenden wäßrigen Lösung injiziert. Der nachgewiesene Strom betrug bei Glucose 395 nA, bei Ascorbinsäure 11,1 nA. Dieses Ergebnis ist in Tabelle 3 dargestellt. Die Elektrode E4 zeigte somit durch eine Ultraschallbehandlung keine Veränderungen ihrer Leistungsfähigkeit.
Nach einer 3-monatigen Aufbewahrung der ultraschallbehandelten Elektrode in einer Pufferlösung bei Raumtemperatur wurde keine Verringerung der Empfindlichkeit oder Selektivität festgestellt. Dies bedeutet eine ausgezeichnete Haltbarkeit. Tabelle 3 Nachgewiesener Strom vor einer Ultraschallbehandlung (nA) Beisp. Glucose Ascorbinsäure Ref. Beisp.

Referenzbeispiel 5

Entsprechend Beispiel 4, mit der Ausnahme, daß bei der Herstellung der selektiven permeablen Membran kein Chitosan enthalten war, wurde eine immobilisiertes Enzym aufweisende Elektrode C5 hergestellt.
Diese Elektrode C5 wurde in die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 um Phosphatpufferlösung 1 eines pH-Werts von 6,0 eine Spannung von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Elektrode, angelegt wurde. Der nachgewiesene Strom bei Injektion von 5 ul einer wäßrigen 30 mM Glucose enthaltenden Lösung betrug 385 nA. Bei Injektion desselben Volumens einer wäßrigen 30 mM Ascorbinsäure enthaltenden Lösung betrug der nachgewiesene Strom 10,3 nA.
Des weiteren wurde diese Elektrode C5 nach Ausbau aus der Meßvorrichtung vom Strömungstyp 10 min lang in einer Ultraschallbehandlungsvorrichtung behandelt. Visuell wurde keine Abnormalität der Membran beobachtet, bei abermaligem Einbau der Elektrode in die Meßvorrichtung vom Strömungstyp betrugen jedoch bei Injektion von jeweils 5 ul einer wäßrigen 30 mM Glucose bzw. Ascorbinsäure enthaltenden Lösung entsprechend dem Vorgehen vor einer Ultraschallbehandlung der nachgewiesene Strom bei Glucoseinjektion 402 nA und der nachgewiesene Strom bei einer Ascorbinsäureinjektion 16,2 nA. Dieses Ergebnis ist in Tabelle 3 zusammen mit dem Ergebnis von Beispiel 4 dargestellt. Somit wurden bei der Elektrode C5 die Membranpermeabilität durch Ultraschallbehandlung verändert und die Selektivität verringert.
Darüber hinaus wurde bei einer 2-monatigen Aufbewahrung der ultraschallbehandelten Elektrode in einer Pufferlösung bei Raumtemperatur durch visuelle Beobachtung der Membran eine Ablösung beobachtet. Es wird angenommen, daß ein durch eine Ultraschallbehandlung induziertes teilweises Aufreißen der Membran einer Ablösung der Membran voranging.
Wie es aus den obigen Beispielen ersichtlich ist, ist es erfindungsgemäß bei Herstellen einer funktionellen Membran mit einer selektiven Permeabilität unter Verwendung eines Proteins möglich, eine selektive perineable Membran herzustellen, die ohne Schwierigkeiten eine ausgezeichnete physikalische Festigkeit aufweist. Gleichzeitig werden die charakteristischen Eigenschaften der immobilisiertes Protein aufweisenden Membran nicht in widriger Weise beeinträchtigt.

Beispiel 5

1. Meßvorrichtung

In diesem Beispiel wurde die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp verwendet.
2. Herstellung einer immobilisiertes Enzym aufweisenden Elektrode E5
Als Protein wurden Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma Co.) und Glucoseoxidase (Typ II, hergestellt von Sigma Co.), als Aldehyd Glutaraldehyd und als das Carboxylat Natriumacetat verwendet.
In einem Wassermann-Teströhrchen wurden eine 5%ige wäßrige Rinderserumalbuminlösung (100 ul), eine 5%ige wäßrige Glucoseoxidaselösung (100 ul), eine wäßrige 1M Natriumacetatlösung (100 ul) , eine 10%ige wässrige Glutaraldehydlösung (100 ul) und eine 100 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7) (600 ul) vermischt, wobei ein Lösungsgemisch mit den folgenden Endkonzentrationen hergestellt wurde:
0,5% Rinderserumalbumin,
0,5% Glucoseoxidase,
1,0% Glutaraldehyd und
100 mM Natriumacetat.
Der PH-Wert dieses Lösungsgemisches betrug 7,0.
Nach 20-minütigem Stehenlassen dieses Lösungsgemisches bei Raumtemperatur wurden mit Hilfe einer Mikrospritze 5 ul der Lösung auf die Oberfläche der auf dem Platindraht von Beispiel 1 ausgebildeten selektiven permeablen Membran aufgebracht und bei 40ºC getrocknet. Dabei wurde eine immobilisiertes Enzym aufweisende Elektrode E5 erhalten.

3. Messung

Diese immobilisierte Glucoseoxidase aufweisende Elektrode E5 wurde in eine in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpuffer 1 (pH-Wert 6,0) ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Referenzelektrode 8, angelegt wurde. Der nachgewiesene Strom betrug bei Injektion von 5 mM Wasserstoffperoxid 145 nA. Bei Injektion von 5 mM Glucoselösung betrug der nachgewiesene Strom 36 nA. Folglich betrug gemäß der Darstellung in Tabelle 4 der Anteil an dem nachgewiesenen Strom infolge einer Glucoseinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, 25%. Tabelle 4 Wasserstoffperoxid Glucose Beispiel
Wenn das Carboxylat und Glutaraldehyd enthaltende Proteinlösungsgemisch nach einer Herstellung 20 min lang bei Raumtemperatur stehengelassen wurde, konnte es ohne Schwierigkeiten auf einem Träger, beispielsweise einem Platindraht, verteilt werden. Dabei konnte bei Verstreichenlassen einer ausreichenden Zeit die immobilisiertes Enzym aufweisende Elektrode hergestellt werden. Darüber hinaus war gemäß der Erkenntnis aus Tabelle 4 durch Zugabe des Carboxylats die Aktivität der Enzymelektrode in keinster Weise beeinträchtigt. Ferner wurde nach einer Lagerung dieser Elektrode E5 in 100 mM Phosphatpuffer bei einem PH-Wert von 6,0 während 90 Tagen bei Raumtemperatur und einem anschließenden abermaligen Einbau in die obige Meßvorrichtung und Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber Glucose dieselbe Empfindlichkeit erhalten. Damit wurde bestätigt, daß das Enzym stabil immobilisiert war.

Beispiel 6

Als Protein wurden Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma Co.) und Glucoseoxidase (Typ 11, hergestellt von Sigma Co.) und als Aldehyd Glutaraldehyd verwendet.
In einem Wassermann-Teströhrchen wurden eine 5%ige wäßrige Rinderserumalbuminlösung (100 ul), eine 5%ige Glucoseoxidaselösung (100 ul) , eine 10%ige wässrige Glutaraldehydlösung (100 ul) und eine 100 mM Phosphatpufferlösung (pH- Wert 7) (700 ul) vermischt, wobei ein Lösungsgemisch mit den folgenden Endkonzentrationen hergestellt wurde:
0,5% Rinderserumalbumin,
0,5% Glucoseoxidase und
1,0% Glutaraldehyd.
Direkt nach einer Herstellung dieses Lösungsgemisches wurden 5 ul mit Hilfe einer Mikrospritze auf der Oberfläche der auf dem Platindraht von Beispiel 1 ausgebildeten selektiven permeablen Membran aufgebracht und bei 40ºC getrocknet. Dabei wurde eine immobilisiertes Enzym aufweisende Elektrode E6 erhalten.
Diese immobilisierte Glucoseoxidase aufweisende Elektrode wurde in die in Fig. 1 dargestellte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut, worauf unter gleichzeitigem Durchleiten von 100 mM Phosphatpufferlösung ein Potential von 0,6 V, bezogen auf die Ag/AgCl-Referenzelektrode 8, angelegt wurde. Der nachgewiesene Strom bei Injizieren von 5 mM Wasserstoffperoxid betrug 143 nA. Der nachgewiesene Strom bei Injizieren von 5 mM Glucoselösung betrug 36 nA. Somit betrug gemäß der Darstellung in Tabelle 4 der Anteil an dein nachgewiesenen Strom infolge einer Glucoseinjektion, bezogen auf den nachgewiesenen Strom infolge einer Wasserstoffperoxidinjektion in derselben Konzentration, 25%. In diesem Beispiel wurde das Protein/Glutaraldehyd-Lösungsgemisch nach einer Herstellung augenblicklich auf der Elektrode verteilt, wobei eine ausgezeichnete Elektrode erhalten wurde. Da es bei diesem Lösungsgemisch zu einer Viskositätserhöhung kommen kann, unterliegt die Herstellung dieser Elektrode Beschränkungen.
Wie aus der Beschreibung der Ausführungsformen hier ersichtlich, ist es erfindungsgemäß bei Immobilisieren eines Enzyms unter Verwendung eines mehrwertigen Aldehyds ohne Schwierigkeiten möglich, die homogene und in quantitativem Maße immobilisiertes Enzym aufweisende Membran kontinuierlich und mit hoher Reproduzierbarkeit, ohne daß das Enzym in widriger Weise beeinträchtigt wird, herzustellen.

Claims

1. Selektiv permeable Membran, die durch Ausbreiten eines Lösungsgemisches, das ein Protein, mindestens eine Art eines Vernetzungsmittels und mindestens eine Art eines mit dem Vernetzungsmittel reagierenden hochmolekularen Stoffes außer dem Protein aufweist, in Form einer Membran und Immobilisieren des Proteins durch Vernetzungsreaktion hergestellt wurde, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mindestens eine Art eines globulären Proteins enthält, das Vernetzungsmittel ein mit einer Aminogruppe reagierendes Vernetzungsmittel enthält und der hochmolekulare Stoff ein lineares Polysaccharid enthält, das entweder Aminogruppen oder Derivate hiervon oder beide aufweist.

2. Selektiv permeable Membran nach Anspruch 1, wobei das Protein Albumin, Globulin oder Prolamin ist.

3. Selektiv permeable Membran nach Anspruch 1, wobei das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd oder Hexamethylendiisocyanat ist.

4. Selektiv permeable Membran nach Anspruch 1, wobei der hochmolekulare Stoff Chitosan ist.

5. Selektiv permeable Membran nach Anspruch 1, wobei das Zusammensetzungsverhältnis Protein/lineares Polysaccharid auf Gew.-Basis in einem Bereich von 1000/1 bis 1000/10 liegt.

6. Selektiv permeable Membran nach Anspruch 1, wobei das Zusammensetzungsverhältnis Protein/Vernetzungsmittel auf Gew.-Basis in einem Bereich von 100/5 bis 100/50 liegt.

7. Elektrode (E1 bis E6) mit der selektiv permeablen Membran nach Anspruch 1, die auf oder nahe der Oberfläche der elektrisch leitenden Grundlage angeordnet ist.

8. Elektrode (E1 bis E6) nach Anspruch 7, wobei die immobilisiertes Enzym aufweisende Membran mit mindestens einer Art von Enzym auf oder nahe der Oberfläche der selektiv permeablen Membran an der gegenüberliegenden Seite zur elektrisch leitenden Grundlage angeordnet ist.

9. Elektrode (E1 bis E6) nach Anspruch 8, wobei eine immobilisiertes Enzym aufweisende Membran mit mindestens einer Art von Oxidase auf oder nahe der Oberfläche der selektiv permeablen Membran an der gegenüberliegenden Seite zur elektrisch leitenden Grundlage angeordnet ist.

10. Elektrode (E1 bis E6) nach Anspruch 8 oder 9, wobei die immobilisiertes Enzym aufweisende Membran aus einer immobilisiertes Enzym aufweisenden Membran, die durch Trocknen oder Erwärmen eines Lösungsgemisches mindestens einer Art von Enzym, mindestens einer Art von Carbonsäure oder Carboxylat und eines Aldehyds als Vernetzungsmittel hergestellt wurde, besteht.

11. Elektrode (E1 bis E6) nach Anspruch 10, wobei der pH- Wert des Lösungsgemisches von Enzym und Aldehyd, das dieses Carboxylat enthält, in einem Bereich von 5 bis 8 liegt.

12. Elektrode (E1 bis E6) nach Anspruch 10, wobei das Molekulargewicht der Carbonsäure oder des Carboxylats 300 oder weniger beträgt.

13. Verfahren zur Herstellung einer selektiv permeablen Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem ein Lösungsgemisch, das ein Protein, mindestens eine Art eines Vernetzungsmittels und mindestens eine Art eines mit dem Vernetzungsmittel reagierenden hochmolekularen Stoffes außer dem Protein aufweist, in Form einer Membran ausgebreitet und das Protein durch Vernetzungsreaktion immobilisiert werden, wobei das Protein mindestens eine Art von globulärem Protein, das Vernetzungsmittel ein mit einer Aminogruppe vernetzendes Vernetzungsmittel und der hochmolekulare Stoff ein lineares Polysaccharid enthalten, das entweder Aminogruppen oder Derivate davon oder beide enthält.