BE854625A - PROCESS FOR PREPARING A HYDROPHILIC COMPLEX GEL - Google Patents

PROCESS FOR PREPARING A HYDROPHILIC COMPLEX GEL

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BE854625A BE177570A BE177570A BE854625A BE 854625 A BE854625 A BE 854625A BE 177570 A BE177570 A BE 177570A BE 177570 A BE177570 A BE 177570A BE 854625 A BE854625 A BE 854625A
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Description

       

  "Procédé de préparation d'un gel complexe hydrophile".

  
La présente invention est relative à un procédé de

  
préparation d'un complexe hydrophile homogène par la formation

  
d'un lyogel ou xérogel, doué d'une compatibilité et d'une affinité intéressantes avec une substance biologique, utilisable à titre

  
de matrice de support pour des cellules microbiennes et constituant

  
un excellent produit pharmaceutique. L'invention est également

  
relative à un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes

  
douées d'activités enzymatiques, qui consiste à emprisonner ces

  
cellules à l'intérieur de la matrice de gel constituée par le  <EMI ID=1.1> 

  
est obtenue à partir d'un polymère' soluble dans l'eau et d'un silicate. 

  
Les enzymes sont des catalyseurs biologiques présen-  tant des propriétés spécifiques et une efficacité très élevée.  On peut les utiliser pour catalyser presque n'importe quel type  de réaction chimique. Les réactions enzymatiques sont réalisées 

  
sous des conditions plus douces que les réactions chimiques et ne 

  
l produisant pas de substances nocives. Au cours de ces dernières  années, l'attention a été particulièrement focalisée sur le pro-  blème important de la pollution de l'environnement dans l'indus- 

  
trie chimique. 

  
Par conséquent, il est très avantageux d'utiliser 

  
les enzymes dans l'industrie chimique. L'application à l'industrie  d'enzymes ou de micro- organismes a été réalisée en utilisant des  micro-organismes intacte ou des préparations d'enzymes solubles. 

  
 <EMI ID=2.1> 

  
seule fermentation ou réaction discontinue. Si l'on peut stabi-  liser des enzymes et micro-organismes et les récupérer de façon économique sans inactivation, il sera possible d'utiliser les biocatalyseurs d'une façon plus intense dans l'industrie.

  
L'immobilisation des catalyseurs offre un moyen de réaliser plusieurs objectifs. Les enzymes immobilisées sont utilisables dans dos applications technologiques ainsi que dans des applications médicales et analytiques. La plupart des études relatives à l'immobilisation concernent des enzymes exemptes de cellules, mais au cours de ces récentes années une attention croissante  s'est faite vers l'utilisation de cellules microbiennes entières immobilisées. Ce système évite la nécessité d'une séparation des  cellules, d'une extraction des enzymes et d'une purification des  enzymes avant l'immobilisation. Les cellules immobilisées sont  également plus facilement applicables à la catalyse de réactions  séquentielles et permettent la régénération in situ des cofac- 

  
 <EMI ID=3.1> 

  
continue un système enzymatique multiple à l'état immobilisé,  cela signifierait que le procédé de fermentation traditionnel  pourrait être remplacé par un procédé utilisant des cellules  immobilisées. 

  
Les inconvénients associés à l'utilisation de cel-  lules immobilisées sont le coût de la matrice de support et la 

  
perte de l'activité catalytique, ou bien la difficulté de maintenir le caractère entier des cellules au cours de l'immobilisation.  En particulier, la plupart des cellules et enzymes microbiennes  sont tellement instables que le rait de les soumettre à un procédé d'immobilisation, entraîne une diminution de leurs activités enzymatiques et modifie la spécificité de leurs activités. Il 

  
 <EMI ID=4.1> 

  
pratique sans encourir les inconvénients mentionnés précédemment.  Par conséquent, quelques procédés d'immobilisation d'une appli-  cation aisée et étendue ont été mis au point. 

  
la présente invention est relative à un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes ayant une activité enzymatique sous des conditions très douces sans diminuer l'activité de celles-ci, et met en évidence certaines propriétés chimique, physiques et biologiques intéressantes des cellules microbiennes immobilisées ainsi obtenues. 

  
Les procédés d'immobilisation de cellules micro- 

  
 <EMI ID=5.1> 

  
à un support, le procédé de réticulation, le procédé d'emprison-

  
 <EMI ID=6.1>  

  
Parsi ces quatre catégories, le procédé d'emprisonnement par gel,

  
 <EMI ID=7.1> 

  
la matrice de gel, est largement utilisé en pratique . Le pro-

  
 <EMI ID=8.1> 

  
défauts suivants. Les procédés d'emprisonnement des cellules microbiennes par la formation de gel entraînent une diminution importante des activités enzymatiques de ces cellules étant

  
 <EMI ID=9.1> 

  
 <EMI ID=10.1> 

  
 <EMI ID=11.1> 

  
 <EMI ID=12.1> 

  
 <EMI ID=13.1> 

  
la température ambiante de manière à obtenir le gel emprisonnait

  
 <EMI ID=14.1> 

  
tée, est instable à des températures comparativement élevées

  
 <EMI ID=15.1>  

  
De plus, les procédés chimiques utilisés pour l'obtention de matrices de gel au moyen de réactifs de réticulation sont trop puissants et destructeurs pour être utilisés avec des substances biologiques. Ceci est le fait de la réactivité élevée des réactifs de réticulation, cela température élevée ainsi que du pH extrêmement élevé ou faible de la réaction de gélification. Par exemple, lorsqu'on utilise le procédé d'emprisonnement par gel

  
de polyacrylamides, le monomère d'acrylamide est polymérisé

  
avec du N,N'-méthylène-bis-acrylamide en présence d'un catalyseur, tel que le persulfate d'ammonium. Dans ce cas, l'enzyme est souvent inactivée par le catalyseur fortement réactif. Par conséquent, la gamme de pH et de température de la réaction de gélification doit être soigneusement choisie pour en conserver les ac-

  
 <EMI ID=16.1> 

  
(1973)). De plus, on doit empêcher d'utiliser les gels obtenus dans le domaine de l'industrie pharmaceutique et alimentaire

  
 <EMI ID=17.1> 

  
 <EMI ID=18.1> 

  
que les enzymes peuvent &#65533;tre emprisonnées à l'intérieur de matrices de gel formées de polymères d'alcool polyvinylique, en dissolvant les enzymes et les piymères d'alcool polyvinylique dans de l'eau et en les mélangeant avec de l'acide borique ou du borate de sodium pour obtenir le gel emprisonnant les enzymes. Suivant la demande da brevet citée ci-dessus, les enzymes peuvent être immobilisées sans dénaturation importante à des températures de gélification inférieuresà 45[deg.]C. Toutefois, étant donné que les gels ne peuvent être obtenus qu'à des pH alcalins, ce procédé ne peut être appliqué qu'à des enzymes stables en milieu alcalin.

  
 <EMI ID=19.1>  à et boue 904

  
D'autres procédés de réticulation utilisant des rayonnements  d'énergie élevée tels que les rayons gamma, les rayons électro-  niques ou les rayons X, sont d'une application difficile étant  donné qu'ils requièrent un vaste appareillage et de grandes pré-  cautions pour empêcher les effets physiologiques provenant des  rayons de haute énergie (référence H. Maeda; Biotech. & Bioeng., 
15, 607 (1973". 

  
Les enzymes ou micro-organismes immobilisés obtenus par les procédés d'emprisonnement par geh traditionnels sont  lâches du point de vue physique et présentent une résistance  mécanique particulièrement faible lorsqu'ils sont à l'état humide.  C'est ainsi qu'il est difficile d'utiliser ces gels dans des  réactions continues sur une longue période de temps. Lorsque 

  
 <EMI ID=20.1> 

  
tinue, ils sont écrasés par la pression de l'eau et on ne peut  pas obtenir un débit satisfaisant pour le mélange de réaction. 

  
D'autres publications antérieures dans ce domaine  sont résumées par F. Katchlski & I. Silman dans "Effect of the micro-environment on the mode of action of immobilized enzymes" :
Advance in Enzymology, 34, 445 (19-il".

  
La demanderesse a étudié de façon appronfondie

  
 <EMI ID=21.1> 

  
 <EMI ID=22.1> 

  
la silice est un composé qui n'est pas nocif vis-à-vis des orga-  nismes biologiques et bon marché. Lorsque l'on mélange du sol 

  
de silice et du gel de silice fabriqués par des moyens tradition-

  
 <EMI ID=23.1> 

  
rentes conditions, il n'est pas possible d'obtenir un lyogel 

  
 <EMI ID=24.1> 

  
 <EMI ID=25.1> 

  
 <EMI ID=26.1>  

  
bien que la nature des composés polymères ait changé de façon considérable. Par exemple, lorsque l'on ajoute du sol de silice à la solution aqueuse d'alcool polyvinylique ( appelée PVA ciaprès), on assiste à la séparation de deux couches ( 5 à 20% de silice, 1 à 5% de PVA). Au-dessus de pH 5, le mélange se sépare complètement sous la forme de deux couches, l'une contenant la silice et l'autre le PVA. En-dessous de pH 5, la silice se disperse dans la couche de PVA et il se forme un produit de coacervation. Le sol ou gel transparent homogène désiré ne se forme pas à n'importe quel pH. De plus, les sels de silicates inorganiques tels que l'orthosilicate ne peuvent pas former une solution homogène avec le PVA au moyen d'une hydrolyse acide, de sorte qu'il est impossible d'obtenir le gel complexe transparent homogène désiré.

  
On prévoit, suivant la présente invention, un procédé de préparation d'un gel complexe hydrophile, par le mélange d'un polymère soluble dans l'eau et d'un silicate organique, en

  
 <EMI ID=27.1> 

  
ditions douces, de sorte que l'on obtient un gel complexe hydrophile n'ayant aucun effet nuisible sur l'activité de substances biologiques telles que les cellules microbiennes ou enzymes, et qui est utilisable pour l'immobilisation des cellules microbien-

  
 <EMI ID=28.1> 

  
duit pharmaceutique.

  
On a constaté qu'un tétraalkoxysilane tel que le

  
 <EMI ID=29.1> 

  
solution aqueuse d'un polymère soluble dans l'eau tel que l'al-

  
 <EMI ID=30.1> 

  
 <EMI ID=31.1> 

  
On a de plus constaté que le sol compléta homogène obtenu est  <EMI ID=32.1> 

  
luble dans l'eau. On a également constaté qu'on peut immobiliser des cellules microbiennes possédant une activité enzymatique en les emprisonnant à l'intérieur- de la matrice de gel sans une diminution de leur activité enzymatique étant donné que ledit

  
sol complexe est gélifié sous des conditions très douces.

  
Par conséquent, l'un des buts les plus importants de la présente invention est de prévoir un gel hydrophile qui est insolble dans l'eau.et bon marché à obtenir, et qui présente une excellente compatibilité et affinité avec la substance biologique.

  
Un autre but de la présente invention est de prévoir une matrice de gel hydrophile qui est facilement utilisable pour l'immobilisation de cellules microbiennes présentant une activité enzymatique.

  
Un autre but de la présente invention est de prévoir des moyens pour immobiliser des cellules microbiennes tout

  
en permettant à celles-ci de conserver au moins plus de 50% de leur activité enzymatique par rapport à l'activité que les cellules microbiennes non traitées montrent initialement.

  
Enfin, encore un autre but de la présente invention est de prévoir des cellules microbiennes immobilisées qui peuvent être utilisées dans un procédé continu avec un réacteur en forme de colonne, ou dans un procédé discontinu avec agitation.

  
D'autres détails et particularités de l'invention rassortiront de la description ci-après, donnée à titre d'exemple non limitatif et en se référant au ,dessin annexé, dent la figure unique donne la relation existant entre le taux de conversion du D-glucose

  
 <EMI ID=33.1> 

  
tion enzymatique. L'ordonnée représente le taux de conversion exprimé en pourcentage en poids et l'abcisse représente le nombre de fois que l'.on- utilise la préparation enzymatique. Les courbes 1 et 2 montrent les résultats obtenus respectivement avec ces cellules immobilisées et des cellules non traitées.

  
On obtient le gel complexe hydrophile suivant la présente invention en faisant réagir un polymère soluble dans l'eau et un tétraalkoxysilane pour former un sol homogène, ce gel étant ensuite gélifié sous des conditions très douces. Le tétraalkoxysilane est hydrolysé en présence d'un acide dans une solution aqueuse du polymère soluble dans l'eau pour fermer un sol homogène. Les cellules microbiennes présentant une activité enzymatique sont ajoutées au sol ainsi obtenu. Le mélange est gélifié en ajustant le pH pour former un lyogel complexe, ou séché après l'ajustement du pH pour former un xérogel insoluble dans l'eau,le lyogel ou xérogel emprisonnant les cellules sans diminuer leur activité enzymatique.

  
Les composés polymères solubles dans l'eau utilisés dans le cadre de la présente invention possèdent de nombreux

  
 <EMI ID=34.1> 

  
formant de fortes liaisons d'hydrogène avec les groupes -OH acides du silicate par déshydratation. On peut utiliser les composés polymères solubles dans l'eau indiqués au tableau 1.

  
TABLEAU 1.

  
(A) Composés polymères naturels et leurs dérivés. 

  
1. Cellulose; carboxyméthylcollulose , méthylcellulose, 

  
éthylcellulose, hydroxyéthylcellulose. 

  
2. Amidons; hydroxyéthylamidon, carboxyméthylamidon. 

  
3. Autres polysaccharides.-. mannan, dextran, chitosan, pullu- 

  
lan, gomme de guar, huile de fèves de "locast ", gomme  adragante, gomme de xanthane, agar, arginate de sodium.

  
4. Protéines; gélatine, albumine. 

  
(B) Composés polymères synthétiques 

  
 <EMI ID=35.1> 

  
Les polymères solubles dans l'eau préférés utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être constitués

  
par un alcool polyvinylique présentant un taux de polymérisation moyen situé entre 500 et 2000, et un taux de saponification de  l'ordre de 70 à 100%, une gélatine du commerce de qualité cornes-  tible qui a une résistance de gelée de plus de 200 g (bille)/5 

  
 <EMI ID=36.1> 

  
boxyméthylcellulose du commerce de la qualité comestible qui a  un degré de carboxylation compris entre 0,4 et 0,8 et une teneur 

  
en sodium de l'ordre de 7,0 à 8,5%. 

  
Le composé polymère soluble dans l'eau est solubilisé dans de l'eau à une concentration présentant une visco- 

  
aité inférieure à 10.000 centipoises, de préférence inférieure à

  
 <EMI ID=37.1> 

  
viscosité dont question ci-dessus est mesurée au moyen d'un rotor

  
 <EMI ID=38.1> 

  
 <EMI ID=39.1> 

  
le cadre de la présente invention sont ceux répondant à la formule structurale Si(OR)4, formule dans laquelle R représente

  
un groupe alkyle contenant jusqu'à 12 atomes de carbone, par  exemple le méthyle, l'éthyle, le propyle, le butyle, l'octyle

  
ou le lauryle. On utilise de préférence pour obtenir le sol complexe homogène des composés dans lesquels R représente un

  
groupe alkyle contenant jusqu'à 3 atomes de carbone. Le tétraéthoxysilane se révèle le composé le plus approprié.

  
On mélange le composé polymère soluble dans l'eau

  
avec le tétraalkoxysilane mentionné précédemment, et on ajuste ensuite le pH du mélange en-dessous de 3 avec de l'acide ou un   <EMI ID=40.1> 

  
sel à caractère acide qui n'exerce aucun effet préjudiciable  sur les activités enzymatiques des cellules microbiennes. Les  acides ou sels acides que l'on peut utiliser dans le cadre de la  présente invention sont donnés au tableau 2. 

  
TABLEAU 2. 

  
 <EMI ID=41.1> 
(B) Acides organiques : acide acétique, acide glutamique, acide  <EMI ID=42.1> 

  
que, acide citrique, acide tàrtarique. 

  
 <EMI ID=43.1>  ammonium. 

  
La quantité de tëtraalkoxysilane nécessaire au  mélange mentionné précédemment avec la solution aqueuse de poly-  mère soluble dans l'eau varie suivant le type de composé silanique  et suivant les propriétés du polymère soluble dans l'eau utilisés. La quantité de SiO contenue dans le tétraalkoxysilane, calculée 

  
 <EMI ID=44.1> 

  
à 300% (poids/poids) par rapport au poids sec du polymère solu-

  
 <EMI ID=45.1> 

  
 <EMI ID=46.1> 

  
la solubilité dans l'eau du gel formé s'accroît d'une façon signi-

  
 <EMI ID=47.1> 

  
le gel devient cassant. Les propriété du gel dépendent de la

  
 <EMI ID=48.1> 

  
que du polymère soluble dans l'eau. Par exemple, on peut utiliser  du PVA ayant un taux de polymérisation moyen compris entre 500 et 2000 et un taux de saponification de l'ordre de 70 à 100%,

  
 <EMI ID=49.1> 

  
manière particulièrement préférée supérieure à 50%, dans le cas d'un PVA totalement saponifié, tandis qu'il est nécessaire  <EMI ID=50.1> 

  
un taux de saponification inférieur.

  
Au cours du stade initial du procéda réactionnel,

  
 <EMI ID=51.1> 

  
 <EMI ID=52.1> 

  
 <EMI ID=53.1> 

  
 <EMI ID=54.1> 

  
à la température ambiante tout en le chauffant à une température

  
 <EMI ID=55.1> 

  
 <EMI ID=56.1> 

  
 <EMI ID=57.1> 

  
 <EMI ID=58.1> 

  
 <EMI ID=59.1>  <EMI ID=60.1> 

  
 <EMI ID=61.1> 

  
Le sol obtenu peut être conservé pendant une_longue

  
 <EMI ID=62.1> 

  
 <EMI ID=63.1> 

  
moL:: . 

  
 <EMI ID=64.1> 

  
 <EMI ID=65.1> 

  
 <EMI ID=66.1>  

  
Les gels complexes formés sous différentes conditions à partir

  
du rame composé polymère soluble dans l'eau ont différents degré

  
de turbidité. Par exemple, le sol complexe formé de gélatine et  de tétraéthoxysilane est converti en un gel transparent en-dessous!

  
de pH 4. Le gel le plus trouble est obtenu à pH 5, et au-dessus 

  
de pH 7 le gel devient semi- transparent. 

  
Les gels complexes obtenus sont ordinairement clas- 

  
sés dans la catégorie des lyogels suivant qu'ils contiennent une  grande quantité d'eau ou dans la catégorie des xérogels suivant  qu'ils contiennent une petite quantité d'eau. Dans ce dernier  type de gel, l'humidité du gel est presque complètement éliminée  par le procédé de séchage. Suivant la présente invention, les  composants du sol ne se séparent pas, mais conservent l'état  complexe homogène tout au long de la formation du sol, de la forma-  tion du gel et de la formation du xérogel. Les xérogels obtenus  sont insolubles ou difficilement solubles dans l'eau mais ne  montrent aucune propriété hydrophile.

  
Ainsi que cela est indiqué dans les exemples donnés  ci-après, les propriétés du xérogel obtenus dépendent de la nature  du polymère soluble dans l'eau utilisé et également du rapport du 

  
 <EMI ID=67.1> 

  
ainsi que le degré de résistance et de fragilité du gel augmentent

  
 <EMI ID=68.1> 

  
devient plus flexible lorsque l'on accroît la quantité de polymère. En qui concerne l'effet du polymère solfie dans l'eau

  
 <EMI ID=69.1> 

  
tion du taux de saponification du PVA utilisé. Dans le cas d'un

  
 <EMI ID=70.1> 

  
 <EMI ID=71.1> 

  
 <EMI ID=72.1>   <EMI ID=73.1> 

  
 <EMI ID=74.1> 

  
petite mais doit être d'au moins de plus de 20% en poids/poids.

  
Suivant la présente invention, les cellules microbiennes douées d'activités enzymatiques peuvent être immobilisées sous des conditions très douces en les emprisonnant à l'intérieur de la matrice du gel complexe hydrophile mentionné précédemment obtenu à partir du composé polymère soluble dans l'eau et du silicate. Les cellules microbiennes sont ajoutées au sol homo-  gène mentionné ci-dessus sans aucun ajustement du pH ou à des 

  
sels basiques comme indiqué au tableau 3.

  
TABLEAU 3.

  
 <EMI ID=75.1>  <EMI ID=76.1>  <EMI ID=77.1> 

  
Les cellules microbiennes que l'on peut utiliser

  
dans le cadre de la présente invention sont des cellules sèches,  des cellules humides provenant d'un bouillon par centrifugation

  
ou filtration ou le bouillon cultivé lui-même. Ces cellules mi-  crobiennes sont classées en cinq groupes, à savoir les bactéries,  les actinomycètes, les champignons, les levures et les algues. 

  
Les bactéries du premier groupe, appartenant à la classe des schizomycètes,sont du genre :Pseudomonas, Acetobacter, Glucono- 

  
 <EMI ID=78.1> 

  
 <EMI ID=79.1> 

  
etc. Les Actinomycètes du second groupe, appartenant à la classe

  
 <EMI ID=80.1> 

  
 <EMI ID=81.1>   <EMI ID=82.1> 

  
 <EMI ID=83.1> 

  
ARX, "The genera of Fungi sporulating in pure culture" Verlag von J. Cramer,et H.L. Barnett & Barry B. Hunter, "Illuatrated gênera of Imperfect Fungi" 3ème édition, (1970); Burgess Publiahing Company) . Les levures du quatrième groupe, appartenant à la classe des Ascomycètes, sont du genre : Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenula: Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Kloechera, etc (J. Lodder, "The yeast A taxonomic study" 2ème édition (1970); North-Holland Publishing Company). Les algues du cinquième groupe sont du genre unicellulaire 

  
 <EMI ID=84.1> 

  
Spirulina en ce qui concerne les algues bleu-vert ( H. Tamiya ,

  
 <EMI ID=85.1> 

  
 <EMI ID=86.1> 

  
La plupart de ces cellules microbiennes sont des

  
 <EMI ID=87.1> 

  
laires des micro-organismes individuels appartenant aux groupes

  
 <EMI ID=88.1> 

  
ou la largeur de chaque cellule utilisée dans le cadre de la présente invention est de l'ordre de 1 à 20 microns. Les cellules microbiennes peuvent être dispersées dans des solvants aqueux. Certains types d'actinomycètes du.second groupe et de champignons du troisième groupe ont une longueur supérieure

  
 <EMI ID=89.1> 

  
 <EMI ID=90.1> 

  
 <EMI ID=91.1> 

  
à l'intérieur de la matrice de gel dont il a été question pré-

  
 <EMI ID=92.1> 

  
 <EMI ID=93.1>   <EMI ID=94.1>  sont de préférence broyées pour ne pas avoir plus de 20 microns.

  
On peut -utiliser, à cet effet, une homogénéisation mécanique dans l'eau. 

  
Les cellules microbiennes utilisées dans le cadre de la présente invention, choisies parmi les cinq groupes mentionnés précédemment, possèdent plus d'une activités enzymatiques. Les enzymes sont classées d'après les cinq groupes suivants.

  
TABLEAU 4.

  
 <EMI ID=95.1>  lase, phénol oxydase, monoamine oxydase, cytochrome c réductase.
(B) Transférases Glutamate-oxaloacétate-trans-aminase, macrolide 3-acyltransaminase, macrolide 3-acyltransférase à 16 chaînons, ATB: nucléoside-5' monophosphate pyrophosphotransférase. <EMI ID=96.1>  lipase, lactase, pénicilline amidase, phosphatase alcaline, amino acylase, urêase, cellulase. <EMI ID=97.1>  <EMI ID=98.1>  naso.

  
Les enzymes utilisées dans le cadre de la présente invention sont des enzymes intracellulaires existant à l'intérieur de la cellule ou du mycélium microbien, ou à l'intérieur de l'organella d'organismes biologiques. Dans la présente invention, le terme "activité" englobe non seulement l'activité enzymatique mais également d'autres activités biologiques, telles que, par exemple, les activités en tant qu'inhibiteurs, coenzymes, antibiotiques, antigènes, anticorps ,etc. 

  
 <EMI ID=99.1> 

  
microbiennes doit être choisi en tenant compte de la stabilité

  
 <EMI ID=100.1> 

  
ajuste celui-ci à pH 4 - 8, de préférence à pH 5 - 7. Lors

  
de l'immobilisation des cellules microbiennes, il n'est pas nécessaire dans la plupart des cas d'ajuster le pH étant donné

  
que les cellules microbiennes présentent elles-mêmes une activité de tampon. Le pH du mélange mentionné précédemment tombe ordinairement dans la gamme de 5 à 6,5 après l'addition des cellules.

  
Le poids sec deq cellules microbiennes à ajouter est inférieur à 1000% (poids/poids), de préférence de l'ordre de
20 à 500% (poids/poids ), par rapport au poids sec du sol complexe homogène. Après l'addition . des cellules microbiennes au sol complexe homogène, on agite à fond le mélange de manière à le disperser de façon homogène. La réaction de gélification du sol contenant lea cellules microbiennes se produit à n'importe quelle température. Toutefois, étant donné que lea enzymes sont instables aux températures supérieures, on réalise la réaction de gélifica-

  
 <EMI ID=101.1> 

  
entre 10[deg.]C et 40[deg.]C. On réalise ordinairement la réaction de

  
 <EMI ID=102.1> 

  
le sol se gélifie complètement à pH 6,0 par une agitation continue à la température ambiante pendant 10 à 20 minutes.

  
Un des avantages les plus importants de la présente invention consiste en l'utilisation de conditions douces pour l'immobilisation, conditions sous lesquelles les activités enzymatiques peuvent être entretenues tout au long de la totalité du procédé sans une inactivation importante.

  
Le gel complexe obtenu renfermant les cellules microbiennes est séché et converti à la forme désirée. On réalise  <EMI ID=103.1> 

  
rativement stable et l'on peut réaliser la totalité du procédé 

  
de la présente invention à la température ambiante . Pour ce

  
qui est des cellules bactériennes instables telles celles qu'on  utilise pour la synthèse enzymatique de L-tyrosine, on réalise 

  
la totalité du procédé sous une température inférieure à 5[deg.]C afin

  
de maintenir les activités enzymatiques et l'on utilise de préférence pour le procédé de séchage une dessication par évapora-  tion de la glace. Aussi longtemps que la température est maintenue dans la gamme des températures mentionnées ci-dessus, on ne re-  marque pratiquement aucune inactivation de l'enzyme. Pour amener 

  
le lyogel mentionné ci-dessus immobilisant les cellules microbiennes sous différentes formes, on utilise, suivant la présente  invention, les méthodes traditionnelles. On peut réaliser un  moulage avant ou après le séchage. En particulier, les solvants  organiques hydrophiles ou hydrophobes dans lesquels le lyogel com- 

  
plexe est pratiquement insoluble, peuvent être utilisés pour le 

  
i moulage. On peut utiliser les solvants organiques suivants donnés

  
au tableau 5.

  
TABLEAU 5.

  
(A) Alcools; alcool méthylique, alcool éthylique, alcool n-pro- ' pylique, alcool n-butylique, éthylèneglycol, glycérol. <EMI ID=104.1>  <EMI ID=105.1> 
(D) Alcanes : n-heptane, n-paraffine.
(E) Aromatiques : Benzène, toluène, xylène.
(F) Autres : chlorure de méthylène.

  
Dans le cadre de la présente invention, les formes des cellules microbiennes immobilisées par le gel peuvent être du 

  
 <EMI ID=106.1> 

  
lier, elles peuvent consister en dès sphères, des granules, des 

I

  
boulettes, des filaments, etc. Lorsque l'on insère les cellules  .i <EMI ID=107.1> 

  
on obtient de bons résultats en utilisant la réaction continue. 

  
i

  
 <EMI ID=108.1> 

  
î peuvent avoir la forme d'une pellicule ou d'une bande et dans  d'autres cas, elles consistent en une poudre eudes granules irré-  guliers. L'épaisseur et/ou le diamètre moyens du gel moulé contenant les cellules microbiennes peuvent se situer entre 0,2 et

  
5 mm, et de préférence entre 0,4 et 1,0 mm. Lorsque l'on utilise des gels moulés ayant cette épaisseur, on peut obtenir un contact efficace entre les cellules inmobilisées et leur substrat.

  
De plus, on peut également obtenir un débit approprié pour le mélange de réaction à travers le réacteur à colonne.

  
La forme désirée peut être obtenue par une coulée à travers une fente étant donné que le lyogel complexe renfermant

  
les cellules microbiennes est une pâte molle. Par exemple, le

  
lyogel de la présente invention est converti en un long cylindre

  
au moyen d'une coulée à travers une fente dans un solvant organique ou à l'air, et est annuité séché. Le lyogel peut également 

  
 <EMI ID=109.1> 

  
 <EMI ID=110.1> 

  
obtenus de la sorte présentent des aires superficielles spécifiques élevées.

  
On peut également utiliser le séchage par pulvérisation pour obtenir les formes désirées. Les granules obtenus présentent des airas superficielle. spécifiques élevées et de

  
 <EMI ID=111.1>  

  
 <EMI ID=112.1> 

  
dustrielle, notamment pour une question d'économie.

  
On obtient également de bons résultats, suivant la

  
 <EMI ID=113.1> 

  
 <EMI ID=114.1> 

  
sante même ai l'on applique le procédé à des cellules microbiennes instables à la chaleur indiqué aux exemples 16 et 17 décrits

  
 <EMI ID=115.1> 

  
 <EMI ID=116.1> 

  
Une autre forme appropriée de gel est le gel pelli-

  
 <EMI ID=117.1>  <EMI ID=118.1> 

  
 <EMI ID=119.1> 

  
 <EMI ID=120.1> 

  
 <EMI ID=121.1> 

  
continues et discontinues. Par exemple, on peut utiliser les cel-

  
 <EMI ID=122.1> 

  
 <EMI ID=123.1> 

  
 <EMI ID=124.1> 

  
 <EMI ID=125.1>  ........ 

  
élevé et avec divers degrés de concentration 'ionique.

  
Les cellules microbiennes immobilisées suivant la présente invention peuvent être utilisées comme catalyseurs pour la conversion biochimique de divers substrats non seulement dans un système de réaction à colonne mais également dans un système de réaction à fractionnement discontinu. En utilisant le système de réaction à fractionnement discontinu et traditionnel avec agitation, on ne remarque aucune perte importante de cellules microbiennes à partir du gel ou destruction du gel moulé. De plus,

  
on peut récupérer le composé polymère soluble dans l'eau à partir du gel immobilisant les cellules microbiennes et l'utiliser de façon répétée jusqu'à ce que les activités aient diminué après une longua période d'utilisation. Le composé polymère soluble

  
 <EMI ID=126.1> 

  
 <EMI ID=127.1> 

  
en réparant les cellules par centrifugation ou filtration, -et en ajustant ensuite le pH.

  
Les exemples suivants illustrent des modes de réalisation de la présents invention mais on notera qu'ils sont donnas à titre d'exemples non limitatifs et qu'ils ont surtout pour but d'illustrer davantage les caractéristiques du procédé de l'invention.

Exemple 1.

  
On mélange et on agite 50 g d'une solution aqueuse

  
 <EMI ID=128.1> 

  
 <EMI ID=129.1> 

  
HCl IN. Le mélange trouble se transforme graduellement en un sol complexe homogène transparent, incolore à la température am-

  
 <EMI ID=130.1>  w va1 v w ws sw

  
un, lyogel complexe homogène transparent, incolore sans aucune séparation entre les composants du lyogel, tels que le PVA ou le tétraéthoxyailane. Le sol homogène est également gélifié sans neutralisation en le stockant pendant une longue période de temps pour former un lyogel complexe, qui est également transparent, homogène et insoluble dans l'eau à la température ambiante.

  
On sèche le lyogel complexe homogène obtenu par ventilation &#65533; la température ambiante de manière à obtenir un xérogel complexe homogène transparent, qui est insoluble dans l'eau du robinet.

  
Le xërogel complexe ainsi obtenu gonfle sans que ses composants ne se séparent, lorsqu'on le traite dans de l'eau bouillante pendant une heure. Dans le cas d'un xérogel complexe obtenu après neutralisation et séchage par ventilation comme mentionné précédemment, la quantité solubilisée est* 50% par rapport au poids initial du xërogel complexe, et le degré de gonflement est de l'ordre de 30 fois dans l'eau bouillante. Dans le cas du sol complexe sana neutralisation, la quantité solubilisée est de 30% et le degré de gonflement est de l'ordre de 12 fois dans l'eau bouillante.

Exemple 2.

  
En procédant comme décrit dans l'exemple 1, à l'ex-

  
 <EMI ID=131.1> 

  
lyogel complexe homogène. Le processus réactionnel, le sol inter-

  
 <EMI ID=132.1> 

  
ceux de l'exemple 1. Le xérogel compila obtenu avec ou sans neutralisation est insoluble dans l'eau du robinet. La quantité solubilisée est inférieure à 3% et le degré de gonflement est

  
 <EMI ID=133.1> 

  
 <EMI ID=134.1> 

  
 <EMI ID=135.1> 

  
 <EMI ID=136.1>  

  
 <EMI ID=137.1> 

  
 <EMI ID=138.1> 

  
similaire (c'est-à-dire qui est incolore et transparent) à celui 

  
de l'exemple 1. Le xérogel complexe obtenu par la suite, avec ou sans neutralisation, est plus dur et plus cassant que celui de l'exemple 1. Le gel est insoluble dans l'eau du robinet, la quantité solubilisée est de l'ordre de 2% et le degré de gonflement  d'environ 2 fois dansl'eau bouillante.

Exemple 4.

  
En procédant comme décrit dans l'exemple 1, à l'exception que l'on ajoute 2 g de tétraéthoxysilane dans 5 g d'une solution aqueuse contenant 10% de PVA (taux de polymérisation de

  
1700 et taux de saponification de 87), on obtient un lyogel complexe homogène, qui a un aspect très similaire à celui de l'exemple

  
1. Le xérogel complexe formé avec ou sans neutralisation ast insoluble dans l'eau du robinet, la quantité solubilisée est inférieure à 9% et le degré de gonflement est inférieur à 6 fois

  
dans l'eau bouillante.

Exemple 5.

  
On effectue une réaction similaire à celle de

  
l'exemple 4, en utilisant 10 g de tétraéthoxysilane et 5 g d'une solution aqueuse contenant 10% de PVA (taux de polymérisation de

  
1700 et tauxcb saponification de 87). Les caractéristiques de la 

  
 <EMI ID=139.1> 

  
 <EMI ID=140.1> 

  
xérogel complexe final obtenu avec ou sans neturalisation est in-  soluble dans l'eau du robinet, sa quantité solubilisée est de 

  
 <EMI ID=141.1> 

  
dans l'eau bouillante. 

  
 <EMI ID=142.1>  

  
 <EMI ID=143.1> 

  
tion aqueuse contenant 5% de PVA (taux de polymérisation de

  
1100, complètement saponifié ) et de 0,5 g de chlorure d'aluminium.

  
On poursuit l'agitation pendant environ 2 heures et l'on obtient un sol complexe homogène, transparent et incolore. Le sol ainsi obtenu est séché sous ventilation et l'on obtient une pellicule

  
de xérogel complexe homogène transparent. Cette pellicule est insoluble même par extraction dans de l'eau bouillante et conserve sa forme pelliculaire de départ. On neutralise le sol ainsi ob-

  
 <EMI ID=144.1> 

  
une couleur blanche. On le sèche ensuite par ventilation et l'on

  
 <EMI ID=145.1> 

  
dans l'eau du robinet et conserve sa forme initiale dans l'eau bouillante.

Exemple 7.

  
 <EMI ID=146.1> 

  
de gélatine dans 66 g d'eau, on agite à fond tout en chauffant et l'on ajoute 15 g de tétraéthoxysilane. Après avoir ajusté le pH

  
à 3 ou en-dessous de 3 avec du HCl dilué, on agite le mélange de façon continue à la température ambiante pendant 3 heures, période après laquelle le mélange devient transparent. Le sol complexe homogène ainsi obtenu est laissé au repos à la température ambiante ot l'on obtient un lyogel complexe homogène, transparent. Après axir ajusté le pH du lyogel avec du NH OH dilué, le gel complexe devient trouble à un pH d'environ 4,5 et très trouble à un pH d'environ 5 à 6, mais redevient à nouveau semi-transparent aux pH au-desus de 7. L'homogénéité est maintenue et l'on ne remarque aucune couche d'eau. La valeur du pH influence la période de repos nécessaire à la formation du lyogel complexe. Par un séchage des sols complexes homogènes et des lyogels complexes homogènes,  <EMI ID=147.1> 

  
 <EMI ID=148.1> 

  
rents degrés de turbidité en fonction dé la variation du pH 
(transparents aux pH acides, trouble et laiteux aux pH de l'ordre de 5 à 6, et semi-transparent au-dessus de pH 8). Le xérogel est insoluble dans l'eau à la température ambiante et gonfle dans l'eau bouillante sans perdre sa forme initiale.

Exemple 8.

  
On dilue 100 g d'une solution aqueuse contenant 5%

  
 <EMI ID=149.1> 

  
gène tout en chauffant, et l'on ajoute 15 g de tétraéthoxysilane.

  
 <EMI ID=150.1> 

  
on agite le mélange à la température ambiante pendant environ 2 heures jusqu'à ce que l'on obtienne un sol complexe homogène, transparent. On neutralise ce sol avec du NaOH dilué et on obtient après environ 30 minutes un lyogel complexe homogène. Soit le séchage sous ventilation du sol complexe homogène sans neutralisation, soit le séchage sous ventilation du lyogel complexe homogène obtenu après neutralisation, mène à la formation d'un xérogel trouble, laiteux qui se révèle cassant lorsqu'on y applique une force physique. Seulement une petite quantité d'amidon est extraite du xérogel dans l'eau courante et 50% de cet amidon sont extraits dans l'eau bouillante. La forme initiale est conservée dans les deux cas et on observe un gonflement, en particulier dans l'eau bouillante.

Exemple 9.

  
On ajoute 100 g d'une solution aqueuse contenant 5% de carboxyméthylcollulose dans 66 g d'eau , on agite à fond le mélange à une température de 45[deg.]C, et l'on ajoute ensuite au mélange 20 g de tétraéthoxysilane. Le pH du mélange est ajusté

  
 <EMI ID=151.1>   <EMI ID=152.1> 

  
 <EMI ID=153.1> 

  
 <EMI ID=154.1> 

  
un xérogel complexe homogène, transparent. Le xérogel complexe

  
 <EMI ID=155.1> 

  
rature ambiante. Même dans l'eau bouillante, il est pratiquement insoluble et le degré de gonflement est de l'ordre d'un facteur de 2.

Exemple 10.

  
 <EMI ID=156.1> 

  
solution aqueuse contenant 5% de polyacrylate, on dilue avec 66 g d'eau et on agite le mélange à la température ambiante pendant environ 2 heures. Le mélange prend graduellement la forme d'un sol complexe homogène transparent, que l'on neutralise avec 17 g

  
 <EMI ID=157.1> 

  
complexe semi-transparent. Le sol complexe homogène formé sans neutralisation et le lyogel complexe homogène obtenu par neutralisation sont séchés et ce pour obtenir respectivementdes xérogels

  
 <EMI ID=158.1> 

  
obtenu se dissout dans l'eau bouillante et l'autre moitié reste sous la forme d'un hydrogel mou, insoluble dans l'eau bouillante.

Exemple 11.

  
 <EMI ID=159.1> 

  
 <EMI ID=160.1> 

  
culaire de 4000), on dilue avec 66 g d'eau et on agite le mélange à la température ambiante. Par l'addition de lg de HCl IN sur

  
 <EMI ID=161.1> 

  
homogène transparent et incolore. On neutralise ce sol avec du

  
 <EMI ID=162.1>   <EMI ID=163.1> 

  
 <EMI ID=164.1> 

  
 <EMI ID=165.1> 

  
 <EMI ID=166.1> 

  
mé se dissolvent en laissant un gel trouble. Ce xérogel solide a plutôt tendance à se détruire.

Exemple 12. 

  
On mélange 100 parties d'une solution aqueuse contenant 10% de PVA (taux de polymérisation de 1700 et taux de saponification de 99,5) avec 321,5 parties deau distillée, 28,5

  
 <EMI ID=167.1> 

  
pendant plus de 2 heures à la température ambiante et l'on obtient un sol homogénéisé.et transparent ayant un pH d'environ 3, con-

  
 <EMI ID=168.1> 

  
Si02). Une partie de levure de boulangerie, sèche, disponible dans le commerce (Saccharomyces cerevisiae) est mise en suspension

  
 <EMI ID=169.1> 

  
 <EMI ID=170.1> 

  
levure par agitation, on ajuste le pH à 7,0 avec une solution de

  
 <EMI ID=171.1> 

  
ché spontanément à la température ambiante. On obtient une pellicule de couleur brun-jaunâtre contenant les cellules * levure . Une partie de la pellicule immobilisant un g des cellules de levure est prélevée et incubée dans 50 g d'une solution aqueuse 

  
 <EMI ID=172.1> 

  
 <EMI ID=173.1> 

  
se dégager après quelques minutes et après 30 minutes, une grande  quantité de gaz se dégage de la surface entière de la pellicule. 

  
 <EMI ID=174.1> 

  
 <EMI ID=175.1> 

  
de 30 heures. On suit la réaction en mesurant la diminution de   <EMI ID=176.1> 

  
 <EMI ID=177.1> 

  
se réalise proportionnellement au temps réaction. On décèle une odeur légèrement parfumée particulière à la fermention alcoolique. Une augmentation de la turbidité de la solution de glucose, qui est considérée comme provenant du fait que les

  
 <EMI ID=178.1> 

  
servée et, de ce fait, le mélange est presque transparent. A titre de contrôle, on effectue la même réaction en utilisant

  
1 g de cellules de levure déséchées non immobilisées. Aux premiers stades de la réaction, il se dégage une quantité légère-

  
 <EMI ID=179.1> 

  
 <EMI ID=180.1> 

  
 <EMI ID=181.1> 

  
 <EMI ID=182.1> 

  
 <EMI ID=183.1> 

  
 <EMI ID=184.1> 

  
 <EMI ID=185.1> 

  
 <EMI ID=186.1> 

  
légère agitation est requise pour que la réaction se poursuive. D'après les résultats précédents, il est démontre que les cellules microbiennes sont fermement immbbilisées par le procédé de la présente invention tout en entretenant une activité de fermentation égale à celle des cellules natives.

  
 <EMI ID=187.1> 

  
 <EMI ID=188.1> 

  
celui décrit dans l'exemple <1>2. Quatre parties de levure des-

  
 <EMI ID=189.1> 

  
sont mises en suspension dans 5 parties d'eau. On mélange la  <EMI ID=190.1> 

  
étale le gel sur une plaque et. on le sèche par ventilation de manière à obtenir une pellicule de couleur brun-jaunâtre contenant lea cellules de levure. Une languette de la pellicule contenant

  
1 g de cellules immobilisées est découpée et incubée dans 50 g d'une solution aqueuse contenant 5% de glucose à 30[deg.]C pour réaliser la fermentation comme dans l'exemple 12- Une grande quantité de gaz C02se libère même dans les premiers stades de l'incubation, ainsi qu'onl'a observé lors de l'expérience témoin.

  
Une fois que la fermentation est terminée, la pellicule est prélevée du milieu et plongée à nouveau dans une autre solution aqueuse de 50 g contenant 5% de glucose, une production de gaz

  
 <EMI ID=191.1> 

  
portante que celle observée lors de l'essaiprécédent réalisé avec les cellules natives. On répète cette fermentation 5 fois, et

  
 <EMI ID=192.1> 

  
 <EMI ID=193.1> 

  
de fermentation en utilisant 1 g de cellules non immobilisées

  
 <EMI ID=194.1> 

  
cellules immobilisées. Lors de ces essais, les cellules de levure sont recueillies par centrifugation et remises en suspension

  
 <EMI ID=195.1> 

  
provenant des 50 g de la solution aqueuse contenant 5% de glu-  cose atteint plus de 85% de la valeur théorique.

Exemple 14.

  
 <EMI ID=196.1> 

  
de PVA (taux de polymérisation de 2000 et taux de saponification

  
 <EMI ID=197.1> 

  
éthoxysilane et une partie de HCl IN, et l'on agite ensuite à

  
 <EMI ID=198.1>   <EMI ID=199.1> 

  
de l'ordre de 3, contenant 5% de matières solides. Deux parties de levure de boulangerie sèche, disponible dans le commerce
(Saccharomyces cerevisiae) sont mises en suspension dans 4 parties d'eau. On mélange la suspension avec 20 parties du sol complexe de PVA-Si02 et on agite à fond. Le gel ainsi obtenu est étalé sur une plaque et séché par ventilation à la température àmbiante de manière à obtenir une pellicule.de couleur brun-jaunatre contenant 1 g de cellules de levure. On utilise cette pellicule contenant 1 g de cellules de levure pour un essai de fermentation réalisé suivant le processus indiqué à l'exemple 12. La fermentation se fait à un taux intermédiaire entre celui de l'exemple
12 et celui de l'exemple 31. C'eqt-à-dire que la quantité de gaz

  
 <EMI ID=200.1> 

  
inférieure à celle des cellules non immobilisées, mais que la quan-

  
 <EMI ID=201.1> 

  
85% de la valeur théorique. Ce résultat est presque comparable au résultat obtenu avec les cellules non immobilisées.

Exemple 15.

  
On mélange 100 parties d'une gélatine alimentaire du commerce avec 15 parties de tétraéthoxysilane, 66 parties

  
 <EMI ID=202.1> 

  
 <EMI ID=203.1> 

  
obtenir un sol complexe homogène et transparent avec un pH de l'ordre de 3, contenant 5% de matières solides. Deux portion de levure de boulangerie desséchée, disponible dans la commerce sont

  
 <EMI ID=204.1> 

  
 <EMI ID=205.1>  

  
 <EMI ID=206.1> 

  
est plus cassante et friable que la pellicule de PVA-Si02 obtenue

  
 <EMI ID=207.1> 

  
pellicule mentionnée ci-dessus contenant 1 g de cellules lisées, on la plonge dans 50g d'une solution aqueuse contenant 5% de glucose, et on réalise l'essai de fermentation d'une manière

  
 <EMI ID=208.1> 

  
l'essai de fermentation et atteint plus de 85% de la valeur théorique. Au cours de l'essai de fermentation, on ne remarque aucune cellule microbienne s'échappant de la pellicule. Ce fait montra que les cellules de levure sont solidement immobilisées par le procédé de l'invention.

Exemple 16.

  
 <EMI ID=209.1> 

  
similaire à celle de l'exemple 12, et l'on cultive du Erwinia herbicola (ATCC 21434), une souche produisant de la 0 -tyrosinase, dans le milieu de culture suivant.

  
Composition du milieu de culture pour les bactéries

  
 <EMI ID=210.1> 

  

 <EMI ID=211.1> 
 

  

 <EMI ID=212.1> 


  
4 g de cellules cultivées (poids sec : 1 g) provenant de la bac-

  
 <EMI ID=213.1> 

  
centrifugation et immobilisées de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1, à l' exception que l'on procède à une dessication par évaporation de la glace. Toutes les étapes de cette préparation sont réalisées en-dessous de 5[deg.]C. L'activité

  
 <EMI ID=214.1> 

  
tionnées précédemment, contenant 20 mg de cellules bactériennes, est déterminée en mesurant la L-tyrosine synthétisée dans le milieu de synthèse de L-tyrosine suivant .

  
Composition du milieu pour la formation de L-tyrosine. 

  

 <EMI ID=215.1> 


  
Comme indiqué au tableau 6, les activités relatives

  
 <EMI ID=216.1> 

  
lisées préparées dans l'exemple 16, sont de l'ordre de 85% ou plus de l'activité du témoin utilisant des cellules bactériennes non immobilisées. Les activités des cellules bactériennes immobilisées  <EMI ID=217.1> 

  
 <EMI ID=218.1> 

  
lange de réaction utilisé pour la synthèse de L-tyrosine de façon continue à raison de 5 ml/heure pour synthétiser la L-tyroaine. On obtient un régime constant dans la colonne en ce qui concerne la synthèse de L-tyrosine après 12 heures d'une alimentation continue en milieu. Ce régime est maintenu même après 24 heures aprèa avoir commencé l'alimentation en milieu, et le taux de la réaction est maintenu à environ 0,6 mg/ml. 

  

 <EMI ID=219.1> 


  

 <EMI ID=220.1> 
 

  
 <EMI ID=221.1> 

  
 <EMI ID=222.1> 

  
 <EMI ID=223.1> 

  
 <EMI ID=224.1>  obtenue en utilisant du chlorure de méthylène présente une activité <EMI ID=225.1>  <EMI ID=226.1> 

  
 <EMI ID=227.1>  

  

 <EMI ID=228.1> 


  

 <EMI ID=229.1> 
 

  
 <EMI ID=230.1> 

  
 <EMI ID=231.1> 

  
 <EMI ID=232.1> 

  
 <EMI ID=233.1> 

  
de saponification de 99,5) sont mélangées avec 231,5 parties

  
 <EMI ID=234.1> 

  
 <EMI ID=235.1> 

  
température ambiante de manière à obtenir un sol homogénéisé transparent (appelé ci-après sol complexe) contenant 5% de matières solides, et ayant un pH aux alentours de 3. Cinq parties en poids de cellules microbiennes du type glucose isomérase disponibles dans le commerce (Nagase Sangyo CO., Ltd; dénomination commerciale ; GI-150; classification : Streptomyces albus 

  
 <EMI ID=236.1> 

  
 <EMI ID=237.1> 

  
pendant 3 minutes. Ensuite, on ajoute la suspension préparée dans 20 parties en poids du sol complexe et on la disperse par

  
 <EMI ID=238.1> 

  
à former un gel. Le gel est versé dans une boite de Pétri et

  
séché sous ventilation à une température de 55[deg.]C, et l'on obtient une pellicule de couleur brune dans laquelle sont enfermées les cellules. La pellicule est broyée dans un mortier, et tamisée au moyen d'un tamis à ouvertures de 0,191 mm de manière à obtenir  de fins granules. Les cellules microbiennes de glucose isomérase 

  
 <EMI ID=239.1> 

  
unités par gramme et l'activité de la glucose isomérase est de

  
 <EMI ID=240.1>  Dea cellules immobilisée" granulaires contenant

  
1 g de cellules séchées sont incubées avec 100 ml d'une solution

  
 <EMI ID=241.1> 

  
24 heures. Après l'incubation, les cellules immobilisées sont séparées par filtration et utilisées de façon répétée pour la même réaction, à savoir six fois, de manière à examiner la sta-

  
 <EMI ID=242.1> 

  
rées. On incube un gramme de cellules natives sur une base sèche sous les mêmes conditions. Les résultats sont indiqués à la figure annexée. L'ordonnée du graphique représente le pourcentage de D-fructose par rapport à la teneur totale en matières solides du mélange de réaction après chaque réaction, et l'abcisse représente le nombre de fois que l'on a utilisé la préparation enzymatique dans la réaction. On constate sur le graphique que la quan-

  
 <EMI ID=243.1> 

  
ae trouvant dans la réaction initiale après 6 réutilisations dans

  
 <EMI ID=244.1> 

  
tié de la quantité se trouvant dans la réaction initiale après

  
 <EMI ID=245.1> 

  
sées.

Exemple 19.

  
50 g de cellules de glucose isomérase immobilisées obtenues de la même façon que dans l'exemple 18, sont introduits:. dans une colonne de 2,5 x 20 cm maintenue à une température de

  
 <EMI ID=246.1> 

  
 <EMI ID=247.1> 

  
 <EMI ID=248.1> 

  
 <EMI ID=249.1> 

  
 <EMI ID=250.1> 

  
 <EMI ID=251.1>   <EMI ID=252.1> 

  
 <EMI ID=253.1> 

  
Le SV 1 est défini comme étant le taux d'écoulement correspondant à l'écoulement d'un volume du mélange de

  
 <EMI ID=254.1> 

  
dans la colonne, endéans une heure.

Exemple 20.

  
Des cellules microbiennes immobilisées ayant l'activité de la glucose isomérase, obtenues par le même procédé que celui décrit dans l'exemple 18, sont chargées dans un réacteur à colonne et l'on mesure les chutes de pression par écoulement

  
 <EMI ID=255.1> 

  
Enzyme Technology", p. 225 (1975) édité par H. Weethall et S.

  
 <EMI ID=256.1> 

  
des cellules microbiennes immobilisées présentant l'activité de

  
 <EMI ID=257.1> 

  
 <EMI ID=258.1> 

  
réaction est de 6,4 cm. On y fait passer de l'eau à raison de
58 cm par heure par application d'une méthode d'écoulement par remontée. On constate que la chute de pression A P/L est de 0,315 mH20/ m de lit. Un gel de polyacrylamide contenant des cellules microbiennes immobilisées contenant de la glucose isomérase

  
 <EMI ID=259.1> 

  
5,438 mH-0/ m de lit, soua les mêmes conditions.

Exemple 21,

  
 <EMI ID=260.1> 

  
celle décrite à l'exemple 18. On cultive des champignons fila-

  
 <EMI ID=261.1> 

  
 <EMI ID=262.1> 

  
 <EMI ID=263.1> 

  
 <EMI ID=264.1>  Composition du milieu de culture pour ;la production

  
 <EMI ID=265.1> 

  

 <EMI ID=266.1> 


  
Le bouillon est recueilli par filtration, 4 g de cellules humides (1 g à l'état sec) sont mises en suspension dans
10 ml d'un tampon salin de phosphate 0,1 M à pH 7,0, et on broie le mycélium au moyen d'un homogénéiseur à 18.000 tours par minute pendant 3 minutes. La suspension obtenue est ajoutée à 10 g de sol complexe de PVA-Si02 et agitée à la température ambiante pendant 15 minutes. Le mélange est versé dans une boite de Pétri et ventilé à la température ambiante de sorte que l'on obtient 1,5 g d'une pellicule de cellules immobilisées de couleur brun-jaunâtre. Un gramme de cellules humides non immobilisées correspond à 240 unités d'activité de glucose oxydase tandis que un gramme des cellules immobilisées obtenues contient 510 unités de cette activité.

   La récupération de l'activité de la glucose cxidase par l'intermédiaire de ce procédé d'immobilisation est de 87% par-gramme de cellules.

  
Une unité d'activité de glucose oxydase est définie

  
 <EMI ID=267.1> 

  
glucose en une minute. 

  
 <EMI ID=268.1> 

  
 <EMI ID=269.1> 

  
 <EMI ID=270.1> 

  
pouvoir être agitée s,sont mélangées avec 15 parties de tétra-

  
 <EMI ID=271.1> 

  
étant agité pendant plus de 2 heures de manière à former un sol complexe homogène, transparent. Le sol obtenu contient 5% de

  
 <EMI ID=272.1> 

  
du Chlorella fusca produisant de la nitrite réductase dans les cellules est cultivée dans le milieu suivant avec aération à une

  
 <EMI ID=273.1> 

  
Composition du milieu de culture pour la production de nitrite réductase.

  

 <EMI ID=274.1> 


  
Les cellules cultivées sont recueillies par filtration, et 6 g de cellules à l'état humide ( 1 g sur une base pondérale sèche)

  
 <EMI ID=275.1> 

  
est mélangée avec 10 ml de sol complexe de gélatine-Si02 et 

  
agitée à la température ambiante pendant 15 minutes. Le mélange  obtenu est versé dans une boite de Pétri et séché par congéla- 

  
tion de la glace pour obtenir 2,1 grammes d'une pellicule vert-  foncé contenant les cellules immobilisées. Un gramme de cellules humides non immobilisées contient 2,6 unités d'activité  <EMI ID=276.1> 

  
de l'activité de nitrate de réductase par ce procédé d'immobilisation est de 83% par gramme de cellules.

  
Une unité d'activité de nitrate réductase est définie comme étant la quantité de l'enzyme qui réduit une micromole de nitrite à 30[deg.]C pendant 1* minute.

Exemple 23.

  
100 parties d'une solution aqueuse contenant 10%

  
de PVA( taux de polymérisation de 1700 ; taux de saponification de 99,5) sont mélangées avec 221 parties d'eau distillée, 36 parties de tétrapropylsilicate et 3 parties de HCl IN, le tout étant agité à fond en chauffant à 50[deg.]C pendant plus de 2 heures de manière à obtenir un sol complexe homogène, tranparent. Le sol obtenu contient environ 5% de matières solides.

  
Une partie de levure de boulangerie séchée du commerce (Oriental Yeast Company., Ltd.) est mise en suspension dans 2 parties d'eau, la suspension est mélangée avec le sol obtenu ci-dessus et dispersée à fond par agitation. On ajuste le pH à

  
 <EMI ID=277.1> 

  
de Pétri et on le ventile à une température en-dessous de 30[deg.]C de manière à obtenir une pellicule de cellules immobilisées de couleur brun-jaunâtre. On réalise un essai de fermentation dans 50 g d'une solution aqueuse contenant 5% de glucose à 30[deg.]C, en utilisant une partie de la pellicule préparée contenant 1 g de cellules séchées.

  
La fermentation se poursuit normalement et on observe un dégagement

  
 <EMI ID=278.1> 

  
la valeur théorique. De plus, on ne remarque aucune perte de cellules au cours de la réaction, de sorte que l'on n'observe aucune turbidité dans le mélange de réaction tout au long de l'essai de fermentation. 

  
 <EMI ID=279.1> 

  
 <EMI ID=280.1> 

  
de PVA (taux de-polymérisation de 1700; taux de saponification de 99,5) sont mélangées avec 27 parties d'eau distillée, 27 par-

  
 <EMI ID=281.1> 

  
à fond à la température ambiante pendant plus de 2 heures de manière à former.un sol transparent homogène. Le sol obtenu a une teneur en matières solides de 5% Deux parties de cellules microbiennes du commerce ayant l'activité de la glucose isomérase

  
 <EMI ID=282.1> 

  
sification : Streptomyces albus) sont immobilisées dans 20 parties de sol complexe par le même procédé que celui décrit à l'exemple 1. La récupération de l'activité par ce procédé d'immobilisation est de 82%.

Exemple 25.

  
100 parties d'une solution aqueuse contenant 5% de gélatine comestible du commerce sont chauffées à 50[deg.]C de manière

  
à pouvoir être agitées et mélangées avec 13 parties de tétra-

  
 <EMI ID=283.1> 

  
le tout étant agité pendant plus de 2 heures de Manière à obtenir un sol complexe homogène transparent. Le sol obtenu a une teneur en matières solides de l'ordre de 5%. Deux parties de levure de boulangerie séchée du commerce sont mises en suspension dans 3 parties d'eau et mélangées dans 20 parties de ce sol complexe

  
avec agitation de manière à former une solution homogène.- On verse le mélange dans une boite de Pétri et on le ventile de manière à obtenir une pellicule de cellules immobilisées de couleur jaunatre. La pellicule obtenue est cassante et se désagrège aisément. On effectue un essai de fermentation en :utilisant une languette

  
de la pellicule obtenue, contenant un gramme de cellules desséchées. 

  
 <EMI ID=284.1> 

  
rique. De plus, on ne remarque aucune fuite de cellules, ce qui est la preuve d'une immobilisation appropriée .

Exemple 26.

  
100 parties d'une solution aqueuse contenant 5% de

  
 <EMI ID=285.1> 

  
 <EMI ID=286.1> 

  
 <EMI ID=287.1> 

  
ambiante pendant plus de 2 heures pour obtenir un sol complexe.

  
Le sol est homogène mais plutôt plus trouble que le sol de PVA.

  
On immobilise 3 parties de levure desséchée du commerce (Oriental Yeast Co., Ltd.) avec 20 parties du sol complexe en appliquant la même processus que celui décrit dans 1' exemple 23. La pellicule

  
 <EMI ID=288.1> 

  
 <EMI ID=289.1> 

  
 <EMI ID=290.1> 

  
 <EMI ID=291.1> 

  
lis1&#65533;a.

  
 <EMI ID=292.1> 

  
100 parties d'une solution aqueuse contenant 5%

  
 <EMI ID=293.1> 

  
 <EMI ID=294.1> 

  
 <EMI ID=295.1>  on ne remarque aucune fuite de cellules.

REVENDICATIONS.. 

  
1. Procédé de préparation d'un gel complexe .hydrophile, caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger une solution aqueuse d'un composé polymère soluble dans l'eau choisi <EMI ID=296.1> 

  
la carboxyméthylcellulose, avec un tétraalkoxysilane répondant à la formule générale : Si(OR)4, dans laquelle R représente un groupe alkyle comprenant jusqu'à 12 atomes de carbone,

  
à hydrolyser le mélange résultant par l'addition d'un acide

  
 <EMI ID=297.1> 

  
complexe homogène, et, ensuite, à gélifier le sol .



  "Process for preparing a hydrophilic complex gel".

  
The present invention relates to a process for

  
preparation of a homogeneous hydrophilic complex by the formation

  
of a lyogel or xerogel, endowed with an interesting compatibility and affinity with a biological substance, which can be used as

  
a support matrix for microbial cells and constituting

  
an excellent pharmaceutical product. The invention is also

  
relating to a method for immobilizing microbial cells

  
endowed with enzymatic activities, which consists in imprisoning these

  
cells inside the gel matrix constituted by the <EMI ID = 1.1>

  
is obtained from a water soluble polymer and a silicate.

  
Enzymes are biological catalysts with specific properties and very high efficiency. They can be used to catalyze almost any type of chemical reaction. Enzymatic reactions are carried out

  
under conditions milder than chemical reactions and not

  
l Producing no harmful substances. In recent years, attention has been particularly focused on the important problem of environmental pollution in industry.

  
chemical sort.

  
Therefore, it is very advantageous to use

  
enzymes in the chemical industry. The industrial application of enzymes or microorganisms has been carried out using intact microorganisms or soluble enzyme preparations.

  
 <EMI ID = 2.1>

  
single fermentation or batch reaction. If enzymes and microorganisms can be stabilized and recovered economically without inactivation, it will be possible to use biocatalysts more intensively in industry.

  
The immobilization of catalysts offers a means of achieving several objectives. The immobilized enzymes are useful in technological applications as well as in medical and analytical applications. Most studies relating to immobilization have involved cell-free enzymes, but in recent years there has been increasing attention towards the use of immobilized whole microbial cells. This system avoids the need for cell separation, enzyme extraction, and enzyme purification prior to immobilization. Immobilized cells are also more easily applicable to the catalysis of sequential reactions and allow in situ regeneration of cofac-

  
 <EMI ID = 3.1>

  
Continuing a multiple enzyme system in the immobilized state, this would mean that the traditional fermentation process could be replaced by a process using immobilized cells.

  
The disadvantages associated with the use of immobilized cells are the cost of the support matrix and the

  
loss of catalytic activity, or the difficulty of maintaining the integrity of the cells during immobilization. In particular, most cells and microbial enzymes are so unstable that subjecting them to an immobilization process leads to a decrease in their enzymatic activities and changes the specificity of their activities. he

  
 <EMI ID = 4.1>

  
practice without incurring the previously mentioned drawbacks. Therefore, some immobilization methods of easy and wide application have been developed.

  
the present invention relates to a method of immobilizing microbial cells having enzymatic activity under very mild conditions without reducing the activity thereof, and demonstrates certain interesting chemical, physical and biological properties of microbial cells immobilized thus obtained.

  
Micro-cell immobilization processes

  
 <EMI ID = 5.1>

  
to a support, the crosslinking process, the imprisonment process

  
 <EMI ID = 6.1>

  
Among these four categories, the process of imprisonment by freezing,

  
 <EMI ID = 7.1>

  
the gel matrix, is widely used in practice. The pro-

  
 <EMI ID = 8.1>

  
following faults. The processes of imprisoning microbial cells by gel formation lead to a significant decrease in the enzymatic activities of these cells being

  
 <EMI ID = 9.1>

  
 <EMI ID = 10.1>

  
 <EMI ID = 11.1>

  
 <EMI ID = 12.1>

  
 <EMI ID = 13.1>

  
room temperature so as to get the gel trapped

  
 <EMI ID = 14.1>

  
tee, is unstable at comparatively high temperatures

  
 <EMI ID = 15.1>

  
In addition, the chemical processes used for obtaining gel matrices by means of crosslinking reagents are too powerful and destructive to be used with biological substances. This is due to the high reactivity of the crosslinking reagents, this high temperature as well as the extremely high or low pH of the gelation reaction. For example, when using the method of freezing imprisonment

  
of polyacrylamides, the acrylamide monomer is polymerized

  
with N, N'-methylene-bis-acrylamide in the presence of a catalyst, such as ammonium persulfate. In this case, the enzyme is often inactivated by the highly reactive catalyst. Therefore, the pH and temperature range of the gelation reaction must be carefully chosen in order to maintain its properties.

  
 <EMI ID = 16.1>

  
(1973)). In addition, the use of gels obtained in the pharmaceutical and food industry must be avoided.

  
 <EMI ID = 17.1>

  
 <EMI ID = 18.1>

  
that enzymes can be trapped inside gel matrices formed from polyvinyl alcohol polymers, by dissolving the enzymes and polyvinyl alcohol polymers in water and mixing them with water. boric acid or sodium borate to get the gel trapping the enzymes. According to the patent application cited above, the enzymes can be immobilized without significant denaturation at gel temperatures below 45 [deg.] C. However, since gels can only be obtained at alkaline pHs, this process can only be applied to enzymes which are stable in alkaline medium.

  
 <EMI ID = 19.1> at and mud 904

  
Other crosslinking processes using high energy radiation, such as gamma rays, electronic rays or X-rays, are difficult to apply since they require extensive equipment and great precautions. to prevent physiological effects from high energy rays (reference H. Maeda; Biotech. & Bioeng.,
15, 607 (1973 ".

  
The immobilized enzymes or microorganisms obtained by traditional geh entrapment methods are physically loose and exhibit particularly low mechanical strength when wet. Thus, it is difficult to use these gels in continuous reactions over a long period of time. When

  
 <EMI ID = 20.1>

  
However, they are crushed by the water pressure and a satisfactory flow rate for the reaction mixture cannot be obtained.

  
Other previous publications in this field are summarized by F. Katchlski & I. Silman in "Effect of the micro-environment on the mode of action of immobilized enzymes":
Advance in Enzymology, 34, 445 (19-il ".

  
The plaintiff has studied in depth

  
 <EMI ID = 21.1>

  
 <EMI ID = 22.1>

  
silica is a compound which is not harmful to biological organisms and inexpensive. When mixing soil

  
of silica and silica gel manufactured by traditional means

  
 <EMI ID = 23.1>

  
annuities conditions, it is not possible to obtain a lyogel

  
 <EMI ID = 24.1>

  
 <EMI ID = 25.1>

  
 <EMI ID = 26.1>

  
although the nature of polymeric compounds has changed dramatically. For example, when silica sol is added to the aqueous solution of polyvinyl alcohol (referred to as PVA hereafter), two layers are separated (5 to 20% silica, 1 to 5% PVA). Above pH 5, the mixture separates completely as two layers, one containing silica and the other containing PVA. Below pH 5, the silica disperses in the PVA layer and a coacervation product is formed. The desired homogeneous transparent sol or gel does not form at any pH. In addition, salts of inorganic silicates such as orthosilicate cannot form a homogeneous solution with PVA by means of acid hydrolysis, so that the desired homogeneous transparent complex gel cannot be obtained.

  
According to the present invention, a process for preparing a hydrophilic complex gel is provided by mixing a water-soluble polymer and an organic silicate, in

  
 <EMI ID = 27.1>

  
soft editions, so that a hydrophilic complex gel is obtained which has no deleterious effect on the activity of biological substances such as microbial cells or enzymes, and which is useful for immobilizing microbial cells.

  
 <EMI ID = 28.1>

  
pharmaceutical product.

  
It has been found that a tetraalkoxysilane such as

  
 <EMI ID = 29.1>

  
aqueous solution of a water soluble polymer such as al-

  
 <EMI ID = 30.1>

  
 <EMI ID = 31.1>

  
It was further noted that the homogeneous completeness soil obtained is <EMI ID = 32.1>

  
luble in water. It has also been found that it is possible to immobilize microbial cells possessing enzymatic activity by trapping them inside the gel matrix without a decrease in their enzymatic activity since said said

  
complex sol is gelled under very mild conditions.

  
Therefore, one of the most important objects of the present invention is to provide a hydrophilic gel which is insoluble in water and inexpensive to obtain, and which exhibits excellent compatibility and affinity with the biological substance.

  
Another object of the present invention is to provide a hydrophilic gel matrix which is easily usable for the immobilization of microbial cells exhibiting enzymatic activity.

  
Another object of the present invention is to provide means for immobilizing microbial cells while

  
by allowing these to retain at least more than 50% of their enzymatic activity compared to the activity that the untreated microbial cells initially show.

  
Finally, still another object of the present invention is to provide immobilized microbial cells which can be used in a continuous process with a column-shaped reactor, or in a batch process with agitation.

  
Other details and particularities of the invention will be corroborated by the description below, given by way of non-limiting example and with reference to the accompanying drawing, tooth the single figure gives the relationship between the degree of conversion of D -glucose

  
 <EMI ID = 33.1>

  
enzymatic tion. The ordinate represents the conversion rate expressed as a percentage by weight and the abscissa represents the number of times the enzyme preparation is used. Curves 1 and 2 show the results obtained respectively with these immobilized cells and untreated cells.

  
The hydrophilic complex gel according to the present invention is obtained by reacting a water soluble polymer and a tetraalkoxysilane to form a homogeneous sol, this gel then being gelled under very mild conditions. The tetraalkoxysilane is hydrolyzed in the presence of an acid in an aqueous solution of the water soluble polymer to close a homogeneous sol. The microbial cells exhibiting enzymatic activity are added to the sol thus obtained. The mixture is gelled by adjusting the pH to form a complex lyogel, or dried after adjusting the pH to form a water insoluble xerogel, the lyogel or xerogel trapping the cells without decreasing their enzymatic activity.

  
The water-soluble polymer compounds used in the context of the present invention have many

  
 <EMI ID = 34.1>

  
forming strong hydrogen bonds with acidic -OH groups of the silicate by dehydration. The water-soluble polymeric compounds shown in Table 1 can be used.

  
TABLE 1.

  
(A) Natural polymer compounds and their derivatives.

  
1. Cellulose; carboxymethylcollulose, methylcellulose,

  
ethylcellulose, hydroxyethylcellulose.

  
2. Starches; hydroxyethyl starch, carboxymethyl starch.

  
3. Other polysaccharides.-. mannan, dextran, chitosan, pullu-

  
lan, guar gum, locast bean oil, tragacanth, xanthan gum, agar, sodium arginate.

  
4. Proteins; gelatin, albumin.

  
(B) Synthetic polymer compounds

  
 <EMI ID = 35.1>

  
The preferred water-soluble polymers used in the context of the present invention may consist of

  
by a polyvinyl alcohol having an average polymerization rate of between 500 and 2000, and a saponification rate of the order of 70 to 100%, a commercial gelatin of horn quality which has a gel strength of more than 200 g (ball) / 5

  
 <EMI ID = 36.1>

  
commercial boxymethylcellulose of edible quality which has a degree of carboxylation between 0.4 and 0.8 and a content

  
sodium of the order of 7.0 to 8.5%.

  
The water-soluble polymeric compound is solubilized in water at a concentration exhibiting viscosity.

  
aity less than 10,000 centipoise, preferably less than

  
 <EMI ID = 37.1>

  
viscosity referred to above is measured by means of a rotor

  
 <EMI ID = 38.1>

  
 <EMI ID = 39.1>

  
within the scope of the present invention are those corresponding to the structural formula Si (OR) 4, formula in which R represents

  
an alkyl group containing up to 12 carbon atoms, for example methyl, ethyl, propyl, butyl, octyl

  
or lauryl. In order to obtain the homogeneous complex sol, compounds in which R represents a

  
alkyl group containing up to 3 carbon atoms. Tetraethoxysilane appears to be the most suitable compound.

  
The water soluble polymer compound is mixed

  
with the previously mentioned tetraalkoxysilane, and then the pH of the mixture is adjusted below 3 with acid or <EMI ID = 40.1>

  
salt with an acidic character which does not exert any detrimental effect on the enzymatic activities of microbial cells. The acids or acid salts which can be used in the context of the present invention are given in Table 2.

  
TABLE 2.

  
 <EMI ID = 41.1>
(B) Organic acids: acetic acid, glutamic acid, acid <EMI ID = 42.1>

  
as, citric acid, tararic acid.

  
 <EMI ID = 43.1> ammonium.

  
The amount of tetraalkoxysilane required for the aforementioned admixture with the aqueous solution of water soluble polymer varies depending on the type of silane compound and the properties of the water soluble polymer used. The amount of SiO contained in the tetraalkoxysilane, calculated

  
 <EMI ID = 44.1>

  
at 300% (weight / weight) based on the dry weight of the polymer solu-

  
 <EMI ID = 45.1>

  
 <EMI ID = 46.1>

  
the solubility in water of the gel formed increases significantly.

  
 <EMI ID = 47.1>

  
the gel becomes brittle. The properties of the gel depend on the

  
 <EMI ID = 48.1>

  
than water soluble polymer. For example, it is possible to use PVA having an average polymerization rate of between 500 and 2000 and a saponification rate of the order of 70 to 100%,

  
 <EMI ID = 49.1>

  
particularly preferably greater than 50%, in the case of a totally saponified PVA, while it is necessary <EMI ID = 50.1>

  
a lower rate of saponification.

  
During the initial stage of the reaction process,

  
 <EMI ID = 51.1>

  
 <EMI ID = 52.1>

  
 <EMI ID = 53.1>

  
 <EMI ID = 54.1>

  
at room temperature while heating it to a temperature

  
 <EMI ID = 55.1>

  
 <EMI ID = 56.1>

  
 <EMI ID = 57.1>

  
 <EMI ID = 58.1>

  
 <EMI ID = 59.1> <EMI ID = 60.1>

  
 <EMI ID = 61.1>

  
The resulting soil can be stored for a_long

  
 <EMI ID = 62.1>

  
 <EMI ID = 63.1>

  
moL ::.

  
 <EMI ID = 64.1>

  
 <EMI ID = 65.1>

  
 <EMI ID = 66.1>

  
Complex gels formed under different conditions from

  
of the water soluble polymer compound have different degree

  
turbidity. For example, the complex sol formed from gelatin and tetraethoxysilane is converted into a transparent gel below!

  
of pH 4. The most cloudy gel is obtained at pH 5, and above

  
from pH 7 the gel becomes semi-transparent.

  
The complex gels obtained are usually classified

  
Sés in the category of lyogels according to whether they contain a large amount of water or in the category of xerogels according to whether they contain a small amount of water. In the latter type of gel, the moisture in the gel is almost completely removed by the drying process. In accordance with the present invention, the sol components do not separate, but retain the complex homogeneous state throughout sol formation, gel formation and xerogel formation. The xerogels obtained are insoluble or hardly soluble in water but show no hydrophilic property.

  
As indicated in the examples given below, the properties of the xerogel obtained depend on the nature of the water-soluble polymer used and also on the ratio of

  
 <EMI ID = 67.1>

  
as well as the degree of resistance and fragility of the gel increase

  
 <EMI ID = 68.1>

  
becomes more flexible as the amount of polymer is increased. Regarding the effect of the water-soluble polymer

  
 <EMI ID = 69.1>

  
tion of the rate of saponification of the PVA used. In the case of a

  
 <EMI ID = 70.1>

  
 <EMI ID = 71.1>

  
 <EMI ID = 72.1> <EMI ID = 73.1>

  
 <EMI ID = 74.1>

  
small but must be at least more than 20% w / w.

  
According to the present invention, the microbial cells endowed with enzymatic activities can be immobilized under very mild conditions by trapping them inside the matrix of the hydrophilic complex gel mentioned previously obtained from the water-soluble polymer compound and silicate. The microbial cells are added to the homogeneous soil mentioned above without any adjustment of the pH or at high levels.

  
basic salts as shown in Table 3.

  
TABLE 3.

  
 <EMI ID = 75.1> <EMI ID = 76.1> <EMI ID = 77.1>

  
The microbial cells that can be used

  
in the context of the present invention are dry cells, wet cells from a broth by centrifugation

  
or filtration or the cultured broth itself. These microbial cells are classified into five groups, namely bacteria, actinomycetes, fungi, yeasts and algae.

  
The bacteria of the first group, belonging to the class of schizomycetes, are of the genus: Pseudomonas, Acetobacter, Glucono-

  
 <EMI ID = 78.1>

  
 <EMI ID = 79.1>

  
etc. Actinomycetes of the second group, belonging to the class

  
 <EMI ID = 80.1>

  
 <EMI ID = 81.1> <EMI ID = 82.1>

  
 <EMI ID = 83.1>

  
ARX, "The genera of Fungi sporulating in pure culture" Verlag von J. Cramer, and H.L. Barnett & Barry B. Hunter, "Illuatrated genera of Imperfect Fungi" 3rd edition, (1970); Burgess Publiahing Company). The yeasts of the fourth group, belonging to the class of Ascomycetes, are of the genus: Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenula: Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Kloechera, etc. (J. Lodder, "The yeast A taxonomic study" 2nd edition (1970 ); North-Holland Publishing Company). The algae of the fifth group are of the unicellular genus

  
 <EMI ID = 84.1>

  
Spirulina with regard to blue-green algae (H. Tamiya,

  
 <EMI ID = 85.1>

  
 <EMI ID = 86.1>

  
Most of these microbial cells are

  
 <EMI ID = 87.1>

  
lares of individual microorganisms belonging to groups

  
 <EMI ID = 88.1>

  
or the width of each cell used in the context of the present invention is of the order of 1 to 20 microns. Microbial cells can be dispersed in aqueous solvents. Some types of actinomycetes of the second group and fungi of the third group are longer

  
 <EMI ID = 89.1>

  
 <EMI ID = 90.1>

  
 <EMI ID = 91.1>

  
inside the gel matrix referred to above

  
 <EMI ID = 92.1>

  
 <EMI ID = 93.1> <EMI ID = 94.1> are preferably ground to be no more than 20 microns.

  
Mechanical homogenization in water can be used for this purpose.

  
The microbial cells used in the context of the present invention, chosen from the five groups mentioned above, have more than one enzymatic activity. Enzymes are classified according to the following five groups.

  
TABLE 4.

  
 <EMI ID = 95.1> lase, phenol oxidase, monoamine oxidase, cytochrome c reductase.
(B) Glutamate-oxaloacetate-trans-aminase transferases, macrolide 3-acyltransaminase, 16-membered macrolide 3-acyltransferase, ATB: nucleoside-5 'monophosphate pyrophosphotransferase. <EMI ID = 96.1> lipase, lactase, penicillin amidase, alkaline phosphatase, amino acylase, urease, cellulase. <EMI ID = 97.1> <EMI ID = 98.1> naso.

  
The enzymes used in the context of the present invention are intracellular enzymes existing inside the cell or the microbial mycelium, or inside the organella of biological organisms. In the present invention, the term "activity" encompasses not only enzymatic activity but also other biological activities, such as, for example, activities as inhibitors, coenzymes, antibiotics, antigens, antibodies, etc.

  
 <EMI ID = 99.1>

  
microbial should be chosen taking into account the stability

  
 <EMI ID = 100.1>

  
adjusts this to pH 4 - 8, preferably pH 5 - 7. When

  
immobilization of microbial cells, it is not necessary in most cases to adjust the pH due to the

  
that the microbial cells themselves exhibit buffering activity. The pH of the aforementioned mixture usually falls in the range of 5 to 6.5 after addition of the cells.

  
The dry weight of microbial cells to be added is less than 1000% (w / w), preferably of the order of
20 to 500% (w / w), based on the dry weight of the homogeneous complex soil. After the addition. microbial cells in the homogeneous complex soil, the mixture is thoroughly stirred so as to disperse it homogeneously. The gelation reaction of the soil containing the microbial cells occurs at any temperature. However, since the enzymes are unstable at higher temperatures, the gelation reaction is carried out.

  
 <EMI ID = 101.1>

  
between 10 [deg.] C and 40 [deg.] C. The reaction of

  
 <EMI ID = 102.1>

  
the sol gels completely at pH 6.0 by continuous stirring at room temperature for 10 to 20 minutes.

  
One of the most important advantages of the present invention is the use of mild conditions for immobilization, conditions under which enzymatic activities can be maintained throughout the entire process without significant inactivation.

  
The resulting complex gel containing the microbial cells is dried and converted to the desired shape. We realize <EMI ID = 103.1>

  
ratably stable and the entire process can be carried out

  
of the present invention at room temperature. For this

  
which are unstable bacterial cells such as those used for the enzymatic synthesis of L-tyrosine, we realize

  
the entire process at a temperature below 5 [deg.] C in order to

  
to maintain the enzymatic activities and preferably used for the drying process a desiccation by evaporation of ice. As long as the temperature is maintained within the range of temperatures mentioned above, virtually no inactivation of the enzyme is observed. To bring

  
the lyogel mentioned above immobilizing the microbial cells in different forms, according to the present invention, the traditional methods are used. A molding can be made before or after drying. In particular, hydrophilic or hydrophobic organic solvents in which the lyogel comprises

  
plex is practically insoluble, can be used for the

  
i molding. The following organic solvents given can be used

  
in Table 5.

  
TABLE 5.

  
(A) Alcohols; methyl alcohol, ethyl alcohol, n-propyl alcohol, n-butyl alcohol, ethylene glycol, glycerol. <EMI ID = 104.1> <EMI ID = 105.1>
(D) Alkanes: n-heptane, n-paraffin.
(E) Aromatics: Benzene, toluene, xylene.
(F) Others: methylene chloride.

  
In the context of the present invention, the forms of the microbial cells immobilized by the gel can be of

  
 <EMI ID = 106.1>

  
bind, they can consist of spheres, granules,

I

  
pellets, filaments, etc. When inserting .i cells <EMI ID = 107.1>

  
good results are obtained using the continuous reaction.

  
i

  
 <EMI ID = 108.1>

  
They may be in the form of a film or a strip and in other cases they consist of a powder of irregular granules. The average thickness and / or diameter of the molded gel containing the microbial cells can be between 0.2 and

  
5 mm, and preferably between 0.4 and 1.0 mm. When molded gels of this thickness are used, effective contact between the immobilized cells and their substrate can be achieved.

  
In addition, a suitable flow rate for the reaction mixture through the column reactor can also be obtained.

  
The desired shape can be obtained by casting through a slit since the complex lyogel containing

  
microbial cells is a soft paste. For example, the

  
lyogel of the present invention is converted into a long cylinder

  
by means of casting through a slit in organic solvent or in air, and is annuity dried. Lyogel can also

  
 <EMI ID = 109.1>

  
 <EMI ID = 110.1>

  
obtained in this way have high specific surface areas.

  
Spray drying can also be used to obtain the desired shapes. The granules obtained exhibit superficial airs. high specifics and

  
 <EMI ID = 111.1>

  
 <EMI ID = 112.1>

  
industrial, in particular for a question of economy.

  
Good results are also obtained, depending on the

  
 <EMI ID = 113.1>

  
 <EMI ID = 114.1>

  
Even if the method is applied to heat unstable microbial cells indicated in Examples 16 and 17 described

  
 <EMI ID = 115.1>

  
 <EMI ID = 116.1>

  
Another suitable form of gel is the skin gel.

  
 <EMI ID = 117.1> <EMI ID = 118.1>

  
 <EMI ID = 119.1>

  
 <EMI ID = 120.1>

  
 <EMI ID = 121.1>

  
continuous and discontinuous. For example, we can use the cells

  
 <EMI ID = 122.1>

  
 <EMI ID = 123.1>

  
 <EMI ID = 124.1>

  
 <EMI ID = 125.1> ........

  
high and with varying degrees of ionic concentration.

  
The immobilized microbial cells according to the present invention can be used as catalysts for the biochemical conversion of various substrates not only in a column reaction system but also in a batch fractionation reaction system. Using the traditional batch and stirred fractionation reaction system, no significant loss of microbial cells from the gel or destruction of the molded gel was noticed. Furthermore,

  
the water soluble polymeric compound can be recovered from the microbial cell immobilizing gel and used repeatedly until the activities have decreased after a long period of use. The soluble polymer compound

  
 <EMI ID = 126.1>

  
 <EMI ID = 127.1>

  
by repairing cells by centrifugation or filtration, and then adjusting the pH.

  
The following examples illustrate embodiments of the present invention but it will be noted that they are given by way of non-limiting examples and that they are mainly intended to further illustrate the characteristics of the process of the invention.

Example 1.

  
50 g of an aqueous solution are mixed and stirred

  
 <EMI ID = 128.1>

  
 <EMI ID = 129.1>

  
HCl IN. The cloudy mixture gradually turns into a transparent, colorless, homogeneous complex sol at room temperature.

  
 <EMI ID = 130.1> w va1 v w ws sw

  
a transparent, colorless, homogeneous complex lyogel without any separation between the components of the lyogel, such as PVA or tetraethoxyailan. The homogeneous sol is also gelled without neutralization by storing it for a long period of time to form a complex lyogel, which is also transparent, homogeneous and insoluble in water at room temperature.

  
The homogeneous complex lyogel obtained is dried by ventilation room temperature so as to obtain a transparent homogeneous complex xerogel which is insoluble in tap water.

  
The complex xerogel thus obtained swells without its components separating, when it is treated in boiling water for one hour. In the case of a complex xerogel obtained after neutralization and drying by ventilation as mentioned previously, the amount solubilized is * 50% relative to the initial weight of the complex xerogel, and the degree of swelling is of the order of 30 times in 'boiling water. In the case of complex sol without neutralization, the amount dissolved is 30% and the degree of swelling is of the order of 12 times in boiling water.

Example 2.

  
By proceeding as described in Example 1, the former

  
 <EMI ID = 131.1>

  
homogeneous complex lyogel. The reaction process, the inter-

  
 <EMI ID = 132.1>

  
those of Example 1. The compiled xerogel obtained with or without neutralization is insoluble in tap water. The solubilized amount is less than 3% and the degree of swelling is

  
 <EMI ID = 133.1>

  
 <EMI ID = 134.1>

  
 <EMI ID = 135.1>

  
 <EMI ID = 136.1>

  
 <EMI ID = 137.1>

  
 <EMI ID = 138.1>

  
similar (i.e., colorless and transparent) to that

  
of Example 1. The complex xerogel obtained subsequently, with or without neutralization, is harder and more brittle than that of Example 1. The gel is insoluble in tap water, the amount solubilized is 1 of the order of 2% and the degree of swelling of about 2 times in boiling water.

Example 4.

  
By proceeding as described in Example 1, except that 2 g of tetraethoxysilane are added to 5 g of an aqueous solution containing 10% PVA (polymerization rate of

  
1700 and saponification rate of 87), a homogeneous complex lyogel is obtained, which has an appearance very similar to that of the example

  
1. The complex xerogel formed with or without neutralization is insoluble in tap water, the solubilized amount is less than 9%, and the degree of swelling is less than 6 times.

  
in boiling water.

Example 5.

  
A reaction similar to that of

  
Example 4, using 10 g of tetraethoxysilane and 5 g of an aqueous solution containing 10% PVA (polymerization rate of

  
1700 and saponification rate of 87). The characteristics of the

  
 <EMI ID = 139.1>

  
 <EMI ID = 140.1>

  
final complex xerogel obtained with or without neturization is insoluble in tap water, its solubilized amount is

  
 <EMI ID = 141.1>

  
in boiling water.

  
 <EMI ID = 142.1>

  
 <EMI ID = 143.1>

  
aqueous solution containing 5% PVA (rate of polymerization of

  
1100, completely saponified) and 0.5 g of aluminum chloride.

  
Stirring is continued for about 2 hours and a homogeneous, transparent and colorless complex sol is obtained. The soil thus obtained is dried under ventilation and a film is obtained

  
of transparent homogeneous complex xerogel. This film is insoluble even by extraction in boiling water and retains its original film form. The soil thus ob-

  
 <EMI ID = 144.1>

  
a white color. It is then dried by ventilation and

  
 <EMI ID = 145.1>

  
in tap water and retains its original shape in boiling water.

Example 7.

  
 <EMI ID = 146.1>

  
of gelatin in 66 g of water, stirred thoroughly while heating and 15 g of tetraethoxysilane are added. After adjusting the pH

  
at 3 or below 3 with dilute HCl, the mixture is stirred continuously at room temperature for 3 hours, after which time the mixture becomes transparent. The homogeneous complex sol thus obtained is left to stand at room temperature ot a homogeneous, transparent complex lyogel is obtained. After adjusting the pH of the lyogel with dilute NH OH, the complex gel becomes cloudy at a pH of about 4.5 and very cloudy at a pH of about 5 to 6, but again becomes semi-transparent again at a pH of about 4.5. -desus of 7. The homogeneity is maintained and no water layer is noticed. The pH value influences the rest period necessary for the formation of the complex lyogel. By drying homogeneous complex soils and homogeneous complex lyogels, <EMI ID = 147.1>

  
 <EMI ID = 148.1>

  
rents degrees of turbidity as a function of pH variation
(transparent at acidic pH, cloudy and milky at pH of the order of 5 to 6, and semi-transparent above pH 8). Xerogel is insoluble in water at room temperature and swells in boiling water without losing its original shape.

Example 8.

  
100 g of an aqueous solution containing 5% are diluted

  
 <EMI ID = 149.1>

  
gene while heating, and 15 g of tetraethoxysilane are added.

  
 <EMI ID = 150.1>

  
the mixture is stirred at room temperature for about 2 hours until a homogeneous, transparent complex sol is obtained. This sol is neutralized with dilute NaOH and a homogeneous complex lyogel is obtained after about 30 minutes. Either ventilation drying of the homogeneous complex soil without neutralization, or ventilation drying of the homogeneous complex lyogel obtained after neutralization, leads to the formation of a cloudy, milky xerogel which is found to be brittle when physical force is applied. Only a small amount of starch is extracted from the xerogel in running water and 50% of this starch is extracted in boiling water. The original shape is retained in both cases and swelling is observed, especially in boiling water.

Example 9.

  
100 g of an aqueous solution containing 5% of carboxymethylcollulose in 66 g of water are added, the mixture is stirred thoroughly at a temperature of 45 [deg.] C, and then 20 g of tetraethoxysilane is added to the mixture. . The pH of the mixture is adjusted

  
 <EMI ID = 151.1> <EMI ID = 152.1>

  
 <EMI ID = 153.1>

  
 <EMI ID = 154.1>

  
a homogeneous, transparent complex xerogel. Complex xerogel

  
 <EMI ID = 155.1>

  
ambient erasure. Even in boiling water it is practically insoluble, and the degree of swelling is in the order of a factor of 2.

Example 10.

  
 <EMI ID = 156.1>

  
aqueous solution containing 5% polyacrylate, diluted with 66 g of water and the mixture stirred at room temperature for about 2 hours. The mixture gradually takes the form of a transparent homogeneous complex sol, which is neutralized with 17 g

  
 <EMI ID = 157.1>

  
semi-transparent complex. The homogeneous complex sol formed without neutralization and the homogeneous complex lyogel obtained by neutralization are dried to obtain xerogels, respectively.

  
 <EMI ID = 158.1>

  
obtained dissolves in boiling water and the other half remains in the form of a soft hydrogel, insoluble in boiling water.

Example 11.

  
 <EMI ID = 159.1>

  
 <EMI ID = 160.1>

  
4000), diluted with 66 g of water and stirred at room temperature. By adding 1 g of IN HCl to

  
 <EMI ID = 161.1>

  
homogeneous transparent and colorless. We neutralize this soil with

  
 <EMI ID = 162.1> <EMI ID = 163.1>

  
 <EMI ID = 164.1>

  
 <EMI ID = 165.1>

  
 <EMI ID = 166.1>

  
me dissolve leaving a cloudy gel. This solid xerogel rather tends to destroy itself.

Example 12.

  
100 parts of an aqueous solution containing 10% PVA (polymerization rate of 1700 and saponification rate of 99.5) are mixed with 321.5 parts of distilled water, 28.5

  
 <EMI ID = 167.1>

  
for more than 2 hours at room temperature and a homogenized and transparent sol is obtained having a pH of about 3,

  
 <EMI ID = 168.1>

  
Si02). Part of dry, commercially available baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) is suspended

  
 <EMI ID = 169.1>

  
 <EMI ID = 170.1>

  
yeast by stirring, the pH is adjusted to 7.0 with a solution of

  
 <EMI ID = 171.1>

  
spontaneously at room temperature. A yellowish-brown film is obtained containing the yeast cells. A part of the film immobilizing one g of the yeast cells is removed and incubated in 50 g of an aqueous solution

  
 <EMI ID = 172.1>

  
 <EMI ID = 173.1>

  
after a few minutes and after 30 minutes a large quantity of gas is evolved from the entire surface of the film.

  
 <EMI ID = 174.1>

  
 <EMI ID = 175.1>

  
30 hours. The reaction is followed by measuring the decrease in <EMI ID = 176.1>

  
 <EMI ID = 177.1>

  
is carried out in proportion to the reaction time. A slightly fragrant odor peculiar to alcoholic fermentation is detected. An increase in the turbidity of the glucose solution, which is believed to be due to the fact that the

  
 <EMI ID = 178.1>

  
served and therefore the mixture is almost transparent. As a control, the same reaction is carried out using

  
1 g of non-immobilized, dried yeast cells. In the early stages of the reaction a slight amount is given off.

  
 <EMI ID = 179.1>

  
 <EMI ID = 180.1>

  
 <EMI ID = 181.1>

  
 <EMI ID = 182.1>

  
 <EMI ID = 183.1>

  
 <EMI ID = 184.1>

  
 <EMI ID = 185.1>

  
 <EMI ID = 186.1>

  
slight agitation is required for the reaction to continue. From the foregoing results, it is demonstrated that microbial cells are firmly imbibilized by the method of the present invention while maintaining fermentation activity equal to that of native cells.

  
 <EMI ID = 187.1>

  
 <EMI ID = 188.1>

  
the one described in example <1> 2. Four parts of yeast des-

  
 <EMI ID = 189.1>

  
are suspended in 5 parts of water. We mix the <EMI ID = 190.1>

  
spread the gel on a plate and. it is ventilated so as to obtain a yellowish-brown film containing the yeast cells. A tab of the film containing

  
1 g of immobilized cells is cut out and incubated in 50 g of an aqueous solution containing 5% of glucose at 30 [deg.] C to carry out the fermentation as in example 12- A large amount of CO2 gas is released even in the cells. early stages of incubation, as observed in the control experiment.

  
Once fermentation is complete, the film is removed from the medium and plunged again into another 50 g aqueous solution containing 5% glucose, producing gas

  
 <EMI ID = 191.1>

  
load-bearing than that observed in the previous test carried out with native cells. This fermentation is repeated 5 times, and

  
 <EMI ID = 192.1>

  
 <EMI ID = 193.1>

  
fermentation using 1 g of non-immobilized cells

  
 <EMI ID = 194.1>

  
immobilized cells. In these tests, the yeast cells are collected by centrifugation and resuspended

  
 <EMI ID = 195.1>

  
from the 50 g of the aqueous solution containing 5% glucose reaches more than 85% of the theoretical value.

Example 14.

  
 <EMI ID = 196.1>

  
of PVA (polymerization rate of 2000 and saponification rate

  
 <EMI ID = 197.1>

  
ethoxysilane and part of HCl IN, and then stirred with

  
 <EMI ID = 198.1> <EMI ID = 199.1>

  
of the order of 3, containing 5% solids. Two parts dry baker's yeast, commercially available
(Saccharomyces cerevisiae) are suspended in 4 parts of water. The suspension is mixed with 20 parts of the PVA-SiO 2 complex sol and stirred thoroughly. The gel thus obtained is spread out on a plate and dried by ventilation at room temperature so as to obtain a yellowish-brown film containing 1 g of yeast cells. This film containing 1 g of yeast cells is used for a fermentation test carried out according to the process indicated in example 12. The fermentation takes place at an intermediate rate between that of the example.
12 and that of Example 31. That is to say that the quantity of gas

  
 <EMI ID = 200.1>

  
less than that of non-immobilized cells, but that the quantity

  
 <EMI ID = 201.1>

  
85% of the theoretical value. This result is almost comparable to the result obtained with non-immobilized cells.

Example 15.

  
100 parts of a commercial edible gelatin are mixed with 15 parts of tetraethoxysilane, 66 parts

  
 <EMI ID = 202.1>

  
 <EMI ID = 203.1>

  
obtain a homogeneous and transparent complex soil with a pH of the order of 3, containing 5% solids. Two portions of dried, commercially available baker's yeast are

  
 <EMI ID = 204.1>

  
 <EMI ID = 205.1>

  
 <EMI ID = 206.1>

  
is more brittle and friable than the obtained PVA-Si02 film

  
 <EMI ID = 207.1>

  
the film mentioned above containing 1 g of read cells, it is immersed in 50 g of an aqueous solution containing 5% glucose, and the fermentation test is carried out in a manner

  
 <EMI ID = 208.1>

  
fermentation test and reaches more than 85% of the theoretical value. During the fermentation test, no microbial cells were noticed escaping from the skin. This fact showed that the yeast cells are firmly immobilized by the method of the invention.

Example 16.

  
 <EMI ID = 209.1>

  
similar to that of Example 12, and Erwinia herbicola (ATCC 21434), a strain producing O-tyrosinase, was grown in the following culture medium.

  
Composition of the culture medium for bacteria

  
 <EMI ID = 210.1>

  

 <EMI ID = 211.1>
 

  

 <EMI ID = 212.1>


  
4 g of cultured cells (dry weight: 1 g) from the bac-

  
 <EMI ID = 213.1>

  
centrifugation and immobilized in the same manner as that described in Example 1, except that drying is carried out by evaporation of ice. All the steps of this preparation are carried out below 5 [deg.] C. The activity

  
 <EMI ID = 214.1>

  
mentioned above, containing 20 mg of bacterial cells, is determined by measuring the L-tyrosine synthesized in the following L-tyrosine synthesis medium.

  
Composition of the medium for the formation of L-tyrosine.

  

 <EMI ID = 215.1>


  
As shown in Table 6, activities relating to

  
 <EMI ID = 216.1>

  
The readings prepared in Example 16 are of the order of 85% or more of the activity of the control using non-immobilized bacterial cells. The activities of immobilized bacterial cells <EMI ID = 217.1>

  
 <EMI ID = 218.1>

  
Reaction mixture used for the synthesis of L-tyrosine continuously at a rate of 5 ml / hour to synthesize L-tyroaine. A constant rate is obtained in the column with regard to the synthesis of L-tyrosine after 12 hours of a continuous supply of medium. This rate is maintained even after 24 hours after starting the medium feed, and the reaction rate is maintained at about 0.6 mg / ml.

  

 <EMI ID = 219.1>


  

 <EMI ID = 220.1>
 

  
 <EMI ID = 221.1>

  
 <EMI ID = 222.1>

  
 <EMI ID = 223.1>

  
 <EMI ID = 224.1> obtained using methylene chloride exhibits activity <EMI ID = 225.1> <EMI ID = 226.1>

  
 <EMI ID = 227.1>

  

 <EMI ID = 228.1>


  

 <EMI ID = 229.1>
 

  
 <EMI ID = 230.1>

  
 <EMI ID = 231.1>

  
 <EMI ID = 232.1>

  
 <EMI ID = 233.1>

  
of saponification 99.5) are mixed with 231.5 parts

  
 <EMI ID = 234.1>

  
 <EMI ID = 235.1>

  
room temperature so as to obtain a transparent homogenized sol (hereinafter called complex sol) containing 5% solids, and having a pH around 3. Five parts by weight of commercially available glucose isomerase-type microbial cells ( Nagase Sangyo CO., Ltd; trade name; GI-150; classification: Streptomyces albus

  
 <EMI ID = 236.1>

  
 <EMI ID = 237.1>

  
for 3 minutes. Then, the suspension prepared in 20 parts by weight of the complex sol is added and dispersed by

  
 <EMI ID = 238.1>

  
to form a gel. The gel is poured into a Petri dish and

  
dried under ventilation at a temperature of 55 [deg.] C, and a brown film in which the cells are enclosed is obtained. The film is ground in a mortar, and sieved by means of a sieve with apertures of 0.191 mm so as to obtain fine granules. Microbial glucose isomerase cells

  
 <EMI ID = 239.1>

  
units per gram and the activity of glucose isomerase is

  
 <EMI ID = 240.1> Dea immobilized "granular cells containing

  
1 g of dried cells are incubated with 100 ml of a solution

  
 <EMI ID = 241.1>

  
24 hours. After the incubation, the immobilized cells are separated by filtration and used repeatedly for the same reaction, i.e. six times, in order to examine the sta-

  
 <EMI ID = 242.1>

  
rees. One gram of native cells is incubated on a dry basis under the same conditions. The results are shown in the attached figure. The ordinate of the graph represents the percentage of D-fructose relative to the total solids content of the reaction mixture after each reaction, and the abscissa represents the number of times the enzyme preparation was used in the reaction. . We see on the graph that the quantity

  
 <EMI ID = 243.1>

  
ae found in the initial reaction after 6 reuses in

  
 <EMI ID = 244.1>

  
of the amount in the initial reaction after

  
 <EMI ID = 245.1>

  
sées.

Example 19.

  
50 g of immobilized glucose isomerase cells obtained in the same way as in Example 18 are introduced :. in a 2.5 x 20 cm column maintained at a temperature of

  
 <EMI ID = 246.1>

  
 <EMI ID = 247.1>

  
 <EMI ID = 248.1>

  
 <EMI ID = 249.1>

  
 <EMI ID = 250.1>

  
 <EMI ID = 251.1> <EMI ID = 252.1>

  
 <EMI ID = 253.1>

  
The SV 1 is defined as the flow rate corresponding to the flow of a volume of the mixture of

  
 <EMI ID = 254.1>

  
in the column, within an hour.

Example 20.

  
Immobilized microbial cells having glucose isomerase activity, obtained by the same method as described in Example 18, are loaded into a column reactor and the pressure drops are measured by flow.

  
 <EMI ID = 255.1>

  
Enzyme Technology ", p. 225 (1975) edited by H. Weethall and S.

  
 <EMI ID = 256.1>

  
immobilized microbial cells exhibiting the activity of

  
 <EMI ID = 257.1>

  
 <EMI ID = 258.1>

  
reaction is 6.4 cm. Water is passed through it at the rate of
58 cm per hour by application of an upward flow method. It can be seen that the pressure drop A P / L is 0.315 mH20 / m of bed. A polyacrylamide gel containing immobilized microbial cells containing glucose isomerase

  
 <EMI ID = 259.1>

  
5.438 mH-0 / m of bed, under the same conditions.

Example 21,

  
 <EMI ID = 260.1>

  
that described in Example 18. Fila fungi are cultivated.

  
 <EMI ID = 261.1>

  
 <EMI ID = 262.1>

  
 <EMI ID = 263.1>

  
 <EMI ID = 264.1> Composition of culture medium for; production

  
 <EMI ID = 265.1>

  

 <EMI ID = 266.1>


  
The broth is collected by filtration, 4 g of wet cells (1 g in the dry state) are suspended in
10 ml of 0.1 M phosphate saline buffer, pH 7.0, and the mycelium is crushed using a homogenizer at 18,000 rpm for 3 minutes. The resulting suspension is added to 10 g of PVA-SiO 2 complex sol and stirred at room temperature for 15 minutes. The mixture is poured into a Petri dish and ventilated to room temperature so that 1.5 g of a film of immobilized cells of yellowish-brown color are obtained. One gram of non-immobilized wet cells corresponds to 240 units of glucose oxidase activity while one gram of immobilized cells obtained contains 510 units of this activity.

   The recovery of glucose cxidase activity via this immobilization method is 87% per gram of cells.

  
One unit of glucose oxidase activity is defined

  
 <EMI ID = 267.1>

  
glucose in one minute.

  
 <EMI ID = 268.1>

  
 <EMI ID = 269.1>

  
 <EMI ID = 270.1>

  
stirred, are mixed with 15 parts of tetra-

  
 <EMI ID = 271.1>

  
being stirred for more than 2 hours so as to form a homogeneous, transparent complex sol. The resulting soil contains 5% of

  
 <EMI ID = 272.1>

  
Chlorella fusca producing nitrite reductase in cells is cultivated in the following medium with aeration at one

  
 <EMI ID = 273.1>

  
Composition of the culture medium for the production of nitrite reductase.

  

 <EMI ID = 274.1>


  
Cultured cells are collected by filtration, and 6 g of cells in the wet state (1 g on a dry weight basis)

  
 <EMI ID = 275.1>

  
is mixed with 10 ml of gelatin-Si02 complex sol and

  
stirred at room temperature for 15 minutes. The mixture obtained is poured into a Petri dish and dried by freezing.

  
ice to obtain 2.1 grams of a dark green film containing the immobilized cells. One gram of non-immobilized wet cells contains 2.6 activity units <EMI ID = 276.1>

  
the nitrate reductase activity by this immobilization method is 83% per gram of cells.

  
One unit of nitrate reductase activity is defined as the amount of the enzyme which reduces one micromole of nitrite at 30 [deg.] C for 1 minute.

Example 23.

  
100 parts of an aqueous solution containing 10%

  
of PVA (polymerization rate of 1700; saponification rate of 99.5) are mixed with 221 parts of distilled water, 36 parts of tetrapropylsilicate and 3 parts of IN HCl, the whole being stirred thoroughly while heating to 50 deg .] C for more than 2 hours so as to obtain a homogeneous, transparent complex sol. The resulting sol contains about 5% solids.

  
One part of commercial dried baker's yeast (Oriental Yeast Company., Ltd.) is suspended in 2 parts of water, the suspension is mixed with the sol obtained above and thoroughly dispersed by stirring. The pH is adjusted to

  
 <EMI ID = 277.1>

  
Petri dish and ventilated at a temperature below 30 [deg.] C so as to obtain a film of immobilized cells of yellowish-brown color. A fermentation test is carried out in 50 g of an aqueous solution containing 5% glucose at 30 [deg.] C, using a part of the prepared film containing 1 g of dried cells.

  
Fermentation continues normally and there is a release

  
 <EMI ID = 278.1>

  
the theoretical value. In addition, no loss of cells was noticed during the reaction, so that no turbidity was observed in the reaction mixture throughout the fermentation run.

  
 <EMI ID = 279.1>

  
 <EMI ID = 280.1>

  
of PVA (polymerization rate of 1700; saponification rate of 99.5) are mixed with 27 parts of distilled water, 27 per-

  
 <EMI ID = 281.1>

  
thoroughly at room temperature for more than 2 hours so as to form a homogeneous transparent sol. The resulting sol has a solids content of 5% Two parts of commercial microbial cells with glucose isomerase activity

  
 <EMI ID = 282.1>

  
sification: Streptomyces albus) are immobilized in 20 parts of complex sol by the same method as that described in Example 1. The recovery of the activity by this immobilization method is 82%.

Example 25.

  
100 parts of an aqueous solution containing 5% of commercial edible gelatin are heated to 50 [deg.] C so

  
can be stirred and mixed with 13 parts of tetra-

  
 <EMI ID = 283.1>

  
the whole being stirred for more than 2 hours so as to obtain a transparent homogeneous complex sol. The sol obtained has a solids content of the order of 5%. Two parts of commercial dried baker's yeast are suspended in 3 parts of water and mixed in 20 parts of this complex sol

  
with stirring so as to form a homogeneous solution. The mixture is poured into a Petri dish and it is ventilated so as to obtain a film of immobilized cells of yellowish color. The film obtained is brittle and disintegrates easily. A fermentation test is carried out by: using a tab

  
of the film obtained, containing one gram of dried cells.

  
 <EMI ID = 284.1>

  
rique. In addition, no cell leakage is noticed, which is evidence of proper immobilization.

Example 26.

  
100 parts of an aqueous solution containing 5%

  
 <EMI ID = 285.1>

  
 <EMI ID = 286.1>

  
 <EMI ID = 287.1>

  
ambient for more than 2 hours to obtain a complex soil.

  
The soil is homogeneous but rather cloudier than the PVA soil.

  
3 parts of commercial dried yeast (Oriental Yeast Co., Ltd.) are immobilized with 20 parts of the complex sol by applying the same procedure as described in Example 23. The film is immobilized.

  
 <EMI ID = 288.1>

  
 <EMI ID = 289.1>

  
 <EMI ID = 290.1>

  
 <EMI ID = 291.1>

  
lis1 &#65533; a.

  
 <EMI ID = 292.1>

  
100 parts of an aqueous solution containing 5%

  
 <EMI ID = 293.1>

  
 <EMI ID = 294.1>

  
 <EMI ID = 295.1> no cell leaks were noticed.

CLAIMS ..

  
1. Process for preparing a complex hydrophilic gel, characterized in that it consists in mixing an aqueous solution of a polymer compound soluble in water chosen <EMI ID = 296.1>

  
carboxymethylcellulose, with a tetraalkoxysilane corresponding to the general formula: Si (OR) 4, in which R represents an alkyl group comprising up to 12 carbon atoms,

  
hydrolyzing the resulting mixture by the addition of an acid

  
 <EMI ID = 297.1>

  
homogeneous complex, and, then, to gel the soil.

Claims (1)

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le radical R du tétraalkoxysilane est un groupe alkyle comprenant jusqu'à 3 atomes de carbone. 2. Method according to claim 1, characterized in that the radical R of the tetraalkoxysilane is an alkyl group comprising up to 3 carbon atoms. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le composé polymère soluble dans l'eau est de l'alcool polyvinylique et le tétraalkoxysilane est le tétraéthoxysilane. 3. Method according to claim 1, characterized in that the polymeric compound soluble in water is polyvinyl alcohol and the tetraalkoxysilane is tetraethoxysilane. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisa <EMI ID=298.1> 4. Method according to claim 1, characterized <EMI ID = 298.1> constitue de 5 à 300%par rapport au poids sec du composé polymère soluble dans l'eau. constitutes from 5 to 300% based on the dry weight of the water soluble polymeric compound. <EMI ID=299.1> <EMI ID = 299.1> en ce que le sol complexe homogène est neutralisé avec une base ou un sel basique de manière à former le gel complexe hydrophile. in that the homogeneous complex sol is neutralized with a base or a basic salt so as to form the hydrophilic complex gel. 6. Procédé de préparation d'un xérogel complexe 6. Process for preparing a complex xerogel <EMI ID=300.1> <EMI ID = 300.1> <EMI ID=301.1> <EMI ID=302.1> <EMI ID=303.1> <EMI ID = 301.1> <EMI ID = 302.1> <EMI ID = 303.1> groupe alkyle comprenant jusqu'à 12 atomes de carbone, à hydrolyser le mélange résultant par l'addition d'un acide ou d'un composé de caractère acide de manière à former un sol complexe homogène, et, ensuite, à gélifier le sol par séchage. alkyl group comprising up to 12 carbon atoms, hydrolyzing the resulting mixture by the addition of an acid or a compound of acidic character so as to form a homogeneous complex sol, and, thereafter, gelling the sol by drying. 7. Procédé suivant la revendication 6,caractérisé 7. The method of claim 6, characterized <EMI ID=304.1> <EMI ID = 304.1> comprenant jusqu'à 3 atomes de carbone. comprising up to 3 carbon atoms. 8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le composé polymère soluble dans l'eau est l'alcool polyvinylique et le tétraalkoxysilane est le tétraéthoxy- silane. 8. A method according to claim 6, characterized in that the polymeric compound soluble in water is polyvinyl alcohol and the tetraalkoxysilane is tetraethoxysilane. 9. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé 9. The method of claim 6, characterized <EMI ID=305.1> <EMI ID = 305.1> constitue de 5 à 300% du poids du composé polymère soluble dans l'eau à l'état sec. constitutes from 5 to 300% of the weight of the polymeric compound soluble in water in the dry state. <EMI ID=306.1> <EMI ID = 306.1> en ce que le sol complexe homogène.est neutralisé avec une base ou un sel basique pour former le xérogel complexe hydrophile. in that the homogeneous complex sol is neutralized with a base or a basic salt to form the hydrophilic complex xerogel. 11. Procédé de préparation d'un xérogel complexe hydrophile dans lequel des cellules microbiennes sont immobilisées, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger une solution aqueuse d'un composé polymère soluble dans l'eau choisi dans le groupe formé par l'alcool polyvinylique, la gélatine et 11. Process for preparing a hydrophilic complex xerogel in which microbial cells are immobilized, this process being characterized in that it consists in mixing an aqueous solution of a water-soluble polymer compound chosen from the group formed by polyvinyl alcohol, gelatin and la carboxyméthycellulosé, avec un tétraalkoxysilane répondant carboxymethycellulose, with a tetraalkoxysilane responding à la formule générale : Si(OR)., dans laquelle R représente un to the general formula: Si (OR)., in which R represents a <EMI ID=307.1> <EMI ID=308.1> <EMI ID = 307.1> <EMI ID = 308.1> <EMI ID=309.1> <EMI ID = 309.1> 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le radical R du tétraalkoxysilane est un groupe alkyle comprenant jusqu'à 3 atomes de carbone. 12. The method of claim 11, characterized in that the R radical of the tetraalkoxysilane is an alkyl group comprising up to 3 carbon atoms. 13. Procédé suivant la revendication 11, caracté- risé en ce que le composé polymère soluble dans l'eau est l'al- cool polyvinylique et le tétraalkoxysilane est le tétraéthoxysilane. 13. A process according to claim 11, characterized in that the water soluble polymeric compound is polyvinyl alcohol and the tetraalkoxysilane is tetraethoxysilane. 14. Procédé suivant la revendication 11, caracté- 14. The method of claim 11, character- <EMI ID=310.1> <EMI ID = 310.1> silane constitue de 5 à 300% du pids du composé polymère soluble dans l'eau à l'état sec. silane constitutes from 5 to 300% of the weight of the polymeric compound soluble in water in the dry state. 15. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules microbiennes ont une largeur de l'ordre de 0,5 à 1,5 micron . et une longueur de l'ordre de 1 à 15. The method of claim 11, characterized in that the microbial cells have a width of the order of 0.5 to 1.5 microns. and a length of the order of 1 to 20 microns. 20 microns. 16. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le mélange du sol complexe homogène et des cellules 16. The method of claim 11, characterized in that the mixture of the homogeneous complex sol and the cells <EMI ID=311.1> <EMI ID = 311.1> 17. Procédé suivant la revendication 11, caracté- 17. The method of claim 11, character- <EMI ID=312.1> <EMI ID = 312.1> Iules microbiennes à un pH compris entre 4 et 8. Microbial cells at a pH between 4 and 8. 18. Procédé suivant la revendication 11, caracté- 18. The method of claim 11, character- &#65533; risé en ce que le poids des cellules microbiennes à l'état sec constitue de 20 à 1000% du poids du sol complexe homogène. &#65533; ized in that the weight of the microbial cells in the dry state constitutes 20 to 1000% of the weight of the homogeneous complex soil. <EMI ID=313.1> <EMI ID = 313.1> hydrophile dans lequel des cellules microbiennes sont immobilisées , hydrophilic in which microbial cells are immobilized, <EMI ID=314.1> <EMI ID = 314.1> <EMI ID=315.1> <EMI ID=316.1> <EMI ID = 315.1> <EMI ID = 316.1> formule générale : Si(OR)., dans laquelle R représente un groupe alkyle comprenant jusqu'à 12 atomes de carbone, à hydrolyser le mélange résultant par l'addition d'un acide ou d'un composé de caractère acide de manière à former un sol complexe homogène, general formula: Si (OR)., in which R represents an alkyl group comprising up to 12 carbon atoms, in hydrolyzing the resulting mixture by the addition of an acid or a compound of acidic character so as to form a homogeneous complex soil, à disperser de façon homogène des cellules microbiennes dans le sol et à gélifier le mélange du sol et des cellules microbiennes par coulée dans un solvant organique et séchage. homogeneously dispersing microbial cells in the soil and gelating the mixture of soil and microbial cells by pouring in an organic solvent and drying. 20. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que le radical R du tétraalkoxysilane est un groupe alkyle comprenant jusqu'à 3 atomes de carbone. 20. The method of claim 19, characterized in that the R radical of the tetraalkoxysilane is an alkyl group comprising up to 3 carbon atoms. 21. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que le composé polymère soluble dans l'eau est l'alcool polyvinylique et le tétraalkoxysilane est le tétraéthoxysilane. 21. The method of claim 19, characterized in that the polymeric compound soluble in water is polyvinyl alcohol and the tetraalkoxysilane is tetraethoxysilane. 22. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que le poids de Si02 contenu dans le tétraalkoxysilane constitue de 5 à 300% du poids du composé polymère soluble dans l'eau à l'état sec. 22. The method of claim 19, characterized in that the weight of SiO2 contained in the tetraalkoxysilane constitutes from 5 to 300% of the weight of the polymer compound soluble in water in the dry state. 23. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que les cellules microbiennes ont une largeur de l'ordre de 0,5 à 1,5 micron et une longueur de l'ordre de 1 à 20 nierons. 23. The method of claim 19, characterized in that the microbial cells have a width of the order of 0.5 to 1.5 microns and a length of the order of 1 to 20 nierons. 24. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que le mélange du sol complexe homogène et des cellules 24. The method of claim 19, characterized in that the mixture of the homogeneous complex sol and the cells <EMI ID=317.1> <EMI ID = 317.1> 70[deg.]C. 70 [deg.] C. 25. Procédé suivant la revendication 19, caract6risé en ce que le sol complexe homogène est mélangé aux cellules <EMI ID=318.1> 25. The method of claim 19, characterized in that the homogeneous complex sol is mixed with the cells <EMI ID = 318.1> <EMI ID=319.1> <EMI ID = 319.1> <EMI ID=320.1> <EMI ID = 320.1> <EMI ID=321.1> <EMI ID = 321.1> 27. Procédé de préparation d'un gel complexe hy- 27. Process for preparing a complex hy- <EMI ID=322.1> <EMI ID = 322.1> dans lea exemples donnée. <EMI ID=323.1> in the examples given. <EMI ID = 323.1> OCEAN CO., LTD. déposée le 13 mai 1977, sous le N[deg.] PV 0/177.570 pour : "Procédé de préparation d'un gel complexe hydrophileVeuillez noter que le texte de la description déposée à l'appui du brevet en rubrique doit être rectifié comme suit: OCEAN CO., LTD. filed May 13, 1977, under N [deg.] PV 0 / 177.570 for: "Process for the preparation of a hydrophilic complex gel Please note that the text of the description filed in support of the relevant patent must be corrected as follows : - page 6, ligne 18, il faut lire : "Katchalski" au lieu de : "Katchlski" - page 27, ligne 19, il faut lire : "NH.OH" au lieu de : - page 6, line 18, it should read: "Katchalski" instead of: "Katchlski" - page 27, line 19, it should read: "NH.OH" instead of: <EMI ID=324.1> <EMI ID = 324.1> - page 6, ligne 20, il faut lire : "...(1971).", au lieu de : - page 6, line 20, it should read: "... (1971).", instead of: "... (1971))." "... (1971))." - page 9, ligne 20, il faut lire : "... par hydrolyse". , au lieu de : "... par déshydratation." - page 9, ligne 24, il faut lire : "1. Celluloses:..." , au lieu de : " 1. Cellulose:..." - page 9, ligne 28, il faut lire : "... fèves de robinier...", au lieu de : "... fèves de "locast"..." - page 10, ligne 9, il faut lire : "... Bloom Gelometer...", au lieu de : "... Bloom Gerometer..." - page 14, lignes 26 et 27, il faut lire : "... Mycobacterium...", au lieu de : "... Mycobacerium..." - page 16, ligne 15, il faut lire : ATP...", au lieu de : "... - page 9, line 20, it should read: "... by hydrolysis". , instead of: "... by dehydration." - page 9, line 24, it should read: "1. Cellulose: ...", instead of: "1. Cellulose: ..." - page 9, line 28, it should read: "... black locust beans ...", instead of: "... beans from" locast "..." - page 10, line 9, it should read: "... Bloom Gelometer ...", instead of: "... Bloom Gerometer ..." - page 14, lines 26 and 27, it should read: "... Mycobacterium ...", instead of: "... Mycobacerium ..." - page 16, line 15, it should read: ATP ... ", instead of: "... ATB..." - page 27, ligne 10, il faut lire : "...tétraéthoxysilane...", au lieu de "...tétraéthylsilane..." - page 27, ligne 22, il faut lire : "Une bande de ...", au lieu de : "Une partie de..." - page 28, ligne 2 à partir du bas, il faut lire : "... cerevisiae...", au lieu de : "... cerivisiae..." - page 30, ligne 13, il faut lire : "...exemple 13...", au lieu de : "... exemple 31..." - page 35, ligne 10, il faut lire : "... chlorure de méthylène...", au lieu de : "... chlorure de méthyle...." - page 37, ligne 5, à la page 41, lignes 4 et 5 et à la page 44, ligne 7, il faut lire : "...tétraéthoxysilane...", au lieu de : "... tétraéthylsilicate..." <EMI ID=325.1> <EMI ID=326.1> ATB ... " - page 27, line 10, it should read: "... tetraethoxysilane ...", instead of "... tetraethylsilane ..." - page 27, line 22, it should read: "A band of ...", instead of: "A part of ..." - page 28, line 2 from the bottom, it should read: "... cerevisiae ...", instead of: "... cerivisiae ..." - page 30, line 13, it should read: "... example 13 ...", instead of: "... example 31 ..." - page 35, line 10, it should read: "... methylene chloride ...", instead of: "... methyl chloride ...." - page 37, line 5, on page 41, lines 4 and 5 and on page 44, line 7, it should read: "... tetraethoxysilane ...", instead of: "... tetraethylsilicate .. . "<EMI ID = 325.1> <EMI ID = 326.1> - page 37, ligne 9, il faut lire : '... de 3,5....", au lieu de : **... de 3...." - page 42, lignes 3 et 5, il faut lire : "... nitrite...", au lieu de : "... nitrate..." <EMI ID=327.1> - page 43, ligne 5, à la page 43, lignes 18 et 19 et à la page <EMI ID=328.1> - page 37, line 9, it should read: '... of 3.5 .... ", instead of: ** ... of 3 ...." - page 42, lines 3 and 5, it should read: "... nitrite ...", instead of: "... nitrate ..." <EMI ID = 327.1> - page 43, line 5, on page 43, lines 18 and 19 and on page <EMI ID = 328.1> <EMI ID=329.1> <EMI ID = 329.1> - page 43, ligne 12, il faut lire : "... exemple 18...", au lieu de : "... exemple 1...". - page 43, line 12, it should read: "... example 18 ...", instead of: "... example 1 ...". La demanderesse n'ignore pas qu'aucun document joint au dossier d'un brevet d'invention ne peut être de nature The applicant is aware that no document attached to the file of a patent for invention can be of a nature <EMI ID=330.1> <EMI ID = 330.1> cations de fond et déclare que le contenu de cette note n'apporte pas de telles modifications et n'a d'autre objet que de signaler une ou plusieurs erreurs matérielles. substantive cations and declares that the content of this note does not make such changes and has no other purpose than to point out one or more material errors. Elle reconnaît que le contenu de cette note ne peut avoir pour effet de rendre valable totalement ou partiellement le brevet N[deg.] PV 0/177.570 si celui-ci ne l'était pas en tout ou en partie en vertu de la législation actuellement en vigueur. It recognizes that the content of this note cannot have the effect of making patent N [deg.] PV 0 / 177.570 fully or partially valid if it was not fully or partially valid under current legislation. in force. Elle autorise l'administration à joindre cette note au dossier du brevet et à en délivrer photocopie. It authorizes the administration to attach this note to the patent file and to issue a photocopy thereof. Ci-joint 100,- frs en timbres fiscaux en vue du paiement de la taxe perçue pour les notifications de l'espèce. Herewith 100, - frs in fiscal stamps for the payment of the tax collected for the notifications of the species. <EMI ID=331.1> <EMI ID = 331.1> distinguées. distinguished. P. Pon de SANRAKU-OCEAN CO., LTD. P. Pon de SANRAKU-OCEAN CO., LTD. P. Pon du Bureau GEVERS, société anonyme P. Pon of Bureau GEVERS, public limited company
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