"Procédé de préparation d'un gel complexe hydrophile".
La présente invention est relative à un procédé de
préparation d'un complexe hydrophile homogène par la formation
d'un lyogel ou xérogel, doué d'une compatibilité et d'une affinité intéressantes avec une substance biologique, utilisable à titre
de matrice de support pour des cellules microbiennes et constituant
un excellent produit pharmaceutique. L'invention est également
relative à un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes
douées d'activités enzymatiques, qui consiste à emprisonner ces
cellules à l'intérieur de la matrice de gel constituée par le <EMI ID=1.1>
est obtenue à partir d'un polymère' soluble dans l'eau et d'un silicate.
Les enzymes sont des catalyseurs biologiques présen- tant des propriétés spécifiques et une efficacité très élevée. On peut les utiliser pour catalyser presque n'importe quel type de réaction chimique. Les réactions enzymatiques sont réalisées
sous des conditions plus douces que les réactions chimiques et ne
l produisant pas de substances nocives. Au cours de ces dernières années, l'attention a été particulièrement focalisée sur le pro- blème important de la pollution de l'environnement dans l'indus-
trie chimique.
Par conséquent, il est très avantageux d'utiliser
les enzymes dans l'industrie chimique. L'application à l'industrie d'enzymes ou de micro- organismes a été réalisée en utilisant des micro-organismes intacte ou des préparations d'enzymes solubles.
<EMI ID=2.1>
seule fermentation ou réaction discontinue. Si l'on peut stabi- liser des enzymes et micro-organismes et les récupérer de façon économique sans inactivation, il sera possible d'utiliser les biocatalyseurs d'une façon plus intense dans l'industrie.
L'immobilisation des catalyseurs offre un moyen de réaliser plusieurs objectifs. Les enzymes immobilisées sont utilisables dans dos applications technologiques ainsi que dans des applications médicales et analytiques. La plupart des études relatives à l'immobilisation concernent des enzymes exemptes de cellules, mais au cours de ces récentes années une attention croissante s'est faite vers l'utilisation de cellules microbiennes entières immobilisées. Ce système évite la nécessité d'une séparation des cellules, d'une extraction des enzymes et d'une purification des enzymes avant l'immobilisation. Les cellules immobilisées sont également plus facilement applicables à la catalyse de réactions séquentielles et permettent la régénération in situ des cofac-
<EMI ID=3.1>
continue un système enzymatique multiple à l'état immobilisé, cela signifierait que le procédé de fermentation traditionnel pourrait être remplacé par un procédé utilisant des cellules immobilisées.
Les inconvénients associés à l'utilisation de cel- lules immobilisées sont le coût de la matrice de support et la
perte de l'activité catalytique, ou bien la difficulté de maintenir le caractère entier des cellules au cours de l'immobilisation. En particulier, la plupart des cellules et enzymes microbiennes sont tellement instables que le rait de les soumettre à un procédé d'immobilisation, entraîne une diminution de leurs activités enzymatiques et modifie la spécificité de leurs activités. Il
<EMI ID=4.1>
pratique sans encourir les inconvénients mentionnés précédemment. Par conséquent, quelques procédés d'immobilisation d'une appli- cation aisée et étendue ont été mis au point.
la présente invention est relative à un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes ayant une activité enzymatique sous des conditions très douces sans diminuer l'activité de celles-ci, et met en évidence certaines propriétés chimique, physiques et biologiques intéressantes des cellules microbiennes immobilisées ainsi obtenues.
Les procédés d'immobilisation de cellules micro-
<EMI ID=5.1>
à un support, le procédé de réticulation, le procédé d'emprison-
<EMI ID=6.1>
Parsi ces quatre catégories, le procédé d'emprisonnement par gel,
<EMI ID=7.1>
la matrice de gel, est largement utilisé en pratique . Le pro-
<EMI ID=8.1>
défauts suivants. Les procédés d'emprisonnement des cellules microbiennes par la formation de gel entraînent une diminution importante des activités enzymatiques de ces cellules étant
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
<EMI ID=13.1>
la température ambiante de manière à obtenir le gel emprisonnait
<EMI ID=14.1>
tée, est instable à des températures comparativement élevées
<EMI ID=15.1>
De plus, les procédés chimiques utilisés pour l'obtention de matrices de gel au moyen de réactifs de réticulation sont trop puissants et destructeurs pour être utilisés avec des substances biologiques. Ceci est le fait de la réactivité élevée des réactifs de réticulation, cela température élevée ainsi que du pH extrêmement élevé ou faible de la réaction de gélification. Par exemple, lorsqu'on utilise le procédé d'emprisonnement par gel
de polyacrylamides, le monomère d'acrylamide est polymérisé
avec du N,N'-méthylène-bis-acrylamide en présence d'un catalyseur, tel que le persulfate d'ammonium. Dans ce cas, l'enzyme est souvent inactivée par le catalyseur fortement réactif. Par conséquent, la gamme de pH et de température de la réaction de gélification doit être soigneusement choisie pour en conserver les ac-
<EMI ID=16.1>
(1973)). De plus, on doit empêcher d'utiliser les gels obtenus dans le domaine de l'industrie pharmaceutique et alimentaire
<EMI ID=17.1>
<EMI ID=18.1>
que les enzymes peuvent �tre emprisonnées à l'intérieur de matrices de gel formées de polymères d'alcool polyvinylique, en dissolvant les enzymes et les piymères d'alcool polyvinylique dans de l'eau et en les mélangeant avec de l'acide borique ou du borate de sodium pour obtenir le gel emprisonnant les enzymes. Suivant la demande da brevet citée ci-dessus, les enzymes peuvent être immobilisées sans dénaturation importante à des températures de gélification inférieuresà 45[deg.]C. Toutefois, étant donné que les gels ne peuvent être obtenus qu'à des pH alcalins, ce procédé ne peut être appliqué qu'à des enzymes stables en milieu alcalin.
<EMI ID=19.1> à et boue 904
D'autres procédés de réticulation utilisant des rayonnements d'énergie élevée tels que les rayons gamma, les rayons électro- niques ou les rayons X, sont d'une application difficile étant donné qu'ils requièrent un vaste appareillage et de grandes pré- cautions pour empêcher les effets physiologiques provenant des rayons de haute énergie (référence H. Maeda; Biotech. & Bioeng.,
15, 607 (1973".
Les enzymes ou micro-organismes immobilisés obtenus par les procédés d'emprisonnement par geh traditionnels sont lâches du point de vue physique et présentent une résistance mécanique particulièrement faible lorsqu'ils sont à l'état humide. C'est ainsi qu'il est difficile d'utiliser ces gels dans des réactions continues sur une longue période de temps. Lorsque
<EMI ID=20.1>
tinue, ils sont écrasés par la pression de l'eau et on ne peut pas obtenir un débit satisfaisant pour le mélange de réaction.
D'autres publications antérieures dans ce domaine sont résumées par F. Katchlski & I. Silman dans "Effect of the micro-environment on the mode of action of immobilized enzymes" :
Advance in Enzymology, 34, 445 (19-il".
La demanderesse a étudié de façon appronfondie
<EMI ID=21.1>
<EMI ID=22.1>
la silice est un composé qui n'est pas nocif vis-à-vis des orga- nismes biologiques et bon marché. Lorsque l'on mélange du sol
de silice et du gel de silice fabriqués par des moyens tradition-
<EMI ID=23.1>
rentes conditions, il n'est pas possible d'obtenir un lyogel
<EMI ID=24.1>
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
bien que la nature des composés polymères ait changé de façon considérable. Par exemple, lorsque l'on ajoute du sol de silice à la solution aqueuse d'alcool polyvinylique ( appelée PVA ciaprès), on assiste à la séparation de deux couches ( 5 à 20% de silice, 1 à 5% de PVA). Au-dessus de pH 5, le mélange se sépare complètement sous la forme de deux couches, l'une contenant la silice et l'autre le PVA. En-dessous de pH 5, la silice se disperse dans la couche de PVA et il se forme un produit de coacervation. Le sol ou gel transparent homogène désiré ne se forme pas à n'importe quel pH. De plus, les sels de silicates inorganiques tels que l'orthosilicate ne peuvent pas former une solution homogène avec le PVA au moyen d'une hydrolyse acide, de sorte qu'il est impossible d'obtenir le gel complexe transparent homogène désiré.
On prévoit, suivant la présente invention, un procédé de préparation d'un gel complexe hydrophile, par le mélange d'un polymère soluble dans l'eau et d'un silicate organique, en
<EMI ID=27.1>
ditions douces, de sorte que l'on obtient un gel complexe hydrophile n'ayant aucun effet nuisible sur l'activité de substances biologiques telles que les cellules microbiennes ou enzymes, et qui est utilisable pour l'immobilisation des cellules microbien-
<EMI ID=28.1>
duit pharmaceutique.
On a constaté qu'un tétraalkoxysilane tel que le
<EMI ID=29.1>
solution aqueuse d'un polymère soluble dans l'eau tel que l'al-
<EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
On a de plus constaté que le sol compléta homogène obtenu est <EMI ID=32.1>
luble dans l'eau. On a également constaté qu'on peut immobiliser des cellules microbiennes possédant une activité enzymatique en les emprisonnant à l'intérieur- de la matrice de gel sans une diminution de leur activité enzymatique étant donné que ledit
sol complexe est gélifié sous des conditions très douces.
Par conséquent, l'un des buts les plus importants de la présente invention est de prévoir un gel hydrophile qui est insolble dans l'eau.et bon marché à obtenir, et qui présente une excellente compatibilité et affinité avec la substance biologique.
Un autre but de la présente invention est de prévoir une matrice de gel hydrophile qui est facilement utilisable pour l'immobilisation de cellules microbiennes présentant une activité enzymatique.
Un autre but de la présente invention est de prévoir des moyens pour immobiliser des cellules microbiennes tout
en permettant à celles-ci de conserver au moins plus de 50% de leur activité enzymatique par rapport à l'activité que les cellules microbiennes non traitées montrent initialement.
Enfin, encore un autre but de la présente invention est de prévoir des cellules microbiennes immobilisées qui peuvent être utilisées dans un procédé continu avec un réacteur en forme de colonne, ou dans un procédé discontinu avec agitation.
D'autres détails et particularités de l'invention rassortiront de la description ci-après, donnée à titre d'exemple non limitatif et en se référant au ,dessin annexé, dent la figure unique donne la relation existant entre le taux de conversion du D-glucose
<EMI ID=33.1>
tion enzymatique. L'ordonnée représente le taux de conversion exprimé en pourcentage en poids et l'abcisse représente le nombre de fois que l'.on- utilise la préparation enzymatique. Les courbes 1 et 2 montrent les résultats obtenus respectivement avec ces cellules immobilisées et des cellules non traitées.
On obtient le gel complexe hydrophile suivant la présente invention en faisant réagir un polymère soluble dans l'eau et un tétraalkoxysilane pour former un sol homogène, ce gel étant ensuite gélifié sous des conditions très douces. Le tétraalkoxysilane est hydrolysé en présence d'un acide dans une solution aqueuse du polymère soluble dans l'eau pour fermer un sol homogène. Les cellules microbiennes présentant une activité enzymatique sont ajoutées au sol ainsi obtenu. Le mélange est gélifié en ajustant le pH pour former un lyogel complexe, ou séché après l'ajustement du pH pour former un xérogel insoluble dans l'eau,le lyogel ou xérogel emprisonnant les cellules sans diminuer leur activité enzymatique.
Les composés polymères solubles dans l'eau utilisés dans le cadre de la présente invention possèdent de nombreux
<EMI ID=34.1>
formant de fortes liaisons d'hydrogène avec les groupes -OH acides du silicate par déshydratation. On peut utiliser les composés polymères solubles dans l'eau indiqués au tableau 1.
TABLEAU 1.
(A) Composés polymères naturels et leurs dérivés.
1. Cellulose; carboxyméthylcollulose , méthylcellulose,
éthylcellulose, hydroxyéthylcellulose.
2. Amidons; hydroxyéthylamidon, carboxyméthylamidon.
3. Autres polysaccharides.-. mannan, dextran, chitosan, pullu-
lan, gomme de guar, huile de fèves de "locast ", gomme adragante, gomme de xanthane, agar, arginate de sodium.
4. Protéines; gélatine, albumine.
(B) Composés polymères synthétiques
<EMI ID=35.1>
Les polymères solubles dans l'eau préférés utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être constitués
par un alcool polyvinylique présentant un taux de polymérisation moyen situé entre 500 et 2000, et un taux de saponification de l'ordre de 70 à 100%, une gélatine du commerce de qualité cornes- tible qui a une résistance de gelée de plus de 200 g (bille)/5
<EMI ID=36.1>
boxyméthylcellulose du commerce de la qualité comestible qui a un degré de carboxylation compris entre 0,4 et 0,8 et une teneur
en sodium de l'ordre de 7,0 à 8,5%.
Le composé polymère soluble dans l'eau est solubilisé dans de l'eau à une concentration présentant une visco-
aité inférieure à 10.000 centipoises, de préférence inférieure à
<EMI ID=37.1>
viscosité dont question ci-dessus est mesurée au moyen d'un rotor
<EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
le cadre de la présente invention sont ceux répondant à la formule structurale Si(OR)4, formule dans laquelle R représente
un groupe alkyle contenant jusqu'à 12 atomes de carbone, par exemple le méthyle, l'éthyle, le propyle, le butyle, l'octyle
ou le lauryle. On utilise de préférence pour obtenir le sol complexe homogène des composés dans lesquels R représente un
groupe alkyle contenant jusqu'à 3 atomes de carbone. Le tétraéthoxysilane se révèle le composé le plus approprié.
On mélange le composé polymère soluble dans l'eau
avec le tétraalkoxysilane mentionné précédemment, et on ajuste ensuite le pH du mélange en-dessous de 3 avec de l'acide ou un <EMI ID=40.1>
sel à caractère acide qui n'exerce aucun effet préjudiciable sur les activités enzymatiques des cellules microbiennes. Les acides ou sels acides que l'on peut utiliser dans le cadre de la présente invention sont donnés au tableau 2.
TABLEAU 2.
<EMI ID=41.1>
(B) Acides organiques : acide acétique, acide glutamique, acide <EMI ID=42.1>
que, acide citrique, acide tàrtarique.
<EMI ID=43.1> ammonium.
La quantité de tëtraalkoxysilane nécessaire au mélange mentionné précédemment avec la solution aqueuse de poly- mère soluble dans l'eau varie suivant le type de composé silanique et suivant les propriétés du polymère soluble dans l'eau utilisés. La quantité de SiO contenue dans le tétraalkoxysilane, calculée
<EMI ID=44.1>
à 300% (poids/poids) par rapport au poids sec du polymère solu-
<EMI ID=45.1>
<EMI ID=46.1>
la solubilité dans l'eau du gel formé s'accroît d'une façon signi-
<EMI ID=47.1>
le gel devient cassant. Les propriété du gel dépendent de la
<EMI ID=48.1>
que du polymère soluble dans l'eau. Par exemple, on peut utiliser du PVA ayant un taux de polymérisation moyen compris entre 500 et 2000 et un taux de saponification de l'ordre de 70 à 100%,
<EMI ID=49.1>
manière particulièrement préférée supérieure à 50%, dans le cas d'un PVA totalement saponifié, tandis qu'il est nécessaire <EMI ID=50.1>
un taux de saponification inférieur.
Au cours du stade initial du procéda réactionnel,
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
<EMI ID=53.1>
<EMI ID=54.1>
à la température ambiante tout en le chauffant à une température
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1> <EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
Le sol obtenu peut être conservé pendant une_longue
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
moL:: .
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
<EMI ID=66.1>
Les gels complexes formés sous différentes conditions à partir
du rame composé polymère soluble dans l'eau ont différents degré
de turbidité. Par exemple, le sol complexe formé de gélatine et de tétraéthoxysilane est converti en un gel transparent en-dessous!
de pH 4. Le gel le plus trouble est obtenu à pH 5, et au-dessus
de pH 7 le gel devient semi- transparent.
Les gels complexes obtenus sont ordinairement clas-
sés dans la catégorie des lyogels suivant qu'ils contiennent une grande quantité d'eau ou dans la catégorie des xérogels suivant qu'ils contiennent une petite quantité d'eau. Dans ce dernier type de gel, l'humidité du gel est presque complètement éliminée par le procédé de séchage. Suivant la présente invention, les composants du sol ne se séparent pas, mais conservent l'état complexe homogène tout au long de la formation du sol, de la forma- tion du gel et de la formation du xérogel. Les xérogels obtenus sont insolubles ou difficilement solubles dans l'eau mais ne montrent aucune propriété hydrophile.
Ainsi que cela est indiqué dans les exemples donnés ci-après, les propriétés du xérogel obtenus dépendent de la nature du polymère soluble dans l'eau utilisé et également du rapport du
<EMI ID=67.1>
ainsi que le degré de résistance et de fragilité du gel augmentent
<EMI ID=68.1>
devient plus flexible lorsque l'on accroît la quantité de polymère. En qui concerne l'effet du polymère solfie dans l'eau
<EMI ID=69.1>
tion du taux de saponification du PVA utilisé. Dans le cas d'un
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
<EMI ID=72.1> <EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
petite mais doit être d'au moins de plus de 20% en poids/poids.
Suivant la présente invention, les cellules microbiennes douées d'activités enzymatiques peuvent être immobilisées sous des conditions très douces en les emprisonnant à l'intérieur de la matrice du gel complexe hydrophile mentionné précédemment obtenu à partir du composé polymère soluble dans l'eau et du silicate. Les cellules microbiennes sont ajoutées au sol homo- gène mentionné ci-dessus sans aucun ajustement du pH ou à des
sels basiques comme indiqué au tableau 3.
TABLEAU 3.
<EMI ID=75.1> <EMI ID=76.1> <EMI ID=77.1>
Les cellules microbiennes que l'on peut utiliser
dans le cadre de la présente invention sont des cellules sèches, des cellules humides provenant d'un bouillon par centrifugation
ou filtration ou le bouillon cultivé lui-même. Ces cellules mi- crobiennes sont classées en cinq groupes, à savoir les bactéries, les actinomycètes, les champignons, les levures et les algues.
Les bactéries du premier groupe, appartenant à la classe des schizomycètes,sont du genre :Pseudomonas, Acetobacter, Glucono-
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
etc. Les Actinomycètes du second groupe, appartenant à la classe
<EMI ID=80.1>
<EMI ID=81.1> <EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
ARX, "The genera of Fungi sporulating in pure culture" Verlag von J. Cramer,et H.L. Barnett & Barry B. Hunter, "Illuatrated gênera of Imperfect Fungi" 3ème édition, (1970); Burgess Publiahing Company) . Les levures du quatrième groupe, appartenant à la classe des Ascomycètes, sont du genre : Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenula: Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Kloechera, etc (J. Lodder, "The yeast A taxonomic study" 2ème édition (1970); North-Holland Publishing Company). Les algues du cinquième groupe sont du genre unicellulaire
<EMI ID=84.1>
Spirulina en ce qui concerne les algues bleu-vert ( H. Tamiya ,
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
La plupart de ces cellules microbiennes sont des
<EMI ID=87.1>
laires des micro-organismes individuels appartenant aux groupes
<EMI ID=88.1>
ou la largeur de chaque cellule utilisée dans le cadre de la présente invention est de l'ordre de 1 à 20 microns. Les cellules microbiennes peuvent être dispersées dans des solvants aqueux. Certains types d'actinomycètes du.second groupe et de champignons du troisième groupe ont une longueur supérieure
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
à l'intérieur de la matrice de gel dont il a été question pré-
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1> <EMI ID=94.1> sont de préférence broyées pour ne pas avoir plus de 20 microns.
On peut -utiliser, à cet effet, une homogénéisation mécanique dans l'eau.
Les cellules microbiennes utilisées dans le cadre de la présente invention, choisies parmi les cinq groupes mentionnés précédemment, possèdent plus d'une activités enzymatiques. Les enzymes sont classées d'après les cinq groupes suivants.
TABLEAU 4.
<EMI ID=95.1> lase, phénol oxydase, monoamine oxydase, cytochrome c réductase.
(B) Transférases Glutamate-oxaloacétate-trans-aminase, macrolide 3-acyltransaminase, macrolide 3-acyltransférase à 16 chaînons, ATB: nucléoside-5' monophosphate pyrophosphotransférase. <EMI ID=96.1> lipase, lactase, pénicilline amidase, phosphatase alcaline, amino acylase, urêase, cellulase. <EMI ID=97.1> <EMI ID=98.1> naso.
Les enzymes utilisées dans le cadre de la présente invention sont des enzymes intracellulaires existant à l'intérieur de la cellule ou du mycélium microbien, ou à l'intérieur de l'organella d'organismes biologiques. Dans la présente invention, le terme "activité" englobe non seulement l'activité enzymatique mais également d'autres activités biologiques, telles que, par exemple, les activités en tant qu'inhibiteurs, coenzymes, antibiotiques, antigènes, anticorps ,etc.
<EMI ID=99.1>
microbiennes doit être choisi en tenant compte de la stabilité
<EMI ID=100.1>
ajuste celui-ci à pH 4 - 8, de préférence à pH 5 - 7. Lors
de l'immobilisation des cellules microbiennes, il n'est pas nécessaire dans la plupart des cas d'ajuster le pH étant donné
que les cellules microbiennes présentent elles-mêmes une activité de tampon. Le pH du mélange mentionné précédemment tombe ordinairement dans la gamme de 5 à 6,5 après l'addition des cellules.
Le poids sec deq cellules microbiennes à ajouter est inférieur à 1000% (poids/poids), de préférence de l'ordre de
20 à 500% (poids/poids ), par rapport au poids sec du sol complexe homogène. Après l'addition . des cellules microbiennes au sol complexe homogène, on agite à fond le mélange de manière à le disperser de façon homogène. La réaction de gélification du sol contenant lea cellules microbiennes se produit à n'importe quelle température. Toutefois, étant donné que lea enzymes sont instables aux températures supérieures, on réalise la réaction de gélifica-
<EMI ID=101.1>
entre 10[deg.]C et 40[deg.]C. On réalise ordinairement la réaction de
<EMI ID=102.1>
le sol se gélifie complètement à pH 6,0 par une agitation continue à la température ambiante pendant 10 à 20 minutes.
Un des avantages les plus importants de la présente invention consiste en l'utilisation de conditions douces pour l'immobilisation, conditions sous lesquelles les activités enzymatiques peuvent être entretenues tout au long de la totalité du procédé sans une inactivation importante.
Le gel complexe obtenu renfermant les cellules microbiennes est séché et converti à la forme désirée. On réalise <EMI ID=103.1>
rativement stable et l'on peut réaliser la totalité du procédé
de la présente invention à la température ambiante . Pour ce
qui est des cellules bactériennes instables telles celles qu'on utilise pour la synthèse enzymatique de L-tyrosine, on réalise
la totalité du procédé sous une température inférieure à 5[deg.]C afin
de maintenir les activités enzymatiques et l'on utilise de préférence pour le procédé de séchage une dessication par évapora- tion de la glace. Aussi longtemps que la température est maintenue dans la gamme des températures mentionnées ci-dessus, on ne re- marque pratiquement aucune inactivation de l'enzyme. Pour amener
le lyogel mentionné ci-dessus immobilisant les cellules microbiennes sous différentes formes, on utilise, suivant la présente invention, les méthodes traditionnelles. On peut réaliser un moulage avant ou après le séchage. En particulier, les solvants organiques hydrophiles ou hydrophobes dans lesquels le lyogel com-
plexe est pratiquement insoluble, peuvent être utilisés pour le
i moulage. On peut utiliser les solvants organiques suivants donnés
au tableau 5.
TABLEAU 5.
(A) Alcools; alcool méthylique, alcool éthylique, alcool n-pro- ' pylique, alcool n-butylique, éthylèneglycol, glycérol. <EMI ID=104.1> <EMI ID=105.1>
(D) Alcanes : n-heptane, n-paraffine.
(E) Aromatiques : Benzène, toluène, xylène.
(F) Autres : chlorure de méthylène.
Dans le cadre de la présente invention, les formes des cellules microbiennes immobilisées par le gel peuvent être du
<EMI ID=106.1>
lier, elles peuvent consister en dès sphères, des granules, des
I
boulettes, des filaments, etc. Lorsque l'on insère les cellules .i <EMI ID=107.1>
on obtient de bons résultats en utilisant la réaction continue.
i
<EMI ID=108.1>
î peuvent avoir la forme d'une pellicule ou d'une bande et dans d'autres cas, elles consistent en une poudre eudes granules irré- guliers. L'épaisseur et/ou le diamètre moyens du gel moulé contenant les cellules microbiennes peuvent se situer entre 0,2 et
5 mm, et de préférence entre 0,4 et 1,0 mm. Lorsque l'on utilise des gels moulés ayant cette épaisseur, on peut obtenir un contact efficace entre les cellules inmobilisées et leur substrat.
De plus, on peut également obtenir un débit approprié pour le mélange de réaction à travers le réacteur à colonne.
La forme désirée peut être obtenue par une coulée à travers une fente étant donné que le lyogel complexe renfermant
les cellules microbiennes est une pâte molle. Par exemple, le
lyogel de la présente invention est converti en un long cylindre
au moyen d'une coulée à travers une fente dans un solvant organique ou à l'air, et est annuité séché. Le lyogel peut également
<EMI ID=109.1>
<EMI ID=110.1>
obtenus de la sorte présentent des aires superficielles spécifiques élevées.
On peut également utiliser le séchage par pulvérisation pour obtenir les formes désirées. Les granules obtenus présentent des airas superficielle. spécifiques élevées et de
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
dustrielle, notamment pour une question d'économie.
On obtient également de bons résultats, suivant la
<EMI ID=113.1>
<EMI ID=114.1>
sante même ai l'on applique le procédé à des cellules microbiennes instables à la chaleur indiqué aux exemples 16 et 17 décrits
<EMI ID=115.1>
<EMI ID=116.1>
Une autre forme appropriée de gel est le gel pelli-
<EMI ID=117.1> <EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
<EMI ID=121.1>
continues et discontinues. Par exemple, on peut utiliser les cel-
<EMI ID=122.1>
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1> ........
élevé et avec divers degrés de concentration 'ionique.
Les cellules microbiennes immobilisées suivant la présente invention peuvent être utilisées comme catalyseurs pour la conversion biochimique de divers substrats non seulement dans un système de réaction à colonne mais également dans un système de réaction à fractionnement discontinu. En utilisant le système de réaction à fractionnement discontinu et traditionnel avec agitation, on ne remarque aucune perte importante de cellules microbiennes à partir du gel ou destruction du gel moulé. De plus,
on peut récupérer le composé polymère soluble dans l'eau à partir du gel immobilisant les cellules microbiennes et l'utiliser de façon répétée jusqu'à ce que les activités aient diminué après une longua période d'utilisation. Le composé polymère soluble
<EMI ID=126.1>
<EMI ID=127.1>
en réparant les cellules par centrifugation ou filtration, -et en ajustant ensuite le pH.
Les exemples suivants illustrent des modes de réalisation de la présents invention mais on notera qu'ils sont donnas à titre d'exemples non limitatifs et qu'ils ont surtout pour but d'illustrer davantage les caractéristiques du procédé de l'invention.
Exemple 1.
On mélange et on agite 50 g d'une solution aqueuse
<EMI ID=128.1>
<EMI ID=129.1>
HCl IN. Le mélange trouble se transforme graduellement en un sol complexe homogène transparent, incolore à la température am-
<EMI ID=130.1> w va1 v w ws sw
un, lyogel complexe homogène transparent, incolore sans aucune séparation entre les composants du lyogel, tels que le PVA ou le tétraéthoxyailane. Le sol homogène est également gélifié sans neutralisation en le stockant pendant une longue période de temps pour former un lyogel complexe, qui est également transparent, homogène et insoluble dans l'eau à la température ambiante.
On sèche le lyogel complexe homogène obtenu par ventilation � la température ambiante de manière à obtenir un xérogel complexe homogène transparent, qui est insoluble dans l'eau du robinet.
Le xërogel complexe ainsi obtenu gonfle sans que ses composants ne se séparent, lorsqu'on le traite dans de l'eau bouillante pendant une heure. Dans le cas d'un xérogel complexe obtenu après neutralisation et séchage par ventilation comme mentionné précédemment, la quantité solubilisée est* 50% par rapport au poids initial du xërogel complexe, et le degré de gonflement est de l'ordre de 30 fois dans l'eau bouillante. Dans le cas du sol complexe sana neutralisation, la quantité solubilisée est de 30% et le degré de gonflement est de l'ordre de 12 fois dans l'eau bouillante.
Exemple 2.
En procédant comme décrit dans l'exemple 1, à l'ex-
<EMI ID=131.1>
lyogel complexe homogène. Le processus réactionnel, le sol inter-
<EMI ID=132.1>
ceux de l'exemple 1. Le xérogel compila obtenu avec ou sans neutralisation est insoluble dans l'eau du robinet. La quantité solubilisée est inférieure à 3% et le degré de gonflement est
<EMI ID=133.1>
<EMI ID=134.1>
<EMI ID=135.1>
<EMI ID=136.1>
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
similaire (c'est-à-dire qui est incolore et transparent) à celui
de l'exemple 1. Le xérogel complexe obtenu par la suite, avec ou sans neutralisation, est plus dur et plus cassant que celui de l'exemple 1. Le gel est insoluble dans l'eau du robinet, la quantité solubilisée est de l'ordre de 2% et le degré de gonflement d'environ 2 fois dansl'eau bouillante.
Exemple 4.
En procédant comme décrit dans l'exemple 1, à l'exception que l'on ajoute 2 g de tétraéthoxysilane dans 5 g d'une solution aqueuse contenant 10% de PVA (taux de polymérisation de
1700 et taux de saponification de 87), on obtient un lyogel complexe homogène, qui a un aspect très similaire à celui de l'exemple
1. Le xérogel complexe formé avec ou sans neutralisation ast insoluble dans l'eau du robinet, la quantité solubilisée est inférieure à 9% et le degré de gonflement est inférieur à 6 fois
dans l'eau bouillante.
Exemple 5.
On effectue une réaction similaire à celle de
l'exemple 4, en utilisant 10 g de tétraéthoxysilane et 5 g d'une solution aqueuse contenant 10% de PVA (taux de polymérisation de
1700 et tauxcb saponification de 87). Les caractéristiques de la
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
xérogel complexe final obtenu avec ou sans neturalisation est in- soluble dans l'eau du robinet, sa quantité solubilisée est de
<EMI ID=141.1>
dans l'eau bouillante.
<EMI ID=142.1>
<EMI ID=143.1>
tion aqueuse contenant 5% de PVA (taux de polymérisation de
1100, complètement saponifié ) et de 0,5 g de chlorure d'aluminium.
On poursuit l'agitation pendant environ 2 heures et l'on obtient un sol complexe homogène, transparent et incolore. Le sol ainsi obtenu est séché sous ventilation et l'on obtient une pellicule
de xérogel complexe homogène transparent. Cette pellicule est insoluble même par extraction dans de l'eau bouillante et conserve sa forme pelliculaire de départ. On neutralise le sol ainsi ob-
<EMI ID=144.1>
une couleur blanche. On le sèche ensuite par ventilation et l'on
<EMI ID=145.1>
dans l'eau du robinet et conserve sa forme initiale dans l'eau bouillante.
Exemple 7.
<EMI ID=146.1>
de gélatine dans 66 g d'eau, on agite à fond tout en chauffant et l'on ajoute 15 g de tétraéthoxysilane. Après avoir ajusté le pH
à 3 ou en-dessous de 3 avec du HCl dilué, on agite le mélange de façon continue à la température ambiante pendant 3 heures, période après laquelle le mélange devient transparent. Le sol complexe homogène ainsi obtenu est laissé au repos à la température ambiante ot l'on obtient un lyogel complexe homogène, transparent. Après axir ajusté le pH du lyogel avec du NH OH dilué, le gel complexe devient trouble à un pH d'environ 4,5 et très trouble à un pH d'environ 5 à 6, mais redevient à nouveau semi-transparent aux pH au-desus de 7. L'homogénéité est maintenue et l'on ne remarque aucune couche d'eau. La valeur du pH influence la période de repos nécessaire à la formation du lyogel complexe. Par un séchage des sols complexes homogènes et des lyogels complexes homogènes, <EMI ID=147.1>
<EMI ID=148.1>
rents degrés de turbidité en fonction dé la variation du pH
(transparents aux pH acides, trouble et laiteux aux pH de l'ordre de 5 à 6, et semi-transparent au-dessus de pH 8). Le xérogel est insoluble dans l'eau à la température ambiante et gonfle dans l'eau bouillante sans perdre sa forme initiale.
Exemple 8.
On dilue 100 g d'une solution aqueuse contenant 5%
<EMI ID=149.1>
gène tout en chauffant, et l'on ajoute 15 g de tétraéthoxysilane.
<EMI ID=150.1>
on agite le mélange à la température ambiante pendant environ 2 heures jusqu'à ce que l'on obtienne un sol complexe homogène, transparent. On neutralise ce sol avec du NaOH dilué et on obtient après environ 30 minutes un lyogel complexe homogène. Soit le séchage sous ventilation du sol complexe homogène sans neutralisation, soit le séchage sous ventilation du lyogel complexe homogène obtenu après neutralisation, mène à la formation d'un xérogel trouble, laiteux qui se révèle cassant lorsqu'on y applique une force physique. Seulement une petite quantité d'amidon est extraite du xérogel dans l'eau courante et 50% de cet amidon sont extraits dans l'eau bouillante. La forme initiale est conservée dans les deux cas et on observe un gonflement, en particulier dans l'eau bouillante.
Exemple 9.
On ajoute 100 g d'une solution aqueuse contenant 5% de carboxyméthylcollulose dans 66 g d'eau , on agite à fond le mélange à une température de 45[deg.]C, et l'on ajoute ensuite au mélange 20 g de tétraéthoxysilane. Le pH du mélange est ajusté
<EMI ID=151.1> <EMI ID=152.1>
<EMI ID=153.1>
<EMI ID=154.1>
un xérogel complexe homogène, transparent. Le xérogel complexe
<EMI ID=155.1>
rature ambiante. Même dans l'eau bouillante, il est pratiquement insoluble et le degré de gonflement est de l'ordre d'un facteur de 2.
Exemple 10.
<EMI ID=156.1>
solution aqueuse contenant 5% de polyacrylate, on dilue avec 66 g d'eau et on agite le mélange à la température ambiante pendant environ 2 heures. Le mélange prend graduellement la forme d'un sol complexe homogène transparent, que l'on neutralise avec 17 g
<EMI ID=157.1>
complexe semi-transparent. Le sol complexe homogène formé sans neutralisation et le lyogel complexe homogène obtenu par neutralisation sont séchés et ce pour obtenir respectivementdes xérogels
<EMI ID=158.1>
obtenu se dissout dans l'eau bouillante et l'autre moitié reste sous la forme d'un hydrogel mou, insoluble dans l'eau bouillante.
Exemple 11.
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
culaire de 4000), on dilue avec 66 g d'eau et on agite le mélange à la température ambiante. Par l'addition de lg de HCl IN sur
<EMI ID=161.1>
homogène transparent et incolore. On neutralise ce sol avec du
<EMI ID=162.1> <EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
<EMI ID=166.1>
mé se dissolvent en laissant un gel trouble. Ce xérogel solide a plutôt tendance à se détruire.
Exemple 12.
On mélange 100 parties d'une solution aqueuse contenant 10% de PVA (taux de polymérisation de 1700 et taux de saponification de 99,5) avec 321,5 parties deau distillée, 28,5
<EMI ID=167.1>
pendant plus de 2 heures à la température ambiante et l'on obtient un sol homogénéisé.et transparent ayant un pH d'environ 3, con-
<EMI ID=168.1>
Si02). Une partie de levure de boulangerie, sèche, disponible dans le commerce (Saccharomyces cerevisiae) est mise en suspension
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1>
levure par agitation, on ajuste le pH à 7,0 avec une solution de
<EMI ID=171.1>
ché spontanément à la température ambiante. On obtient une pellicule de couleur brun-jaunâtre contenant les cellules * levure . Une partie de la pellicule immobilisant un g des cellules de levure est prélevée et incubée dans 50 g d'une solution aqueuse
<EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
se dégager après quelques minutes et après 30 minutes, une grande quantité de gaz se dégage de la surface entière de la pellicule.
<EMI ID=174.1>
<EMI ID=175.1>
de 30 heures. On suit la réaction en mesurant la diminution de <EMI ID=176.1>
<EMI ID=177.1>
se réalise proportionnellement au temps réaction. On décèle une odeur légèrement parfumée particulière à la fermention alcoolique. Une augmentation de la turbidité de la solution de glucose, qui est considérée comme provenant du fait que les
<EMI ID=178.1>
servée et, de ce fait, le mélange est presque transparent. A titre de contrôle, on effectue la même réaction en utilisant
1 g de cellules de levure déséchées non immobilisées. Aux premiers stades de la réaction, il se dégage une quantité légère-
<EMI ID=179.1>
<EMI ID=180.1>
<EMI ID=181.1>
<EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1>
<EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
<EMI ID=186.1>
légère agitation est requise pour que la réaction se poursuive. D'après les résultats précédents, il est démontre que les cellules microbiennes sont fermement immbbilisées par le procédé de la présente invention tout en entretenant une activité de fermentation égale à celle des cellules natives.
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
celui décrit dans l'exemple <1>2. Quatre parties de levure des-
<EMI ID=189.1>
sont mises en suspension dans 5 parties d'eau. On mélange la <EMI ID=190.1>
étale le gel sur une plaque et. on le sèche par ventilation de manière à obtenir une pellicule de couleur brun-jaunâtre contenant lea cellules de levure. Une languette de la pellicule contenant
1 g de cellules immobilisées est découpée et incubée dans 50 g d'une solution aqueuse contenant 5% de glucose à 30[deg.]C pour réaliser la fermentation comme dans l'exemple 12- Une grande quantité de gaz C02se libère même dans les premiers stades de l'incubation, ainsi qu'onl'a observé lors de l'expérience témoin.
Une fois que la fermentation est terminée, la pellicule est prélevée du milieu et plongée à nouveau dans une autre solution aqueuse de 50 g contenant 5% de glucose, une production de gaz
<EMI ID=191.1>
portante que celle observée lors de l'essaiprécédent réalisé avec les cellules natives. On répète cette fermentation 5 fois, et
<EMI ID=192.1>
<EMI ID=193.1>
de fermentation en utilisant 1 g de cellules non immobilisées
<EMI ID=194.1>
cellules immobilisées. Lors de ces essais, les cellules de levure sont recueillies par centrifugation et remises en suspension
<EMI ID=195.1>
provenant des 50 g de la solution aqueuse contenant 5% de glu- cose atteint plus de 85% de la valeur théorique.
Exemple 14.
<EMI ID=196.1>
de PVA (taux de polymérisation de 2000 et taux de saponification
<EMI ID=197.1>
éthoxysilane et une partie de HCl IN, et l'on agite ensuite à
<EMI ID=198.1> <EMI ID=199.1>
de l'ordre de 3, contenant 5% de matières solides. Deux parties de levure de boulangerie sèche, disponible dans le commerce
(Saccharomyces cerevisiae) sont mises en suspension dans 4 parties d'eau. On mélange la suspension avec 20 parties du sol complexe de PVA-Si02 et on agite à fond. Le gel ainsi obtenu est étalé sur une plaque et séché par ventilation à la température àmbiante de manière à obtenir une pellicule.de couleur brun-jaunatre contenant 1 g de cellules de levure. On utilise cette pellicule contenant 1 g de cellules de levure pour un essai de fermentation réalisé suivant le processus indiqué à l'exemple 12. La fermentation se fait à un taux intermédiaire entre celui de l'exemple
12 et celui de l'exemple 31. C'eqt-à-dire que la quantité de gaz
<EMI ID=200.1>
inférieure à celle des cellules non immobilisées, mais que la quan-
<EMI ID=201.1>
85% de la valeur théorique. Ce résultat est presque comparable au résultat obtenu avec les cellules non immobilisées.
Exemple 15.
On mélange 100 parties d'une gélatine alimentaire du commerce avec 15 parties de tétraéthoxysilane, 66 parties
<EMI ID=202.1>
<EMI ID=203.1>
obtenir un sol complexe homogène et transparent avec un pH de l'ordre de 3, contenant 5% de matières solides. Deux portion de levure de boulangerie desséchée, disponible dans la commerce sont
<EMI ID=204.1>
<EMI ID=205.1>
<EMI ID=206.1>
est plus cassante et friable que la pellicule de PVA-Si02 obtenue
<EMI ID=207.1>
pellicule mentionnée ci-dessus contenant 1 g de cellules lisées, on la plonge dans 50g d'une solution aqueuse contenant 5% de glucose, et on réalise l'essai de fermentation d'une manière
<EMI ID=208.1>
l'essai de fermentation et atteint plus de 85% de la valeur théorique. Au cours de l'essai de fermentation, on ne remarque aucune cellule microbienne s'échappant de la pellicule. Ce fait montra que les cellules de levure sont solidement immobilisées par le procédé de l'invention.
Exemple 16.
<EMI ID=209.1>
similaire à celle de l'exemple 12, et l'on cultive du Erwinia herbicola (ATCC 21434), une souche produisant de la 0 -tyrosinase, dans le milieu de culture suivant.
Composition du milieu de culture pour les bactéries
<EMI ID=210.1>
<EMI ID=211.1>
<EMI ID=212.1>
4 g de cellules cultivées (poids sec : 1 g) provenant de la bac-
<EMI ID=213.1>
centrifugation et immobilisées de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1, à l' exception que l'on procède à une dessication par évaporation de la glace. Toutes les étapes de cette préparation sont réalisées en-dessous de 5[deg.]C. L'activité
<EMI ID=214.1>
tionnées précédemment, contenant 20 mg de cellules bactériennes, est déterminée en mesurant la L-tyrosine synthétisée dans le milieu de synthèse de L-tyrosine suivant .
Composition du milieu pour la formation de L-tyrosine.
<EMI ID=215.1>
Comme indiqué au tableau 6, les activités relatives
<EMI ID=216.1>
lisées préparées dans l'exemple 16, sont de l'ordre de 85% ou plus de l'activité du témoin utilisant des cellules bactériennes non immobilisées. Les activités des cellules bactériennes immobilisées <EMI ID=217.1>
<EMI ID=218.1>
lange de réaction utilisé pour la synthèse de L-tyrosine de façon continue à raison de 5 ml/heure pour synthétiser la L-tyroaine. On obtient un régime constant dans la colonne en ce qui concerne la synthèse de L-tyrosine après 12 heures d'une alimentation continue en milieu. Ce régime est maintenu même après 24 heures aprèa avoir commencé l'alimentation en milieu, et le taux de la réaction est maintenu à environ 0,6 mg/ml.
<EMI ID=219.1>
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1>
<EMI ID=222.1>
<EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1> obtenue en utilisant du chlorure de méthylène présente une activité <EMI ID=225.1> <EMI ID=226.1>
<EMI ID=227.1>
<EMI ID=228.1>
<EMI ID=229.1>
<EMI ID=230.1>
<EMI ID=231.1>
<EMI ID=232.1>
<EMI ID=233.1>
de saponification de 99,5) sont mélangées avec 231,5 parties
<EMI ID=234.1>
<EMI ID=235.1>
température ambiante de manière à obtenir un sol homogénéisé transparent (appelé ci-après sol complexe) contenant 5% de matières solides, et ayant un pH aux alentours de 3. Cinq parties en poids de cellules microbiennes du type glucose isomérase disponibles dans le commerce (Nagase Sangyo CO., Ltd; dénomination commerciale ; GI-150; classification : Streptomyces albus
<EMI ID=236.1>
<EMI ID=237.1>
pendant 3 minutes. Ensuite, on ajoute la suspension préparée dans 20 parties en poids du sol complexe et on la disperse par
<EMI ID=238.1>
à former un gel. Le gel est versé dans une boite de Pétri et
séché sous ventilation à une température de 55[deg.]C, et l'on obtient une pellicule de couleur brune dans laquelle sont enfermées les cellules. La pellicule est broyée dans un mortier, et tamisée au moyen d'un tamis à ouvertures de 0,191 mm de manière à obtenir de fins granules. Les cellules microbiennes de glucose isomérase
<EMI ID=239.1>
unités par gramme et l'activité de la glucose isomérase est de
<EMI ID=240.1> Dea cellules immobilisée" granulaires contenant
1 g de cellules séchées sont incubées avec 100 ml d'une solution
<EMI ID=241.1>
24 heures. Après l'incubation, les cellules immobilisées sont séparées par filtration et utilisées de façon répétée pour la même réaction, à savoir six fois, de manière à examiner la sta-
<EMI ID=242.1>
rées. On incube un gramme de cellules natives sur une base sèche sous les mêmes conditions. Les résultats sont indiqués à la figure annexée. L'ordonnée du graphique représente le pourcentage de D-fructose par rapport à la teneur totale en matières solides du mélange de réaction après chaque réaction, et l'abcisse représente le nombre de fois que l'on a utilisé la préparation enzymatique dans la réaction. On constate sur le graphique que la quan-
<EMI ID=243.1>
ae trouvant dans la réaction initiale après 6 réutilisations dans
<EMI ID=244.1>
tié de la quantité se trouvant dans la réaction initiale après
<EMI ID=245.1>
sées.
Exemple 19.
50 g de cellules de glucose isomérase immobilisées obtenues de la même façon que dans l'exemple 18, sont introduits:. dans une colonne de 2,5 x 20 cm maintenue à une température de
<EMI ID=246.1>
<EMI ID=247.1>
<EMI ID=248.1>
<EMI ID=249.1>
<EMI ID=250.1>
<EMI ID=251.1> <EMI ID=252.1>
<EMI ID=253.1>
Le SV 1 est défini comme étant le taux d'écoulement correspondant à l'écoulement d'un volume du mélange de
<EMI ID=254.1>
dans la colonne, endéans une heure.
Exemple 20.
Des cellules microbiennes immobilisées ayant l'activité de la glucose isomérase, obtenues par le même procédé que celui décrit dans l'exemple 18, sont chargées dans un réacteur à colonne et l'on mesure les chutes de pression par écoulement
<EMI ID=255.1>
Enzyme Technology", p. 225 (1975) édité par H. Weethall et S.
<EMI ID=256.1>
des cellules microbiennes immobilisées présentant l'activité de
<EMI ID=257.1>
<EMI ID=258.1>
réaction est de 6,4 cm. On y fait passer de l'eau à raison de
58 cm par heure par application d'une méthode d'écoulement par remontée. On constate que la chute de pression A P/L est de 0,315 mH20/ m de lit. Un gel de polyacrylamide contenant des cellules microbiennes immobilisées contenant de la glucose isomérase
<EMI ID=259.1>
5,438 mH-0/ m de lit, soua les mêmes conditions.
Exemple 21,
<EMI ID=260.1>
celle décrite à l'exemple 18. On cultive des champignons fila-
<EMI ID=261.1>
<EMI ID=262.1>
<EMI ID=263.1>
<EMI ID=264.1> Composition du milieu de culture pour ;la production
<EMI ID=265.1>
<EMI ID=266.1>
Le bouillon est recueilli par filtration, 4 g de cellules humides (1 g à l'état sec) sont mises en suspension dans
10 ml d'un tampon salin de phosphate 0,1 M à pH 7,0, et on broie le mycélium au moyen d'un homogénéiseur à 18.000 tours par minute pendant 3 minutes. La suspension obtenue est ajoutée à 10 g de sol complexe de PVA-Si02 et agitée à la température ambiante pendant 15 minutes. Le mélange est versé dans une boite de Pétri et ventilé à la température ambiante de sorte que l'on obtient 1,5 g d'une pellicule de cellules immobilisées de couleur brun-jaunâtre. Un gramme de cellules humides non immobilisées correspond à 240 unités d'activité de glucose oxydase tandis que un gramme des cellules immobilisées obtenues contient 510 unités de cette activité.
La récupération de l'activité de la glucose cxidase par l'intermédiaire de ce procédé d'immobilisation est de 87% par-gramme de cellules.
Une unité d'activité de glucose oxydase est définie
<EMI ID=267.1>
glucose en une minute.
<EMI ID=268.1>
<EMI ID=269.1>
<EMI ID=270.1>
pouvoir être agitée s,sont mélangées avec 15 parties de tétra-
<EMI ID=271.1>
étant agité pendant plus de 2 heures de manière à former un sol complexe homogène, transparent. Le sol obtenu contient 5% de
<EMI ID=272.1>
du Chlorella fusca produisant de la nitrite réductase dans les cellules est cultivée dans le milieu suivant avec aération à une
<EMI ID=273.1>
Composition du milieu de culture pour la production de nitrite réductase.
<EMI ID=274.1>
Les cellules cultivées sont recueillies par filtration, et 6 g de cellules à l'état humide ( 1 g sur une base pondérale sèche)
<EMI ID=275.1>
est mélangée avec 10 ml de sol complexe de gélatine-Si02 et
agitée à la température ambiante pendant 15 minutes. Le mélange obtenu est versé dans une boite de Pétri et séché par congéla-
tion de la glace pour obtenir 2,1 grammes d'une pellicule vert- foncé contenant les cellules immobilisées. Un gramme de cellules humides non immobilisées contient 2,6 unités d'activité <EMI ID=276.1>
de l'activité de nitrate de réductase par ce procédé d'immobilisation est de 83% par gramme de cellules.
Une unité d'activité de nitrate réductase est définie comme étant la quantité de l'enzyme qui réduit une micromole de nitrite à 30[deg.]C pendant 1* minute.
Exemple 23.
100 parties d'une solution aqueuse contenant 10%
de PVA( taux de polymérisation de 1700 ; taux de saponification de 99,5) sont mélangées avec 221 parties d'eau distillée, 36 parties de tétrapropylsilicate et 3 parties de HCl IN, le tout étant agité à fond en chauffant à 50[deg.]C pendant plus de 2 heures de manière à obtenir un sol complexe homogène, tranparent. Le sol obtenu contient environ 5% de matières solides.
Une partie de levure de boulangerie séchée du commerce (Oriental Yeast Company., Ltd.) est mise en suspension dans 2 parties d'eau, la suspension est mélangée avec le sol obtenu ci-dessus et dispersée à fond par agitation. On ajuste le pH à
<EMI ID=277.1>
de Pétri et on le ventile à une température en-dessous de 30[deg.]C de manière à obtenir une pellicule de cellules immobilisées de couleur brun-jaunâtre. On réalise un essai de fermentation dans 50 g d'une solution aqueuse contenant 5% de glucose à 30[deg.]C, en utilisant une partie de la pellicule préparée contenant 1 g de cellules séchées.
La fermentation se poursuit normalement et on observe un dégagement
<EMI ID=278.1>
la valeur théorique. De plus, on ne remarque aucune perte de cellules au cours de la réaction, de sorte que l'on n'observe aucune turbidité dans le mélange de réaction tout au long de l'essai de fermentation.
<EMI ID=279.1>
<EMI ID=280.1>
de PVA (taux de-polymérisation de 1700; taux de saponification de 99,5) sont mélangées avec 27 parties d'eau distillée, 27 par-
<EMI ID=281.1>
à fond à la température ambiante pendant plus de 2 heures de manière à former.un sol transparent homogène. Le sol obtenu a une teneur en matières solides de 5% Deux parties de cellules microbiennes du commerce ayant l'activité de la glucose isomérase
<EMI ID=282.1>
sification : Streptomyces albus) sont immobilisées dans 20 parties de sol complexe par le même procédé que celui décrit à l'exemple 1. La récupération de l'activité par ce procédé d'immobilisation est de 82%.
Exemple 25.
100 parties d'une solution aqueuse contenant 5% de gélatine comestible du commerce sont chauffées à 50[deg.]C de manière
à pouvoir être agitées et mélangées avec 13 parties de tétra-
<EMI ID=283.1>
le tout étant agité pendant plus de 2 heures de Manière à obtenir un sol complexe homogène transparent. Le sol obtenu a une teneur en matières solides de l'ordre de 5%. Deux parties de levure de boulangerie séchée du commerce sont mises en suspension dans 3 parties d'eau et mélangées dans 20 parties de ce sol complexe
avec agitation de manière à former une solution homogène.- On verse le mélange dans une boite de Pétri et on le ventile de manière à obtenir une pellicule de cellules immobilisées de couleur jaunatre. La pellicule obtenue est cassante et se désagrège aisément. On effectue un essai de fermentation en :utilisant une languette
de la pellicule obtenue, contenant un gramme de cellules desséchées.
<EMI ID=284.1>
rique. De plus, on ne remarque aucune fuite de cellules, ce qui est la preuve d'une immobilisation appropriée .
Exemple 26.
100 parties d'une solution aqueuse contenant 5% de
<EMI ID=285.1>
<EMI ID=286.1>
<EMI ID=287.1>
ambiante pendant plus de 2 heures pour obtenir un sol complexe.
Le sol est homogène mais plutôt plus trouble que le sol de PVA.
On immobilise 3 parties de levure desséchée du commerce (Oriental Yeast Co., Ltd.) avec 20 parties du sol complexe en appliquant la même processus que celui décrit dans 1' exemple 23. La pellicule
<EMI ID=288.1>
<EMI ID=289.1>
<EMI ID=290.1>
<EMI ID=291.1>
lis1�a.
<EMI ID=292.1>
100 parties d'une solution aqueuse contenant 5%
<EMI ID=293.1>
<EMI ID=294.1>
<EMI ID=295.1> on ne remarque aucune fuite de cellules.
REVENDICATIONS..
1. Procédé de préparation d'un gel complexe .hydrophile, caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger une solution aqueuse d'un composé polymère soluble dans l'eau choisi <EMI ID=296.1>
la carboxyméthylcellulose, avec un tétraalkoxysilane répondant à la formule générale : Si(OR)4, dans laquelle R représente un groupe alkyle comprenant jusqu'à 12 atomes de carbone,
à hydrolyser le mélange résultant par l'addition d'un acide
<EMI ID=297.1>
complexe homogène, et, ensuite, à gélifier le sol .