DD281411A5

DD281411A5 - Verfahren zur herstellung einer zyanidase und ihre anwendung

Info

Publication number: DD281411A5
Application number: DD88313611A
Authority: DD
Inventors: Kjeld Ingvorsen; Sven E Godtfredsen; Birgitte Hojes-Pedersen
Original assignee: ��@��@�a�@��@��k��
Priority date: 1987-03-12
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1990-08-08
Also published as: EP0282351A3; ATE98688T1; JPS63283580A; DK128387D0; AU611674B2; HUT46355A; DK128387A; ZA881746B; EP0282351B1; US5116744A; DE3886240D1; EP0282351A2; DE3886240T2; AU1307188A

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer Zyanidase und ihre Anwendung. Erfindungsgemaesz wird eine Zyanidase, die immunologisch identisch mit dem zyanidumwandelnden Enzym ist, durch Kultivieren eines Stammes von Alcaligenes denitrificans subsp. denitri-ficans var. bei Vorhandensein von Quellen von assimilierbarem Stickstoff, Kohlenstoff und Sauerstoff plus wesentlichen Naehrstoffen und anschlieszendes Gewinnen der Zyanidase auf die bekannte Weise.{Herstellungsverfahren; zyanidumwandelnde Enzyme; anorganisches Zyanid; hohe Konzentrationen}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Vorfahren zur Herstellung neuartiger und verbesserter bakterieller zyanidumwandelnder Enzyme, die bei hohen Konzentrationen anorganischen Zyanids unter einem breiten Bereich von Umweltbedingungen wirksam sind und ihre Anwendung bei dt r Umwandlung von insbesondere anorganischem Zyanid.

Darstellung des bekannten Standes der Technik

Die Einleitung von Induiitrieabwässern, welche anorganisches Zyanid enthalten, in Flüsse, Seen und das Meer verursacht schwerwiegende Probleme der Umweltverschmutzung. Unter anorganischem Zyanid versteht man nachstehend Zyanidionen und Wassers 'offzyanid.

Zyanidhallige Abwässer «verden von einer großen Vielzahl industrieller Fertigungsprozesse verursacht, so dem Abbau von Edelmetallen, dem Galvanisieren und der Herstellung synthetischer Fasern, Polymore, Nahrungsmittelzusätze und Nahrungsmittelerzeugnisse.

Auf Grund seiner hoh^n Tcxizität und der übermäßigen Nutzung in industriellen Prozessen gehört anorganisches Zyanid zu den an höchster Stelle eingeordneten Schadstoffen auf der EPA'ε List of Priority Pollutants (EPA-Liste dor Prioritätsschadstoffe) (siehe Environ. ScI. Technol. 13 [1979), 416-422).

Einige europäische Länder haben Vorschriften erlassen, die festlegen, daß die in aufnehmende Gewässer eingeleiteten Abwässer nicht mehr als etwa 0,5 Teilchen/Mill. anorganischen Zyanids enthalten düifen.

Es ist allgemein bekannt, daß etwa 2000 Spezies von höheren Pflanzen zyanogen sind (d.h., organische Zyanidverbindungen enthalten) und daß diese Pflanzen beim Absterben odor der Verarbeitung nach der Ernte beachtliche Mengen an anorganischem Zyanid freisetzen. Zu den zyanogenen Pflanzen gehören viele wichtige landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie Kassava, Sorghum (Mokrenhirse), Luzerne, Bohnen, Pfirsiche und Mandelbäume, von denen einige hohe Werte an Zyanid aufweisen können (bis zu etwa 3g Zyanid je Kilogramm Pflanzengewebe).

In Gebieten, in denen die oben genannten Kulturpflanzen die Hauptnahrungsmittel darstellen, ist es wahrscheinlich, daß ganze Bevölkerungen an chronischer Zyanidvergiftung leiden (siehe S.101 und 122 in Cyanide In Biology, B.Vennesland, E.E. Conn, C.J.Knowles, J.Westley und F. Wirsing, Hsg., 1981. Academic Press, London und New York).

Der Abbau und Umwandlung und Entgiftung von anorganischem Zyanid ist daher von großer Bedeutung im Zusammenhang mit1) der Abwasserbehandlung, 2) der chemischen Fertigung und 3) der menschlichen Ernährung.

Rein chemische Verfahren für die Umwandlung von anorganischem Zyanid in Abwasserströmen wurden seit vielen Jahren angewendet. Zu den herkömmlichen chemischen Behandlungsmethoden gehören das alkalische Chlorieren, die Wasserstoffperoxidbehandlung, der Ionenaustausch oder die Elektrolyse. Diese Verfahren sind kostspielig und in vielen Fällen im großen Maßstab nicht ausführbar. Außerdem ist das alkalische Chlorieren ein zerstörender Prozeß, der zur Bildung von chlorinierten organischen Verbm Jungen führen kann, die wiederum selbst ernsthafte Schadstoffe sind.

Es wurden verschiedene biologische Methoden zur Behandlung von zyariidhaltigen Abwässern vorgeschlagen und ausgeführt, so akklimatisierte Schlammverfahren und verschiedene biologische Filtersysteme (siehe Howe, R. H. L., 1965, Int. J. Air Water Poll. 9,463-473.

US-PS 3756947,3940332,4461834 und 3660278 beschreiben den Einsatz von speziell vorbereiteten Schlammsystamen, die aus 1) der Impfung von aktiviertem Schlamm mit >/anidumwandelnden Mikroorganischen und 2) der Akklimatisierung des gemischten Sys.sms für die Dauer von ein oder mehreren Wochen vor der Nutzung bestehen. Die in den oben gerannten vier US-PS beschriebenen Systeme auf Schlammbasis haben, entsprechend den Patentansprüchen, eine sehr begrenzte Kapazität der Zyanidumwandlung - nur Abwässer, die weniger als 50-250 Teilchen/Mill. (2- 1OmM) Zyanidionen enthalten, können wirksam sntkontaminiert werden. Industrieabwässer können jedoch weit höhere Zyanidkonzentrationen enthalten.

Biobehandlungssysteme, die mit einer Art abgestimmten Schlamms mit oder ohne Zusatz von speziellen und lebensfähigen, zyanidumwandelnden Mikroorganismen arbeiten, sind u.U. schwer zu erhalten und für den Betrieb auf kleiner Basis nicht

geeignet. Außerdem sind Systeme auf Schlammbasis auf die Abwasserbehandlung beschränkt und beispielsweise nicht anwendbar für die Zyanidumwandlung bei der Nahrungsmittelverarbeitung und für die Entfernung von Zyanidrückständen in chemischen Produktströmen.

Enzymatische Verfahren für die Umwandlung von Zyanid in Formamid unter Vorwendung von Pilzzellen oder immobilisierten Pilzzellen wurden in zwei europäischen Patenten beschrieben (Publikationen 61240 und 116423). Diese Patente legen den Einsatz von Enzymen offen (Enzym-Formamid-Hydrolyase bzw. Zyanidhydratase, EC 4.2.1.66), die alle von Pilzen erzeugt wurden, vor allem Spozies dar bekannten phytopathogenen Pilze. Zyanid wurde mit einer Effektivität von 98% oder bis zu etwa 1 Teilchen/Mill. anorganischem Zyanid bei einer Temperatur zwischen O⁰C und 35⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 10 umgewandelt. Die verbreitete technische Anwendung der zyanidumwandelnden Enzyme, die durch phytopathogene Pilze erzeugt wurden, ist jedoch problematisch, wenn kommerzielle Produkte in bezug auf die Produktionsstämme nicht vollkommen sterii gemacht werden.

Es gab verschiedene Berichte (siehe Knowles und Bunch, Adv. MIa. Physlol. (1986), 73-111, Hsg.: A. H. Rose und D. W. Tempest, Academic Press, London und New York) über die Isolierung von zyanidumwandelnden Bakterien. Einige dieser Bakterienstämme sind nicht mehr verfügbar, und nach keinem dieser Berichte erzeugen diese Bakterien Enzyme, welche hoho Konzentrationen von anorganischem Zyanid in sehr geringe Konzentrationen umwandeln können.

In keinem dieser Gerichte wurde der enzymatische Weg der Zyanidumwandlungen und die Zwischenstufen der Reaktionen eindeutig ausgeführt.

Beispielsweise wurde behauptet, daß die bakteriellen Isolate ATCC 39204 (US-PS 4461834); ATCC 21697 und ATCC 21698 (US-PS 3756947); ATCC 21930 (US-PS 3940322) und ATCC 39204 (US-PS 4461834 zyanidumwandelnde Eigenschaften haben. Die Stämme ATCC 21697 und ATCC 21698, die in der US-PS 3756947 mit Achromobacter nitriloclastes und Alcaligenes vlscolactis angegebon wurden, wurden bai der Deponierung in der ATCC (ATCC: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA) als Bacillus subtills bzw. Corynebacterium sp. neu klassifiziert. Bei der gründlichen Prüfung in den Labors der Autoren wurde festgestellt, daß von den zuletzt genannten fünf Stämmen, die als Produzenten von zyanidumwandelnden Enzymen genannt wurden, nur ATCC 21930 (Corynebacterium sp.) tatsächlich eine solche Aktivität aufweist. Es wurde jedoch fesgestellt, daß das zyanidumwandelnde Enzymsystem von ATCC 21930 bei niedrigen Zyanidkonzentrationen (weniger als oder gleich 2OmM) schnell inaktiviert wurde. Bei höheren Konzentrationen wurde das Enzymsystem als vollkommen inaktiv festgestellt.

Aus den wissenschaftlichen Informationen, die in den oben genannten Patentschriften und in den Artikeln enthalten sind, welche in dem zitierten jüngsten zusammenfassenden Beitrag von Knowles und Bunch genannt werden, geht hervor, daß solche Faktoren wie Phytopathogenozität der Produktionsstämme, Enzymunterbindung und Enzymaktivierung durch Zyanid die Haupthindernisse für die technische Nutzung der Enzyme für die Zyanidentgiftung sind. '

Ziel der Erfindung

In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Erfinder betrifft die Erfindung nach einem Aspekt verbesserte zyanidumwandelnde Enzymsysteme, die ihren Ursprung in Mikroorganismen haben.

Es ist festgestellt worden, daß bestimmte Bakterien, beispielsweise Stämme von Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans, in der Lags sind, zyanidumwandelnde Enzyme mit überlegenen Eigenschaften wie hohe Toleranz und Affinität gegenüber anorganischem Zyanid zu produzieren, und außerdem können Enzyme hergestellt werden. Das Vorhandensein dieser Enzyme in den Bakterien wurde bisher nicht dokumentiert. Außerdem werden Enzyme mit solchen Eigenschaften nicht durch registrierte Typenstämme von Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans (z. B. DSM 30026 oder NCIB 11961 (NCIB ist die National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland)) oder durch Spezies von Alcaligenes, die als NCIB 10109, NCIB 8687, ATCC 31371 und DSM 30030 deponiert sind, produziert.

Es wurde nachgewiesen, daß die neuartigen, überlegenen Enzyme der vorliegenden Erfindung bei Konzentrationen bis zu wenigstens 26000 Teilchen/Mill. anorganischem Zyanid aktiv sind. Das organische Zyanid wird durch die Enzyme in Ameisensäure und Ammoniak umgewandelt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, zyanidumwandelnde Enzyme zu schaffen, die ihren Ursprung in Mikroorganismen haben, welche keine oder eine nur unbedeutende Pathogenizität gegenüber Pflanzen und/oder Tieren haben, eine ausgezeichnete Stabilität bei Zimmertemperatur besitzen, die bei hohen Konzentrationen von anorganischem Zyanid aktiv sind und das anorganische Zyanid bis zu sehr niedrigen Konzentrationen erschöpfen können und die einer hohen Affinität gegenüber anorganischem Zyanid aufweisen.

Die zyanidumwandelnden Enzyme sollten ferner bei Vorhandensein solcher organischen Lösungsmittel wie Azeton und Methanol oder anderer organischer Verbindungen wia Nitrille aktiv sind und außerdem noch einer verbesserten Aktivität bei Vorhandensein von Metallionen besitzen.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß bestimmte grammnegative bakterielle Isolate, die zur Genus Alcaligenes gehören, zyanidumwandelnde Enzyme mit Eigenschaften erzeugen, welche den bisher beschriebenen weit überlegen sind. Zu diesen überlegenen Eigenschaften gehören beispielsweise Toleranz gegenüber hohen Zyanidkonzentrationen und substratkinetische Merkmale, welche die Entgiftung des Zyanids auf sehr niedrige Konzentrationen ermöglichen. Zwei bakterielle Isolate, die solche überlegenen zyanidumwandelnden Enzyme produzieren, wurden von der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Bundesrepublik Deutschland) als Spezies von Alcaligenes denitrificans subs, denitrificans identifiziert und in Verbindung mit der vorliegenden Patentspezifikation unter den Nummern DSM 4009 und DSM 4010 bei der DSM deponiert. Die zyanidumwandelnden Enzyme von DSM 4009 und DSM 4010, welche die direkte Hydrolyse von anorganischem Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak katalysieren, unterscheiden sich eindeutig von bekannten anderen zyanidumwandelnden Enzymen wie Zyanidhydratase (Formamidhydrolyse E.C. 4.2.1.66), Zyanidoxygenase,

ß-Zyanoalaninsynthase und anderen, die im Beitrag von Knowles und Bunch (in Adv. Micr. Physiol. [1986], 73-111, siehe oben)beschrieben werden.

Es wird daher als neuer Name für diesen neuartigen Enzymtyp, der durch DSM 4009 und 4010 produziert wird, der Name Zyanidase vorgeschlagen; eine Enzymklasse, welche die direkte Umwandlung von anorganischem Zyanid des Formamids in Ameisensäure und Ammoniak katalysiert (d. h., ohne die Zwischenstufe Formamid). Zyanidumwandelnde Enzyme (einschließlich Zyanidase) wurden vorher nicht bei anderen Spezies von Alcallgenes beschrieben,

und Versuche in den Labors der Autoren haben gezeigt, daß sie weder konstitutiv noch induzierbar durch registrierte

Typenstämme von Alcaligenes denltrlflcans sub. denltriflcans (DSM 30026 und NCIB 11961 (National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland) oder Spezies von Alcallgenes, die als NCIB 10109, NCIB 8687, ATCC 31371 und DSM 30030 deponiert wurden, produziert werden. Es erscheint daher angemessen, die beiden Isolate DSM 4009 und DSM 4010 der vorliegenden Erfindung entweder als neue Spezies von Alcallgenes oder als neue Untertypen (Varianten) von Alcaligenes denitrificani anzuerkennen, die durch die Einbeziehung eines neuartigen Typs von zyanidhydrolysierendem Enzym - einer sogenannten Zyanidase, gekennzeichnet Die Enzyme der vorliegenden Erfindung, welche in der Lage sind, anorganisches Zyanid umzuwandeln, werden folglich

nachstehend als „Zyanidasen" oder als .zyanidumwandelnde Enzyme" bezeichnet.

Die zyanidumwandelnden Enzyme nach der vorliegenden Erfindung können von Alcaligenes denltriflcans subsp. denltriflcans

und Alcallgenes op. gewonnen werden, von denen zwei Stämme am 23. Februar 1987 unter den Nummern DSM 4009 biw.

DSM 4010 für Patentzwecke nach den Bedingungen des Vertrages von Budapest bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Bundesrepublik Deutschland (nachstehend als DSM bezeichnet) deponiert wurden. Diese

bakterien sind nur Beispiele für Mikroorganismen, die nach der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Es kann alsojede mikrobielle Spezies verwendet werden, die in der Lage ist, zyanidumwandelnde Enzyme mit den gewünschten

Eigenschaften zu produzieren. Zyanidumwandelnde Enzyme können hergestellt werden durch Kultivierung der genannten Mikroorganismen in flüssigen Medien, bei Vorhandensein von Zyanid, wenn mit induzierbaren Stämmen gearbeitet wird. Die Kultivierung in zyanidhaltigen Medien ist nicht notwendig, wenn konstitutive Stämme oder Mutanten eingesetzt werden. Die Kultivierung erfolgt aerob bei

einer Temperatur von etwa 20-40⁰C, vorzugsweise bei etwa 3O⁰C, und einem pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis 9.

Die Zyanidasen der Erfindung können auch hergestellt werden durch Einfügen einer Genkodierung für die Expression einer Zyanidase oder einer modifizierten Zyanidase in einen geeigneten Wert und die Kultivierung dieses Wirts. Der Zyanidumwandlungsprozeß wird bei einem pH-Wert durchgeführt, welcher dicht bei den pH-Wert-Optima der jeweils ·

verwendeten Enzyme liegt. Im typischen Fall liegt dieser pH-Wert etwa bei neutral. Für die Behandlung von Abwasserströmen,die saure oder basische pH-Werte aufweisen, können zyanidumwandelnde Enzyme mit niedrigen bzw. hohen pH-Wert-Optimaeingesetzt werden. Der pH-Wert kann im Bereich von etwa 4 bis 11 liegen. Während der Reaktion sollte die Temperatur über dem

Gefrierpunkt des Reaktionsgemischs und vorzugsweise unter etwa 6O⁰C, beispielsweise im Bereich von etwa 15⁰C bis etwa 4O⁰C,

günstigstenfalls bei etwa 35⁰C, liegen.

Die zyanidumwandelnden Enzyme können als intakte Zellen, behandelte Zellen, eine modifizierte Zellaufschlämmung,

getrocknete Zellen, eine Enzymrohlösung., ein gereinigtes Enzym, die jeweils vernetzt, chemisch modifiziert oder wahlweise aneinen Träger gebunden oder von diesem absorbiert sein können, eingesetzt werden.

Einige der Zyanidasen der Erfindung sind extrem stabil. Beispielsweise wurde nachgewiesen, daß gewaschene Zellaufschlämmungen von DSM 4009 mehr als etwa 95% ihrer ursprünglichen Enzymaktivität bewahren, wenn sie über eine

lange Zeitspanne, beispielsweise mehr ais 30 Tage, bei 22⁰C aufbewahrt werden. Bei niedrigeren Temperaturen erhöht sich die

Enzymstabilität noch. Die Enzyme der Erfindung haben eine hohe Toleranz und Affinität gegenüber anorganischem Zyanid, einige sind in der Lage, Lösungen zu entgiften, die wenigstens 26000 Teilchen je Mill. Zyanidion enthalten, d. h., etwa 1,0M. Außerdem kann die Restkonzentration an anorganischem Zyanid in Lösungen, denen die Enzyme dieser Erfindung zugesetzt wurden, auf weniger als

etwa 0,03 Teilchen/Mill. verringert werden. Zusätzliche wertvolle Merkmale einiger Enzyme dieser Erfindung sind die

Fähigkeiten, anorganisches Zyanid bei Vorhandensein von organischen Lösungsmitteln und Nitrilen (beispielsweise Azeton, Methanol, Methakrylonitril und Akrylonitril) und verschiedenen Metallionen wirksam umzuwandeln. Oft sind in industriellen Abwässerströmen von beispielsweise der synthetischen Faserproduktion, dem Galvanisieren, Bergbauoperationen und der Verarbeitung von Casava oder bitteren Mandeln organische Lösungsmittel oder Nitrile und/oder Metallionen gleichzeitig mit

dem Zyanid s'orhanden.

Die zyanidumwandelnden Enzyme der Erfindung wurden im Labor erfolgreich bei verschiedenen zyanidhaltigen Abwässern von

sehr unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung angewendet.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Das getestete zyanidumwandelnde Enzym

wurde durch Kultivierung des unter DSM-Nr. 4009 deponierten Stammes gewonnen. In den Beispielen 1 bis 19 werdenverschiedene Versuche beschrieben. Diese Beispiele beziehen sich auf Versuche und die Grenzen, die in einigen der angefügten

Patentansprüche ausgeführt sind. Ein bevorzugtes Enzym der Erfindung ist ein Enzym, welches viele oder alle der in den Beispielen beschriebenen Versuche besteht. Die Enzymaktivitäten in den folgenden Beispielen werden in Internationalen Einheiten ausgedrückt (nachstehend IU abgekürzt). Eine IU des Enzyms entspricht der Enzymmenge, welche die Umwandlung von 1 μΜοΙ Zyanid je Minute in 6OmM NaCN bei

einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 30°C katalysiert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Versuch für die Wirksamkeit der Zyanldentglftung

2,5IU des zyanidumwar.delnden Enzyms werden zu 5ml von 0,1 M-Phosphatpuffer (pH-Wert 7) gegeben, der im Verhältnis zu NaCN gleich 0,1 M ist. Dieses Gemisch wird unter sanftem Mischen bei 37°C inkubiert. Nach 60min Inkubationszeit wird die Konzentration des restlichen anorganischen Zyanids im Reaktionsgemisch analysiert (wozu die Testausrüstung Merck Aquaquant* 14429 eingesetzt wird).

Unter Verwendung eines zyanidumwandelnden Enzyms, das aus DSM 4009 gewonnen wurde, betrug die Restkonzentration an anorganischem Zyanid weniger als 0,03 Teilchen/Mill. Die Restkonzentrationen an anorganischem Zyanid, die durch die oben genannte Aquaquant-Testausrüstung bestimmt wurde, wurde in regelmäßigen Abständen unter Anwendung der Pyridin-Barbitursäure-Methode (siehe American Standard Methods, 15.Auflage, 1980,412 D, 320-322) überprüft, um nachzuweisen, daß das anorganische Zyanid tatsächlich unter eine Konzentration von 0,03 Teilchen/Mill. gesenkt worden war.

In Kontrollexperimenten ohne Enzym oder in Experimenten unter Verwendung von gekochtem Enzym wurde anorganisches Zyanid nicht hydrolysiert, womit nachgewiesen wurde, daß die Umwandlung des anorganischen Zyanids vollständig enzymatisch erfolgte.

Beispiel 2

Versuch für die Wirksamkeit der Zyanldentgiftung

Zehn Milliliter des Puffers aus Beispiel 1, der 20OmM NaCN (5200 Teilchen/Mill., pH-Wert 7,5) enthielt, wurden mit 22IU des zyanidumwandelnden Enzyms bei 30°C unter sanftem Verrühren behandelt. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden wurde die Konzentration an anorganischem Zyanid im Reaktionsgemisch bestimmt.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms lag die Restkonzentration an anorganischem Zyanid unter 0,03 Teilchen/Mill. Die Ammoniakkonzentration betrug etwa 20OmM. Ammoniak wurde nach der. Methode von Chaney und Marbach (Clin. Chem. 8 [1962], 130-132) bestimmt.

Beispiel 3

Versuch für die Zyanidtoleranz

Eine 600mM-Lösung von NaCN (29400 Teilchen/Mill.) im Puffer von Beispiel 1 (pH-Wert wurde so kontrolliert, daß er zwischen 7,0 und 7,6 lag) wurde mit dem zyanidumwandelnden Enzym (6IU je ml Lösung) bei 30°C unter sanftem Verrühren behandelt.' Nach 5 Stunden Inkubationszeit wurde die Konzentration an anorganischem Zyanid im Reaktionsgemisch bestimmt.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms lag die Restkonzentration an anorganischem Zyanid unter 0,03 Teilchen/Mill. Die Ammoniakkonzentration betrug etwa 60OmM.

Beispiel 4

Versuch für die Zyanidtoloranz

Eine Lösung von 100OmM NaCN (etwa 49000 Teilchen/Mill.) im Puffer aus Beispiel 1 (pH-Wert wurde so kontrolliert, daß er zwischen 7,0 und 7,5 lag) wurde mit dem zyanidumwandelnden Enzym (8,0IU je ml Reaktionsgemisch, gemessen bei 3O⁰C) behandelt und unter sanftem Verrühren bei 22°C inkubiert.

Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden wurde die Konzentration an anorganischem Zyanid im Reaktionsgemisch gemessen.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms betrug die Zyanidrestkonzentration weniger als 0,03 Teilchen/Mill. Die Ammoniakkonzentration lag bei etwa 100OmM.

Bei einem Kontrollexperiment (d.h., ohne Enzymzusatz) verschwanden weniger als 5% des ursprünglich vorhandenen Zyanids durch Luftaustreiben.

Beispiel 5

Versuch für die Wärmestabilitat

Es wurde der im Beispiel 3 beschriebene Versuch mit der Ausnahme wiederholt, daß die Temperatur 45⁰C betrug. Nach einer Inkubationszeit von vier Stunden wurde die Konzentration an anorganischem Zyanid im Reaktionsgemisch gemessen.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms betrug die Restkonzentration an anorganischem Zyanid weniger als 0,03 Teilchen/Mill.

Beispiel 6

Versuch zur Wärmestabilität

Der im Beispiel 2 beschriebene Versuch wird mit der Ausnahme wiederholt, daß die Temperatur 45⁰C beträgt. Nach zwei Stunden Inkubation wird die Konzentration an anorganischem Zyanid im Reaktionsgemisch gemessen.

Bei Anwendung dos aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms betrug die Restkonzentration an anorganischem Zyanid weniger als 0,03 Teilchen/Mill.

Beispiel 7

Versuch <ur Stabilität gegenüber Azeton (5%)

Es wird der Puffer aus Beispiel 1 hergestellt, der in diesem Fall 5% (Vol./Vo!.) Azeton enthält, das Verhältnis zu NaCN beträgt 10OmM. Diese Lösung (Gesamtvolumen 10ml, pH-Wert mit Phosphorsäure auf 7,5 abgestimmt) wird mit 13IU des zyanidumwandelnden Enzyms behandelt und unter sanftem Verrühren bei 22°C inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von drei Stunden wird die Konzentration an anorganischem Zyanid im Reaktionsgemisch gemessen.

Beispiel 8 Versuch zur StabilitSt gegenüber Azeton (10%)

Der im Beispiel 7 beschriebene Versuch wird mit der Ausnahme wiederholt, daß die wäßrige Lösung 10% (Vol./Vol.) Azeton enthält. Nach einer Inkubationszeit von 5 Stunden wird die Konzentration an anorganischem Zyanid im Reaktionsgemisch gemessen.

Bei Anwendung des aus dem DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms betrug die Restkonzentration an anorganischem Zyanid weniger als 0,03 Teilchen/Mill.

Beispiel 9

Versuch zur Stabilität gegenüber Methakrylonltrll (100 mM) Dreizehn Einheiten des zyanidumwandelnden Enzyms werden zu 10ml eines 0,1 M-Phosphatpuffers (0,1 M NaCN, 0,1 M Methakrylonitril, pH-Wert 7,5) gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2,3 Stunden bei 22⁰C wird die Konzentration an anorganischem Zyanid gemessen.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms lag die Restkonzentration an anorganischem Zyanid unter 0,03 Teilchen/Mill. Methakrylonitril wurde im Reaktionsgemisch nicht abgebaut, wie aus der Analyse durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer C₁₈-Umkehrphasenkolonne hervorging.

Beispiel 10

Versuch zur StabilitSt gegenüber Methakrylonitril (20OmM) Der im Beispiel 9 beschriebene Versuch wird mit der Ausnahme wiederholt, daß die Lösung 20OmM Methakrylonitril enthält und die Konzentration an anorganischem Zyanid nach einer Inkubationszeit von 5,5 Stunden gemessen wird.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms betrug die Restkonzentration an anorganischem Zyanid im Reaktionsgemisch weniger als 0,03 Teilchen/Mill. Die Konzentration an Methakrylonitril blieb während des Experimentes konstant.

Beispiel 11

Versuch zur StabilitSt gegenüber Akrylonitrll (100 mM) ZuIOmI einer 0,1 M-Phosphatpufferlösung (0,12m NaCN, 0,1 M Akrylonitril, pH-Wert 7,5) werden 25IU des zyanidumwandelnden Enzyms gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei 25°C wird die Konzentration an

anorganischem Zyanid gemossen. '

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms lag die Restkonzentration an anorganischem Zyanid unter 0,03 Teilchen/Mill. Akrylonitril wurde nicht abgebaut, wie durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Cu-Umkehrphasenkolonne für die Analyse bestimmt wurde.

Beispiel 12

Versuch zur StabilitSt gegenüber Akrylonitril (200 mM) Der im Beispiel 11 beschriebene Versuch wird mit der Ausnahme wiederholt, daß die wäßrige Lösung 1,2IU Enzym je Milliliter und 200 mM Akrylonitril enthält.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms wurden nach 2,5 Stunden 98,4% der ursprünglichen Menge an anorganischem Zyanid abgebaut. Nach 6 Stunden lag die Restkonzentration an anorganischem Zyanid unter 0,03 Teilchen/Mill.

Beispiel 13

Versuch zur StabilitSt gegenüber Akrylonitril und Methakrylonitril Die vorliegende Zyanidase wird einem 0,1 M-Phcsphatpuffer (0,05 M NaCN, 0,05M Methakrylonitril, 0,05 M Akrylonitril, pH-Wert 7,5) bis zu einer Konzentration von 0,8 IU/ml dds Reaktionsgemischs zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden bei etwa 22°C wird die Zyanidkonzentration gemessen.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen zyanidumwandelnden Enzyms lag die Restkonzentration an anorganischem Zyanid unter 0,03 Teilchen/Mill. Akrylonitril und Methakrylonitril wurden im Reaktionsgemisch nicht abgebaut.

Beispiel 14

Versuch zur StabilitSt gegenüber Methanol Das zyanidumwandelnde Enzym von DSM 4009 wurde auf seine Aktivität und Stabilität bei Vorhandensein unterschiedlicher Methanolkonzentrationen (nachstehend als MeOH abgekürzt) untersucht. Die Ergebnisse werden in den Tabellen IA und IB gezeigt.

Tabelle IA	Anfangsaktivität· (%)
% MeOH (Vol./Vol.)	100
0 = Kontrolle	98 -100
10	6&-66
20	11-15
30

Tabelle IB"

% Restaktivität nach %ΜθΟΗ % Restaktivität nach 6Tagen (Vol./Vol.) 5Tagen

90 0 85

66 10

20 '23

* Die Anfangsaktivität wurde bsi 22'C, pH-Wert 7,5 und einer Substratkonzentration von 6OmM NaCN in 0,1 M-Phosphatpuffer gemessen. Das Reaktionsgemisch (10ml), das 5IU des zyanidumwandelnden Enzyms enthielt, wurde in Versuchsröhrchen aus Glas mit Teflon-verkleideten Schraubkappen gegeben und auf eine Rotationsvorrichtung gebracht. Das verwendete Enzym war ein immobilisiertes Präparat, das durch die Vernetzung von Zellen von DSM 4009 mit Glutaraldehyd unter Anwendung von Immobiüsierungs-Standardverfahren hergestellt worden war. • * Die Reaktionsgemische aus Tabelle IA wurden (fest verschlossen) 5 bzw. 6 Tage bei 22¹C im Labor aufbewahrt. Die Enzymkörnchen wurden durch Zentrifugleren gewonnen, einmal mit Phosphatpuffer gewaschen und wie oben beschrieben auf ihre Aktivität getestet.

Beispiel 15 Entgiftung von Zyanid Im Abwasser von einem Zinkgalvanlsierbad

Spülwasser aus dem alkalischen Zinkbad einer Galvanisieranlage, das freies Zyanid und Zink enthält, wird mit einer Zyanidase nach der vorliegenden Erfindung behandelt.

Bei Anwendung des aus DSM 4009 gewonnenen Enzyms in einer Menge von 0,6 IU je Milliliter Abwasser, das 62 Teilchen je Mill.

freies Zyanid und 50 Teilchen/Mill. Zink enthält, wurde die Konzentration des freien Zyanids nach einer Reaktion über 1,5 Stunden bei 22°C auf weniger als 1 Teilchen je Mill, gesenkt. Der pH-Wert des Reaktionsgemische wurde während des Experiments so überwacht, daß er bei 7,5 ± 0,5 lag.

Beispiel 16

Entgiftung von Zyanid aus einem Zinkgalvanisierbad Das Abwasser aus Beispiel 15 wurde mit Leitungswasser auf das Dreifache verdünnt, so daß es nun 20 Teilchen/Mill. freies Zyanid und 17 Teilchen/Mill. Zink enthielt.

Bei Anwendung der Zyanidase von DSM 4009 in einer Konzentration von 0,6 IU je Milliliter des Reaktionsgemischs \ietrug die Konzentration an freiem Zyanid bei 22⁰C nach 30 Minuten weniger als 1 Teilchen/Mül. Während der Reaktion wurde der pH-Wert so überwacht, daß ar während des Experimentes bei 7,5 ± 0,5 lag.

Beispiel 17

Entgiftung von Zyanid im Abwasser von der Marzipanherstellung Die Zyanidase von DSM 4009 wurde für die Entgiftung von Abwasser verwendet, das seinen Ursprung in der Entbitterung von Aprikosenkernen bei der Herstellung von Marzipan hat. Das Abwasser enthielt 95 Teilchen/Mill. freies Zyanid.

Durch die Reaktion dieses Abwassers bei 22°C für dia Dauer von 4 Stunden mit 0,6IU Zyanidase je ml Reaktionsgemisch, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemische durch den Zusatz von verdünntem Natriumhydroxid bei 7,5 gehalten wurde, konnte der Zyanidgehält auf weniger als 1 Teilchen/Mill. freies Zyanid gesenkt werden.

Beispiel 18

Entgiftung von Zyanid bei Vorhandensein von Metallionen Die Zyanidase von DSM 4009 wurde für die Entgiftung von Lösungen von Metallionen (ZN'*, Ni'', Fe³-) in der Pufferlösung von Beispiel 1 verwendet.

Durch die Reaktion von Lösungen von jedem der oben genannten Metallionen, die freies Zyanid enthielten, mit eier Zyanidase der Erfindung wurde der Gehalt an freiem Zyanid so gesenkt, wie das unten in den Tabellen Il und III gezeigt wird.

Tabelle Il

Verringerung des freien Zyanids in Lösungen von 2mM-Metalllonen und 6OmM NaCN, pH-Wert 7,8 Motall Zyanidase lU/ml CN" nach 72 Stunden

Reaktionsgemisch Teilchen/Mill.

<0,03

<0,3

<0,03

Tabelle III

Verringerung des fruien Zyanids in Lösungen von 4mM-Metal!ionen und 120mM NaCN, pH-Wert 7,8 Metall Zyanidase iU/ml CN" nach 22 Stunden

Reaktionsgemisch Teilchen/Mill.

<0,03 <0,03 <0,03 <0,03 <0,03

Aus den Tabellen wird deutlich, daß das vorliegende Zyanidase-Enzym wirksam bei der Verringerung beachtlicher Mengen an Zyanid zu sehr niedrigen Werten bei Vorhandensein verschiedener Metallionen ist.

Zn'-	0,41
Ni'-	0,43
Fe'-	0,44
Fe³-	0,40
Kontrolle	0,33

Zn'*	0,67
Ni'-	0,67
Fe'-	0,64
Fe³-	0,58
Kontrolle	0,70

Beispiel 19 Versuch zur Lagerungsstabilität

Gewaschene Zellen, die auf die gleiche Weise wie im Beispiel 13 gewonnen wurden, wurden im Labor in durchsichtigen Glasflaschen (0,1 M-Phosphatpuffer, pH-Wert 7) unter vorherrschend Lichtbedingungen und einer Temperatur von 22⁰J ± <2°C aufbewahrt.

Nach einer Lagerungszeit von 30 Tagen waren noch mehr als etwa 95% der ursprünglichen Enzymaktivität innerhalb der Zellen vorhanden, wenn ein aus DSM 4009 gewonnenes Enzym eingesetzt wurde.

Beispiel 20 Kultivierung von Stimmen (DSM 4009)

Die Stämme wurden in Schalen von Nährbrühe gehalten, welche 2 % Agar enthielt. Die Nährbrühe wurde bei den Difco Laboratories (Detroit, Michigan, USA) bezogen. Die Flüssigkultur wurde in 500-ml-Schüttelflaschen ausgeführt, die 100ml des Nährbrühemediums enthielten, ergänzt mit 1 % Glyzerol. Die Inkubation bei 30°C dauerte etwa 24 Stunden bei guter Belüftung.

Die Induzierung der zyanidumwandelndan Fnzyme erfolgte nach acht bis zehn Stunden Wachstum durch den Zusatz von NaCN (1mM) zur wachsenden Kuitur. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, gewaschen und bei 4°C aufbewahrt oder gefriergetrocknet. Auf Wunsch können die zyanidumwandelnden Enzyme isoliert und auf bekannte Weise gereinigt worden.

Konstituive Stämme werden auf die gleiche Weise kultiviert, der einzige Unterschied besteht darin, daß eine Induzierung der Herstellung des zyanidumwandelnden Enzyms nicht notwendig ist.

Die Merkmale, die in der vorstehenden Beschreibung und in den nachfolgenden Patentansprüchen offengelegt werden, können sowohl getrennt als auch in einer beliebigen Kombination wesentlich für die Durchführung dieser Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Zyanidase, gekennzeichnet durch Kultivieren eines Stammes von Alcaligenes denitrificans subsp. donitrificans var. bei Vorhandensein von Quellen von assimilierbarem Stickstoff, Kohlenstoff und Sauerstoff plus wesentlichen Nährstoffen und anschließendes Gewinnen der Zyanidase auf die bekannte Weise.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Alcaligenes denitrificans nach Akzessions-Nr. DSM 4009, Mutanten oder daraus abgeleitete genetisch manipulierte Derivate ist.

3. Verfahren n3ch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans nach Akzessions-Nr. DSM 4010, Mutanten oder daraus abgeleitete genetisch manipulierte Derivate ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm ein konstitutiver Stamm von Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans, Mutanten oder darai's abgeleiteten genetisch manipulierten Derivaten ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym in Form von intakten Zellen, behandelten Zellen, getrockneten Zellen eines Zellenrohextral.tes oder eines reinen Enzyms, entweder allein oder in Mischung mit einem geeigneten Zusatz, vorhanden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in vernetzter oder immobilisierter Form vorhanden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, bei Vorhandensein von anorganischem Zyanid in einer Konzentration von 1OmM oder höher aktiv zu sein.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage is'c, bei Vorhandensein von anorganischem Zyanid in einer Konzentration von 50OmM oder höher aktiv zu sein.

P. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, bei Vorhandensein von anorganischem Zyanid in einer Konzentration von 60OmM oder höher aktiv zu sein.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichn., daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, den Zyanidgehalt bei derZyanidunwandlui j auf weniger als 1 Teilchen/Mill. zu erschöpfen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, den Zyanidgehalt bei der Zyanidumwandlung auf weniger als 0,1 Teilchen/Mill. zu erschöpfen.

12. Vorfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, den Zyanidgehalt bei der Zyanidumwandlung auf weniger als 0,01 Teilchen/Mill. zu erschöpfen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lago ist, Zyanid bei Vorhandensein organischer Lösungsmittel umzuwandeln.

14. Vorfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel Methanol oder Aceton ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, Zyanid bei Vorhandensein von Nitrilen umzuwandeln.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitrile Akrylnitril oder Methacrylnitril sind.

17. Verfahren ».ach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, Zyanid bei höheren Temperaturen umzuwandeln.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die höhere Temperatur gleich 4O⁰C, 45⁰C oder 5C°C oder höher ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, Zyanid bei Vorhandensein von Metallionen umzuwandeln.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallionen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Zink (Zn²⁺), Nickel (Ni²⁺), Eisen (Fe²⁺, Fe³⁺) und Silber (Ag⁺) besteht.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, bei der Zyanidumwandluny Ameisensäure (Form) und Ammoniak zu produzieren.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zyanidase hergestellt wird, die in der Lage ist, Zyanid in Produkte umzuwandeln, die Substrate oder Produkte des mikrowellen Zellstoffwechsels sind.

23. Verwendung eines erfindungsgernäß hergestellten Zyanidasepräparates, dadurch gekennzeichnet, daß es

a) für die Entgiftung von Zvanid im Abwasser und industriellen Verfahrensströmen oder

b) für die Entgiftung von Zyanid bei der Nahrungsmittel- und Futterverarbeitung oder

c) für die Entgiftung von Zyanid in Abwasserströmen, die Metallionen enthalten oder

d) für die selektive Entfernung von Zyanid in biochemischen Reaktionen, bei denen Zyanid als Stoffwechselhemmer vorhanden ist, eingesetzt wird.