CH622537A5

CH622537A5 -

Info

Publication number: CH622537A5
Application number: CH593277A
Authority: CH
Inventors: Tsunetoshi Hino; Seizo Okamura; Hideaki Yamada
Original assignee: Sanraku Ocean Co
Priority date: 1976-05-14
Filing date: 1977-05-12
Publication date: 1981-04-15
Also published as: ATA345477A; NL168552B; NL168552C; DK210777A; DE2721829A1; SE7705501L; IT1084642B; AT357504B; DE2721829C3; DE2721829B2; FR2350874B1; US4148689A; SE435934B; FR2350874A1; NL7705329A; CA1073833A

Description

L'invention est relative à un procédé de préparation d'un gel hydrophile complexe apte à être utilisé pour l'immobilisation de cellules microbiennes, ainsi que pour des usages médicaux, par le mélange d'un polymère soluble dans l'eau, de préférence un alcool 40 polyvinylique, et d'un tétraalcoxysilane, de préférence le tétraéthoxysilane, et agitation, normalement à température ambiante à pH 3, pour former un sol complexe homogène auquel on rajoute des cellules microbiennes possédant des activités enzymatiques, telle une activité glucose isomérase, et en ajustant subséquemment 45 le pH pour former un lyogel complexe ou en séchant le mélange pour former un xérogel complexe hydrophile, lesquels posséderont plus de 80% de l'activité originelle des cellules microbiennes, ainsi que des propriétés physiques excellentes, et qui pourront être appliqués à un processus de réaction enzymatique dans un réac-50 teur à lots, de manière répétitive, ou dans un réacteur continu à colonne.

Un but de l'invention est la préparation d'un complexe hydrophile homogène, tel qu'un lyogel ou un xérogel, qui présente la compatibilité et l'affinité voulues avec une substance biologique, 55 et qui serait utile en tant que matrice de support pour des cellules microbiennes et en tant que matériel pharmaceutique excellent. Un autre but de l'invention est l'immobilisation de cellules microbiennes possédant des activités enzymatiques par leur blocage à l'intérieur d'ime matrice de gel complexe hydrophile dans des 60 conditions de faible réactivité, gel formé à partir d'un polymère soluble dans l'eau et d'un silicate.

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques possédant une efficacité extrêmement élevée et des propriétés spécifiques. Ils peuvent être utilisés pour catalyser presque n'importe quel type de '65 réaction chimique. Les réactions enzymatiques sont effectuées sous des conditions plus douces que celles des réactions chimiques et ne produisent pas des substances secondaires néfastes. Récemment, une attention sérieuse a été apportée à l'important pro-

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blême de la pollution de l'environnement dans l'industrie chimique.

De ce point de vue, il est très avantageux d'appliquer des enzymes à l'industrie chimique. L'application industrielle d'enzymes ou de micro-organismes a été effectuée en utilisant des micro-organismes intacts ou des préparations solubles d'enzymes. Mais de tels biocatalyseurs ne peuvent être utilisés que pour un seul lot de réaction ou de fermentation. Si ces enzymes et ces micro-organismes pouvaient être stabilisés et récupérés, sans frais élevés et surtout sans inactivation, il serait alors possible d'utiliser des biocatalyseurs de manière plus large dans l'industrie.

L'immobilisation desdits catalyseurs offre un moyen pratique pour aboutir à ces objectifs. Des enzymes ainsi immobilisés tendent à être utilisés à des fins technologiques, ainsi qu'à des fins médicales ou analytiques. La plupart des études sur cette immobilisation concernent des enzymes exempts de cellules; mais, dans les années récentes, une attention particulière a été portée à l'utilisation de cellules microbiennes entières immobilisées. Ces systèmes éliminent la nécessité de la séparation des cellules, l'extraction de l'enzyme et des étapes de purification des enzymes avant leur immobilisation. Des cellules immobilisées sont aussi plus facilement appliquables pour la catalyse de réactions séquentielles et fournissent un moyen de régénération in situ des cofac-teurs nécessaires. De plus, s'il était possible d'utiliser en continu un système enzymatique multiple sous une forme immobilisée,

cela impliquerait que les méthodes traditionnelles de fermentation pourraient être remplacées par une méthode utilisant des cellules immobilisées.

Les désavantages associés avec les cellules immobilisées sont le coût de la nature du support et la perte d'activité catalytique ou la difficulté de maintenir l'intégrité desdites cellules pendant l'immobilisation. En particulier, la plupart des enzymes et des cellules microbiennes sont si instables que, en les soumettant aux procédés d'immobilisation, on provoque une diminution de leurs activités enzymatiques et des changements dans la spécificité de leurs activités. Il est très difficile de développer un procédé pratique d'immobilisation sans les désavantages susmentionnés. Donc peu de processus d'immobilisation, facilement et largement utilisables, ont été développés.

La présente invention offre une méthode pour l'immobilisation de cellules microbiennes présentant des activités enzymatiques sous des conditions si douces que leurs activités ne sont pas diminuées, et décrit des propriétés chimiques, physiques et biologiques désirables pour des cellules microbiennes immobilisées.

Dans l'état actuel de la technique, les méthodes pour l'immobilisation de cellules microbiennes sont classifiées sous quatre types : méthode de fixation de support, méthode de liaisons croisées, méthode de blocage dans un gel, méthode de blocage dans des microcapsules. Parmi ces types, la méthode du blocage dans un gel, dans laquelle des cellules microbiennes sont immobilisées dans la matrice d'un gel, est largement utilisée dans la pratique. Les méthodes habituelles de blocage dans un gel ont, toutefois, les défauts suivants: par les processus de formation du gel pour le blocage de cellules microbiennes, leurs activités enzymatiques ont tendance à être diminuées fortement parce que ces dites activités sont fréquemment affectées par des facteurs d'environnement tels que la température, le pH, la force ionique, la pression et autres facteurs analogues. Donc une méthode nouvelle de formation d'un gel qui n'a aucune influence néfaste sur la stabilité des enzymes a été désirée. Beaucoup d'investigations sur les liaisons croisées et la formation d'un gel ont été effectuées avec des composés polymères divers de ce dit point de vue. Toutefois, des méthodes physiques pour la gélification de polymères telles que l'abaissement de la température ou l'addition de sels ou de solvants non aqueux n'ont pas été utilisées de manière étendue puisqu'il est généralement difficile d'obtenir des gels permanents par ces réactions de gélification réversibles. Par exemple, au Japon, dans le brevet Kokai Showa N° 50-52276, il a été décrit que des enzymes peuvent être bloqués dans la matrice d'un gel de polymères d'alcool vinylique par une méthode selon laquelle des enzymes et des polymères d'alcool vinylique sont solubilisés dans de l'eau et solidifiés de préférence entre —25 et — 80° C puis fondus à température ambiante pour donner le gel bloquant les enzymes. Mais le gel ainsi préparé par la méthode selon le brevet susmentionné est instable à des températures comparativement élevées telles que 60 ou 70° C, qui constituent des températures utilisables pour la glucose isomérase. De plus, des méthodes chimiques pour la formation d'une matrice de gel par des réactifs aboutissant à des liaisons croisées sont trop puissants et destructeurs pour être utilisées avec des substances biologiques, cela à cause de la haute réactivité des réactifs de liaisons croisées et de la haute température ou le pH extrêmement élevé ou extrêmement bas auquel s'effectue la réaction de gélification. Par exemple, lorsque la méthode de blocage dans un gel de Polyacrylamide est utilisée, du monomère d'acrylamide est polymérisé avec du N-N'-méthylène-bis-acrylamide en présence d'un catalyseur tel que le persulfate d'ammonium. Dans ce cas, l'enzyme est trop souvent inactivé par ce catalyseur hautement actif. La gamme de pH et de températures de la réaction de gélification doit donc être soigneusement choisie pour le maintien des activités enzymatiques [S.S. Wang, «Biotech, and Bioeng.», 15,93 (1973)]. Et, de plus, les gels ainsi obtenus doivent être prohibés dans les industries pharmaceutiques et la nutrition à cause de la possibilité d'une réma-nence du monomère toxique d'acrylamide.

Dans le brevet japonais Kokai Showa N° 50-53583, il a été proposé que des enzymes soient bloqués dans une matrice de gel de polymères d'alcool polyvinylalcoolique par une méthode selon laquelle des enzymes et des polymères d'alcool polyvinylique sont dissous dans de l'eau et mélangés avec de l'acide borique ou du borate de sodium pour former le gel de blocage d'enzymes. Selon ce dit brevet, il serait possible d'immobiliser des enzymes à des températures de gélification en dessous de 45° C. Toutefois, comme ces gels ne sont fournis seulement qu'à des pH alcalins, cette méthode ne peut être appliquée qu'à des enzymes stables sous des conditions alcalines. La toxicité de l'acide borique doit également être prise en considération. D'autres méthodes de liaisons croisées utilisant des radiations à haute énergie, telles que les rayons y, des faisceaux d'électrons ou les rayons X, sont difficiles à appliquer pratiquement parce qu'elles nécessitent un équipement encombrant et que des protections doivent être prises pour éviter les effets physiologiques associés avec ces rayonnements à haute énergie [H. Maeda, «Biotech, and Bioeng.», 15, 607 (1973)].

Les enzymes immobilisés ou des micro-organismes préparés par les méthodes habituelles de blocage dans un gel sont physiquement faibles et sont spécialement faibles en force mécanique sous des conditions mouillées. Il est donc difficile d'utiliser de tels gels dans des réactions en continu pendant de longues périodes. Lorsque ces gels sont tassés dans une colonne à réaction continue, ils sont fragmentés par la pression de l'eau, et un taux d'écoulement satisfaisant du mélange de réaction ne peut pas être obtenu.

Une autre technique antérieure est résumée par F. Katchalski et I. Silman: «Effet du micro-environnement sur le mode d'action d'enzymes immobilisés», «Advance in Enzymology», 34, 445 (1971).

Lors de la réalisation du procédé selon l'invention, il a été étudié à fond la formation de gels complexes homogènes à partir de silice et de divers types de composés organiques, parce que la silice est un composé qui n'affecte pas les bio-organismes et qui est, de plus, bon marché. Lorsqu'un sol de silice ou un gel de silice fabriqué par les méthodes habituelles a été mélangé avec des composés polymères solubles dans l'eau sous diverses conditions, aucun lyogel complexe homogène contenant beaucoup d'eau, aucun lyogel complexe homogène et transparent, ou aucun xérogel complexe transparent n'a pu être obtenu. Par exemple, lorsqu'un sol de silice est rajouté dans une solution d'alcool polyviny-

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lique (mentionné ci-après par l'abréviation PVA), on observe la séparation de deux couches (5 à 20% de silice, 1 à 5% de PVA). Au-dessus de pH 5, le mélange est complètement séparé en deux couches, l'une contenant la silice et l'autre le PVA. En dessous de pH 5, la silice se disperse dans la couche de PVA et il se forme un coacervat. Le sol ou gel homogène et transparent désiré n'est formé à aucun pH. De plus, des sels inorganiques à base de silice, telle que le verre soluble, ne peuvent pas former une solution homogène avec le PVA par hydrolyse acide, ce qui fait qu'il est impossible d'obtenir le gel complexe homogène et transparent désiré.

Selon la présente invention, il est fourni un procédé de préparation d'un gel complexe hydrophile par le mélange d'un polymère soluble dans l'eau et d'un silicate organique, en particulier un tétraalcoxysilane, et la gélification sous des conditions douces, procédé par lequel on obtient un gel complexe hydrophile qui n'a aucun effet néfaste sur l'activité de substances biologiques, telles que des cellules microbiennes ou des enzymes, qui est utilisable pour l'immobilisation de cellules microbiennes possédant des activités enzymatiques et qui peut servir de matériel pharmaceutique.

Il a été trouvé qu'un tétraalcoxysilane, tel que le tétraéthoxysilane, est hydrolysé par un acide dans une solution aqueuse d'un polymère soluble dans l'eau, tel que l'alcool polyvinylique, la gélatine, la carboxyméthylcellulose, l'amidon et l'alginate de sodium, pour former un sol complexe homogène.

De plus, il a été prouvé que ce sol complexe homogène ainsi formé peut être gélifié pour former un xérogel insoluble dans l'eau par un processus de séchage. Et il a également été trouvé, en plus, que des cellules microbiennes possédant une activité enzymatique peuvent être immobilisées par blocage dans l'intérieur de la matrice de ce gel sans diminution de l'activité enzymatique, parce que ce sol complexe susmentionné est gélifié sous des conditions extrêmement douces.

L'invention a pour but de fournir un gel hydrophile qui est insoluble dans l'eau et qu'il est peu coûteux de produire, et qui présente d'excellentes compatibilité et affinité avec une substance biologique.

Un autre but de la présente invention est de fournir une matrice de gel hydrophile qui est facilement applicable à l'immobilisation de cellules microbiennes possédant une activité enzymatique.

A cette fin, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on mélange une solution aqueuse d'un composé polymère soluble dans l'eau, choisi parmi l'alcool polyvinylique, la gélatine et la carboxyméthylcellulose, avec un tétraalcoxysilane de formule générale Si(OR)4 dans laquelle R représente un groupe alcoyle ayant jusqu'à 12 atomes de carbone, qu'on hydrolyse le mélange résultant par addition d'un acide ou d'un composé acide pour former un sol complexe homogène et qu'on gélifie le sol.

Une application particulièrement intéressante du procédé selon l'invention est la préparation d'un xérogel hydrophile complexe dans lequel sont immobilisées des cellules microbiennes qui peuvent être employées pour l'usage dans un processus continu dans un réacteur à colonne ou dans un processus par lots avec agitation.

Cette application est caractérisée en ce qu'on mélange une solution aqueuse d'un composé polymère soluble dans l'eau,

choisi parmi l'alcool polyvinylique, la gélatine et la carboxyméthylcellulose, avec un tétraalcoxysilane de formule générale Si(OR)4 dans laquelle R représente un groupe alcoyle ayant jusqu'à 12 atomes de carbone, qu'on hydrolyse le mélange résultant par addition d'un acide ou d'un composé acide pour former un sol complexe homogène, qu'on disperse de façon homogène des cellules microbiennes dans ce sol et qu'on gélifie le mélange du sol et des cellules microbiennes par séchage.

Il est ainsi possible d'immobiliser des cellules microbiennes tout en maintenant au moins plus de 50% de l'activité enzymatique présentée originellement par ces mêmes cellules bactériennes intactes, non traitées.

La fig. 1 montre la relation qui existe entre le taux de conversion du D-glucose en D-fructose et le nombre d'utilisations de la 5 préparation d'enzymes. L'axe des ordonnées représente le taux de conversion exprimé en % en poids et l'axe des abscisses représente le nombre d'utilisations exprimées en fois. Les courbes 1 et 2 montrent les résultats obtenus avec des cellules immobilisées et des cellules non traitées, respectivement.

,o Le gel complèxe hydrophile selon la présente invention est formé par la réaction d'un polymère soluble dans l'eau et d'un tétraalcoxysilane pour former un sol homogène et la gélification subséquente dans des conditions très douces. Le tétraalcoxysilane est hydrolysé sous des conditions acides dans une solution 15 aqueuse du polymère soluble dans l'eau pour former le sol homogène. Des cellules microbiennes possédant une activité enzymatique sont additionnées à ce sol ainsi obtenu. Le mélange est gélifié par ajustement du pH pour former un lyogel complexe; on sèche après ajustement du pH pour donner un xérogel insoluble 20 dans l'eau, lyogel ou xérogel dans lequel sont bloqués ces dites cellules sans diminution de l'activité enzymatique.

Les composés polymères solubles dans l'eau utilisables dans la présente invention ont plusieurs groupes polaires, tels que le groupe —OH, le groupe — COOH, le groupe — NH2 et le groupe 25 =NH et ainsi de suite, qui forment de fortes liaisons hydrogène avec les groupes acides —OH des silicates par hydrolyse. Les composés polymères solubles dans l'eau désignés au tableau 1 peuvent être employés.

Tableau 1 :

30 A) Composés polymères naturels et leurs dérivés :

1) Celluloses: carboxyméthylcellulose, méthylcellulose, hydroxyéthylcellulose.

2) Amidons : hydroxyéthylamidon, carboxyméthylamidon. 35 3) Autres Polysaccharides : mannane, dextrane, chitosanne,

pullulanne, gomme guar, gomme de caroubier, gomme traga-cantha, gomme xanthanne, alginate de sodium.

4) Protéines: gélatine, albumine.

B) Composés polymères synthétiques : alcool polyvinylique, polyéthylèneglycol, polyéthylène-imide.

Les polymères solubles dans l'eau préférés employés dans la présente invention peuvent être : un alcool polyvinylique qui a un degré de polymérisation moyen entre 500 et 2000 et un degré de saponification dans la gamme de 70 à 100% ; une gélatine com-45 merciale du type consommable qui a une résistance de gel de plus de 200 g/coup/5 s dans un gélomètre Bloom; ou une carboxyméthylcellulose de type commercial consommable qui a un degré de carboxylation entre 0,4 et 0,8 et une teneur en sodium dans la gamme de 7,0 à 8,5%.

50 Le composé polymère soluble dans l'eau est solubilisé dans de l'eau à une concentration telle qu'il présente une viscosité en dessous de 10000 cPo, de préférence en dessous de 3000 cPo pour une agitation complète. La viscosité susmentionnée est mesurée avec un rotor N° 3 d'un viscosimètre de type B à 40° C. 55 Les tétraalcoxysilanes qui peuvent être employés dans la présente invention sont ceux de formule générale Si(OR)4 dans laquelle R représente un groupe alkyle ayant jusqu'à 12 atomes de carbone, par exemple les groupes méthyle, éthyle, propyle, butyle, octyle et lauryle. Les composés dans lesquels R représente un 60 groupement alkyle à 3 atomes de carbone sont de préférence utilisés pour la formation effective du sol complexe homogène. Le tétraéthoxysilane est le composé le plus convenable.

Le composé polymère soluble dans l'eau est mélangé avec le tétraalcoxysilane susmentionné, puis le pH du mélange est alors 65 ajusté en dessous de 3 avec un acide ou un sel acide qui ne présente aucun effet néfaste sur les activités enzymatiques des cellules microbiennes. Les acides ou les sels acides qui peuvent être employés dans la présente invention sont désignés au tableau 2.

Tableau 2:

A) Acides inorganiques: HCl, HNO3, H3PO4, H2SO4.

B) Acides organiques : acides acétique, glutamique, lactique, maléique, succinique, ascorbique, citrique, tartrique.

C) Sels inorganiques ou organiques acides: AICI3, 1-citrate d'ammonium.

La quantité de tétraalcoxysilane nécessaire pour le mélange susmentionné avec la solution aqueuse du polymère soluble dans l'eau varie selon le type de composé de silane et les propriétés du polymère soluble dans l'eau employé. La quantité de SÌO2 contenue dans le tétraalcoxysilane, calculé sur la base du SÌO2 formé par hydrolyse acide, devrait être de 5 à 300% (poids/poids) du poids sec du polymère soluble dans l'eau. La quantité préférable de SÌO2 est dans la gamme de 50 à 200%. Lorsque la quantité de SÌO2 est en dessous de 5%, la solubilité dans l'eau du gel formé augmente de manière significative, tandis que, dans les cas où cette quantité est au-dessus de 300%, ce dit gel devient fragile. Les propriétés du gel dépendent de la quantité en SÌO2 du tétraalcoxysilane et/ou de la structure chimique du polymère soluble dans l'eau. Par exemple, un PVA ayant un degré moyen de polymérisation entre 500 et 2000 et un degré moyen de saponification dans la gamme de 70 à 100% peut être employé, mais la quantité préférée en SÌO2 est au-dessus de 20%, et plus préférablement au-dessus de 50% dans le cas d'un PVA complètement saponifié, alors qu'une plus faible quantité de SÌO2 est nécessaire pour un PVA ayant un degré de saponification plus faible.

Dans l'étape initiale du processus de réaction, le mélange du composé polymère soluble dans l'eau et du tétraalcoxysilane est séparé en deux couches à cause de leur insolubilité mutuelle.

Après ajustement du pH en dessous de 3 par addition d'un acide ou d'un sel acide, le mélange est bien agité à température ambiante en chauffant en dessous de 80° C, si nécessaire, afin d'obtenir une hydrolyse complète. Plus le pH est bas et plus la température est haute, plus la réaction d'hydrolyse est rapide,

mais les conditions exactes sont choisies selon la nature du gel désiré. La solution aqueuse de PVA et celle de tétraalcoxysilane sont mélangées à un taux tel que la quantité de SÌO2 du tétraalcoxysilane est de 100% (poids/poids) du poids sec du PVA. Le mélange est complètement hydrolysé à pH 3 et à température ambiante pendant 2 h pour former un sol complexe, incolore, transparent et homogène. Le fait que l'hydrolyse est complète peut être déterminé par l'observation que la limite des deux couches séparées a disparu et qu'une solution homogène et transparente a été obtenue. L'odeur spécifique originale du tétraalcoxysilane se transforme en un parfum alcoolique.

Le sol ainsi formé peut être conservé pendant une longue période en dessous de la température ambiante. En particulier, aucune propriété du sol n'a changé à 5°C même après un mois.

Comme mentionné auparavant, divers types de composés polymères solubles dans l'eau peuvent être employés en tant qu'un des composants du sol complexe. Ce sol complexe peut facilement être gélifié par l'ajustement du pH ou par le processus de chauffage. Les gels complexes fournis par différentes conditions à partir du même composé polymère soluble dans l'eau ont des degrés de turbidité différents. Par exemple, le sol complexe de gélatine et de tétraéthoxysilane est converti en un gel transparent en dessous de pH 4. Le gel le plus trouble est obtenu à pH 5; au-dessus de pH 7, le gel devient semi-transparent.

Les gels complexes formés sont normalement classifiés en type lyogel, qui contient beaucoup d'eau à l'intérieur, et en type xérogel, qui contient peu d'eau. Dans ce dernier type, l'humidité de gel est presque complètement enlevée par le processus de séchage. Selon la présente invention, les composants du sol ne sont pas séparés, mais maintiennent l'état complexe homogène tout au long des étapes formation du sol -»formation du gel -»formation du xérogel. Les xérogels ainsi préparés sont insolubles dans l'eau, mais présentent des propriétés hydrophiles.

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Comme montré dans les exemples donnés ensuite, les propriétés du xérogel formé dépendent de la nature du polymère soluble dans l'eau utilisé, et aussi du rapport entre le SÌO2 et le polymère. En général, le gel devient plus insoluble dans l'eau, plus dur et plus friable avec une augmentation du taux de SÌO2. Par contre, il devient plus flexible par l'augmentation du taux de polymère. Quant à l'effet du polymère soluble dans l'eau, par exemple lorsqu'il s'agit du PVA, les propriétés du xérogel varieront selon le degré de saponification du PVA employé. Dans le cas d'un PVA complètement saponifié, la plus petite quantité de SÌO2 nécessité est de 50% (poids/poids) basé sur le PVA utilisé. Pour la formation d'un xérogel similaire avec un PVA partiellement saponifié (87% de saponification), la quantité de SÌO2 nécessaire est plus faible, mais doit être au moins plus de 20% (poids/poids).

Selon la présente invention, des cellules microbiennes possédant des activités enzymatiques peuvent être immobilisées sous des conditions très douces en les bloquant à l'intérieur de la matrice du gel complexe hydrophile susmentionné obtenu à partir d'un silicate et d'un composé polymère soluble dans l'eau. Les cellules microbiennes sont rajoutées dans le sol homogène susmentionné sans aucune modification du pH ou d'ajustement par des sels basiques tels que ceux mentionnés au tableau 3.

Tableau 3:

A) Bases: NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH4OH.

B) Sels basiques: Na2CC>3, CT^COONa, NaHCC>3, K2CO3, K2HPO4, Na2HP04, CH3COOK.

Les cellules microbiennes qui peuvent être utilisées dans la présente invention peuvent être des cellules sèches, des cellules humides obtenues à partir d'un bouillon de culture par centrifuga-tion ou filtration, ou bien le bouillon de culture lui-même. Ces cellules microbiennes sont classifiées dans les cinq groupes suivants : bactéries, actinomycètes, champignons parasites, levures et algues. Des bactéries du premier groupe, appartenant à la classe des schizomycètes, taxonomiquement, sont du genre: Pseudomonas, Acetobacter, Gluconobacter, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Clostridium, Brevibac-terium, Arthrobacter, Erwinia, etc. Des actinomycètes du deuxième groupe appartenant à la classe des schizomycètes, taxonomiquement, sont du genre : Streptomyces, Nocardia, Mycobacterium et ainsi de suite (R.E. Buchran et N.E. Gibbons, «Ber-gey's Manuel de Bactériologie déterminative», 8e éd. (1974), The Williams and Wilkins Company). Les champignons parasites du troisième groupe appartenant aux classes phycomycètes, ascomy-cètes, Fungi imperfecti, et basidiomycètes, taxonomiquement, sont du genre: Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Pénicillium, Monascus, Nerosporium et ainsi de suite (J. von Arx, «Les genres de Fungi sporulant en cultures pures», Ed. J. Cramer; ainsi que H.L. Barnett et Barry B. Hunter, «Illustration des genres de Fungi imperfecti», 3e éd. (1970), Burgess Publishing Co.). Les levures du quatrième groupe appartenant à la classe ascomycètes, taxonomiquement, sont du genre : Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenia, Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Kloechera et ainsi de suite (J. Lodder, «Les levures: Etude taxonomique», 2e éd. (1970), North-Holland Publishing Co.). Les algues du cinquième groupe sont du genre à cellules uniques Chlorella et Scedesmus dans les algues vertes, et du genre à cellules uniques Spirulina dans les algues bleu-vert (H. Tamiya, «Etudes sur les microalgues et les bactéries photosynthétisantes» (1963), Presses de l'Université de Tokyo).

La plupart de ces cellules microbiennes sont des organismes cultivables à partir d'une seule cellule. Les tailles cellulaires des micro-organismes individuels appartenant aux groupes mentionnés ci-dessus sont différentes les unes des autres, mais le diamètre ou la largeur de chaque cellule utilisable dans la présente invention reste dans la gamme de 1 à 20 |x. Ces cellules microbiennes peuvent être dispersées dans des solvants aqueux. Certaines

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espèces dCActinomyces et des Fungi du troisième groupe ont parfois plus de 20 (i de long. Des cellules microbiennes de longue taille (longueur moyenne: 50 à 100 |x) et/ou des cellules microbiennes sous forme de sphérules peuvent être bloquées dans la matrice d'un gel ci-dessus mentionné, mais la quantité de cellules bloquées est comparativement diminuée. De telles cellules sont donc de préférence dissociées afin de présenter une taille inférieure à 20 n. Pour ce faire, une homogénéisation dans l'eau peut être faite, par exemple mécaniquement.

Les cellules microbiennes utilisées dans la présente invention, choisies dans un des cinq groupes ci-dessus mentionnés, présentent en général plus d'une activité enzymatique. Les enzymes sont classifiés dans les cinq groupes suivants.

Tableau 4:

A) Oxydoréductases : glucose-oxydase, nitriteréductase, catalase, monoamine-oxydase, cytochrome-c-réductase.

B) Transférases: glutamate-oxyloacétatetransaminase,3-acyl-transférases macrolides à 16 membres, ATP, nucléoside-5'-mono-phosphatepyrophosphatetransférase.

C) Hydrolases: protéases, glucoamylase, a-amylase, isoamy-lase, lipase, lactase, pénicilline-amidase, phosphatase alcaline, aminoacylase, uréase, cellulase.

D) Isomérases: glucose-isomérase, alanineracémase.

E) Lyases: ß-tyrosinase, histidinedécarboxylase, tryptopha-nase.

Les enzymes utilisables dans la présente invention sont les enzymes intracellulaires existant à l'intérieur de la cellule microbienne ou du mycélium ou à l'intérieur de l'organelle d'un organisme. Dans la présente invention, l'indication activité indique non seulement une activité enzymatique, mais aussi d'autres activités biologiques, telles que par exemple les coenzymes, les antibiotiques, les antigènes et les anticorps, et leurs analogues.

Le pH du mélange du gel complexe et les cellules microbiennes doivent être choisis en considération de la stabilité de l'enzyme ou des propriétés du gel formé. Habituellement, il est ajusté entre pH 4 et 8, de préférence entre 5 et 7. Lors de l'immobilisation de cellules microbiennes, l'ajustement du pH est inutile dans la plupart des cas parce que les cellules microbiennes ont un pouvoir tampon par elles-mêmes. Le pH du mélange ci-dessus mentionné tombe généralement dans la gamme 5 à 6,5 après addition des cellules.

Le poids sec des cellules microbiennes qui sera ajouté est moins de 1000% (poids/poids), de préférence de 20 à 500% (poids/poids), basé sur le poids sec du sol complexe homogène. Après addition des cellules microbiennes en sol complexe homogène, le mélange est bien agité afin de les disperser de manière homogène. La réaction de gélification du sol comprenant les cellules microbiennes s'effectue à n'importe quelle température. Toutefois, comme les enzymes sont instables aux températures plus élevées, la gélification est effectuée à une température entre 0 et 70e'C, de préférence entre 10 et 40° C. La réaction de gélification est en général terminée complètement entre 10 et 30 mn. Par exemple, le sol est complètement gélifié à pH 6,0 par agitation continue à température ambiante pendant 10 à 20 mn.

Un des avantages plus important de la présente invention réside dans les conditions douces sous lesquelles s'effectue l'immobilisation et sous lesquelles les activités enzymatiques peuvent être maintenues pendant tout le processus sans inactivation remarquable.

Le gel complexe formé bloquant les cellules microbiennes peut être séché et converti en la forme désirée. Ce processus de séchage est effectué en dessous de 75° C. Dans le cas de cellules de levure, l'activité de fermentation est comparativement stable et tout le processus de la présente invention peut être effectué à température ambiante. Mais pour des cellules bactériennes telles que celles employées pour la synthèse enzymatique de la L-tyrosine, tout le processus peut être effectué en dessous de 5°C afin de maintenir intactes les activités enzymatiques, et spécialement la lyophilisation est préférée aux processus de séchage. Aussi longtemps que la température est maintenue dans la gamme mentionnée ci-dessus, presque aucune inactivation de l'enzyme n'est observée. Pour la conversion du lyogel susmentionné, bloquant des cellules microbiennes, en formes diverses, des méthodes traditionnelles peuvent être employées dans le procédé selon la présente invention. Les processus de moulage peuvent être effectués avant ou après le séchage. Spécialement, des solvants organiques hydrophiles ou hydrophobes dans lesquels le lyogel complexe est presque insoluble peuvent être employés dans ces processus de moulage. Les solvants organiques tels que ceux désignés au tableau 5 peuvent être employés.

Tableau 5:

A) Alcools : les alcools méthylique, éthylique, n-propylique, n-butylique, l'éthylèneglycol, la glycérine.

B) Cétones : l'acétone, la méthyléthyleétone.

C) Ethers : le dioxanne, le tétrahydrofuranne.

D) Alcanes : le n-heptane, la n-paraffine.

E) Composés aromatiques : le benzène, le toluène, le xylène.

F) Divers : le chlorure de méthylène.

Dans la présente invention, les formes des cellules microbiennes bloquées dans le gel peuvent être du type granulaire ayant une section ronde, et en particulier peuvent être des sphères, des granules, des sphérules, des filaments, et ainsi de suite. Lorsque • ces cellules microbiennes immobilisées dans un gel moulé sont tassées dans un réacteur à colonne, elles fournissent de bons résultats dans une réaction en continu. Dans certains cas de cellules microbiennes immobilisées dans un gel moulé, ce dernier peut être du type film ou lamelle ou, dans d'autres cas, du type granules irréguliers ou pulvérulents. Le diamètre moyen et/ou l'épaisseur du gel moulé comprenant des cellules microbiennes peuvent se trouver entre 0,2 et 5 um, de préférence entre 0,4 et 1,0 (im. Avec des gels moulés de ces épaisseurs, un contact désiré entre les cellules microbiennes et leur substrat peut être obtenu. De plus, le taux d'écoulement désiré de mélange de réaction à travers la colonne de réaction peut aussi être maintenu.

La forme désirée peut être obtenue par la méthode de moulage par fente, parce que le lyogel complexe bloquant les cellules microbiennes est sous la forme d'une pâte molle. Par exemple, le lyogel selon la présente invention peut être converti en un long cylindre par moulage par fente dans un solvant organique ou dans l'air, et ensuite par séchage. Et aussi le lyogel est formé en granules ronds en le laissant tomber dans un solvant organique ou dans l'air. Les gels ainsi préparés ont une aire de surface spécifique élevée.

Le séchage par pulvérisation peut aussi être employé pour la préparation de formes désirées. Les granules ainsi préparés ont une aire de surface spécifique élevée et de bonnes propriétés pour l'utilisation dans un réacteur à colonne. Cette méthode peut avantageusement, sur le plan économique, être employée à l'échelle industrielle.

Dans la présente invention, de bons résultats peuvent aussi être obtenus par l'utilisation de la lyophilisation. Les activités enzymatiques des granules ainsi préparés par cette méthode sont maintenues de manière satisfaisante même si cette méthode est appliquée aux cellules microbiennes instables à la chaleur, comme indiqué aux exemples 16 et 17 décrits ci-après, dans lesquels des cellules bactériennes aptes à effectuer la synthèse enzymatique de la L-tyrosine ont été utilisées.

Une autre forme préférée du gel est du type film, qui peut être produit en étalant le sol sur la surface d'une plaque. Ce type de gel peut aussi avantageusement être appliqué à une utilisation industrielle parce qu'il a une aire de surface spécifique élevée et peut facilement être produit. Des granules comprenant des cellules microbiennes immobilisées peuvent aussi être obtenus par le

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processus de la pulvérisation. En général, plus de 80% et au moins 50% des activités enzymatiques des cellules microbiennes non traitées peuvent être maintenues dans les granules préparés par cette méthode.

•Les cellules microbiennes immobilisées mentionnées ci-dessus, préparées par le procédé selon la présente invention, sont stables et maintiennent leurs activités pendant une longue période de temps, au moins pendant une année lorsqu'elles sont stockées à 10°C, et peuvent être appliquées à des réactions en continu ou en lots répétés. Par exemple, des cellules microbiennes immobilisées à action glucose-isomèrase peuvent être utilisées sans aucune perte dans une réaction en continu en employant un réacteur à colonne pendant 30 j. Pendant toute la longue période du processus en continu, des diminutions de pression peuvent être ignorées même avec un taux d'écoulement comparativement élevé et avec des degrés divers de force ionique.

Les cellules microbiennes immobilisées selon la présente invention peuvent être utilisées en tant que catalyseurs pour la conversion biochimique de divers substrats non seulement dans les systèmes de réacteurs à colonne, mais aussi dans les systèmes de réacteurs à lots répétés. Lors de l'utilisation d'un système normal de réacteur à lots répétés avec agitation, aucune fuite prononcée de cellules microbiennes hors du gel ou aucune destruction appréciable du gel moulé ne peuvent être observées. De plus le composé polymère soluble dans l'eau peut être récupéré à partir du gel immobilisant les cellules microbiennes, utilisé de manière répétée, lorsque ses activités ont diminué après une longue période d'utilisation. Le composé polymère soluble dans l'eau ou le sol complexe peut être récupéré en dissolvant le gel dans une eau alcaline et chaude, telle que de l'ammoniaque dilué, en éliminant les cellules par centrifugation ou par filtration et en ajustant subséquemment le pH.

Les exemples suivants illustrent des modes de mise en route de la présente invention, mais il doit être bien entendu qu'ils ne sont donnés qu'à des fins d'illustration et non de limitation.

Exemple 1 :

50 g d'une solution aqueuse de PVA (degré de polymérisation 2000 et de saponification complète) à 10% ont été mélangés avec 20 g d'eau, 5 g de tétraéthoxysilane et 2 g de HCl IN et agités. Le mélange trouble devient graduellement un sol complexe, transparent et homogène à température ambiante au bout de 2 h. Ce sol complexe homogène ainsi préparé a été neutralisé en ajustant le pH à 7 avec du NH4OH IN, et un lyogel complexe homogène, transparent et incolore est formé sans aucune séparation de ses composants, tels que le PVA ou le tétraéthoxysilane. Le sol homogène peut aussi être gélifié sans neutralisation par stockage pendant une longue période de temps pour former un lyogel complexe qui était également homogène et transparent et insoluble dans l'eau à température ambiante. Ce lyogel complexe homogène ainsi préparé a été séché par ventilation à température ambiante pour former un xérogel complexe homogène et transparent qui est insoluble dans l'eau du robinet. Ce xérogel complexe ainsi obtenu a été gonflé sans aucune séparation de ses composants lorsqu'il a été traité pendant 1 h dans l'eau bouillante. Dans le cas d'un xérogel préparé après neutralisation et séchage par la méthode de ventilation mentionnée ci-dessus, la quantité solubilisée était de 50% du poids initial du xérogel complexe et le degré de gonflement était d'environ 30 fois dans l'eau bouillante. Dans le cas du sol complexe sans neutralisation, la quantité solubilisée était de 30% et le taux de gonflement était d'environ 12 fois dans l'eau bouillante.

Exemple 2:

Par la même procédure que celle décrite à l'exemple 1, sauf que l'on a ajouté 15 g de tétraéthoxysilane, l'on a obtenu un lyogel complexe homogène. Le processus de réaction, le sol produit comme intermédiaire et l'apparence du lyogel étaient à

peu près les mêmes que ceux de l'exemple 1. Le xérogel formé avec ou sans neutralisation était insoluble dans l'eau du robinet. La quantité solubilisée était de moins de 3% et le gonflement était moins de 3 fois par traitement dans l'eau bouillante.

Exemple 3:

En employant le même procédé que celui décrit à l'exemple 1, sauf que l'on a rajouté 20 g de tétraéthoxysilane au lieu de 5 g, un lyogel complexe homogène a encore été formé, qui avait une apparence similaire (c'est-à-dire qui était incolore et transparent) à celle de l'exemple 1. Le xérogel formé subséquemment, avec ou sans neutralisation, était plus dur et plus friable envers des forces physiques que celui de l'exemple I. Le gel était insoluble dans l'eau du robinet, la quantité solubilisée était d'environ 2% et le degré de gonflement de 2 fois dans l'eau bouillante.

Exemple 4:

Par la même procédure que celle décrite à l'exemple 1, sauf que l'on rajoutait 2 g de tétraéthoxysilane dans 5 g de solution aqueuse de PVA (degré de polymérisation 1700 et de saponification 87) à 10%, le lyogel homogène complexe a été formé, qui a été trouvé possédant une apparence très similaire à celle de l'exemple 1. Le xérogel complexe formé avec ou sans neutralisation était insoluble dans l'eau du robinet, la quantité solubilisée était de moins de 9% et le degré de gonflement était de moins de 6 fois dans l'eau bouillante.

Exemple 5:

On a procédé à une réaction analogue à celle utilisée à l'exemple 4 en employant 10 g de tétraéthoxysilane et 5 g de solution aqueuse de PVA (degré de polymérisation 1700 et de saponification 87) à 10%. Les caractères de la réaction, l'apparence du sol complexe et du lyogel complexe homogène ont été à peu près les mêmes que ceux de l'exemple 1. Le xérogel complexe final obtenu avec ou sans neutralisation était insoluble dans l'eau du robinet, la quantité solubilisée était de moins de 4% et le taux de gonflement était d'environ 2,5 fois dans l'eau bouillante.

Exemple 6:

2 g de tétraéthoxysilane ont été rajoutés, en agitant à température ambiante, à un mélange de 20 g de solution aqueuse de PVA (de degré de polymérisation 1100 et complètement saponifié) à 5% et de 0,5 g de chlorure d'ammonium. L'agitation a été continuée pendant environ 2 h et un sol complexe homogène, transparent et incolore, a été obtenu. Le sol ainsi formé a été séché sous ventilation pour former un film de xérogel complexe homogène et transparent. Ce film était insoluble même par extraction à l'eau bouillante et maintenait sa forme de film originelle. Le sol mentionné ci-dessus a aussi été neutralisé par NH4OH IN, ce qui a pour effet de donner un sol blanc trouble. Il a été séché par ventilation pour former un xérogel semi-transparent. Le gel final était insoluble dans l'eau du robinet et maintenait sa forme originelle de film dans l'eau bouillante.

Exemple 7:

100 g d'une solution aqueuse de gélatine à 5% ont été dilués dans 66 g d'eau, bien agités en chauffant et additionnés de 15 g de tétraéthoxysilane. Après que le pH a été ajusté à 3 ou en dessous par du HCl dilué, le mélange a été agité continuellement à température ambiante pendant 3 h, après quoi le mélange devient transparent. Le sol complexe homogène ainsi formé a été laissé au repos à température ambiante afin d'obtenir un lyogel complexe homogène et transparent. Après que le pH du lyogel fut ajusté par du NH4OH dilué, le gel complexe devint trouble à environ pH 4,5 et très trouble à environ pH 5 à 6, mais redevint semi-transparent au-dessus de pH 7. L'homogénéité a été maintenue et aucune couche aqueuse ne fut observée. La valeur du pH a influencé le temps d'attente pour la formation du lyogel complexe. En séchant

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les sols complexes homogènes et les lyogels complexes homogènes, il a été obtenu des xérogels complexes homogènes ayant des degrés variés de turbidité (transparent dans la gamme acide, trouble-blanchâtre autour d'environ pH 5 à 6 et semi-transparent au-dessus de pH 8). Le xérogel était insoluble dans l'eau à température ambiante et gonflait dans l'eau bouillante sans perdre sa forme originelle.

Exemple 8:

100 g d'amidon soluble à 5% en solution aqueuse ont été dilués dans 66 g d'eau et, après agitation d'homogénéisation avec chauffage, 15 g de tétraéthoxysilane ont été rajoutés. Après ajustage du pH à 3 avec une solution diluée de H3PO4, le mélange a été agité à température ambiante pendant environ 2 h jusqu'à ce qu'un sol complexe transparent homogène soit obtenu. Ce sol fut neutralisé avec du NaOH dilué et, après environ 30 mn de stockage, un lyogel complexe homogène a été obtenu. Soit le séchage par ventilation du sol complexe sans neutralisation, soit le séchage par ventilation du lyogel complexe homogène formé après neutralisation, aboutit à la formation d'un xérogel turbide blanchâtre qui est fragile aux forces physiques. Seulement une petite quantité d'amidon a été extraite du xérogel dans l'eau du robinet, et 50% peuvent en être extraits par l'eau bouillante. La forme originelle a été conservée dans les deux cas et un gonflement fut observé, en particulier dans l'eau bouillante.

Exemple 9:

100 g de solution aqueuse de carboxyméthylcellulose ont été additionnés à 66 g d'eau, et le mélange a été agité à 45° C, puis 20 g de tétraéthoxysilane ont été incorporés au mélange. Le pH de ce mélange a été ajusté à 3 avec du HCl IN. Le mélange a été continuellement agité pendant environ 2 h jusqu'à ce qu'un sol complexe homogène et transparent ait été radialement formé. De plus, par ajustement du pH du sol à 6,0 avec NH4OH IN et séchage par ventilation, un xérogel complexe homogène et transparent a été obtenu. Ce xérogel complexe et homogène était insoluble et ne gonflait pas dans l'eau à température ambiante. Mais, dans l'eau bouillante, il était presque insoluble et le taux de gonflement était d'environ 2 fois.

Exemple 10:

15 g de tétraéthoxysilane ont été rajoutés à 100 g d'ime solution aqueuse de polyacrylate à 5% dilué avec 66 g d'eau, et le mélange a été agité à température ambiante pendant environ 2 h. Le mélange est devenu peu à peu un sol homogène et transparent, qui fut neutralisé avec 17 g de NH4OH IN et stocké pour fournir le lyogel complexe semi-transparent. Le sol complexe homogène fourni sans neutralisation et le lyogel complexe homogène formé par neutralisation ont été séchés pour donner respectivement des xérogels blancs semi-transparents. Environ une moitié du xérogel ainsi obtenu était dissous dans l'eau bouillante et l'autre moitié restait sous forme d'hydrogel mou insoluble dans l'eau bouillante.

Exemple 11:

15 g de tétraéthoxysilane ont été rajoutés à 100 g de solution aqueuse de polyéthylèneglycol (+4000) à 5% dilué avec 66 g d'eau et le mélange a été agité à température ambiante. Par addition de 1 g de HCl IN pendant 3 h, le mélange devint un sol homogène incolore et transparent. Ce sol fut neutralisé avec du NH4OH IN et stocké pendant 3 h pour former un lyogel complexe incolore, homogène et transparent. Par séchage du lyogel, un xérogel complexe incolore, homogène et transparent fut obtenu.

Dans l'eau bouillante, 50% du xérogel formé a été dissous pour laisser un gel turbide. Ce xérogel solide était assez sensible à la destruction.

Exemple 12:

100 parties de solution aqueuse de PVA (degré de polymérisation 1700 et de saponification 99,5) à 5% ont été mélangées à 231,5 parties d'eau distillée, 28,5 parties de tétraéthoxysilane et 1 partie de HCl IN et agitées pendant plus de 2 h à température ambiante pour former un sol homogénéisé de manière transparente à environ pH 3, contenant 5% d'une partie solide (abrégé ci-après en sol complexe PVA-SÌO2). Une partie de levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) séchée obtenue du commerce a été suspendue dans 2 parties d'eau puis mélangée avec le sol complexe PVA-SÌO2. Lorsque la levure a été dispersée de manière homogène par agitation, le pH a été ajusté à 7 avec une solution de NH4OH IN. Le gel a été versé dans une plaque de Pétri et séché spontanément à température ambiante. Un film brun jaunâtre contenant les cellules de la levure a été obtenu. Une bande de ce film immobilisant 1 g des cellules de levure a été enlevé et incubé dans 50 g d'une solution aqueuse à 5% de glucose à 30° C pour effectuer le test de fermentation. Une forte production de gaz commence en quelques minutes, et en 30 mn ime forte quantité de production de gaz fut observée sur toute la surface du film. Le film ne gonfle pas et se décolore, mais sa forme ne montre aucun changement et le pétillement continue pendant 30 h. La réaction a été estimée par la diminution du poids du milieu par libération de CO2 gazeux. La réaction s'effectue en proportion du temps de réaction. Une faible odeur fragrante particulière à la fermentation alcoolique a été observée. Une augmentation de la turbidité de la solution de glucose, qui est considérée comme provenant de la fuite de cellules de levure du film, n'a presque pas été observée et, de ce fait, le mélange était presque transparent. En tant que contrôle, la même réaction a été effectuée en utilisant 1 g de cellules de levure sèches non immobilisées. Au tout début de l'étape initiale de réaction, une quantité légèrement plus grande de CO2 a été enregistrée; mais, après 30 h d'incubation, le taux de CO2 gazeux libéré par les deux milieux est presque égal. De cette façon, ce fait indique que l'activité unitaire dans les deux cas, cellules normales et cellules immobilisées, était presque comparable, et donc que l'inactivation des enzymes dans les cellules immobilisées ne se produisait pas pendant le processus d'immobilisation des cellules de levure. Pourtant, puisque les cellules non immobilisées ont été suspendues dans le milieu, une faible agitation est nécessaire pour favoriser le progrès de la réaction. Des résultats ci-dessus, il a été démontré que les cellules microbiennes ont été fermement immobilisées par le présent procédé, tandis que l'activité de fermentation a été maintenue égale à celle des cellules normales.

Exemple 13:

Le même sol complexe PVA-SÌO2 tel que décrit à l'exemple 12 a été utilisé. 4 parties de levure (,Saccharomyces cerevisiae) séchée obtenue du commerce ont été suspendues dans 5 parties d'eau.

Cette suspension a été mélangée dans 20 parties du sol complexe PVA-SÌO2 et le gel étalé sur une plaque et séché par ventilation pour obtenir un film brun jaunâtre contenant des cellules de levure. Une portion de ce film contenant 1 g de cellules immobilisées a été déchiquetée et incubée dans 50 g d'une solution aqueuse de glucose à 5% à 30° C pour effectuer la fermentation comme à l'exemple 12. Une forte quantité de CO2 gazeux a été libérée même aux premiers moments de l'incubation telle qu'on l'observe dans l'expérimentation de contrôle. Après la fin de la fermentation, le film a été retiré du milieu et trempé dans une autre quantité de 50 g de solution aqueuse de glucose à 5% ; la libération de CO2 gazeux a encore été observée au moins autant que dans l'épreuve antérieure avec des cellules normales. Ce test de fermentation a été répété 5 fois et le film dans la solution de glucose montrait presque la même activité à chaque fois. Le même test de fermentation en utilisant 1 g de cellules de levure a été effectué pour comparer les résultats avec ceux obtenus avec des cellules

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immobilisées. Dans ces tests, les cellules de levure ont été récupérées par centrifugation et resuspendues dans le milieu. Dans ces tests, la quantité de CO2 gazeux libéré à partir de 50 g de solution aqueuse de glucose à 5% atteignait plus de 85% de la quantité théorique. 5

Exemple 14:

100 parties de solution aqueuse de PVA (degré de polymérisation 2000 et de saponification 88) à 10% ont été mélangées avec 181 parties d'eau, 18 parties de tétraéthoxysilane et 1 partie de 10 HCl IN et ce mélange a été ensuite bien agité pendant plus de 2 h à température ambiante pour obtenir un sol homogène et transparent à environ pH 3, contenant 5% de partie solide. 2 parties de levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) sèche obtenue du commerce ont été suspendues dans 4 parties d'eau. Cette suspen- 15 sion a été mélangée avec 20 parties du sol complexe PVA-SÌO2 et agitée de manière complète. Le gel ainsi obtenu est étalé sur une plaque et séché par ventilation à température ambiante pour obtenir un film brunâtre contenant 1 g de cellules de levure. Ce film contenant 1 g de cellules de levure a été utilisé pour des tests 20 de fermentation selon les mêmes procédés qu'aux exemples 12 et 13, c'est-à-dire que la quantité de CO2 gazeux libéré dans les étapes initiales de la réaction était faiblement inférieure à celle des cellules non immobilisées, mais que la quantité de CO2 gazeux libéré jusqu'à l'étape finale de la réaction atteignait jusqu'à 85% 25 de la valeur théorique. Cela est presque comparable au résultat obtenu avec des cellules non immobilisées.

Exemple 15:

100 parties de gélatine commerciale pour usages nutritifs ont 30 été mélangées à 15 parties de tétraéthoxysilane, 66 parties d'eau et 5 parties de HCl IN et bien agitées pendant plus de 2 h à environ 50° C pour former un sol complexe homogène et transparent à environ pH 3, contenant 5% de parties solides. 2 parties de levure de boulanger sèche, obtenue dans le commerce, ont été suspen- 35 dues dans 3 parties d'eau, et cette suspension a été rajoutée à 20 parties du sol complexe PVA-SÌO2 et agitée jusqu'à homogénéisation. Ce gel a été étalé sur une plaque et un film brun jaunâtre contenant des cellules de levure immobilisées a été obtenu par séchage à température ambiante. Le film ainsi obtenu était « plus fragile et plus friable que le film obtenu à partir du complexe PVA-SÌO2 des exemples 12, 13 et-14. Une portion du film mentionné ci-dessus a été déchiquetée, trempée dans 50 g de solution aqueuse de glucose à 5% et le test de fermentation a été conduit de façon analogue à celle de l'exemple 14. Le CO2 gazeux «

engendré pendant tout le test de fermentation atteignait plus de 85% de la valeur théorique. Pendant le test de fermentation, il n'a pas été observé de fuite de cellules microbiennes au travers du film. Ce fait démontre que les cellules de levure sont fermement immobilisées par le présent procédé. so

Exemple 16:

Un sol complexe PVA-SÌO2 a été préparé par les mêmes techniques que celles de l'exemple 12 et Erwinia herbicola (ATCC 21434), une souche produisant une ß-tyrosinase, a été cultivée dans le milieu de culture suivant:

Composition du milieu de culture pour des bactéries formant une ß-tyrosinase

L-Tyrosine

0,2 g/100 ml

KH2PO4

0,05 g/100 ml

MgS04

0,05 g/100 ml

Chlohydrate de pyridoxine

0,01 g/100 ml

Glycérine

0,6 g/100 ml

Acide fumarique

0,7 g/100 ml

L-phénylalanine

0,2 g/100 ml

DL-alanine

0,4 g/100 ml

Glycine

0,3 g/100 ml

Monoglutamate de sodium

0,45 g/100 ml

Aji-eki

1,0 g/100 ml

Zn+ +

2,0 ppm

Fe+ +

2,0 ppm pH final 7,5

4 g de cellules cultivées (poids sec: 1 g) de la bactérie produisant la ß-tyrosinase ont été récupérés par centrifugation et immobilisés de la façon décrite à l'exemple 12, sauf que la lyophilisation fut utilisée. Toutes les manipulations de cette préparation ont été effectuées en dessous de 5°C. L'activité enzymatique en ß-tyrosinase des cellules immobilisées décrites ci-dessus, et contenant 20 mg de cellules bactériennes, a été déterminée par la mesure de la L-tyrosine synthétisée dans le milieu suivant:

Composition du milieu pour la synthèse de la L-tyrosine

Pyruvate de sodium

3,0 g

Acétate d'ammonium

5,0 g

EDTA

0,3 g

Sulfate de sodium

0,2 g

Phosphate de pyridoxal

0,01g

Phénol

0,1 g

Eau le reste

Volume final 100 ml pH final 8,0

Ainsi qu'il est montré au tableau 6, les activités relatives pour la synthèse de la L-tyrosine par des bactéries immobilisées préparées à l'exemple 16 étaient d'environ 85% ou plus de 95% de l'activité du contrôle utilisant des cellules bactériennes non immobilisées. Les activités des cellules immobilisées ont ainsi été prouvées excellentes. De plus, 1 g des cellules immobilisées obtenues dans l'essai 3 du tableau 6 a été tassé dans une colonne dans laquelle le mélange de réaction de synthèse de la L-tyrosine a été rajouté de manière continue à un taux d'écoulement de 5 ml/h pour synthétiser la L-tyrosine. Un état constant de synthèse de la L-tyrosine dans la colonne a été obtenu après 12 h de fourniture continue du milieu. Cet état a été maintenu même après 24 h après le début de la fourniture du milieu et le taux de réaction a été maintenu à environ 0,6 mg/h.

Tableau 6

Cellules

H2O

Sol

NH4OH

Cellules

Activité

bactériennes

complexe

IN

séchées /

relative

humides

PVA-SÌO2

solides

(g)

(Totaux)

(%)

Contrôle

4

—

100

Exemple 1

4

7

40

0,4

1/3

90,4

Exemple 2

4

7

20

0,2

1/2

89,0

Exemple 3

4

7

10

0,1

2/3

85,6

Exemple 4

4

7

6,7

0,067

3/4

84,2

Exemple 5

4

7

4,0

0,04

5/6

88,3

622 537

10

Exemple 17:

Un sol complexe PVA-SÌO2 a été préparé ayant la même composition qu'à l'exemple 1. De la même manière qu'à l'exemple 16,4 g de cellules bactériennes (1 g sur base sèche) ayant une 5 activité ß-tyrosinase ont été suspendus dans 6 g d'eau. Puis cette suspension a été mélangée avec 20 g du sol complexe PVA-SÌO2 refroidi en dessous de 5°Cet homogénéisée. Après que le pH du gel eut été ajusté à 7,0 avec NH4OH IN, ce gel a été extrudé dans de l'acétone, du chlorure de méthylène et de l'alcool isopropylique, 10 respectivement, qui étaient réfrigérés dans un bain de glace sèche et d'acétone. Les gels extradés ont été immédiatement lyophilisés pour former un type granulaire de la préparation à base de cellules bactériennes immobilisées. La formation de la L-tyrosine a été essayée en utilisant 40 mg de chaque préparation, immobilisée, sous forme granulaire.

Ainsi qu'il est montré au tableau 7, le taux relatif de formation de la L-tyrosine pour chaque préparation atteignait plus de 50% de celle fournie par 40 mg de cellules non immobilisées utilisées en tant que contrôle (100%). La préparation obtenue par l'emploi de chlorure de méthylène atteignait plus de 70% d'activité relative. Pendant la formation de la L-tyrosine, aucune fuite de cellules hors de la préparation sous forme granulaire contenant les cellules bactériennes immobilisées n'a pu être constatée.

Tableau 7

Exemple 6 Exemple 7 Exemple 8

Cellules H2O Sol Solvant Rapport Activité

bactériennes complexe organique cellules relative

PVA-SÌO2 sèches/

solides

(g) (g) (g) (Totaux) (%)

4 6 20 acétone 1/2 54,0

chlorure de

4 6 20 méthylène 1/2 70,5

alcool isopropy-

4 6 20 lique 1/2 61,1

Exemple 18. mêmes conditions. Les résultats sont montrés à la fig. 1. Dans la

100 parties en poids (par la suite: parties) de solution aqueuse fig. 1, les ordonnées du graphique représentent les pourcentages de PVA (degré de polymérisation 1700 et de saponification 99,5) à 35 de D-fructose par rapport au contenu solide total du mélange de 10% ont été mélangées avec 231,5 parties d'eau distillée, 28,5 par- réaction après chaque réaction et les abscisses représentent le ties de tétraéthoxysilane et 1 partie de HCl IN, et agitées pendant nombre d'utilisation de la réaction. Il a été trouvé d'après la fig. 1 plus de 2 h à température ambiante, pour former un sol transparent que la quantité de fructose formé était réduite à, à peu près, la homogénéisé transparent (par la suite : sol complexe) contenant moitié de ce le de la réaction initiale après six utilisations dans le 5% de parties solides, à un pH autour de 3 ; 5 parties de cellules 40 cas des cellules immobilisées, et était réduite à environ la moitié microbiennes, obtenues du commerce, possédant une activité de après seulement deux utilisations dans le cas des cellules non glucose isomérase (Nagase Sangyo Co., Ltd., nom commercial: immobilisées.

GI-1150, nom taxonomique: Streptomyces albus) ont été suspendues dans 10 parties d'eau après déchiquetage du mycélium dans Exemple 19:

un homogénéiseur à 18 000 t/mn pendant 3 mn. Après quoi la 45 50 g des cellules immobilisées à activité glucose isomérase suspension ainsi produite est rajoutée à 20 parties du sol complexe préparées par la même procédure que celle décrite à l'exemple 18 et dispersée par agitation après ajustement du pH à 6,0 avec du ont été tassés dans une colonne dé 2,5 x 20 cm maintenue à 65° C (le HCl IN pour former un gel. Ce gel a été versé dans une plaque de volume des cellules immobilisées était de 80 ml) et utilisés pour la Pétri et séché sous ventilation à 55°C; un film brun immobilisant réaction en continu d'isomérisation d'une solution à 60% de les cellules a été obtenu. Ce film a été broyé au mortier et tamisé au 50 D-glucose contenant 0,005 mol MgS04 à pH 7,5 avec un taux travers d'un tamis de 16 mailles pour obtenir de fins granules. Les d'écoulement de SV 1, et la solution ayant réagi est récupérée. Les cellules immobilisées, ayant une activité glucose isomérase, ainsi pourcentages des quantités de D-fructose par rapport au contenu préparées montraient une activité spécifique de 925 unités/g et en solides totaux de la solution ayant réagi ont été maintenus l'activité du glucose isomérase était de 88% de celle des cellules autour de 50% pendant 30 j et graduellement diminués à moins de initiales. 55 25% après 38 j.

Une unité de l'enzyme était définie comme la quantité d'enzyme SV 1 était défini comme étant le taux d'écoulement tel que le qui produit 1 mg de D-fructose sous les conditions de l'essai volume du mélange de réaction, identique à celui du volume suivant : le mélange réactionnel contient 0,1 mol de D-glucose et apparent des cellules immobilisées tassées dans la colonne, s'écoule 0,005 M MgSC>4-7H20 et la réaction est effectuée au pH 7,2 à 70° C en 1 h.

pendant 1 h. 60

Des cellules immobilisées sous forme granulaire comprenant Exemple 20:

1 g de cellules sèches ont été incubées avec 100 ml d'une solution à Les cellules microbiennes immobilisées ayant une activité 40% de D-glucose contenant 0,005 mol MgSC>4-7H20 à 70° C pen- glucose isomérase préparées par la même procédure que celle dant24 h. Après incubation, les cellules immobilisées ont été sépa- décrite à l'exemple 18 ont été placées dans un réacteur à colonne, rées par filtration et employées de manière répétée pour la même 65 et la diminution de pression, selon la méthode de T. Fukushima réaction pendant 6 fois pour examiner la stabilité de l'activité et al. («Technologie des enzymes immobilisées», p. 225 (1975),

enzymatique de la préparation des cellules immobilisées. 1 g des éd. H. Weethall et S. Suzuki, Plenum Press, New York-Londres) a cellules normales, sur base pondérable sèche, a été incubé sous les été mesurée. Le diamètre moyen des cellules microbiennes ayant

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une activité glucose isomérase était de 0,099 cm. Le diamètre du réacteur à colonne, D, était de 1,24 cm et la longueur du lit de réaction, L, était de 6,4 cm. De l'eau était envoyée au taux de V=58 cm/h par la méthode du flux remontant. Il a été trouvé que la diminution de pression AP/L était de 0,315 mlfeO/ml. Les cellules microbiennes immobilisées dans le gel de Polyacrylamide ayant une activité glucose isomérase utilisées comme contrôle montraient une diminution de pression AP/L de 5,438 ml^O/ml, sous les mêmes conditions.

Exemple 21 :

Le sol complexe a été préparé par les mêmes procédures que celles décrites à l'exemple 18. Les champignons parasites filamenteux ayant une activité glucose oxydase (Aspergillus niger IAM 2020) ont été cultivés dans des récipients à secouer, contenant le milieu de culture suivant, à 30° C pendant 3 j :

Composition du milieu pour la production de glucose oxydase

Amidon soluble

3,0 %

Peptone

0,5 %

Extrait de viande

0,3 %

KH2PO4

0,01 %

MgS04

0,01 %

FeSÛ4

0,001%

pH final 6,0

La récupération des cellules à partir du milieu de culture a été effectuée par filtration. 4 g de cellules humides (1 g calculé sur la base du poids sec) ont été suspendus dans 10 ml d'un tampon salin au phosphate à 0,1 mol à pH 7,0, et le mycélium a été déchiqueté par un homogénéisateur à 18000 t/mn pendant 3 mn. La suspension ainsi produite a été rajoutée à 10 g d'un sol complexe PVA-SÌO2 et agité à température ambiante pendant 15 mn. Le mélange a été versé dans une plaque de Pétri et ventilé à température ambiante pour obtenir 1,5 g d'un film brun jaunâtre de cellules immobilisées. 1 g de cellules non immobilisées humides possédait 240 unités de glucose oxydase, tandis que 1 g des cellules immobilisées avait 510 unités de cette activité. La récupération de cette activité glucose isomérase au travers de ce processus d'immobilisation était de 87% par gramme de cellules.

Une unité d'activité glucose isomérase était définie comme la quantité d'enzyme qui oxyde 1 |miol de glucose en 1 mn.

Exemple 22:

100 parties d'une solution aqueuse à 5% d'une gélatine commerciale nutritive chauffées à 50° C pour être agitables ont été mélangées à 15 parties de tétraéthoxysilane, 66 parties d'eau et 5 parties de HCl IN et ont été agitées pendant plus de 2 h pour former un sol complexe homogène et transparent. Le sol préparé avait un contenu solide de 5% et présentait un pH d'environ 3. D'un autre côté, Chlorellafusca, formant une nitrite réductase dans ses cellules, a été cultivée dans le milieu suivant avec aération à 25°C pendant 4 j:

Composition du milieu de culture pour la production de nitrite réductase

Glycérine 0,3 %

Nitrite de sodium 0,25 %

KH2PO4 0,13 %

MgS04 0,24 %

KCl 0,16 %

FeS04 0,0002% pH final 6,8

Les cellules cultivées ont été récupérées par filtration, et 6 g de cellules humides (1 g basé par calcul sur base sèche) ont été suspendus dans 10 ml d'eau. La suspension ainsi préparée a été mélangée avec 10 ml du sol complexe gélatine-SiC>2 et agitée à température ambiante pendant 15 mn. Le mélange ainsi préparé a été versé dans une plaque de Pétri et lyophilisé pour obtenir 2,1 g d'un film vert foncé comprenant les cellules immobilisées. 1 g de cellules immobilisées possédait 2,6 unités de nitrite réductase, et 1 g de la préparation à base de cellules immobilisées possédait 6,2 unités de cette dite activité. La récupération de l'activité nitrite réductase par ce processus d'immobilisation était de 83% par gramme de cellules.

Une unité de nitrite réductase était définie comme la quantité d'enzyme qui réduit 1 ^mol de nitrite à 30° C pendant 1 mn.

Exemple 23 :

100 parties d'une solution aqueuse de PVA (degré de polymérisation 1700 et de saponification 99,5) à 10% ont été mélangées à 221 parties d'eau distillée, 36 parties de tétrapropoxysilane et 3 parties de HCl IN et bien agitées en chauffant à 50° C pendant plus d'environ 2 h pour former un sol complexe homogène et transparent. Ce sol ainsi préparé comprend environ 5% de contenu solide.

Une partie de levure de boulanger sèche (Oriental Yeast Co. Ltd) a été suspendue dans 2 parties d'eau, et cette suspension a été melangée avec le sol préparé ci-dessus et bien dispersée par agitation. Le pH a été ajusté à environ 6 avec du NH4OH IN. Ce mélange a été versé dans une plaque de Pétri et ventilé spontanément en dessous de 30° C pour obtenir un film brun jaunâtre comprenant les cellules immobilisées. Un test de fermentation a été effectué avec 50 g d'une solution aqueuse de glucose à 5% à 30°C en utilisant une portion du film ainsi préparé contenant 1 g de cellules sèches. La fermentation a très bien progressé et la génération du CO2 a été observée. La quantité du CO2 gazeux libéré représentait environ le 80% de la valeur théorique. De plus, la fuite de cellules n'a pas pu être observée pendant la réaction, ce qui fait qu'aucune turbidité du mélange de réaction n'a pu être observée pendant tout le test de fermentation.

Exemple 24:

100 parties de solution aqueuse de PVA (degré de polymérisation 1700 et de saponification 99,5) à 10% ont été mélangées avec 27 parties d'eau distillée, 27 parties de tétraméthoxysilane et 2 parties de HCl IN, et bien agitées à température ambiante pendant plus de 2 h pour former un sol homogène et transparent. Le sol ainsi préparé avait un contenu en matière solide de 5%. Deux parties de cellules microbiennes du commerce ayant une activité de glucose isomérase (Nagase Sangyo Co. Ltd., nom commercial GI-1150, nom taxonomique Streptomyces albus) ont été immobilisées dans 20 parties de ce sol complexe par la même procédure que celle décrite à l'exemple 18. La récupération de l'activité au travers de ce processus est de 82%.

Exemple 25:

100 parties d'une solution aqueuse de gélatine commerciale nutritive ont été chauffées à 50° C pour être agitables, puis ont été mélangées avec 13 parties de tétraméthoxysilane, 85 parties d'eau distillée et 5 parties de HCl IN et agitées pendant plus de 2 h afin de préparer un sol complexe homogène et transparent. Deux parties de levure de boulanger commerciale, séchée, ont été suspendues dans 3 parties d'eau et mélangées avec 20 parties dudit sol complexe par agitation pour former une solution homogène. Ce mélange a été versé dans une plaque de Pétri pour obtenir un film jaunâtre contenant des cellules immobilisées. Ce film était friable et facilement détruit. Un test de fermentation a été effectué en utilisant une portion du film ainsi préparé et qui contenait 1 g de cellules sèches. La quantité de CO2 engendrée était de plus du 80% de la valeur théorique. De plus, la fuite de cellules n'a pas pu être observée, ce qui indiquait une immobilisation parfaite.

Exemple 26:

100 parties de carboxyméthylcellulose (additif commercial nutritif) à 5% ont été mélangées avec 27 parties de tétraméthoxysilane, 118 parties d'eau et 5 parties de HCl IN et agitées à tempé5

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rature ambiante pendant plus de 2 h pour la préparation d'un sol complexe. Le sol était homogène mais peut-être un peu plus trouble que le sol de PVA. 3 parties de levure sèche commerciale (Oriental Yeast Co. Ltd.) ont été immobilisées dans 20 parties de sol complexe selon la même procédure que celle décrite à l'exemple 23. Le film comprenant les cellules immobilisées était plutôt friable et facilement détruit à l'état desséché. Un test de fermentation a été effectué en employant une portion du film ainsi préparé, sous forme de bande, contenant 1 g de cellules sèches, de la même manière que celle décrite à l'exemple 23. La quantité de CO2 engendrée atteignait plus de 85% de la valeur théorique et, de plus, aucune fuite de cellules hors du lit immobilisé n'a pu être observée.

Exemple 27:

100 parties d'une solution aqueuse de carboxyméthylcellulose (composé additif commercial nutritif) ont été mélangées avec 5 195 parties de tétraméthoxysilane, 125,5 parties d'eau distillée et 5 parties de HCl IN pour former un sol complexe selon la même procédure que celle décrite à l'exemple 23.

Les propriétés de ce film immobilisant les cellules sont environ 10 les mêmes que celles de l'exemple 25. La quantité de CO2 engendrée dans le test de fermentation représente plus de 80% de la valeur théorique et, comme dans l'exemple. 23, aucune fuite de cellules n'a pu être observée.

R

1 feuille dessins

Claims

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2

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'un gel hydrophile complexe, caractérisé en ce qu'on mélange une solution aqueuse d'un composé polymère soluble dans l'eau, choisi parmi l'alcool polyviny-lique, la gélatine et la carboxyméthylcellulose, avec un tétraal-coxysilane de formule générale Si(OR)4 dans laquelle R représente un groupe alcoyle ayant jusqu'à 12 atomes de carbone, qu'on hydrolyse le mélange résultant par addition d'un acide ou d'un composé acide pour former un sol complexe homogène et qu'on gélifie le sol.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupe R du tétraalcoxysilane est un groupe alcoyle ayant jusqu'à 3 atomes de carbone.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé polymère soluble dans l'eau est l'alcool polyvinylique, et le tétraalcoxysilane est le tétraéthoxysilane.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poids de SÌO2 contenu dans le tétraalcoxysilane est de 5 à 300% du poids sec dudit composé polymère soluble dans l'eau.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sol complexe homogène est neutralisé par une base ou un composé basique pour former le gel complexe hydrophile.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on gélifie le sol par séchage.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le groupe R du tétraalcoxysilane est un groupe alkyle ayant jusqu'à 3 atomes de carbone.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le composé polymère soluble dans l'eau est l'alcool polyvinylique, et le tétraalcoxysilane est le tétraéthoxysilane.
9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le poids de SÌO2 contenu dans le tétraalcoxysilane est de 5 à 300% du poids sec du composé polymère soluble dans l'eau.
10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le sol complexe homogène est neutralisé par une base ou un composé basique pour former le xérogel complexe hydrophile.
11. Application du procédé selon la revendication 1 à la préparation d'un xérogel hydrophile complexe dans lequel sont immobilisées des cellules microbiennes, caractérisée en ce qu'on mélange une solution aqueuse d'un composé polymère soluble dans l'eau, choisi parmi l'alcool polyvinylique, la gélatine et la carboxyméthylcellulose, avec un tétraalcoxysilane de formule générale Si(OR)4 dans laquelle R représente un groupe alcoyle jusqu'à 12 atomes de carbone, qu'on hydrolyse le mélange résultant par addition d'un acide ou d'un composé acide pour former un sol complexe homogène, qu'on disperse de façon homogène des cellules microbiennes dans ce sol et qu'on gélifie le mélange du sol et des cellules microbiennes.
12. Application selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'on gélifie le mélange du sol et des cellules microbiennes par séchage.
13. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que le groupe R du tétraalcoxysilane est un groupe alkyle ayant jusqu'à 3 atomes de carbone.
14. Application selon la revendication 13, caractérisée en ce que le composé polymère soluble dans l'eau est l'alcool polyvinylique, et le tétraalcoxysilane est le tétraéthoxysilane.
15. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que le poids de SÌO2 est de 5 à 300% du poids sec dudit composé polymère soluble dans l'eau.
16. Application selon la revendication 12, caractérisé en ce que les cellules microbiennes mesurent 0,5 à 1,5 n en largeur et 1 à 20 n en longueur.
17. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que le mélange du sol complexe et des cellules microbiennes est séché à une température entre 0 et 70° C.
18. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que le sol complexe homogène est mélangé avec les cellules microbiennes à un pH entre 4 et 8.
19. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce

5 que le poids sec des cellules microbiennes est de 20 à 1000% de celui du sol complexe homogène.
20. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'on gélifie le mélange du sol et des cellules microbiennes par projection dans un solvant organique et séchage.

10 21. Application selon la revendication 20, caractérisée en ce que le groupe R du tétraalcoxysilane est un groupe alkyle ayant jusqu'à 3 atomes de carbone.
22. Application selon la revendication 20, caractérisée en ce que le composé polymère soluble dans l'eau est l'alcool polyviny-

15 lique, et le tétraalcoxysilane est le tétraéthoxysilane.
23. Application selon la revendication 20, caractérisée en ce que le poids de SÌO2 contenu dans le tétraalcoxysilane est de 5 à 300% de celui du composé polymère soluble dans l'eau.
24. Application selon la revendication 20, caractérisée en ce

20 que les cellules microbiennes mesurent 0,5 à 1,5 n en largeur et 1 à 20 n en longueur.
25. Application selon la revendication 20, caractérisée en ce que le mélange du sol complexe homogène et des cellules microbiennes est séché à une température entre 0 et 70° C.

25 26. Application selon la revendication 20, caractérisée en ce que le sol complexe homogène est mélangé avec les cellules microbiennes à un pH entre 4 et 8.
27. Application selon la revendication 20, caractérisée en ce que le poids sec des cellules microbiennes est de 20 à 1000% de

30 celui du sol complexe homogène.

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