DE69710617T2

DE69710617T2 - Verfahren zur entgiftung von nitril- und/oder amid-verbindungen

Info

Publication number: DE69710617T2
Application number: DE69710617T
Authority: DE
Inventors: E. Pierce
Original assignee: Cytec Technology Corp
Current assignee: Kemira Oyj
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2002-07-18
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: WO1998027016A1; ATE213489T1; JP2002513324A; NO992975L; EP0958252A1; KR100574770B1; AU5620298A; US5863750A; EP0958252B1; CA2275413A1; US6132985A; KR20000057662A; NO992975D0; DE69710617D1; AU721240B2; ES2173511T3

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Entgiftung eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen durch Umsetzen der Nitrilverbindungen zu entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen mittels einer Reinkultur eines induzierten Mikroorganismusstammes, welcher fähig ist, einen Nitrilanteil zu einem Amid- oder Säureanteil umzusetzen. Wenn ein Amid in dem Gemisch gebildet wird oder vorliegend ist, kann das Amid mittels der vorliegenden Verfahren zur Entgiftung weiter zu entsprechender Säure umgesetzt werden. Die Säure kann daraufhin, soweit gewünscht, weiter zu CO&sub2;, H&sub2;O und Biomasse abgebaut werden. Die induzierten Reinkulturen sind fähig, ein Gemisch von Nitrilen oder ein Gemisch von Nitrilen und Amiden, die typischerweise in hoher Konzentration (hohen Konzentrationen) in Nitrilproduktionsabfallströmen vorliegend sind, zu entgiften.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren zum Entfernen einer Nitrilverbindung aus einer Amidzubereitung, wie eine Acetamid- oder Acrylamidzubereitung, enthaltend eine unerwünschte Nitrilverbindung, mittels einer Reinkultur eines induzierten Mikroorganismusstammes, der die Fähigkeit hat, einen Nitrilanteil zu einem Amid- oder Säureanteil umzusetzen. Die induzierten Reinkulturen sind fähig, die Giftigkeit der Amidzubereitung zu reinigen oder zu verringern und damit die Reinheit und die Ausbeute eines Amidproduktes aus der Amidzubereitung zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren zur Umsetzung eines Gemisches von Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen mittels einer Reinkultur eines induzierten Mikroorganismusstammes, der fähig ist, einen Amidanteil zu einem Säureanteil umzusetzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Biofilter und Verfahren zum Gebrauch von Biofiltern zur Entgiftung eines Gemisches von Nitrilen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen oder eines Gemisches von Amidverbindungen.
Diese Erfindung betrifft auch Kits, die die nützlichen mehrfach induzierten Mikroorganismusstämme enthalten.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Nitrile sind äußerst vielseitige Verbindungen, die in der Synthese einer breiten Vielfalt von Verbindungen, einschließlich Amine, Amide, Amidine, Carbonsäuren, Ester, Aldehyde, Ketone, Imine und heterocyclische Verbindungen verwendet werden. Eines der wichtigsten kommerziell bedeutenden Nitrile ist Acetonitril, das ein gebräuchliches Lösungsmittel ist. Andere Nitrilverbindungen werden als Herbizide oder in der Synthese von Detergenzien oder Antiseptika verwendet. Ein weiteres der kommerziell am bedeutendsten Nitrile ist Acrylnitril, das verwendet wird, um Acrylamid, Acrylsäure, Acrylfasern, Copolymerharze und Nitrilkautschuke herzustellen.
Ein Verfahren der Herstellung von Acrylnitril ist durch Einsatz des SOHIO/BP-Verfahrens, welches die direkte Ammoxidation von Propen (auch bekannt als Propylen) durch Ammoniakdämpfe in Luft in Gegenwart eines Katalysators umfasst (siehe allgemein, Acrylonitrile, 1979, Process Economics Program Report, Stanford Research International, Menlo Park, CA; Weissermel und Arpe, 1978, Industrial Organic Chemistry, Verlag Chemie - Weinheim New York, Seite 266-270). Der Abfallstrom von diesem Verfahren enthält ein komplexes Gemisch von Nitrilen, einschließlich Dinitrilen, Amiden und Säuren in hohen Konzentrationen. Insbesondere enthält der Abfallstrom im Allgemeinen Nitrile, wie Acetonitril, Acrylnitril, Succinnitril und Fumarnitril sowie Acrylamid. Zusätzlich ist/sind häufig Cyanid(e) in veränderlichen und/oder hohen Konzentrationen vorliegend. Der Abfallstrom enthält im Allgemeinen hohe und/oder veränderliche Konzentrationen von Ammoniumsulfat. Dieser gefährliche Abfallausfluss kann aufgrund seiner Giftigkeit nicht in die Umwelt freigesetzt werden und wird in den Vereinigten Staaten normalerweise durch Tiefbrunneneinspritzung in Formationen unter der Oberfläche entsorgt. Diese Entsorgung kann nicht als "Behandlung" des Abfallstromes angesehen werden, sondern ist eher analog zu dem Verfahren der Geländeauffüllung.
Außerhalb der Vereinigten Staaten ist es üblich, den Abfallstrom von der Produktion von Acrylnitril durch Verdünnen des Abfallstroms auf eine niedrige Gesamtnitrilkonzentration von etwa 250 ppm oder weniger und Behandeln durch herkömmliche belüftete biologische Abfallstromsysteme, d. h. aktivierter Abwasserschlamm, nach Nass-/Luftoxidation, zu "behandeln", was flüchtige Bestandteile entfernt und viele der organischen Bestandteile oxidiert. Ein solches "Behandlungs"-verfahren ist aufgrund folgender Gründe nicht für effiziente Entsorgung des Abfallstroms einer Nitrilproduktionsanlage geeignet: (1) Nass-/Luftoxidation bewirkt, dass flüchtige Bestandteile abgestreift werden, was ein Luftemissionsproblem verursacht; (2) Verdünnung des Abfallstroms erfordert große Abwasserbehandlungseinrichtungen, um den Fluss und die lange Aufenthaltszeit, die erforderlich ist, um geeignete "Behandlung" zu erhalten, zu handhaben; und (3) die Kombination von Nass- /Luftoxidation mit biologischer Behandlung durch aktivierten Schlamm führt zu hohen Behandlungskosten. Es bleibt ein langes, tiefempfundenes Bedürfnis in der Nitrilproduktionsbranche nach einem effizienten, kosteneffektiven, umweltsicheren Verfahren, um den Ausfluss von Nitrilproduktionsanlagen zu entsorgen.
Es ist seit langem bekannt, dass bestimmte Mikroorganismen nützlich sind, um eine Nitrilverbindung biologisch zu ihrer entsprechenden Amid- oder Säureverbindung umzusetzen. Die wissenschaftliche wie die Patentliteratur enthalten zahlreiche Verweise, die den Gebrauch von nitrilumsetzenden Mikroorganismen für die Produktion von Spezialchemikalien, beispielsweise Acrylamid und Acrylsäure oder Acrylat aus Acrylnitril beschreiben. Siehe im Allgemeinen Kobayshi und andere, 1992, Trends Biotechnol. 10: 402-408. Es hat sich gezeigt, dass die nitrilumsetzenden Mikroorganismen Aktivitäten haben, einschließlich Nitrilase, die eine Nitrilverbindung zu ihrer entsprechenden Säureverbindung umsetzt; Nitrilhydratase, die eine Nitrilverbindung zu ihrer entsprechenden Amidverbindung umsetzt; und Amidase, die eine Amidverbindung zu ihrer entsprechenden Säureverbindung umsetzt.
Dem Wissen des betreffenden Erfinders nach wurde bei sämtlichen dieser chemischen Spezialproduktionen, die nitrilumsetzende Mikroorganismen verwenden, nur eine einzige Verbindung verwendet, um die entsprechende Aktivität zu induzieren, und nur eine einzige Nitrilverbindung ist umgesetzt worden, um eine einzige Spezialverbindung zu produzieren.

2. 1. MIKROORGANISMEN, DIE EINE NITRILVERBINDUNG VERWERTEN KÖNNEN

Die Literatur enthält bestimmte Verweise, die eine Anzahl von Mikroorganismen enthüllen, die eine Nitril- oder eine Amidverbindung als einzige Quelle von Kohlenstoff und/oder Stickstoff verwerten können.
Zum Beispiel beschreiben Asano und andere, 1982, Agric. Biol. Chem. 46: 1165-1174, einen isolierten Stamm von Arthrobacter, der unter Verwertung von Acetonitril als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle wachsen kann.
Nawaz und andere, 1989, 43rd Purdue Ind. Waste Conf. Proc., Seite 251-256 (Nawaz, 1989), beschreiben die Isolierung eines Pseudomonas aeruginosa Stammes, der fähig ist, verschiedene Nitrilverbindungen, einschließlich Acetonitril, als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten. Jedoch ist dieser Stamm nicht fähig, andere Nitrilverbindungen, wie Acrylnitril, Acrylamid, Benzonitril und Malonnitril, zu verwerten.
Nawaz und andere, 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58: 27-31 (Nawaz), beschreiben einen Klebsiella pneumonia NCTR1 Stamm, der, nach Anpassung mittels Benzonitril, ein Gemisch von Benzonitril und einem anderen Nitril, das ausgewählt ist aus Butyronitril, Acetonitril, Glutaronitril, Propionitril, Succinnitril und Methacrylnitril, abbauen konnte. Ganz im Gegensatz zu dem vorliegenden Verfahren zur Induktion, das die Gegenwart eines aromatischen Nitrils nicht erfordert, erforderte der Mikroorganismus von Nawaz Benzonitril, um die Fähigkeit, das Gemisch von Benzonitril und einem anderen Nitril abzubauen, zu induzieren. Zudem musste, was am wichtigsten ist, Benzonitril vorliegend sein, um den Abbau eines der Gemische von Nitrilen zu erreichen. Da der Nitrilabfallstrom einer Nitrilproduktionsanlage kein Benzonitril enthält, wäre dieser Organismus und das durch Nawaz offenbarte Verfahren völlig unpraktisch und in der Tat für die Behandlung des Abfallstromes nicht verwendbar.
Chapatwala und andere, 1993, App. Biochem. Biotech. 39/40: 655-666, beschreiben die Isolierung eines Pseudomonas putida Stammes, der fähig ist, Acetonitril als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten. Jedoch gibt es keine Offenbarung der Verwendung einer anderen nitrilhaltigen Verbindung durch den Stamm.
Narayanasamy und andere, 1990, Indian J. Exp. Biol. 28: 968- 971, offenbaren die Verwendung von Acrylnitril, Acetonitril, Acrylamid und Acetamid durch eine Arthrobacter Sp. einzeln. Es gibt keinen Hinweis darauf, dass der Bakterienstamm fähig ist, Dinitrile oder ein Gemisch von Nitrilen abzubauen.
O'Grady und Pembroke, 1994, Biotech. Letters 16: 47-50, beschreiben die Isolierung einer Agrobacterium Sp. und die Fähigkeit des isolierten Stammes, eine Anzahl verschiedener Nitrilverbindungen einzeln zu verwerten oder zu zerlegen. Es gibt keinen Hinweis darauf, dass der isolierte Stamm fähig wäre, ein Gemisch von Nitrilverbindungen zu verwerten oder zu zerlegen.
Martinkova und andere, 1992, Folia Microbiol. 37: 373-376, offenbaren die Isolierung verschiedener Bakterienstämme, einschließlich Corynebacterium Sp. Stamm 3 B und Agrobacterium radobacter Stamm 8/4/1, die fähig sind, Acetonitril als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten. Es gibt keine Offenbarung, dass die Stämme dazu fähig sind, irgendeine andere Nitrilverbindung oder ein Gemisch von Nitrilverbindungen zu verwerten.
Nawaz und andere, 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60: 3343- 3348, beschreiben die Isolierung eines Bakteriums, das versuchsweise als eine Rhodococcus Sp. identifiziert ist, aus Erde, die mit dem Herbizid Alachlor verschmutzt ist. Es wurde gezeigt, dass dieses Bakterium fähig war, Acrylnitril als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten.
Nawaz und andere, 1993, Can. J. Microbiol. 39: 207-212, beschreiben die Isolierung einer Pseudomonas Sp. und Xanthomonas maltophilia, welche jeweils Acrylamid als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwerten können.
Internationale Patentveröffentlichung WO 97/06248, veröffentlicht am 20. Februar 1997, offenbart Verfahren zum Produzieren einer Amidase durch Kultivieren eines geeigneten Mikroorganismus in Gegenwart von einem Amid oder einem Amidvorläufer, wie ein Nitril oder ein Gemisch davon, unter durchgängigen kohlenstoffbegrenzenden Kultivierbedingungen, in welchen das Amid oder der Amidvorläufer wenigstens 20 Mol% und vorzugsweise im Wesentlichen alle des Kohlenstoffes bildet. Geeignete Mikroorganismen umfassen Pseudomonas, Rhodococcus usw. Ebenfalls werden Verfahren zum Produzieren einer Nitrilase offenbart durch Kultivieren eines Mikroorganismus in Gegenwart von einem Nitril oder einem Nitrilvorläufer oder einem Gemisch davon unter durchgängigen kohlenstoffbegrenzenden Kultivierbedingungen. Geeignete Mikroorganismen umfassen Nocardia, Rhodococcus Sp., einschließlich Rhodococcus ATCC 39484 usw. Das induzierte Enzym wird dann unter anderem dazu verwendet, ein Nitril oder Amid zu seiner entsprechender Säure umzusetzen.
Obgleich Mikroorganismen, die eine Nitrilverbindung verwerten, möglicherweise nützlich sind, um eine einzige Nitrilverbindung aus einer nitrilhaltigen Zusammensetzung zu entfernen, ist der Gebrauch eines solchen Organismus, um bei der Entsorgung des Abfallstromes einer Nitrilproduktionsanlage zu helfen, nicht zu erwarten, da der Gebrauch von Nitril von der Expression einer Nitrilase oder Nitrilhydratase, die für die verwertete Nitrilverbindung spezifisch ist, abhängig ist. Die Expression einer spezifischen Nitrilase oder Nitrilhydratase stellt nicht sicher, dass der Mikroorganismus die Fähigkeit haben wird, das Gemisch von Nitrilverbindungen oder das Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen umzusetzen, die in den hohen Konzentrationen, die in dem Abfallstrom einer Nitrilproduktionsanlage gefunden werden, vorhanden sind.

2.2 BEHANDLUNG VON NITRILABFÄLLEN EINSCHLIESSLICH EINES ABFALLSTROMS EINER NITRILPRODUKTIONSANLAGE

Eine Anzahl von Verweisen beschreiben Versuche, ein mikrobiologisches Verfahren zur Verfügung zu stellen, um ein Nitril aus einem Nitrilabfall, einschließlich des Abfallstroms einer Nitrilproduktionsanlage, zu entfernen.
WS. Patent Nr. 3,940,332 für Kato und andere (Kato) beschreibt den Gebrauch eines isolierten Bakterienstammes, Nocardia rubropertincta, ATCC Nr. 21930, in Verbindung mit aktiviertem Schlamm von einer Abwasserbehandlungsanlage, um einen Abfallstrom, der Nitrile und anorganische Cyanide enthält, abzubauen. Kato weist auch darauf hin, dass der Bakterienstamm fähig ist, Nitrile, einschließlich Acetonitril, Acrylnitril, Propionitril, Butyronitril, Crotonnitril, Fumarnitril, Valeronitril, Glutaronitril und Benzonitril abzubauen, obgleich kein Hinweis zu der Menge jedes solcher Nitrile oder den Bedingungen, bei denen die Nitrile abgebaut werden, oder ob die Nitrile zusammen abgebaut werden können, gegeben wird. Es gibt keinen Hinweis darauf, dass der Stamm, der durch Kato offenbart wird, ein Gemisch von Nitrilverbindungen abbauen oder entgiften kann. Des Weiteren war der Nitrilabfall, der durch Kato behandelt wurde, ein Abfall von geringer Stärke, 50-250 ppm Gesamtnitrilkonzentration. Zudem hat der betreffende Erfinder den Stamm, der durch Kato offenbart wurde, geprüft und hat herausgefunden, dass der Stamm Acetonitril nicht mit der gleichen Effizienz aus einem Gemisch von Nitrilen entfernt, wie mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt werden kann.
Sunarko und Meyer, 1989, DECHMA Biotech. Conf. 3: 859-862, offenbaren, dass gefriergetrocknete Zellen von Mycobacterium UBT5, Bacillus UBT2, Corynebacterium UBT9 und Flexibacter UBT4, die durch Wachsen der Zellen in Gegenwart von 2-Acrylsäurenitril induziert worden waren, fähig waren, kleine Mengen von Acetonitril, das in dem Ausfluss der HPLC-Kolonne des Labors gefunden wurde, abbauen konnten.
Brown und andere, 1980, Water Res. 14: 775-778, offenbaren, dass Acrylamid, das in Konzentrationen von 0,5 ppm bis 5 ppm natürlichen und verschmutzten Wasser der Umgebung zugesetzt wurde, zum Abbau des Acrylamids führte.
Kincannon und andere, 1983, Journal WPCF 55: 157-163, offenbaren, dass ein Gemisch von Mikroorganismen, die aus einer städtischen aktivierten Schlammwasserbehandlungsanlage isoliert wurden, fähig war, Acrylnitril nach einem Anpassungszeitraum von einem Monat abzubauen. Des Weiteren zeigten die Autoren auch, das Acrolein in ähnlicher Weise durch das Gemisch von Mikroorganismen abgebaut werden konnte.
Donberg und andere, 1992, Environ. Toxicol. chem. 11: 1583- 1594, offenbaren, dass ein Gemisch von Mikroorganismen, die in Erde gefunden wurden, fähig war, Acrylnitril bei aeroben Bedingungen abzubauen. Einige Gemische waren fähig, 10 - 100 ppm Acrylnitril innerhalb von etwa 2 Tagen abzubauen. Jedoch wurde der Abbau bei höheren Konzentrationen von Acrylnitril (1000 ppm) gehemmt. Die Autoren vermuteten, dass die Hemmung durch die hemmenden Wirkungen der Ausgangsacrylnitrilverbindung begründet war.
Knowles und Wyatt, Europäisches Patent Nr. 274 856 B1, und Wyatt und Knowles, 1995, Biodegradation 6: 93-107, beschreiben den Abbau eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen aus den Abfallströmen einer Nitrilproduktionsanlage (die das BP/SOHIO-Verfahren der Acrylnitrilproduktion verwendet) durch ein Gemisch von Mikroorganismen. Der Gebrauch eines Gemisches von Mikroorganismen statt einer Reinkultur ist ein erheblicher Nachteil des Verfahrens von Knowles und Wyatt. Es ist schwierig, eine Mischkultur zu haltenr da bei Veränderung der Bedingungen der Reaktion bestimmte Stämme innerhalb der Mischkultur zu unterschiedlichen Zeiten für Wachstum bevorzugt werden, so dass die Wirksamkeit des Abbaus verringert werden kann.
Es gibt eine Anzahl von Nachteilen, die mit obigen Verweisen verbunden sind. Zum Beispiel haben viele der einzelnen Mikrobenstämme, die oben beschrieben sind, nur einen begrenzten Bereich von Nitril- oder Amidverbindungen, die sie abbauen können. Die Zeit, die für den Abbau/die Verwertung von Nitril- und Amidverbindungen erforderlich ist, bewegt sich im Bereich von Tagen oder Wochen. Des Weiteren hat die Entsorgung durch traditionelle aktivierte Schlammbehandlung ihre eigenen Nachteile, wie die große Menge von Biomasse, die produziert wird, die letztlich entsorgt werden muss. Zudem, was am wichtigsten ist, macht die Verwendung eines Gemisches von Mikroorganismen statt Reinkulturen es sehr schwierig, da es schwierig ist, die Mischkultur zu halten. Wenn sich die Bedingungen der Reaktion verändern, werden bestimmte Stämme innerhalb der Mischkultur zu unterschiedlichen Zeiten für Wachstum bevorzugt, so dass sich die Eigenschaften der Mischkultur über die Zeit verändern und die Wirksamkeit des Abbaues abnehmen kann. Die Mischkultur kann nicht einfach reproduziert oder gehalten werden.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Verfahren zur Entgiftung eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen mittels einer Reinkultur von induzierten Mikroorganismen oder eines Extraktes davon werden durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt. Die Verfahren des Einsetzens der Mikroorganismen sind hilfreich bei der Entgiftung dieser Gemische von Verbindungen in der Form von Gasen, Aerosolen oder Fluiden, einschließlich Flüssigkeiten.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, um einen Mikroorganismusstamm mehrfach zu induzieren, um ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entgiften. In einer Art dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismusstammes auf einem vollständigen Nährmedium, das ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen enthält. In einer anderen Art dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismusstammes auf einem Minimalmedium, das ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch Von Nitril- und Amidverbindungen als die einzige Kohlenstoff- und Energie- und/oder Stickstoffquelle enthält.
Die Verfahren zur Mehrfachinduktion erfordern die Gegenwart eines aromatischen Nitrils nicht; jedoch wird gemäß einer Ausführungsform die Fähigkeit, ein aromatisches Nitril zu entgiften, vorteilhafterweise ohne die Verwendung eines aromatischen Nitrils erhalten.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum mehrfachen Induzieren eines Mikroorganismusstammes, um ein Gemisch von Amidverbindungen zu entgiften, zur Verfügung gestellt. In einer Art dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismusstammes auf einem vollständigen Nährmedium, das ein Gemisch von Nitril(en) und Amid(en) enthält. In einer anderen Art dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismusstammes auf einem Minimalmedium, das ein Gemisch von Nitril(en) und Amid(en) als die einzige Kohlenstoff- und Energie- und/oder Stickstoffquelle enthält.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, um einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen entgiften kann. Im Allgemeinen umfasst dieses Verfahren das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus (oder einer definierten Mischkultur von Mikroorganismen, die aus einem Gemisch von bekannten Reinkulturen zusammengesetzt ist) mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen bei aeroben Bedingungen und das Wiedergewinnen aus dem/den gezüchteten Mikroorganismus(men) eines Mikroorganismus, der ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen entgiftet, wie diejenigen, die normalerweise in dem Abfallstrom einer Nitrilproduktionsanlage in hoher/hohen Konzentration(en) wie in Nitrilproduktionsabfallströmen gefunden werden. Der wiedergewonnene Mikroorganismus kann isoliert werden, um eine Reinkultur eines Mikroorganismus, der fähig ist, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entgiften, zur Verfügung zu stellen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erhalten eines Mikroorganismus, der ein Gemisch von Amidverbindungen entgiften kann, zur Verfügung gestellt. Im Allgemeinen umfasst dieses Verfahren das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus (oder einer definierten Mischkultur von Mikroorganismen, die aus einem Gemisch von bekannten Reinkulturen zusammengesetzt ist) mit einem Gemisch von Nitril(en) und Amid(en) bei aeroben Bedingungen und das Wiedergewinnen aus dem (den) kultivierten Mikroorganismus (Mikroorganismen) eines Mikroorganismus, der ein Gemisch von Amidverbindungen entgiftet. Der wiedergewonnene Mikroorganismus kann isoliert werden, um eine Reinkultur eines Mikroorganismus, der fähig ist, ein Gemisch von Amidverbindungen zu entgiften, zur Verfügung zu stellen.
Die Reinkulturen der Mikroorganismen können nach Induktion ausgedehnte Zeiträume lang gelagert werden, z. B. wenigstens 4 Monate bei normalen Kühlungstemperaturen, d. h. etwa 4ºC, länger (Jahre) bei normalen Gefriertemperaturen, d. h. -20 ºC oder kälter, oder wenn Gefriertrocknen oder Tieftemperaturkonservierung eingesetzt wird. Zusätzlich können die Mikroorganismen schnell und wirksam relativ hohe Konzentration(en) von Nitrilverbindung(en) entgiften. Des Weiteren können die Mikroorganismen einen breiten Bereich von Konzentrationen von Nitril- und/oder Amidverbindung(en) tolerieren. Bestimmte Mikroorganismen sind fähig, wenigstens eine der Nitril- oder Amidverbindungen als einzige Kohlenstoff- und Energie- und Stickstoffquelle zu verwerten.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Entgiftung eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen zur Verfügung gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen mit einer Reinkultur eines Mikroorganismusstammes, wobei der Stamm aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mikroorganismen mit ATCC Nummern 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 und 55725 besteht, der mehrfach induziert wurde, um das Gemisch Von Nitrilen und/oder Amiden zu entgiften über eine ausreichende Zeit, um die Nitrile und/oder Amide zu entsprechenden Amiden und/oder Säuren umzusetzen. Die Reinkultur von induzierten Mikroorganismen braucht nicht aktiv teilend oder sogar lebendig zu sein, wenn sie in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen eines Rohextraktes einer Reinkultur eines Mikroorganismusstammes, wobei der Stamm aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mikroorganismen mit ATCC Nummern 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 und 55725 besteht, und der mehrfach induziert worden ist, um das Gemisch von Nitrilen und/oder Amiden zu entgiften über eine ausreichende Zeit, um die Nitrile und/oder Amide zu entsprechenden Amiden und/oder Säuren umzusetzen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Entgiftungsverfahren des Weiteren das Zufügen zu der Reinkultur von Mikroorganismen und/oder zu dem Rohextrakt der Reinkultur von Mikroorganismen eines oder mehr nitril- und/oder amidabbauender Enzyme, beispielsweise Nitrilase, Nitrilhydratase und Amidase, um die Geschwindigkeit und/oder Wirksamkeit der Entgiftung der Nitril- und/oder Amidverbindungen zu beschleunigen.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Umsetzen eines Gemisches von Amidverbindungen zur Verfügung gestellt. Die Amide werden zu entsprechenden Säureverbindungen umgesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen eines Gemisches von Amiden mit einer Reinkultur oder einem Rohextrakt eines Mikroorganismusstammes, wobei der Stamm ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Mikroorganismen mit ATCC Nummern 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 und 55725 besteht, und mehrfach induziert worden ist, um die Fähigkeit zu besitzen, das Gemisch von Amiden zu Säuren umzusetzen über eine ausreichende Zeit, um die Amide zu den entsprechenden Säuren umzusetzen.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein chemisch/biologisches Hybridverfahren zur Herstellung eines Amides, wie Acrylamid oder Acetamid, zur Verfügung. Diese Ausführungsform umfasst ein verbessertes Verfahren, um ein Amid, wie Acetamid oder Acrylamid herzustellen, wobei die Verbesserung das in Kontakt bringen einer intermedlären Lösung umfasst, die während eines chemischen Syntheseprozesses zum Herstellen eines Amides gebildet wurde, wobei die Lösung etwa 30%-50% Amid und etwa > 100 und ≤ 10 000 ppm Nitril mit einem mehrfach induzierten Mikroorganismus umfasst, der behandelt wurde, um Amidaseaktivität zu deaktivieren, über eine ausreichende Zeit, um die Konzentration von Nitril auf weniger als 100 ppm zu reduzieren. Das Nitril wird zu Acrylamid umgesetzt.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt einen Biofilter zur Verfügung, der einen induzierten Mikroorganismus oder einen Extrakt davon und Verfahren zum Gebrauch des Biofilters umfasst. Biofilter werden in der Entgiftung eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen oder eines Gemisches von Amidverbindungen in Ausflüssen, wie Luft, Dämpfe, Aerosole und Wasser oder wässrige Lösungen, verwendet.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Kits zur Verfügung gestellt, die eine Reinkultur eines Mikroorganismus enthalten, der mehrfach induziert wurde, um die Fähigkeit zu besitzen, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entgiften.
Die Verfahren, Biofilter und Kits der Erfindung sind nützlich, um ein Gemisch, das eine Verschiedenheit von Nitrilverbindungen umfasst, oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen in hoher (hohen) Konzentration(en), zu entgiften. Das Gemisch von Nitrilverbindungen oder Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder Gemisch von Amidverbindungen ist im Allgemeinen in einer wässrigen Umgebung. Die Verfahren, Biofilter und Kits der Erfindung sind auch nützlich, um Nitrilverbindung(en) von einer Amidzubereitung, die eine unerwünschte Nitrilverbindung enthält, zu entfernen, und so eine im Wesentlichen reine Amidzubereitung zur Verfügung zu stellen. In beispielhaften Ausführungsformen ist die Amidzubereitung eine Acetamid- oder Acrylamidzubereitung. Des Weiteren sind die Verfahren, Biofilter und Kits der Erfindung auch nützlich, um eine unerwünschte Amidmonomerverbindung(en) in einer Polyamid- oder polymerisierten Amidzubereitung, die ein unerwünschtes Amidmonomer oder nicht polymerisierte Amidverbindung enthält, zu der entsprechenden Säureverbindung umzusetzen, die leicht aus der Zubereitung entfernt werden kann, und stellt so eine im Wesentlichen reine Polyamid- oder polymerisierte Amidzubereitung zur Verfügung. Vorzugsweise wird das Polyamid oder polymerisierte Amid durch die Verfahren nicht beeinflusst, d. h. im Wesentlichen kein Verlust des Polyamids oder polymerisierten Amids.
In einer Hinsicht sind die Verfahren, Biofilter und Kits der Erfindung besonders geeignet für den Gebrauch, um ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen in Abfallströmen von Nitrilproduktionsanlagen zu entgiften. In dieser Hinsicht sind die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung besonders vorteilhaft insofern, als dass die Nitrile in hoher (hohen) Konzentration(en) durch eine Reinkultur eines induzierten Mikroorganismus entgiftet werden. In einer anderen Hinsicht der Erfindung sind die Verfahren besonders geeignet für den Gebrauch, um Nitrilverbindung(en) aus Amidzubereitungen, die ein unerwünschte Nitrilverbindung enthält, zu entfernen. In dieser Hinsicht sollte die Reinkultur oder der Extrakt, wenn die Reinkultur von induzierten Mikroorganismen oder Extrakt davon Amidaseaktivität enthält, bei einer Temperatur inkubiert werden, die jegliche Fähigkeit, ein Amid zu Säure umzusetzen, deaktiviert, jedoch die Fähigkeit des Mikroorganismus oder Extraktes, eine Nitrilverbindung zu einer Amidverbindung umzusetzen, vor Gebrauch in den Verfahren nicht beeinflussen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung braucht die Mikroorganismusreinkultur, wenn sie einmal induziert ist, nicht mehr aktiv teilend oder sogar lebendig sein, damit die Entgiftung stattfindet. Dieses Abkoppeln des Wachstums von der Entgiftung ermöglicht eine schnelle Entgiftung von Nitrilverbindungen bei Bedingungen, die hemmend für Wachstum sind; zum Beispiel bei sehr hoher (hohen) Konzentration(en) von Nitrilverbindungen, hoch basischem oder saurem pH, hoher Temperatur, z. B. 55ºC usw. Zudem bedeutet Abkoppeln: (1) dass, da die Zellen nicht im Wachstum sein brauchen, um zu entgiften, Zellen (Biomasse) nicht hergestellt werden oder ihre Herstellung minimiert ist, wo Zellen wachsen, ist es erforderlich, mit der Abfallbiomasse, die geschaffen wird, umzugehen; (2) da die Zellen nicht wachsen, können Verbindungen, die nicht als Wachstumssubstrate dienen, zufällig entgiftet werden; und (3) das Verfahren führt zu der Herstellung von weniger giftigen oder nicht giftigen Zwischenprodukten, die in der Natur einfach abgebaut werden können (Verringerung der Rekalzitranz sowie Giftigkeit).
Des Weiteren, da einige Nitril- oder Amidverbindungen besonders unempfindlich gegenüber Bioremediation sind, erlaubt die vorliegende Erfindung die Entgiftung von Nitrilen zu entsprechenden Amid- und/oder Säureverbindungen oder die Umsetzung von Amiden zu Säureverbindungen, die weniger unempfindlich gegenüber Bioremediation sind, um damit die erfolgreiche Bioremediation von unempfindlichen Verbindungen zu erlauben.
Die Geschwindigkeit und die Wirksamkeit, die mit den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung erzielt werden, sind niemals zuvor bei der Entgiftung von Nitrilverbindung(en) erreicht worden.

3.1. DEFINITIONEN

Wie in dieser Anwendung bezüglich einer Nitrilverbindung verwendet, soll der Ausdruck "Entgiftung" die Umsetzung einer Nitrilverbindung entweder zu entsprechender Amid- oder Säureverbindung oder Gemisch davon umfassen. Zum Beispiel wird Acrylnitril durch Umsetzung zu Acrylamid oder zu Acrylsäure oder Gemisch davon entgiftet. Wie in dieser Anwendung bezüglich einer Amidverbindung verwendet, soll der Begriff "Entgiftung" die Umsetzung einer Amidverbindung zu der entsprechenden Säureverbindung umfassen. Die Säure kann als eine freie Säure oder Salzform bestehen, wenn die Säure in Gegenwart von einem Salz ist. Der Begriff "Entgiftung" soll nicht bedeuten, dass die Verbindung, zu der die Nitril- oder Amidverbindung umgesetzt ist, weniger giftig (d. h. schädlich für einen lebenden Organismus) als die Nitril- oder Amidverbindung ist, obgleich diese Verbindung es wohl sein kann. Zusätzlich soll der Begriff "Entgiftung" nicht bedeuten, dass die Nitril- oder Amidverbindung zu Endprodukten CO&sub2;, H&sub2;O und Biomasse abgebaut wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Entgiftung Umsetzung der Nitril- und/oder Amidverbindungen zu Verbindungen, für die durch eine Umweltschutzbehörde bescheinigt werden kann, dass sie weniger schädlich und vorzugsweise unschädlich sind.
Wie in dieser Anwendung verwendet, soll eine "Nitril"- Verbindung eine organische Verbindung umfassen, enthaltend eine oder mehr Nitrilanteile, d. h., C N, und wenigstens ein Kohlenstoffatom zusätzlich zu dem C N Anteil. Wie gegenwärtig verwendet, umfasst der Begriff "Nitril" Verbindungen, wie Acroleincyanhydrin. Es wird bemerkt, dass Acrolein in Gegenwart von reaktivem Cyanid in der Form von Acroleincyanhydrin besteht. Die nitrilentgiftenden Mikroorganismen sind fähig, ein Nitril, welches ein Cyanhydrin ist, zu einer entsprechenden Säure umzusetzen. Zum Beispiel wird Acroleincyanhydrin zu Acrylsäure umgesetzt. Wie gegenwärtig verwendet, umfasst der Begriff "Nitril", ist jedoch nicht beschränkt auf, Acetonitril, Acrylnitril, Fumarnitril, Succinnitril, Crotonnitril, Adiponitril, Benzonitril, Butyronitril, β-Propriosulfonitril, Isovaleronitril, Valeronitril, Phenylnitril, Acroleincyanhydrin usw.

3.2 AUFGABEN DIESER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine induzierte Reinkultur eines einzelnen Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen, der fähig ist, ein Gemisch von Nitril- oder Nitril- und Amidverbindungen zu deren entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen umzusetzen, ohne notwendigerweise das Gemisch von Verbindungen abzubauen (zu verwerten). Des Weiteren kann diese Umsetzung stattfinden, wenn die Verbindungen, die in dem Gemisch vorliegen, in hohen Konzentrationen sind, solche Konzentrationen wie diejenigen, die in dem Abfallstrom einer Nitril-, z. B. Acrylnitril-, Produktionsanlage gefunden werden. Des Weiteren sind die induzierten Reinkulturen fähig, einen breiten Bereich von Nitril- (einschließlich Dinitril-) und Amidverbindungen gleichzeitig umzusetzen, nicht nur eine oder zwei Nitrilverbindungen einzeln.
Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zum Gebrauch solcher Reinkulturen zur Verfügung zu stellen, um das Gemisch von Verbindungen, die in dem Abfallstrom einer Nitrilproduktionsanlage gefunden werden, zu Verbindungen umzusetzen, die in der Natur einfacher abgebaut werden können. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass, da die Umsetzung des Gemisches von Verbindungen nicht notwendigerweise an Wachstum gebunden ist, weniger Biomasse für anschließende Entsorgung produziert werden kann. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Zeit, die für die Umsetzung der Verbindungen in hohen Konzentrationen erforderlich ist, nur im Bereich von Minuten oder Stunden liegt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Verfahren für den Gebrauch der Reinkulturen zur Verfügung zu stellen, um eine unerwünschte Nitrilverbindung aus einer Amidzubereitung, wie eine Amidzubereitung, die in einer Amidproduktionsanlage zubereitet wird, zu entfernen. Die Reinkulturen werden vorteilhafterweise verwendet, um Amidzubereitungen von handelsüblicher Qualität, wie Acetamid oder Acrylamid, die eine unerwünschte Nitrilverbindung enthalten, durch Umsetzen des Nitrils zu einem Säureanteil, zu reinigen. Hierdurch wird die Reinheit und die Produktausbeute des Amids, das hergestellt wird, verbessert.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Verfahren zur Verfügung zu stellen für den Gebrauch der Reinkulturen, um ein Gemisch von Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen umzusetzen.
Andere Aufgaben und/oder Vorteile der Erfindung werden Fachleuten offensichtlich sein.

4. KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Die vorliegende Erfindung kann genauer durch den Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung, Veranschaulichungsbeispiele der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung und die beigefügten Figuren verstanden werden, wobei:
Fig. 1 ein Schaubild ist, das die Wirkung von Temperatur auf die Geschwindigkeit der Nitrilentgiftung durch Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 über einen Temperaturbereich von 25ºC bis 80ºC zeigt.
Fig. 2A-2C Schaubilder sind, die die Fähigkeit von R. rhodochrous Stamm DAP 96622 zeigen, der wie hierin gelehrt induziert ist, um Acetonitril und Acrylnitril bei unterschiedlichen pH-Werten zu entgiften. Fig. 2A, pH = 6; Fig. 2B, pH = 7; Fig. 2C, pH = 8. Einzelheiten siehe Text, Abschnitt 8.2.
Fig. 3 ist ein Schaubild, das die Fähigkeit von Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 zeigt, der wie hierin gelehrt induziert ist, um ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entgiften. Einzelheiten siehe Text, Abschnitt 9.
Fig. 4A und 4B sind Schaubilder, die die Fähigkeit von Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96622 zeigen, der wie hierin gelehrt induziert ist, um einen Abwasserkolonnengrund, entweder zu 1 : 5 verdünnt (Fig. 4A) oder in voller Stärke (Fig. 4B) zu entgiften, Einzelheiten siehe Text, Abschnitt 10.
Fig. 5 ist ein Schaubild, das die Fähigkeit von Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 zeigt, der wie hierin gelehrt induziert ist, einen Reinabstreifgrund zu entgiften. Einzelheiten siehe Text, Abschnitt 11.

5. GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Entgiftung eines Gemisches von Nitrilverbindungen, eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen oder eines Gemisches von Amidverbindungen in hoher (hohen) Gesamtkonzentration(en) durch Umsetzen der Nitrilverbindungen zu entsprechenden Amid- und/oder Säureverbindungen oder durch Umsetzen der Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen mittels einer Reinkultur eines einzelnen Mikroorganismusstammes, der induziert ist, um dazu fähig zu sein, die Nitrilanteile zu Amid- und/oder Säureanteilen und/oder die Amidanteile zu Säureanteilen umzusetzen. Wenn das ursprüngliche Gemisch ein Gemisch von Nitrilverbindungen ist und ein Amid gebildet wird, kann das Amid mittels der vorliegenden Verfahren weiter zu der entsprechenden Säure umgesetzt werden. Die induzierten Reinkulturen sind fähig, Gemische von Nitrilverbindungen oder Gemische von Nitril- und Amidverbindungen umzusetzen, die typischerweise in (einer) hohen Konzentration(en) in Nitrilproduktionsabfallströmen vorliegen. Die induzierten Reinkulturen sind fähig, eine unerwünschte Nitrilverbindung aus Amidzubereitungen, dieselbe enthaltend, die durch Amidproduktionsanlagen hergestellt werden, zu entfernen. Die induzierten Reinkulturen sind fähig, Gemische von Amid zu entsprechenden Säureverbindungen umzusetzen.
Obwohl nicht beabsichtigt ist, sich auf einen bestimmten Mechanismus der Umsetzung zu begrenzen, wird angenommen, dass die Mikroorganismen, die fähig sind, ein Nitril zu entsprechendem Amid umzusetzen, Nitrilhydratase-Enzymaktivität enthalten; diejenigen, die fähig sind, ein Nitril zu entsprechender Säure umzusetzen, enthalten entweder Nitrilhydratase-Enzymaktivität in Verbindung mit Amidase-Enzymaktivität oder Nitrilase-Enzymaktivität.
Entgiftung eines Nitrils zu entsprechendem Amid kann überwacht werden, indem das Verschwinden der Nitrilverbindung und/oder das gleichzeitige Erscheinen der Amidverbindung beurteilt wird durch irgendein Verfahren, dass Fachleuten bekannt ist, beispielsweise mittels der Gas-Flüssigkeit- Chromatographie mit einem Flammenionisierungsdetektor (GLC- FID), um die Amidverbindung nachzuweisen, und Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie (HPLC), um die Säureverbindung nachzuweisen. Die Entgiftung zu der entsprechenden Säure führt zu stöchiometrischer Produktion von Ammoniak für jede Nitril- oder Amidgruppe, die ursprünglich vorliegend war. Das Ausmaß der Entgiftung von Nitrilverbindungen oder Amidverbindungen kann durch Messen der Freisetzung von Ammoniak mittels der Technik von Fawcett und Scott, 1960, J. Clin. Pathol. 13: 156-159 überwacht werden. Wenn die Ammoniakfreisetzung aufgrund der Gegenwart von Ammoniak oder eines Ammoniaksalzes nicht gemessen werden kann, kann die Konzentration der vorliegenden Nitrile und Amide durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, überwacht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, GLC-FID usw. Im anderen Falle kann das Verschwinden von Nitrilverbindungen durch Bewertung der Produktion der entsprechenden Säureverbindungen gemessen werden, welche durch Ableiten der Säureverbindung und Bestimmung des abgeleiteten Produkts mittels GLC-FID überwacht werden kann. Amide und Säuren können für Analyse mittels GLC-FID abgeleitet werden, wenn sie zuerst alkyliert, verestert oder silyliert werden (siehe im Allgemeinen Supelco Chromatography Products Katalog, 1997, auf Seite 653-656 (Supelco Inc., Bellefonte PA).
Die Säure- und andere Nichtnitrilverbindungen können dann, wenn gewünscht, weiter zu CO&sub2;, H&sub2;O und Biomasse abgebaut werden.
Zur Klarheit der Offenbarung und in keiner Weise als Begrenzung ist die genaue Beschreibung der Erfindung in die folgenden Unterabschnitte unterteilt:
(1) Verfahren zur Induktion und Identifizierung von Mikroorganismusstämmen, die eine Nitril- und/oder Amidentgiftungsfähigkeit haben;
(2) Charakterisierung der isolierten Mikroorganismusstämme;
(3) Anwendungen oder Verfahren des Gebrauches der induzierten Mikroorganismusstämme für Entgiftung; und
(4) Kits, die nützliche induzierte Mikroorganismusstämme enthalten.

5.1. VERAHREN ZUR INDUKTION UND IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMUSSTÄMMEN, DIE NITRIL- UND/ODER AMIDENTGIF- TUNGSFÄHIGREIT HABEN

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von nützlichen Mikroorganismusstämmen durch Wachsen eines Stammes in Gegenwart von einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zur Verfügung. Überraschenderweise wurde entdeckt, dass, um eine breite Nitril- oder Amidentgiftungsfähigkeit zu induzieren, d. h. die Fähigkeit, eine Verschiedenheit von Nitrilen oder Amiden, zum Beispiel Nitril mit einem einzigen C N Anteil, wie Acetonitril oder Acrylnitril, und Dinitrile mit zwei C N Anteilen, wie Fumarnitril und Succinnitril, zu entgiften, das Kulturmedium mit mehr als nur einer Nitrilverbindung ergänzt werden muss. Insbesondere wurde entdeckt, dass die Fähigkeit, ein breites Spektrum von Nitrilen und/oder Amiden zu entgiften, induziert werden kann mittels eines Gemisches einer begrenzten Anzahl von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen. Auf diese Weise sind die Stämme "mehrfach induziert". Nach Mehrfachinduktion sind die Stämme in Reinkultur fähig, ein Gemisch eines breiten Bereichs von Nitrilverbindungen zu entgiften, einschließlich Nitrile mit einem einzigen C N Anteil, Dinitrile und Verbindungen, wie Acroleincyanhydrin, sowie einen breiten Bereich von Amidverbindungen. Die Mikroorganismusstämme, die ausgewählt werden, um Induktion zu erfahren, werden aus bekannten Quellen ausgewählt oder können neuisolierte Mikroorganismen sein und können Thermophile oder andere Extremophile, wie Halophile oder Acidophile, sein. Vorteilhafterweise erfordern die Induktionsverfahren kein aromatisches Nitril, wie Benzonitril, haben jedoch gemäß einer Ausführungsform der induzierten Mikroorganismen die Fähigkeit, ein Gemisch zu entgiften, das ein aromatisches Nitril enthält.
Es wurde bemerkt, dass Mikroorganismen, die mehrfach induziert werden können, um Nitril- und/oder Amidentgiftungsaktivität zu haben, in Medien, die ein Nitril oder Amid als einzige Kohlenstoffquelle oder einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthalten, im Vergleich zu Medien, die eine leicht verwertbare Kohlenstoffquelle, wie ein Kohlenhydrat usw., enthalten, langsamer zu wachsen scheinen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Mikroorganismusstamm, der mehrfach induziert sein kann, um Nitril- und/oder Amidentgiftungsaktivität zu haben, in einem Medium kultiviert, das eine leicht verwertbare Kohlenstoffquelle (wie Glukose, Maltose, Saccharose, Acetat, Benzoat usw.) enthält. Der Kohlenstoff und eine Stickstoffquelle werden stufenmäßig oder kontinuierlich zugefügt, so dass die Niveaus von Kohlenstoff und Stickstoff in dem Reaktor unter 1% sind. Auf diese Weise werden große Mengen von Zellen schnell und preiswert produziert. Sobald die gewünschte Zellenmasse erreicht wurde, wird der Mikroorganismus gemäß den Verfahren, die in Abschnitt 5.1.1 oder 5.1.2 unten beschrieben sind, beispielsweise während der letzten 20 Stunden eines Produktionszyklus induziert.

5.1.1. INDUKTION MITTELS NITRILEN ODER NITRIL- UND AMIDVERBINDUNGEN UND VOLLSTÄNDIGEM NÄHRMEDIUM

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für die Induktion von Nitril- und/oder Amidentgiftungsaktivität mittels eines vollständigen Nährmediums zur Verfügung gestellt, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch Von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist. Insbesondere umfasst das Verfahren dieser Ausführungsform das Kultivieren eines Mikroorganismus in einem vollständigen Nährmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist, und das Sammeln der kultivierten Mikroorganismen. Werden sie auf Agar-Agarplatten kultiviert, werden die Mikroorganismen etwa 24 bis 48 Stunden lang in Gegenwart von einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen kultiviert. Werden sie in einem Fermentor kultiviert, werden die Mikroorganismen in vollständigem Nährmedium 1 bis 48+ Stunden lang, vorzugsweise 1 bis 20 Stunden, insbesondere 16 bis 20 Stunden, vor dem Zufügen eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen kultiviert; dann 4 bis 5 Stunden nach dem Zufügen des Gemisches von Nitrilverbindungen oder Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen geerntet. Ist eine größere Biomasse gewünscht, können die Mikroorganismen vor dem Zufügen des Gemisches von Nitrilverbindungen oder des Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen für längere Zeiträume in dem Fermentor kultiviert werden. Wie Fachleuten bekannt, können zusätzliche Nährstoffe nach Erfordernis zugefügt werden, um Wachstum zu halten.
In einer Art dieser Ausführungsform wird der Mikroorganismus in einem vollständigen Nährmedium induziert, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen ergänzt ist. Nützliche Gemische von Nitrilverbindungen umfassen die folgenden: Acetonitril zu etwa 50 bis etwa 500 ppm; Acrylnitril zu etwa 50 bis 500 ppm; und Succinnitril zu etwa 25 bis etwa 100 ppm. Gegebenenfalls können etwa 1-10 ppm KCN oder NaCN dem Gemisch zugefügt werden. Obgleich der Erfinder nicht beabsichtigt, sich auf einen bestimmten Mechanismus zu beschränken, glaubt er, dass die Gegenwart von KCN oder NaCN während der Induktion die Mikroorganismen zu anorganischem Cyanid akklimatisiert. Auch gegebenenfalls kann Kobalt in einer Konzentration von etwa 1-25 ppm dem Gemisch zugefügt werden. Obgleich der Erfinder nicht beabsichtigt, sich auf einen bestimmten Mechanismus zu beschränken, glaubt er, dass Kobalt das Eisenatom in eisenhaltigen Nitrilhydrataseenzymen ersetzt und die Nitrilhydratase gegen Cyanid(e) widerstandsfähig macht. Dies ist hilfreich, wenn das Gemisch von Nitrilverbindungen oder das Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, das entgiftet werden soll, ein Nitrilproduktionsabfallstrom ist, der reich an anorganischem Cyanid ist. Auch gegebenenfalls kann Harnstoff in einer Konzentration von etwa 1-10 g/l dem Gemisch zugefügt werden. Das Zufügen von entweder KCN, NaCN, Kobalt oder Harnstoff ist für die Entgiftungsaktivität nicht erforderlich.
Vorzugsweise wird ein vollständiges Nährmedium mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen ergänzt, die ein Gemisch von wenigstens einem von Acetonitril und Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril und Fumarnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 50 ppm enthält. Insbesondere umfasst das Nitrilgemisch Acetonitril und Acrylnitril zu jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril in einer Konzentration von etwa 50 ppm. Gegebenenfalls wird KCN und Kobalt in einer Konzentration von jeweils etwa 10 ppm und Harnstoff in einer Konzentration von etwa 7 g/l dem Kulturmedium zugefügt. Insbesondere wird ein vollständiges Nährmedium, das BACTOTM R2A Medium (Difco, Detroit, Michigan) oder YEMEA-Medium oder ein Medium, das das Verhältnis der Bestandteile von XEMEA ohne Agar-Agar enthält, ist, mit Acetonitril und Acrylnitril zu jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril in einer Konzentration von etwa 50 ppm, KCN und Kobalt zu jeweils etwa 10 ppm und Harnstoff zu etwa 7 g/l ergänzt. In den bevorzugten Arten induzieren Acetonitril und Acrylnitril zusammen Acetonitril-, Succinnitril- und Fumarnitril-entgiftende Aktivitäten. Der Einschluss von Succinnitril in dem Kulturmedium scheint die Geschwindigkeit der Acetonitril- und Acrylnitrilentgiftung in Gemischen, in welchen Succinnitril und/oder Fumarnitril vorliegt, zu verbessern. Das Zufügen von Succinnitril jedoch scheint die Entgiftung von Succinnitril zu verbessern, hat aber keine Wirkung auf die Entgiftung von Fumarnitril.
In einer alternativen Art dieser Ausführungsform wird der Mikroorganismus in einem vollständigen Nährmedium, das mit einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist, induziert. Nützliche Gemische von Nitril- und Amidverbindungen umfassen die folgenden: (1) wenigstens eine von Succinnitril zu etwa 25 bis 100 ppm, Acetonitril zu etwa 50 bis 150 ppm und Acrylnitril zu etwa 50 bis 150 ppm; und (2) Acetamid zu etwa 50 bis 500 ppm und Acrylamid zu etwa 50 bis 500 ppm. Gegebenenfalls kann KCN oder NaCN zu etwa 1 bis 10 ppm zugefügt werden. Auch gegebenenfalls kann Kobalt zu etwa 1 bis 25 ppm und Harnstoff zu etwa 1-10 g/l zugefügt werden. Vorzugsweise wird ein vollständiges Nährmedium mit 50 ppm Succinnitril und Acetamid und Acrylnitril zu jeweils 150 ppm ergänzt.
Ein vollständiges Nährmedium ist ein Wachstumsmedium, das dem Mikroorganismus alle notwendigen Nährstoffe, die für sein Wachstum erforderlich sind, liefert, d. h. Kohlenstoff und/oder Stickstoff. Zum Beispiel und in keiner Weise als Begrenzung ist BACTOTM R2A Medium (Difco, Detroit, Michigan), das Glukose, Pepton, KH&sub2;PO&sub4;, MgSO&sub4;, Casaminosäuren, Hefeextrakt, lösliche Stärke und Natriumpyruvat enthält, ein geeignetes vollständiges Nährmedium. Ein anderes vollständiges Nährmedium zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung ist YEMEA-Medium, das Glukose, Malzextrakt und Hefeextrakt ohne Agar-Agar enthält. Ein anderes vollständiges Nährmedium zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung ist ein vollständiges Nährmedium, enthaltend Glukose, Pepton, KH&sub2;PO&sub4;, MgSO&sub4;, lösliche Stärke und Natriumpyruvat. Die vorliegende Erfindung umfasst den Gebrauch eines jeden vollständigen Nährmediums, das Fachleuten bekannt ist.
Der Mikroorganismus wird bei Bedingungen kultiviert, die einen pH zwischen 3,0 und 11,0, vorzugsweise zwischen etwa 6,0 und 8,0; und eine Temperatur zwischen 4ºC und 55ºC, vorzugsweise zwischen etwa 15ºC und 37ºC einschließen. Des Weiteren sollte die gelöste Sauerstoffspannung zwischen 0,1% und 100%, vorzugsweise zwischen etwa 4% und 80% und insbesondere zwischen etwa 4% und 30% sein. Die gelöste Sauerstoffspannung kann überwacht und in dem gewünschten Bereich gehalten werden, indem Sauerstoff in der Form von Luft, reinem Sauerstoff, Peroxid und/oder anderen Peroxidzusammensetzungen, die Sauerstoff freisetzen, zugeführt wird.
Am Ende des Kultivierungszeitraums werden die kultivierten Mikroorganismen gesammelt und konzentriert, beispielsweise durch Schaben, Zentrifugieren, Filtern usw. oder durch irgendein anderes Verfahren, das Fachleuten bekannt ist.
In einer beispielhaften Ausführungsform werden Zellen bei 4ºC gesammelt, als Zellkonzentrate präpariert und dann schnell gefroren (Trockeneis und Aceton) und dann bei -20 ºC oder niedriger gelagert. Gefrorenes Zellkonzentrat kann verwendet werden oder es kann dann immobilisiert werden.
Die Nitril- und/oder Amidentgiftungsaktivität der gesammelten Mikroorganismen, nachdem sie gemäß den Verfahren, die oben beschrieben sind, induziert wurden, kann durch Zufügen eines oder mehr Substrate zu den kultivierten Mikroorganismen stabilisiert werden. Obwohl der Erfinder nicht beabsichtigt, sich auf irgendeinen Mechanismus zu beschränken, bemerkt er, dass es Fachleuten wohl bekannt ist, dass Nitrilhydratase- und Amidaseenzyme im Allgemeinen am stabilsten sind, wenn in Gegenwart von einem Substrat. Daher kann beispielsweise das Zufügen einer Amidverbindung, wie Isobutyramid, oder einer Säure, wie Isobuttersäure, eine Nitrilhydratase stabilisieren, so dass die Aktivität für längere Zeiträume gehalten wird.
Stabilisierung kann auch durch Immobilisierung des induzierten Mikroorganismus in Polyacrylamid- oder Acrylamidwürfeln oder in Alginat, das mit Polyethylenimid vernetzt wurde, erreicht werden. Vorzugsweise werden Zellen durch Immobilisierung in Alginat, das mit Polyethylenimid vernetzt wurde, stabilisiert.

5.1.2. INDUKTION MITTELS NITRIL- UND AMIDVERBINDUNGEN UND MINIMALMEDIUM

Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Induktion von Nitrilentgiftungsaktivität mittels eines Minimalkulturmediums zur Verfügung gestellt, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist. Insbesondere umfasst das Verfahren das Kultivieren eines Mikroorganismus in einem Minimalmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist, und das Sammeln der kultivierten Mikroorganismen. Wenn sie auf Agar-Agarplatten kultiviert werden, werden die Mikroorganismen etwa 24 bis 48 Stunden lang kultiviert. Wenn sie in einem Fermentor kultiviert werden, werden die Mikroorganismen in einem Minimalmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist, 1 bis 48+ Stunden, vorzugsweise 1 bis 20 Stunden, insbesondere 16 bis 23 Stunden lang kultiviert; dann 4 bis 5 Stunden nach Zufügen des Gemisches von Nitrilverbindungen oder des Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen geerntet. Wird eine größere Biomasse gewünscht, können die Mikroorganismen für längere Zeiträume in dem Fermentor kultiviert werden.
Nützliche Gemische von Nitrilverbindungen umfassen die folgenden: Acetonitril zu etwa 50 bis etwa 500 ppm; Acrylnitril zu etwa 50 bis 500 ppm und Succinnitril zu etwa 25 bis etwa 100 ppm. Gegebenenfalls können etwa 1-10 ppm KCN oder NaCN dem Gemisch zugefügt werden. Obgleich der Erfinder nicht beabsichtigt, sich auf einen bestimmten Mechanismus zu beschränken, glaubt er, dass die Gegenwart von KCN oder NaCN während der Induktion die Mikroorganismen zu anorganischem Cyanid akklimatisiert. Auch gegebenenfalls kann Kobalt in einer Konzentration von etwa 1-25 ppm dem Gemisch zugefügt werden. Obgleich der Erfinder nicht beabsichtigt, sich auf einen bestimmten Mechanismus zu beschränken, glaubt er, dass Kobalt das Eisenatom in eisenhaltigen Nitrilaseenzymen ersetzt und die Nitrilhydratase widerstandsfähig gegen Cyanid(e) macht. Dies ist hilfreich, wenn das Gemisch von Nitrilverbindungen oder das Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, das entgiftet werden soll, ein Nitrilproduktionsabfallstrom ist, der reich an anorganischem Cyanid ist. Auch gegebenenfalls kann Kobalt in einer Konzentration von etwa 1-10 g/l dem Gemisch zugefügt werden. Das Zufügen von entweder KCN, NaCN, Kobalt oder Harnstoff ist für die Entgiftungsaktivität nicht erforderlich.
Vorzugsweise wird das Minimalmedium mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen ergänzt, die wenigstens eine von Acetonitril und Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril und Fumarnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 50 ppm enthalten. Insbesondere umfasst das Nitrilgemisch Acetonitril und Acrylnitril zu jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 50 ppm. Gegebenenfalls wird KCN und Kobalt in einer Konzentration von jeweils etwa 10 ppm und Harnstoff in einer Konzentration von etwa 7 g/l dem Kulturmedium zugefügt. In dieser bevorzugten Art induzieren Acetonitril und Acrylnitril zusammen Acetonitril-, Acrylnitril-, Succinnitril- und Fumarnitril-entgiftende Aktivitäten. Der Einschluss von Succinnitril in dem Kulturmedium scheint die Geschwindigkeit der Acetonitril- und Acrylnitrilentgiftung in Gemischen, in welchen Succinnitril vorliegend ist, zu verbessern. Das Zufügen von Succinnitril jedoch scheint die Entgiftung von Succinnitril zu verbessern, hat aber keine Wirkung auf die Entgiftung von Fumarnitril.
In einer alternativen Art dieser Ausführungsform wird der Mikroorganismus in einem Minimalmedium, das mit einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist, induziert. Nützliche Gemische von Nitril- und Amidverbindungen umfassen die folgenden: (1) wenigstens eine von Succinnitril zu etwa 25 bis 100 ppm, Acetonitril zu etwa 50 bis 150 ppm und Acrylnitril zu etwa 50 bis 150 ppm; und (2) Acetamid zu etwa 50 bis 500 ppm und Acrylamid zu etwa 50 bis 500 ppm. Gegebenenfalls kann KCN oder NaCN zu etwa 1 bis 10 ppm zugefügt werden. Auch gegebenenfalls kann Kobalt zu etwa 1 bis 25 ppm und Harnstoff zu etwa 1-10 g/l zugefügt werden. Vorzugsweise wird ein Minimalmedium mit 50 ppm Succinnitril und Acetamid und Acrylnitril zu jeweils 150 ppm ergänzt.
Ein Minimalmedium ist ein unvollständiges Nährmedium, das dem Mikroorganismus nicht Kohlenstoff für sein Wachstum liefert. Stattdessen muss das Minimalmedium mit Verbindungen ergänzt werden, welche die Mikroorganismen als Kohlenstoff- und/oder Energiequelle nutzen können. Zum Beispiel, und in keiner Weise als Begrenzung, sind das Minimalmedium von Stanier (Stanier und andere, 1966, J. Gen. Microbiol. 43: 159-271) und phosphatgepufferte Saline (PBS) akzeptable Minimalmedien zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung.
Der Mikroorganismus wird bei Bedingungen kultiviert, die einen pH zwischen 3,0 und 11,0, vorzugsweise zwischen etwa 6,0 und 8,0; und eine Temperatur zwischen 4ºC und 55ºC, vorzugsweise zwischen etwa 15ºC und 37ºC einschließen. Des Weiteren sollte die gelöste Sauerstoffspannung zwischen 0,1% und 100%, vorzugsweise zwischen etwa 4% und 80% und insbesondere zwischen etwa 4% und 30% sein. Der gelöste Sauerstoff kann überwacht und in dem gewünschten Bereich gehalten werden, indem Sauerstoff in der Form von Luft, reinem Sauerstoff, Peroxid und/oder anderen Peroxidzusammensetzungen, die Sauerstoff freisetzen, zugeführt wird.
Am Ende des Kultivierungszeitraums werden die kultivierten Mikroorganismen gesammelt und konzentriert, beispielsweise · durch Schaben, Zentrifugieren, Filtern usw. oder durch irgendein anderes Verfahren, das Fachleuten bekannt ist.
Die Nitril- und/oder Amidentgiftungsaktivität der gesammelten Mikroorganismen, nachdem sie gemäß den Verfahren, die oben beschrieben sind, induziert wurden, kann durch Zufügen eines oder mehr Substrate zu den kultivierten Mikroorganismen stabilisiert werden. Obwohl der Erfinder nicht beabsichtigt, sich auf irgendeinen Mechanismus zu beschränken, bemerkt er, dass es Fachleuten gut bekannt ist, dass Nitrilhydratase- und Amidaseenzyme im Allgemeinen am stabilsten sind, wenn in Gegenwart von einem Substrat. Daher kann beispielsweise das Zufügen einer Amidverbindung, wie Isobutyramid, oder einer Säure, wie Isobuttersäure, eine Nitrilhydratase stabilisieren, so dass die Aktivität für längere Zeiträume gehalten wird.
Stabilisierung kann auch erreicht werden durch Immobilisierung des induzierten Mikroorganismus in Polyacrylamid- oder Acrylamidwürfeln oder in Alginat, das mit Polyethylenimid vernetzt wurde. Vorzugsweise werden Zellen durch Immobilisierung in Alginat, das mit Polyethylenimid vernetzt wurde, stabilisiert.

5.1.3. IDENTIFIZIERUNG NÜTZLICHER MIKROORGANISMEN

Gemäß noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Untersuchen von Mikroorganismen zur Verfügung, um Mikroorganismen zu identifizieren und zu isolieren, die nützlich sind, um Gemische von Nitrilverbindungen, Gemische von Nitril- und Amidverbindungen oder Gemische von Amidverbindungen zu entgiften. Das Verfahren umfasst im Allgemeinen das Aussetzen eines Mikroorganismus, der getestet werden soll, in Bedingungen, die oben in Abschnitt 5.1.1 und 5.1.2 beschrieben sind, die verwendet werden, um Nitril- und/oder Amidentgiftungsfähigkeit mehrfach zu induzieren und dann die Fähigkeit des mutmaßlich "induzierten" Testmikroorganismus, ein Gemisch von Nitrilverbindungen, ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entgiften, zu beurteilen.
Das Verfahren, um Mikroorganismen zu untersuchen, die nützlich sind, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entgiften, umfasst das Kultivieren eines Testmikroorganismus in einem vollständigen Nährmedium oder einem Minimalmedium, das mit einem ersten Gemisch von Nitrilverbindungen (siehe Abschnitt 5.1.1 und 5.1.2 oben) ergänzt ist, etwa 24 bis 48 Stunden lang auf Agar-Agarplatten bei wachstumsgünstigen Bedingungen, um einen mutmaßlich induzierten Mikroorganismus zu erhalten; und Beurteilen der Fähigkeit des mutmaßlich induzierten Mikroorganismus, ein Gemisch von Nitrilen durch in Kontakt bringen des Mikroorganismus mit einem zweiten Gemisch von Nitrilen zu entgiften, umfassend Acrylnitril in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 20 000 ppm, Acetonitril in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 20 000 ppm, Fumarnitril in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 30 000 ppm und Succinnitril in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 40 000 ppm, und Überwachen des Verschwindens eines jeden der Nitrile in dem Gemisch, wobei das Verschwinden von mehr als einer Nitrilverbindung in dem Gemisch anzeigt, dass der Testmikroorganismus die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entgiften. Vorzugsweise umfasst das zweite Gemisch von Nitrilen Acrylnitril, Acetonitril, Fumarnitril und Succinnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 50-250 ppm, und das Verschwinden sämtlicher der Nitrilverbindungen des zweiten Gemisches in etwa 30 Minuten zeigt an, dass der Testmikroorganismus die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entgiften. Insbesondere zeigt das Verschwinden sämtlicher der Nitrilverbindungen des zweiten Gemisches in etwa 10 Minuten an, dass der Mikroorganismus die gewünschte Fähigkeit hat. Wenn gewünscht wird, dass der Mikroorganismus die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Nitrilen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen in Gegenwart von Ammoniumsulfat zu entgiften, wird Ammoniumsulfat in dem zweiten Gemisch zu etwa 1-8% Ammoniumsulfat eingeschlossen.
Gemäß einer bevorzugten Art dieser Ausführungsform wird das vollständige Nährmedium oder Minimalmedium mit einem ersten Gemisch von Nitrilverbindungen, enthaltend ein Gemisch von wenigstens einer von Acetonitril und Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril und Fumarnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 50 ppm, ergänzt. Insbesondere umfasst das erste Gemisch von Nitrilverbindungen Acetonitril und Acrylnitril zu jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril in einer Konzentration von etwa 50 ppm. Gegebenenfalls wird KCN in einer Konzentration von etwa 10 ppm dem Kulturmedium zugefügt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Art dieser Ausführungsform wird das vollständige Nährmedium oder Minimalmedium mit einem ersten Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt (siehe Abschnitt 5.1.1 und 5.1.2 oben).
Nützliche vollständige Nährmedien und Minimalmedien sind oben in Abschnitt 5.1.1 und 5.1.2 beschrieben. Der Testmikroorganismus wird bei Bedingungen kultiviert, die einen pH zwischen etwa 3,0 und 11,0, vorzugsweise zwischen 6,0 und 8,0; und eine Temperatur zwischen etwa 4ºC und 55ºC, vorzugsweise zwischen 15ºC und 37ºC einschließen.
Das Ausmaß der Entgiftung von Nitrilverbindungen kann überwacht werden, indem die Freisetzung von Ammoniak mittels der Technik von Fawcett und Scott, 1960, J. Clin. Pathol. 13: 156-159 gemessen wird. Wenn Ammoniakfreisetzung aufgrund der Gegenwart von Ammoniak oder eines Ammoniumsalzes nicht gemessen werden kann, kann die Konzentration der Nitrile, die in dem zweiten Gemisch vorhanden sind, durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, überwacht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf GLC-FID usw., und die Konzentration der vorhandenen Säureverbindungen kann durch Ableiten der Säureverbindung und Nachweisen des abgeleiteten Produkts durch GLC-FID überwacht werden. Säuren können zur Analyse durch GLC-FID abgeleitet werden, wenn sie zuerst alkyliert, verestert oder silyliert worden sind (siehe allgemein Supelco Chromatography Products Katalog, 1997, auf Seite 653-656 (Supelco Inc., Bellefonte PA).
Das Verfahren zum Untersuchen von Mikroorganismen, die nützlich sind, ein Gemisch von Amidverbindungen zu entgiften, umfasst das Kultivieren eines Testmikroorganismus etwa 24 bis 48 Stunden lang auf Agar-Agarplatten in einem vollständigen Nährmedium oder Minimalmedium, das ergänzt ist mit einem ersten Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen bei wachstumsgünstigen Bedingungen, um einen mutmaßlich induzierten Mikroorganismus zu erhalten; und Beurteilen der Fähigkeit des mutmaßlich induzierten Mikroorganismus, ein Gemisch von Amiden zu entgiften durch in Kontakt bringen des Mikroorganismus mit einem zweiten Gemisch (von Amiden), umfassend Acetamid in einer Konzentration von etwa 1 bis 20 000 ppm und Acrylamid in einer Konzentration von etwa 1 bis 20 000 ppm, und Überwachen des Verschwindens jedes der Amide in dem Gemisch, wobei das Verschwinden der Amide in dem zweiten Gemisch anzeigt, dass der Testmikroorganismus die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Amidverbindungen zu entgiften. Vorzugsweise umfasst das zweite Gemisch Acetamid und Acrylamid zu jeweils 50-150 ppm, und das Verschwinden sämtlicher der Amide in etwa 30 Minuten zeigt an, dass der mutmaßlich induzierte Mikroorganismus induziert wurde, um ein Gemisch von Amiden zu entgiften, und damit ein Mikroorganismus ist, der nützlich ist für die Entgiftungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Insbesondere zeigt das Verschwinden sämtlicher der Amide des zweiten Gemisches in etwa 10 Minuten an, dass der Mikroorganismus die gewünschte Fähigkeit hat. Wenn gewünscht wird, dass der Mikroorganismus die Fähigkeit hat, Amidverbindungen in Gegenwart von Ammoniumsulfat zu entgiften, wird Ammoniumsulfat in dem zweiten Gemisch zu etwa 1-8% Ammoniumsulfat eingeschlossen. Gegebenenfalls kann KCN dem zweiten Gemisch zu etwa 10 ppm zugefügt werden.
Gemäß einer bevorzugten Art dieser Ausführungsform, wird das vollständige Nährmedium oder Minimalmedium mit einem ersten Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, enthaltend ein Gemisch von Succinnitril zu etwa 50 ppm und Acetamid und Acrylamid zu jeweils etwa 150 ppm, ergänzt. Gegebenenfalls wird KCN in einer Konzentration von etwa 10 ppm dem Kulturmedium hinzugefügt.
Nützliche vollständige Nährmedien und Minimalmedien sind oben in Abschnitt 5.1.1 und 5.1.2 beschrieben. Der Testmikroorganismus wird bei Bedingungen kultiviert, die einen pH zwischen etwa 3,0 und 11,0, vorzugsweise zwischen 6,0 und 8,0; und eine Temperatur zwischen etwa 4ºC und 55ºC, vorzugsweise zwischen 15ºC und 37ºC einschließen.
Das Ausmaß der Entgiftung von Nitrilverbindungen kann überwacht werden, indem die Freisetzung von Ammoniak mittels der Technik von Fawcett und Scott, 1960, J. Clin. Pathol. 13: 156-159 gemessen wird. Wenn Ammoniakfreisetzung aufgrund der Gegenwart von Ammoniak oder eines Ammoniumsalzes nicht gemessen werden kann, kann die Konzentration der vorhandenen Amide durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, überwacht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf GLC-FID usw., und die Konzentration der vorhandenen Säureverbindungen kann durch Ableiten der Säureverbindung und Nachweisen des abgeleiteten Produkts mittels GLC-FID überwacht werden. Säuren können zur Analyse durch GLC-FID abgeleitet werden, wenn sie zuerst alkyliert, verestert oder silyliert worden sind (siehe allgemein Supelco Chromatography Products Katalog, 1997, auf Seite 653-656 (Supelco Inc., Bellefonte PA).

5.2. CHARAKTERISIERUNG VON MIKROORGANISMUSSTÄMMEN

Es wurde entdeckt, dass die Mikroorganismusstämme, die unten beschrieben sind, die von bekannten Quellen isoliert oder erhalten wurden, die Fähigkeit haben, nach Mehrfachinduktion gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben in Abschnitt 5.1. beschrieben, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entsprechenden Amid- und/oder Säureverbindungen zu entgiften.
Tabelle I und II unten zeigen bestimmte spezifische Stammeigenschaften von zwei Rhodococcus Stämmen, DAP 96622 und DAP 96253, die abgeleitet sind von zwei Stämmen, die jeweils von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, ATCC Nr. 33298 und ATCC Nr. 39484 erhalten wurden und für welche entdeckt wurde, dass sie nach Mehrfachinduktion gemäß der Erfindung die Fähigkeit haben, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entsprechenden Amid- und/oder Säureverbindungen umzusetzen. In einem Veranschaulichungsbeispiel wurden die zwei Rhodococcus-Stämme mittels jeweils 150 ppm Acrylnitril, Acetonitril und 50 ppm Succinnitril mit oder ohne 50 ppm KCN mehrfach induziert.
Kohlenhydrat-Verwertungstests wurden mittels Protokollen, die in dem Manual of Methods for General Bacteriology, 1983, Philip Gerhardt, Herausgeber, Am. Soc. Microbiol., Washington, D. C. beschrieben sind, durchgeführt. Nitrilverwertungstests wurden durchgeführt, nachdem die Stämme durch Kultivieren des Mikroorganismus auf einem vollständigen Nährmedium, das mit jeweils 150 ppm Acetonitril und Acrylnitril und 50 ppm Succinnitril ergänzt wurde, induziert wurden. Der tatsächliche Verwertungstest wurde in einem Minimalmedium, das mit (einer) bestimmten Testverbindung(en) als einzige Kohlenstoff- und/oder Energiequelle ergänzt wurde, durchgeführt. TABELLE I Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622:

VERWERTUNG VON KOHLENSTOFF UND STICKSTOFF:

Das Minimalmedium von Stanier mit Nitril als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle:

VERWERTUNG VON KOHLENSTOFFQUELLEN:

Das Minimalmedium von Stanier, enthaltend 1 g/l Ammoniumsulfat: VERWERTUNG VON KOHLENSTOFFQUELLEN:

VERWERTUNG VON KOHLENSTOFFQUELLEN:

Das Minimalmedium von Stanier ohne Ammoniumsulfat, jedoch mit 10 ppm KCN: TABELLE II Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253:
* I bedeutet "intermediär" zwischen empfindlich (S) und resistent.

VERWERTUNG VON KOHLENSTOFF UND STICKSTOFF:

VERWERTUNG VON KOHLENSTOFFQUELLEN:

Das Minimalmedium von Stanier, enthaltend 1 g/l Ammoniumsulfat:

VERWERTUNG VON KOHLENSTOFFQUELLEN:

Das Minimalmedium von Stanier, enthaltend 1 g/l Ammoniumsulfat, jedoch mit 10 ppm KCN:

VERWERTUNG VON KOHLENSTOFFQUELLEN:

Das Minimalmedium von Stanier ohne Ammoniumsulfat, jedoch mit 10 ppm KCN:
Es wurde entdeckt, dass die folgenden Mikroorganismusstämme, deren Eigenschaften in den Tabellen unten überprüft sind, die Fähigkeit haben, nach Mehrfachinduktion gemäß der vorliegenden Erfindung ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen und/oder ein Gemisch von Amiden zu entsprechenden Amid- und/oder Säureverbindungen zu entgiften. Die Isolierung dieser Mikroorganismen ist in WO96/18724 beschrieben. Zusammengefasst wurden über 200 separate reine Mikroorganismusisolate aus verschmutzter Erde an demselben Industriegelände kultiviert. Sämtliche dieser reinen Isolate wurden in aerober Weise mit einem Schlamm-/Abfallmaterial, enthaltend ein Gemisch von aromatischen, nitroaromatischen, haloaromatischen, aliphatischen und haloaliphatischen Verbindungen kombiniert und kultiviert. Eine Mischkultur von Mikroorganismen wurde aus dem kultivierten Material wiedergewonnen und auf BACTOTM R2A Medium (Difco, Detroit, Michigan) gehalten.
Die Mischkultur, die als DAP-2 bezeichnet ist, die bei der American Type Culture Collection hinterlegt wurde und der die ATCC Nr. 55644 zugewiesen wurde, baut in aerober Weise wenigstens die folgenden Verbindungen und Gemische davon ab: Benzol, Toluol, Xylol, Ethylbenzol, Naphthalin, Chlorbenzol, Phenol, Kresol, Nitrobenzol, Anilin, Antrhazen, Dimethylphenol, Styrol, Halonaphthalin, 2-, 3- oder 4- Chlortuluol, 2-, 3- oder 4-Chlorbenzoat, 1,3-Dichlorbenzoat, 1,2-, 1,3- oder 1,4-Dinitrobenzol, 1-Chlor-3-Nitrobenzol, 1-Chlor-4-Nitrobenzol, 1- oder 2- Methylnaphthalin, Pyrol, Acenaphthylen, Fluoranthen, Phenanthren, Benzo-(b)- Fluoranthen, Dibenzofuran, Chrysen, Catechol, M-Toluolsäure, Cinnamylacetat, Vanillin, Transzimtaldehyd, Mesitylen, Salicylat, Melamin, Cyanursäure, δ-(-)-Limonen, Hexadecan, Methanol, Formaldehyd und Chloroform.
Die folgenden Reinkulturen wurden von der Mischkultur, die als DAP 2 bezeichnet ist, durch Isolieren einzelner Kolonien auf BACTOTM R2A Medium, das mit jeweils 150 ppm Nitrobenzol, Naphthalin und Toluol ergänzt war, isoliert und charakterisiert.

Mikroorganismus DAP 623:

DAP 623 ist ein Gram-negatives motiles Stäbchenbakterium, im allgemeinen kleine Einzelstäbchenbakterien, obwohl einige Paare gesehen werden. Die Färbung kann ungleichmäßig sein und es gibt etwas Flockungsbildung. Die Kolonien erscheinen weiß bis cremefarben auf BACTOTM R2A Medium. Zusätzlich kann dieser Organismus folgendes verwerten: Mesitylen, Lactat, Succinat, Limonen, m-Toluolsäure, Chlorobenzol, Salicylat, 2-, 3- und 4-Chlortuluol, 2-, 3- und 4-Chlorbenzoesäure und 1,3-Dichlorbenzol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. DAP 623 wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und ihm wurde die ATCC Nummer 55722 zugeordnet und es ist des Weiteren wie in Tabelle III gezeigt charakterisiert: TABELLE III DAP 623

Mikroorganismus DAP 626:

DAP 629 ist ein Gram-variables Stäbchenbakterium von unterschiedlicher Größe und einzeln und in Paaren auftretend. Wachstum auf Flagellenplatten wird gesehen, was flagellare Motilität anzeigt. Zusätzlich kann dieser Organismus folgendes verwerten: Mesitylen, Lactat, Succinat, Limonen, Cinnamylacetat, Catechol, m-Toluolsäure, Chlorbenzol, 2-, 3- und 4-Chlortuluol, 2-, 3- und 4- Chlorbenzolsäure und 1,3-Dichlorbenzol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. DAP 626 wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und ihm wurde die ATCC Nummer 55723 zugeordnet und es ist des Weiteren wie in Tabelle IV gezeigt charakterisiert: TABELLE IV DAP 626

Mikroorganismus DAP 629:

DAP 629 ist ein Gram-negatives kleines motiles Stäbchenbakterium, fast kokkus-bazillär. Kolonien erscheinen weiß mit einer leichten Fluoreszenz, wenn auf einem BACTOTM R2A Agar-Agar gewachsen. Zusätzlich kann dieser Organismus Folgendes verwerten: Fluoranthran, Mesitylen, Lactat, Succinat, Limonen, m-Toluolsäure, Chlorbenzol, 2-, 3- und 4-Chlortuluol, 2-, 3- und 4-Chlorbenzoesäure und 1,3- Dichlorbenzol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. DAP 629 wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und ihm wurde die ATCC Nummer 55726 zugeordnet und es ist des Weiteren wie in Tabelle V gezeigt charakterisiert: TABELLE V DAP 629:

Mikroorganismus DAP 632:

DAP 632 ist ein Gram-variables motiles schlankes Stäbchenbakterium, sowohl einzeln als auch in Paaren gesehen. Kolonien erscheinen cremefarben bis gelblich, wenn auf BACTOTM R2A Agar-Agar gewachsen. Zusätzlich kann dieser Organismus Folgendes verwerten: Fluoranthren, Acenaphthalin, Mesitylen, Lactat, Limonen, m-Toluolsäure, Chlorbenzol, 2-, 3- und 4-Chlortuluol, 2-, 3- und 4- Chlorbenzoesäure und 1,3- Dichlorbenzol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. DAP 632 wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und ihm wurde die ATCC Nummer 55727 zugeordnet und es ist des Weiteren wie in Tabelle VI gezeigt charakterisiert: TABELLE VI DAP 632:

Mikroorganismus DAP 115:

DAP 115 ist ein Gram-negatives motiles Stäbchenbakterium. Wachstum wird auf Flagellenplatten beobachtet, was anzeigt, dass Motilität flagellar ist. Kolonien erscheinen weiß, wenn auf BACTOTM R2A Agar-Agar gewachsen, erscheinen jedoch gelb in einem Nährstoffsud. Zusätzlich kann dieser Organismus Folgendes verwerten: Benzo-(b)-Fluoranthren, Fluoranthren, Dibenzofuran, Acenaphthalin, Salicylat, Lactat, Succinat, Glyoxylat, Mesitylen, Vanillin, Limonen, Cinnamylacetat, Catechol, m-Toluolsäure, Chlorbenzol, 2-, 3- und 4- Chlortuluol, 2-, 3- und 4- Chlorbenzoesäure und 1,3- Dichlorbenzol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. DAP 115 wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und ihm wurde die ATCC Nummer 55724 zugeordnet und es ist des Weiteren wie in Tabelle VII gezeigt charakterisiert: TABELLE VII DAP 115:

Mikroorganismus DAP 120:

DAP 115 ist ein Gram-negatives motiles Stäbchenbakterium. Wachstum wird auf Flagellenplatten beobachtet, was anzeigt, dass Motilität flagellar ist. Zusätzlich kann dieser Organismus Folgendes verwenden: Chrysen, Pyren, Lactat, Succinat, Glyoxylat, Salicylat, Mesitylen, Vanillin, Limonen, Cinnamylacetat, Catechol, m-Toluolsäure, Chlorbenzol, 2-, 3- und 4-Chlortuluol, 2-, 3- und 4- Chlorbenzoesäure und 1,3-Dichlorbenzol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. DAP 120 wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und ihm wurde die ATCC Nummer 55725 zugeordnet und es ist des Weiteren wie in Tabelle VIII gezeigt charakterisiert: TABELLE VIII DAP 120:
Tabelle IX unten zeigt, dass die oben charakterisierten Reinkulturen, isoliert von den als DAP 2 bezeichneten Mischkulturen, fähig sind, auf dem Minimalmedium von Stanier, das nur mit jeweils 150 ppm Acetonitril und Acrylnitril ergänzt ist, zu wachsen. Die Kulturen wurden bei 25-27ºC gewachsen, die Koloniegröße wurde nach 14 Tagen bestimmt. Werte stellen das Mittel von fünf Replikatkolonien für jede Bestimmung dar. TABELLE IX VERWERTUNG VON ACETO- UND ACRYLNITRIL
* Wachstum bewertet als ++++ üppig, +++ gut, ++ angemessen,
+ bescheiden, +/- spärlich, - kein Wachstum
a Wachstum von Stamm DAP 120 war sehr dünn, jedoch schnell ausbreitend, präzise Mengenbestimmung war daher nicht möglich.
Wie in Tabelle IX gezeigt, sind die Stämme fähig, Acetonitril und Acrylnitril als die einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten.

5.3. ANWENDUNGEN ODER VERFAHREN ZUM GEBRAUCH DER MIKROORGANISMEN ZUR ENTGIFTUNG VON NITRILEN UND/ODER AMIDEN

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren für die Entgiftung eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen das in Kontakt bringen einer Reinkultur eines nützlichen Mikroorganismusstammes, der entsprechend der vorliegenden Erfindung mehrfach induziert ist, mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um die Nitrile zu entsprechenden Amiden umzusetzen. Im anderen Falle umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen einer Reinkultur eines mehrfach induzierten Mikroorganismus mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um das (die) Nitril(e) und Amid(e) zu entsprechender (entsprechenden) Säure(n) umzusetzen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren für die Entgiftung eines Gemisches von Amidverbindungen das in Kontakt bringen einer Reinkultur eines nützlichen Mikroorganismussrammes, der gemäß der vorliegenden Erfindung mehrfach induziert ist, mit einem Gemisch von Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um die Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen umzusetzen.
Der Mikroorganismusstamm kann wachsend, d. h. aktiv teilend, oder ruhend, d. h. nicht aktiv teilend oder nicht lebendig, sein. Wenn das Verfahren den Gebrauch einer aktiv wachsenden Kultur von Mikroorganismen umfasst, sollten die Bedingungen für den Kontakt mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder einem Gemisch von Amidverbindungen derart sein, dass der bakterielle Wachstum unterstützt wird. Derartige Bedingungen umfassen beispielsweise einen pH zwischen 3,0 und 11,0, vorzugsweise zwischen etwa 6,0 und 8,0; eine Temperatur zwischen 4ºC und 55ºC, vorzugsweise zwischen etwa 15 ºC und 37ºC; gelöste Sauerstoffspannung zwischen 0,1% und 100%, vorzugsweise zwischen etwa 4% und 80% und insbesondere zwischen 4% und 40% der Sättigung, wobei der Sauerstoff durch Gebrauch einer sauerstoffhaltigen oder sauerstofffreisetzenden Zusammensetzung zugeführt werden kann. Die sauerstoffhaltige oder sauerstofffreisetzende Zusammensetzung kann Luft, reiner Sauerstoff, Peroxid oder andere Peroxidchemikalien, die Sauerstoff oder Gemische davon freisetzen, sein. Des Weiteren kann das Kulturmedium gerührt oder kann nicht gerührt werden, mit positiver gelöster Sauerstoffspannung oder nicht versorgt werden.
Wenn das Verfahren den Gebrauch einer Kultur von Mikroorganismen umfasst, die nicht aktiv teilend sind, sollten die Bedingungen für den Kontakt mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder einem Gemisch von Amidverbindungen derart sein, dass nitril- und/oder amidentgiftende (enzymatische) Aktivitäten unterstützt werden. Zum Beispiel wird die Temperatur zwischen etwa 0ºC und 65ºC, vorzugsweise zwischen etwa 4ºC und 55ºC, insbesondere zwischen etwa 25 ºC und 55ºC gehalten. Der pH kann basisch oder sauer sein und wird am besten in dem Bereich von etwa pH 6 bis 8 gehalten. Diese besondere Ausführungsform ist möglich, da Entgiftung nicht wachstumsabhängig ist, d. h. sobald die nitril- und/oder amidentgiftende Aktivität induziert ist, braucht der Mikroorganismus nicht länger zu wachsen, um zu entgiften. Diese bestimmte Art kann bei anaeroben Bedingungen ausgeführt werden.
Die Reinkultur eines Mikroorganismusstammes kann eingekapselt oder immobilisiert, statt freischwimmend sein, um Sammlung und Wiedergebrauch nach Entgiftung zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismusstamm immobilisiert. Die Reinkultur kann immobilisiert werden durch Sorption, elektrostatische Bindung, kovalente Bindung usw. auf einem Festträger, der bei der Wiedergewinnung der Mikroorganismen aus dem Entgiftungsreaktionsgemisch hilft. Geeignete Festträger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf körnige Aktivkohle, Kompost, Holzrestprodukte (z. B. Holzspäne, Stücke, geschnitzelte Paletten oder Bäume), Aluminiumoxid, Ruthenium, Eisenoxid, Ionenaustauschharze, (z. B. AmberliteTM, IRA-93 oder IRA-96 (Rohm & Haas), DOWEXTM (Dow Chemical Co., Inc.), DEAE Zellulose, DEAE-SEPHADEXTM (Pharmacia, Inc.), Keramikkugeln, Polyacrylamidkugeln, Alginatkugeln und κ-Carrageenanwürfeln sowie Festpartikel, die aufgrund von inhärenter Magnetfähigkeit aus den wässrigen Lösungen wiedergewonnen werden können. Die Alginatkugeln können CA&spplus;&spplus; Alginatkugeln oder gehärtete Alginatkugeln sein. Die α-Carrageenanwürfel können gehärtete α-Carrageenanwürfel sein. Als ein Veranschaulichungsbeispiel kann eine Reinkultur eines mehrfach induzierten Mikroorganismus mit einer Natriumalginatlösung und Kalziumchlorid gemischt werden, um die Mikroorganismen in Alginatkugeln zu immobilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der induzierte Mikroorganismus in Alginatkugeln immobilisiert, die mit Polyethylenimid vernetzt oder in einem polyacrylamidartigen Polymer immobilisiert worden sind.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren für die Entgiftung eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen das in Kontakt bringen eines Extrakts einer Reinkultur eines nützlichen Mikroorganismusstammes, der gemäß der vorliegenden Erfindung mehrfach induziert ist, mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um das (die) Nitril(e) zu entsprechender (entsprechenden) Säure(n) umzusetzen. Im anderen Falle umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen eines Extrakts einer Reinkultur eines mehrfach induzierten Mikroorganismus mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um die Nitril- und Amidverbindungen zu entsprechenden Säuren umzusetzen. Vorzugsweise ist das Extrakt ein Rohextrakt von einem einzigen Mikroorganismus. Extrakte von dem Mikroorganismus werden durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, zubereitet, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die folgenden: Die Zellen eines Musters einer Reinkultur eines induzierten Mikroorganismus werden zum Beispiel durch Sonifikation, Zerdrücken, Verwendung einer französischen Presse unterbrochen, um ein Zelllysat zu produzieren. Das Lysat wird gefiltert oder zentrifugiert, um zelluläre Ablagerung und nicht lysierte Zellen zu entfernen, um ein Rohextrakt zu ergeben. Das Lysat kann auch, wie oben beschrieben, für ganze Zellen immobilisiert werden oder mittels Techniken, die zum Gebrauch mit Immobilisierung von Enzymen bekannt sind, immobilisiert werden.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren für die Entgiftung eines Gemisches von Amidverbindungen das in Kontakt bringen eines Extrakts einer Reinkultur eines nützlichen Mikroorganismusstammes, der gemäß der vorliegenden Erfindung mehrfach induziert ist, mit einem Gemisch von Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um die Amide zu entsprechenden Säuren umzusetzen. Vorzugsweise ist der Extrakt ein Rohextrakt eines einzelnen Mikroorganismus. Extrakte des Mikroorganismus werden durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, zubereitet einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die folgenden: Die Zellen eines Musters einer Reinkultur eines induzierten Mikroorganismus werden zum Beispiel durch Schalltechnik Sonifikation, durch Zerdrücken, Verwendung einer französischen Presse unterbrochen, um ein Zelllysat zu produzieren. Das Lysat wird gefiltert oder zentrifugiert, um zelluläre Ablagerung und nicht lysierte Zellen zu entfernen, um einen Rohextrakt zu ergeben.
Vorzugsweise wird eine Reinkultur oder ein Extrakt eines Mikroorganismus, im Einzelnen in Abschnitt 5.2 oben beschrieben, der gemäß der vorliegenden Erfindung induziert ist, in den Verfahren der Erfindung verwendet. Im anderen Falle wird eine Reinkultur oder ein Extrakt eines Mikroorganismus, der fähig ist, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entgiften, der mittels (eines) Untersuchungsverfahren(s), wie oben in Abschnitt 5.1.3 beschrieben, identifiziert worden ist, in den Verfahren der Erfindung verwendet.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können des Weiteren umfassen das Überwachen der Umsetzung der Nitrilverbindung und/oder des gleichzeitigen Erscheinens der Amidverbindung durch irgendein Verfahren, das Fachleuten bekannt ist, beispielsweise GLC-FID, um das Amid nachzuweisen, und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), um die Säureverbindung nachzuweisen. Entgiftung zu entsprechender Säure führt zu stöchiometrischer Produktion von Ammoniak für jede Nitril- oder Amidgruppe, die ursprünglich vorliegend war. Das Ausmaß der Entgiftung von Nitrilverbindungen oder Amidverbindungen kann durch Messen der Freisetzung von Ammoniak mittels der Technik von Fawcett und Scott, 1960, J. Clin. Pathol. 13: 156-159 überwacht werden. Wenn die Ammoniakfreisetzung aufgrund der Gegenwart von Ammoniak oder eines Ammoniaksalzes nicht gemessen werden kann, kann die Konzentration der vorliegenden Nitrile und Amide durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, überwacht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, GLC-FID usw. Im anderen Falle kann das Verschwinden von Nitrilverbindungen durch Bewertung der Produktion der entsprechenden Säureverbindungen gemessen werden, was durch Ableiten der Säureverbindung und Bestimmung des abgeleiteten Produkts mittels GLC-FID überwacht werden kann. Amide und Säuren können für Analyse mittels GLC-FID abgeleitet werden, wenn sie zuerst alkyliert, verestert oder silyliert werden (siehe allgemein Supelco Chromatography Products Katalog, 1997, auf Seite 653-656 (Supelco Inc., Bellefonte PA).
Die Nitrilverbindungen und/oder Nitril- und Amidverbindungen und/oder Amidverbindungen, die entgiftet werden sollen, können in fester, flüssiger und/oder gasförmiger Form sein. Wenn ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen in der gasförmigen und/oder flüssigen Form ist, kann es auf ein Material, wie ein Feststoff, sorbiert werden. Wenn notwendig kann der pH der Zusammensetzung, die die Nitrile davon enthält, vor Kontakt mit den Mikroorganismen oder Extrakten auf Neutralität eingestellt werden, d. h. pH etwa 6 bis etwa 8.
In einer bevorzugten Anwendung der Erfindung wird das Entgiftungsverfahren verwendet, um ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen in einem wässrigen Abfallstrom von einer Nitrilproduktionsanlage zu entgiften. In einer Art dieser Anwendung produziert die Anlage Acrylnitril. Acrylnitril kann kommerziell durch direkte Ammoxidation von Propen (auch als Propylen bekannt) oder Propan produziert werden. Ein Veranschaulichungsbeispiel der direkten Ammoxidation von Propen ist durch das SOHIO/BP-Verfahren verkörpert (siehe allgemein Acrylonitrile, Process Economics Report, Stanford Research International, Menlo Park, CA; Weissermel und Arpe, 1978, Industrial Organic Chemistry, Verlag Chemie- Weinheim New York, Seite 266-270).
Typischerweise enthält (enthalten) der (die) Abwasserstrom (-ströme) einer Nitrilproduktionsanlage eine hohe Konzentration von einem Gemisch von Nitrilen und Amiden, einschließlich Dinitrile, und Acroleincyanhydrin sowie Ammonionsulfat. Zum Beispiel enthält ein typischer Abwasserstrom, z. B. Abwasserkolonnengrund (Wastewater Column Bottom - WWCB) von einer Acrylnitrilproduktionsanlage, die das SOHIO-Verfahren verwendet, ungefähr 1230 mg/l Acrylnitril, 4500 mg/l Acetonitril, 1490 mg/l Acrylamid, 1070 mg/l Acrolein (in der Form von Acroleincyanhydrin), 547 mg/l Succinnitril, 1446 mg/l Fumarnitril und 335 mg/l Gesamtcyanid und 5-8% Ammoniumsulfat.
Tabelle X veranschaulicht die Konzentrationsbereiche von Nitril- und Amidverbindungen in typischen Abwasserströmen von einer SOHIO/BP-Acrylnitrilproduktionsanlage (AN Abwasser). TABELLE X BEREICHE VON VERBINDUNGEN IN REPRÄSENTATIVEN AN ABWASSER MUSTERN
NSB = Rein-Abstreifgrund; WWCB = Abwasserkolonnengrund
Ein anderes Veranschaulichungsbeispiel von industriellem Nitrilproduktionsabfall, der durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung entgiftet werden kann, umfasst: Acrylnitril zu 50-300 ppm; Acrylamid zu 0-400 ppm; Acetonitril zu 200-5500 ppm; Acrolein zu 0-300 ppm; Propionitril zu 0-100 ppm; Succinnitril zu 100-1500 ppm; Fumarnitril zu 0-40 ppm und wenigstens einen reaktiven C N Anteil.
Die induzierten Stämme sind fähig, hohe Konzentrationen von Nitril- und/oder Amidverbindungen, die in Abfallströmen gefunden werden, zu entgiften. Die Gegenwart oder Abwesenheit von Ammoniumsulfat stört die vorliegenden Entgiftungsverfahren nicht. Des Weiteren sind die mehrfach induzierten Mikroorganismen, die in den vorliegenden Entgiftungsverfahren verwendet werden, fähig, die hohe(n) Konzentration(en) von Nitrilen und/oder Amiden mit großer Geschwindigkeit und Wirksamkeit zu entgiften. Die Entgiftungsgeschwindigkeit beträgt etwa 30-50 ppm pro Minute von jeder einzelnen Nitril- oder Amidverbindung, die in dem Gemisch von Nitrilverbindungen oder in dem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder in dem Gemisch von Amidverbindungen vorliegend ist, in welcher die Konzentration in dem Bereich von bis zu 350-60 000 oder in dem Bereich von 1000- 60 000 oder in dem Bereich von 30 000-60 000 ppm Gesamtnitrile und/oder -amide, die in dem Reaktionsgemisch im Laufe des Entgiftungsverfahrens gefunden werden, liegt.
In einer anderen bevorzugten Anwendung der Erfindung wird das Entgiftungsverfahren verwendet, um ein Nitril aus einer Amidzubereitung zu entfernen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf eine Acetamid- oder Acrylamidzubereitung, enthaltend eine ungewünschte oder unerwünschte Nitrilverbindung. Diese Anwendung ist besonders nützlich, um eine Amidzubereitung, wie eine Amidzubereitung, die in einer Amidproduktionsanlage produziert wird, zu reinigen. Ein Veranschaulichungsbeispiel einer Amidzubereitung ist eine Acrylamidzubereitung, die in einer kommerziellen Acrylamidproduktionsanlage aus Acrylnitril, das ungewünschte Nitrilverbindungen, wie Acrylnitril oder Acetonitril enthalten kann, produziert wird. Das Endprodukt Acrylamid kann eine bedeutende Menge von Acrylnitril und ein niedriges Niveau von Acetonitril enthalten. Zum Beispiel ist Acrylnitril in kommerzieller 30-50%igen Acrylamidlösung im Allgemeinen > 100 ppm und ≤ 1 000 ppm. Die Fähigkeit des mehrfach induzierten Mikroorganismus, ein Amid zu entsprechender Säure zu entgiften, muss deaktiviert oder zerstört werden, bevor der Mikroorganismus in dieser Anwendung verwendet werden kann. Da die Amidentgiftungsaktivität hitzeempfindlich bei etwa 55ºC bis 60ºC ist, muss der mehrfach induzierte Mikroorganismus vor oder gleichzeitig mit dem in Kontakt bringen mit der Amidzubereitung auf wenigstens etwa 55ºC bis 60ºC, insbesondere auf etwa 60-100ºC erhitzt werden. Amidasedeaktivierung kann nach dem Erhitzen auf 60 -100ºC zu verschiedenen Zeiten überwacht werden und Nitrilhydratase- und Amidaseaktivität kann gemessen werden, um den optimalen Zeitraum zur Deaktivierung zu bestimmen.
Der Zeitraum für die Deaktivierung bei einer bestimmten Temperatur hängt von der Konzentration von Zellen oder Extrakt und dem Grad des Mischens ab. Fachleute kennen die Bestimmung des geeigneten Zeitraums. In einer bevorzugten Art wird der mehrfach induzierte Mikroorganismus vor in Kontakt bringen mit der Amidzubereitung mehrere Male auf etwa 70-100ºC, beispielsweise etwa dreimal 10 Sekunden lang auf 100ºC, erhitzt.
Des Weiteren wird das Entgiftungsverfahren vorzugsweise bei Temperaturen von 4-80ºC, vorzugsweise 25-70ºC durchgeführt, was zu einer viel schnelleren Umsetzung der Nitrilverbindung zur entsprechenden Amidverbindung führt. Der mehrfach induzierte Mikroorganismus, der beispielsweise mittels eines Wachstumsmediums, enthaltend ein Kohlenhydrat, Harnstoff und Kobalt und Acrylnitril, Acetonitril und Succinnitril zu jeweils 150, 150 und 50 ppm und gegebenenfalls KCN oder NaCN zu 10 ppm, induziert ist, kann als frische, stabilisierte oder immobilisierte Zellen oder Extrakt verwendet werden. Immobilisierung ist vorzugsweise in Polyacrylamid oder gehärtetem Alginat. Das Verfahren des Entfernens unerwünschten Nitrils kann entweder zu der Zeit durchgeführt werden, wenn das Amid, wie Acrylamid, produziert wird, oder später, nachdem die Produktion vollständig ist, einschließlich nach Verpacken oder während des Versands und/oder der Lagerung.
In noch einer anderen bevorzugten Anwendung der Erfindung wird das Entgiftungsverfahren mit einem Teil eines chemischen Syntheseverfahrens kombiniert, um ein Amid, wie Acrylamid, zu produzieren. Diese Anwendung stellt daher ein chemisch/biologisches Hybridverfahren des Produzierens eines Amides, wie Acrylamid, zur Verfügung. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform dieser Anwendung wird ein chemisches Syntheseverfahren, wie das SOHIO/BP-Verfahren (siehe allgemein Acrylonitrile, 1979; Weissermel und Arpe, 1978, oben), das die direkte Ammoxidation von Propen (auch bekannt als Propylen) durch Ammoniakdämpfe in Luft in Gegenwart von einem Katalysator, um Acrylamid zu produzieren, erfordert, um eine intermediäre Lösung, umfassend etwa 30% oder mehr Acrylamid und 10% oder weniger Acrylnitril, zu produzieren. Die intermediäre Lösung von ungefähr 30% oder mehr Acrylamid und etwa 10% oder weniger Acrylnitril wird mit einem mehrfach induzierten Mikroorganismus oder Extrakt davon in Kontakt gebracht während eines ausreichenden Zeitraums, um das Acrylnitril zu Acrylamid umzusetzen, so dass die Menge von Acrylnitril auf etwa 100 ppm oder weniger verringert wird. Die resultierende Lösung enthält etwa 50% Acrylamid und weniger als 100 ppm Acrylnitril. Die Fähigkeit des mehrfach induzierten Mikroorganismus, um Acrylamid zu Acrylsäure zu entgiften, wird vorzugsweise deaktiviert oder zerstört, bevor der Mikroorganismus in dieser Anwendung verwendet werden kann. Da die Amidentgiftungsaktivität hitzeempfindlich bei etwa 55ºC bis 60ºC ist, wird der mehrfach induzierte Mikroorganismus vor oder gleichzeitig mit dem in Kontakt bringen mit der Lösung vorzugsweise auf wenigstens etwa 55ºC bis 60ºC, insbesondere auf etwa 60-100ºC erhitzt. In einer bevorzugten Art wird der mehrfach induzierte Mikroorganismus vor dem in Kontakt bringen mit der Lösung mehrere Male auf etwa 70- 100ºC erhitzt, zum Beispiel etwa dreimal bei 100ºC etwa 10 Sekunden lang. Des Weiteren wird dieses Verfahren vorzugsweise bei Temperaturen > 50ºC durchgeführt, was eine viel schnellere Umsetzung von Acrylnitril zu Acrylamid ergibt.
Diese chemische/biologische Hybridsyntheseanwendung ist gegenüber dem vollständig chemischen Verfahren zum Produzieren von Acrylamid erheblich verbessert hinsichtlich der Verbesserten Behandlungszeit, geringerer Kosten, Beseitigung der Notwendigkeit von mehrfachen chemischen Verfahren, um das Acrylnitril, das während des chemischen Verfahrens gebildet wird, umzusetzen, und Beseitigung der Notwendigkeit, die Acrylamidlösung zu reinigen, so dass sie weniger als 100 ppm Acrylnitril enthält. Diese Anwendung ist vorzugsweise anwendbar für ein Chargenverfahren oder eine Mehrstufenchargen- oder semikontinuierliche Syntheseart.
In noch einer bevorzugten Anwendung der Erfindung wird das Entgiftungsverfahren verwendet, um Acetonitril aus einer Zubereitung eines Acetonitrilbutadien-Styrol-Copolymer (ABS Copolymer) zu entfernen. Diese Anwendung ist besonders nützlich, um ein ABS-Copolymer zu reinigen.
In noch einer anderen bevorzugten Anwendung der Erfindung wird das Entgiftungsverfahren verwendet, um ein Amidmonomer in einer Polyamid- oder polymerisierten Amidzubereitung umzusetzen, enthaltend ein ungewünschtes oder unerwünschtes Amidmonomer, zu entsprechender monomerer Säureverbindung, die einfach aus der Zubereitung entfernt werden kann, beispielsweise durch irgendein Mittel der chemischen Trennung, das Fachleuten bekannt ist. Zum Beispiel kann Acrylamid zu Acrylsäure, die als das Ammoniumsalz einfach entfernt wird, umgesetzt werden. Diese Anwendung ist besonders nützlich, um eine Polyamid- oder polymerisierte Amidzubereitung, wie eine Polyacrylamidzubereitung oder ein Copolymerhaltiges Acrylamid, zu reinigen.
Ein jegliches Verfahren zum in Kontakt bringen des induzierten Mikroorganismusstammes mit einer Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Derartige Verfahren zum in Kontakt bringen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, in Kontakt bringen in einem geschlossenen Gefäß oder Behälter oder mit einer Vorrichtung, die die induzierten Stämme enthält, usw.
Energie kann beispielsweise durch Zuführen mechanischer Energie, d. h. durch Mischen; durch Zuführen akustischer Energie; d. h. durch Einrichten einer stehenden akustischen Welle in der Flüssigkeit; oder durch Zuführen eines elektrischen oder elektrostatischen Feldes zugeführt werden.
Das Gemisch von Nitrilverbindungen oder Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder Gemisch von Amidverbindungen und die mehrfach induzierten Reinkulturen von Mikroorganismen können bei Bedingungen, die das Wachstum der Bakterien und die Entgiftung der gewünschten Verbindungen, wie oben beschrieben, fördern, gehalten werden.
Im anderen Falle können das Gemisch von Nitrilverbindungen oder Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder Gemisch von Amidverbindungen und die mehrfach induzierten Reinkulturen von Mikroorganismen auch bei Bedingungen, die nicht notwendigerweise das Wachstum der Bakterien fördern, sondern vielmehr die (enzymatische) Nitrilhydratase-, Amidase- und/oder Nitrilaseaktivität der mehrfach induzierten Mikroorganismen unterstützen, gehalten werden. Zum Beispiel kann die Temperatur zwischen etwa 0ºC und 65ºC, vorzugsweise zwischen etwa 4ºC und 55ºC, insbesondere zwischen etwa 25ºC und 55ºC gehalten werden. Der pH wird am besten in dem Bereich von etwa pH 6 bis 8 gehalten. Diese Bedingungen sind möglich, da Entgiftung nicht wachstumsabhängig ist, d. h. ist die nitril- und/oder amidentgiftende Aktivität einmal induziert, braucht der Mikroorganismus nicht länger zu wachsen, um zu entgiften. Zusätzlich können das Gemisch von Nitrilverbindungen oder Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder Gemisch von Amidverbindungen und die mehrfach induzierten Reinkulturen von Mikroorganismen auch bei anaeroben Bedingungen gehalten werden.
Zu unterschiedlichen Zeitpunkten kann man Muster entfernen und die Konzentration von ausgewählten Nitril- und/oder Amidverbindungen durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, beispielsweise GLC-FID usw., messen.

5.3.1. BETRIEBSARTEN

Die Verfahren für die Entgiftung eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen oder eines Gemisches von Amidverbindungen der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Betriebsarten betrieben werden, einschließlich der Chargenbetriebsart, Folgechargenbetriebsart, kontinuierlichen oder semikontinuierlichen Betriebsart und Durchfluss mittels eines Biofilters.
In sämtlichen Betriebsarten können Muster des Inhalts periodisch entfernt werden, um Entgiftung der betreffenden Verbindungen zu überwachen. Zusätzlich kann das Rühren und/oder Mischen des Reaktorinhaltes Schäumen bewirken. In diesen Fällen kann ein Antischaummittel zugefügt werden, um Schäumen zu verhindern. Geeignete Antischaummittel schließen beispielsweise silikonhaltige Antischaumemulsion (z. B. Dow ANTIFOAM-A®; ein Antischaummittel auf Silikonbasis) ein.

5.3.1.1. CHARGENBETRIEBSART

Die Chargenbetriebsart umfasst das Anordnen einer Flüssigkeit, enthaltend ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen, beispielsweise zwei oder mehr Nitrile, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Acetonitril, Acrylnitril, Adiponitril, Fumarnitril, Succinnitril, Cyanid, Benzonitril, Butyronitril, Acrolein (welches in dem Gemisch in der Form von Acroleincyanhydrin ist) und Crotonnitril in ein Gefäß, wie ein Bioreaktor, wobei mit den Mikroorganismen inokuliert wird, die wie in Abschnitt 5.1 beschrieben induziert sind, und das Gemisch inkubiert wird, um die Mikroorganismen zu kultivieren, so dass das Gemisch von Nitrilverbindungen oder Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder Gemisch von Amidverbindungen entgiftet wird. Nach einem vorbestimmten Zeitraum wird die Inkubation angehalten und der Inhalt wird entfernt und die Feststoffe, soweit vorhanden, werden durch Filtration von der Flüssigkeit getrennt. Muster können dann sowohl von der festen als auch der flüssigen Phase entnommen und beispielsweise durch GLC-FID geprüft werden, um das Niveau der Nitril- und/oder Amidverbindungen zu bewerten und zu bestätigen, dass die Nitril- und/oder Amidverbindungen entgiftet worden sind. Die Feststoffe in dem Reaktor werden anschließend entwässert und können weiter verarbeitet werden beispielsweise in einer Geländeauffüllung, oder können als bakterielles Inokulum für die nächste Chargenbetriebsart verwendet werden. In Chargenbetriebsart wird der entwässerte Feststoffrest zu etwa 2-40, vorzugsweise zu etwa 5-20 Gewichts- oder Volumenprozent erneut hinzugefügt. Luft oder Sauerstoff kann in den Reaktor gepumpt und der Inhalt kann mechanisch in dem Bioreaktor gerührt werden.

5.3.1.2. FOLGECHARGENBETRIEBSART

Die Folgechargenbetriebsart wird in sehr ähnlicher Weise wie die Chargenbetriebsart betrieben, mit Ausnahme dass, nachdem die Inkubationszeit vorüber ist, man den Reaktor eine Zeit lang sich setzen lässt, normalerweise etwa 15 Minuten lang, und die oberen 60%-95% des Reaktorinhalts entfernt werden, wobei gesetzte Feststoffe, soweit vorhanden, am Grund als Inokulum für die nächste Charge von neutralisierter Flüssigkeit zurückgelassen werden. Vorzugsweise werden zwischen 70% und 90% des Inhalts abgezogen. Die Folgechargenbetriebsart ist eine bevorzugte Ausführungsform für die Entgiftung von Flüssigkeiten, da die Verzögerungs- oder Akklimationsphase reduziert ist, hohe Niveaus von Biomasse in dem Reaktor zurückbehalten werden, Veränderlichkeit in der Zusammensetzung der Abfallzufuhr besser berücksichtigt wird und die Restfeststoffe, die nach der Biobehandlung zurückbleiben, möglicherweise reduziert sind.

5.3.1.3. SEMIKONTINUIERLICHE/KONTINUIERLICHE BETRIEBSART

Die semikontinuierliche/kontinuierliche Betriebsart ist ähnlich wie die Chargen- und die Folgechargenbetriebsart. Jedoch wird, statt die Inkubation nach einer vorbestimmten Zeit anzuhalten, frische Flüssigkeit, die ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen enthält, in den Bioreaktor in einer festen Menge über einen bestimmten Zeitraum gepumpt, wenn behandelte Flüssigkeit aus dem Bioreaktor gezogen wird. Dies ermöglicht eine kontinuierliche Behandlung der Flüssigkeit, ohne das Entgiftungsverfahren anhalten zu müssen.

5.3.2. BIOFILTER

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt einen Biofilter bereit. Biofilter werden in der Entgiftung von Gemischen von Nitrilverbindungen, Gemischen von Nitril- und Amidverbindungen und Gemischen von Amidverbindungen in Ausflüssen, wie Luft, Dämpfe, Aerosole und Wasser oder wässrige Lösungen, verwendet. Sind beispielsweise flüchtige Nitrilverbindungen vorliegend, können die flüchtigen Stoffe aus der festen oder wässrigen Lösung herausgenommen werden, in der sie gefunden werden, und die Schritte sollten derart durchgeführt werden, dass die flüchtigen Stoffe in einem Biofilter abgefangen werden. Nachdem sie abgefangen wurden, können die flüchtigen Stoffe mit einer Reinkultur eines Mikroorganismusstammes, wie unten beschrieben, entgiftet werden. In einer Art dieser Ausführungsform kann ein Biofilter des klassischen Typs verwendet werden, in welchem Luft, enthaltend ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen, durch die Biofiltervorrichtung durchgeführt wird. In einer anderen Art dieser Ausführungsform kann ein Tropffilterbett-Biofilter verwendet werden, in dem Luft und wässrige Lösungen, enthaltend ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen, durch die Biofiltervorrichtung durchgeführt werden.
Die Biofilter der vorliegenden Erfindung umfassen eine Vorrichtung, die eine Reinkultur eines Mikroorganismus, der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung induziert ist, oder ein Extrakt davon, auf einem Festträger immobilisiert, hat. Der Mikroorganismus kann aktiv teilend oder nicht aktiv teilend sein. Der Mikroorganismus kann auch vor Kombination mit der Biofiltervorrichtung gefriergetrocknet sein. Geeignete Festträger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf körnige Aktivkohle, Kompost, Holzrestprodukte (z. B. Holzspäne, Stücke, geschnitzelte Paletten oder Bäume), Aluminiumoxid, Ruthenium, Eisenoxid, Ionenaustauschharze, (z. B. AmberliteTM, IRA-93 oder IRA-96 (Rohm & Haas), DOWEXTM (Dow Chemical Co., Inc.), DEAE Zellulose, DEAE-SEPHADEXTM (Pharmacia, Inc.), Keramikkugeln, Polyacrylamidkugeln, Alginatkugeln, κ-Carrageenanwürfeln sowie Festpartikel, die aufgrund von inhärenter Magnetfähigkeit aus den wässrigen Lösungen wiedergewonnen werden können. Vorzugsweise ist der Festträger Alginatkugeln, die mit Polyethylenimid vernetzt worden sind. Die Biofiltervorrichtung kann Einfluss- und Ausflussöffnungen haben, so dass das Material, das behandelt werden soll, durch die Vorrichtung fließen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus, der an dem Festträger angeordnet ist, aus der Gruppe ausgewählt, die aus Mikroorganismen mit ATCC Nummern 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 und 55725 besteht, und der gemäß der vorliegenden Erfindung mehrfach induziert ist.
Die Biofilter können in einem Verfahren verwendet werden, welches umfasst das Fließen eines Ausflusses, enthaltend ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen, durch einen Biofilter, welcher eine Vorrichtung, die eine Reinkultur eines Mikroorganismus, der gemäß der vorliegenden Erfindung mehrfach induziert ist, oder Extrakt davon, auf einem Festträger immobilisiert, umfasst. Das Verfahren kann des Weiteren das Überwachen des Ausflusses umfassen, um zu bestimmen, dass die Nitril- und/oder Amidverbindungen tatsächlich entgiftet worden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus, der an dem Festträger angeordnet ist, aus der Gruppe ausgewählt, die aus Mikroorganismen mit ATCC Nummern 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 und 55725 besteht, und der gemäß der vorliegenden Erfindung mehrfach induziert ist.

5.4. KITS

Die vorliegende Erfindung stellt Kits bereit, die eine Reinkultur eines Mikroorganismusstammes umfassen, welcher mehrfach induziert ist und fähig ist, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entgiften. Der Mikroorganismusstamm kann aktiv teilend oder gefriergetrocknet oder gefroren sein und kann direkt einer wässrigen Lösung zugefügt werden, die die Nitril- und/oder Amidverbindungen enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit einen induzierten, gefriergetrockneten Stamm. Der Stamm kann auch auf einem Festträger immobilisiert sein, einschließlich körniger Aktivkohle, Holzspäne, Aluminiumoxid, Ruthenium, Eisenoxid, Keramik- oder Alginatkugeln sowie Festpartikel, die aufgrund inhärenter Magnetfähigkeit aus der wässrigen Lösung wiedergewonnen werden können. Andere Kitbauteile können beispielsweise ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zur Induktion von Mikroorganismen sowie Kitbauteile, wie Glasfläschchen, Verpackungsbauteile und dergleichen beinhalten, die Fachleuten gut bekannt sind.
Die folgenden Beispiele werden lediglich für Veranschaulichungszwecke vorgelegt und sollen den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken.

6. BEISPIEL: WIRKUNG UNTERSCHIEDLICHER INDUKTIONSGEMISCHE AUF ENTGIFTUNGSAKTIVTTÄT

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung von unterschiedlichen Induktionsgemischen auf die Fähigkeit eines beispielhaften Mikroorganismus, d. h. Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253, um ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entgiften.
Eine Reinkultur des Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 wurde mehrfach induziert, wie in Abschnitt 5.1 oben beschrieben, durch Wachsen des Stammes auf einem vollständigen YEMEA- Nährmedium-(Hefeextrakt, 4,0 g; Malzextrakt, 10 g; Dextrose, 4,0 g; Agar-Agar, 20 g und destilliertes H&sub2;O, 1,0 Liter) Agar-Agarplatten, die mit einem der unterschiedlichen Induktionsgemische, die in Tabelle IX zusammengefasst sind, ergänzt waren. Diese Zellen wurden von den Platten geerntet, zentrifugiert und mit phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen.
Der Mikroorganismusstamm wurde beurteilt, indem die unterschiedlich induzierten Zellen in kleinen Chargenreaktionen bei 25ºC auf ihre Fähigkeit, ein Testgemisch, enthaltend 164 ppm Acrylnitril, 160 ppm Acetonitril, 51 ppm Acrylamid, 54 ppm Acrolein, 51 ppm Fumarnitril und 102 ppm Succinnitril in Gegenwart von einem reaktiven C N Anteil zu entgiften, geprüft wurden.
Die mehrfach induzierten Zellen wurden mit dem Testgemisch bei 25ºC in Kontakt gebracht und das Verschwinden der 6 anfänglichen unterschiedlichen Nitril- und Amidverbindungen, die in dem Testgemisch vorliegend waren, wurde durch GLC-FID überwacht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle XII gezeigt. TABELLE XI: INDUKTIONSGEMISCHE
Aktivitätslegende: + = leichte Aktivität, ++ = mäßige Aktivität, +++ gute Aktivität, ++++ = ausgezeichnete Aktivität.
* Acetamid war anfänglich nicht in dem Testgemisch von Nitril- und Amidverbindungen vorliegend, sondern wurde durch Umsetzung von Acetonitril gebildet.
Das Induktionsgemisch von Acetonitril (150 ppm), Acrylnitril (150 ppm) und Succinnitril (50 ppm) gab die beste Entgiftungsaktivität bei den geprüften Bedingungen. Das Eliminieren entweder von Acrylnitril oder Acetonitril eliminierte die Entgiftungsaktivität für diese bestimmte Nitrilverbindung nicht. Wurde jedoch eine der Mononitrilverbindungen aus dem Induktionsgemisch ausgelassen, war die Gesamtaktivität nicht so groß, als wenn beide Mononitrile vorliegend waren. Das Verringern des Niveaus von Acrylnitril oder Acetonitril in dem Induktionsgemisch beeinflusste das Spektrum von umgesetzten Nitril- oder Amidverbindungen nicht, sondern führte zu einem niedrigeren Niveau von Entgiftungsaktivität. Andererseits erhöhte das Erhöhen des Niveaus von Acrylnitril oder Acetonitril in dem Induktionsgemisch nicht proportional das Niveau der Entgiftungsaktivität. Verändern der Konzentration von Succinnitril hatte keine Wirkung auf die Entgiftungsaktivität für Succinnitril. Jedoch war bei höheren Konzentrationen von Succinnitril (100 ppm) das Aktivitätsniveau gegen Acetamid und Acrylamid etwas verringert.
Das Ersetzen von Acetonitril und Acrylnitril durch Acetamid und Acrylamid als Induzierverbindungen verringerte das Spektrum der entgifteten Nitril- und/oder Amidverbindungen nicht. Jedoch führte es zu einem leicht niedrigeren Niveau von Entgiftungsaktivität.

7. BEISPIEL: FÄHIGKEIT VON RHODOCOCCUS SP. STMMM DAP 96253, NITRILE ZU ENTGIFTEN

Dieses Beispiel zeigt die breite Entgiftungsfähigkeit von mehrfach induziertem Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253. Der Stamm war, wie in Abschnitt 5.1 oben beschrieben, mehrfach auf vollständigem YEMEA-Nährmedium induziert, das mit 150 ppm Acrylnitril, 150 ppm Acetonitril und 50 ppm Succinnitril ergänzt war. Die Zellen wurden geerntet, gewaschen und erneut in phosphatgepufferter Saline suspendiert. Die Zellen wurden dann einzeln mit Benzonitril, Crotonnitril, Butyronitril und Adiponitril in Kontakt gebracht, in einer Konzentration von jeweils etwa 100-150 ppm bei 30ºC und bei einem anfänglichen pH von etwa 7. Die Entgiftungsreaktion wurde durch die Freisetzung von Ammoniak gemäß des Verfahrens von Fawcett und Scott, oben, überwacht.
Innerhalb von 10 Minuten war die Entgiftung des Nitrilanteils von Benzonitril im Wesentlichen vollständig. Bei Crotonnitril und Butyronitril erfolgte Entgiftung der Nitrilgruppe, war jedoch weniger schnell, d. h. in 10 Minuten war nur 10-20% der zwei Verbindungen entgiftet. Keine Entgiftungsaktivität wurde in 10 Minuten bei Adiponitril festgestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Mehrfachinduktion mittels Acetonitril, Acrylnitril und Succinnitril die Mikroorganismen induziert, um eine breite Vielfalt von Nitrilverbindungen zu entgiften. Des Weiteren zeigen die Ergebnisse, dass Aktivität, aromatisches Nitril zu entgiften, durch Mehrfachinduktion mittels aliphatischer Nitrile induziert werden kann.

8. BEISPIEL: WIRKUNGEN VON REAKTIONSBEDINGUNGEN AUF ENTGIFTUNG

Dieses Beispiel zeigt die unterschiedlichen Bedingungen, z. B. unterschiedliche Temperaturen, pH, Ammoniumsulfatkonzentrationen und Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff, bei denen Entgiftungsreaktionen durchgeführt werden können. In den Experimenten in diesem Abschnitt wurde eine Reinkultur von Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 oder Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 zuerst mehrfach, wie in Abschnitt 5.1 oben beschrieben, mittels vollständigem YEMEA-Nährmedium induziert, das mit 150 ppm Acetonitril, 150 ppm Acrylnitril und 50 ppm Succinnitril ergänzt war, und dann auf Nitrilentgiftungsaktivität gemäß den unten beschriebenen Verfahren geprüft wurde.

8.1. TEMPERATUR

Die Entgiftung von Acetonitril und Acrylnitril durch Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 bei unterschiedlichen Temperaturen wurde untersucht. Eine Reinkultur von dem mehrfach induzierten Mikroorganismus Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 wurde einem wässrigen Gemisch zugefügt, enthaltend Acrylnitril oder Acetonitril, bei 37ºC, 40ºC und 55ºC, und das Verschwinden von der Nitrilverbindung wurde durch GLC-FID überwacht.
Die Ergebnisse (nicht dargestellt) zeigten, dass die Fähigkeit von Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253, Acetonitril zu entgiften, bei den drei Temperaturen, die geprüft wurden, im Wesentlichen die gleiche war. In ähnlicher Weise ist die Fähigkeit, Acrylnitril zu entgiften, auch die gleiche bei den drei Temperaturen, die geprüft wurden.
In einer anderen Experimentenreihe wurde die Wirkung der Temperatur auf die Geschwindigkeit der Nitrilentgiftung geprüft. Eine Reinkultur von mehrfach induziertem Mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 wurde verschiedenen Mustern zugefügt, jedes Muster entweder Acetonitril oder Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils 150 ppm enthaltend. Die unterschiedlichen Muster mit dem induzierten Mikroorganismus wurden bei Temperaturen von 25 ºC, 35ºC, 45ºC, 55ºC, 60ºC, 70ºC, und 80ºC inkubiert, und das Verschwinden der Nitrilverbindungen wurde durch GLC- FID überwacht. Die Entgiftungsgeschwindigkeit in uM/Minute wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 aufgeführt.
Fig. 1 zeigt, dass die Nitrilentgiftungsgeschwindigkeit konstant bleibt oder sich bei steigender Temperatur zwischen 25ºC und 55ºC leicht verbesserte. Jedoch sinkt die Entgiftungsgeschwindigkeit bei Temperaturen über 55ºC.

8. 2. pH

Induzierte Zellen von Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 wurden auf ihre Fähigkeit, ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, nämlich 164,3 ppm Acrylnitril, 159,9 ppm Acetonitril, 51,4 ppm Acrylamid, 53,5 ppm Acrolein, 51 ppm Fumarnitril und 101,9 ppm Succinnitril, bei drei verschiedenen pH- Werten, pH 6, pH 7 und pH 8, geprüft. Das Verschwinden von Acetonitril und Acrylnitril wurde durch GLC-FID überwacht. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde der Reaktionsinhalt zentrifugiert, das Obenschwimmende abgeschüttet und ein frisches Gemisch Nitril- und Amidverbindungen zugefügt und, soweit erforderlich, der pH des Reaktionsgemisches auf den entsprechenden Test-pH eingestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2A-2C dargestellt.
Die Ergebnisse, die in Fig. 2A-2C dargestellt sind, zeigen, dass Entgiftungsaktivität von Acetonitril und Acrylnitril bei pH-Werten von jeweils 6, 7 und 8 anfänglich über den gesamten Bereich konstant blieb. Bei wiederholte Neuzuführung beginnt die Entgiftungsaktivität jedoch nach der dritten Neuzuführung abzunehmen, und Entgiftungsaktivität bei pH 8 beginnt nach 5 oder mehr Neuzuführungen abzunehmen.

8.3. AMMONIUMSULFAT

Ammoniumsulfat wird in den Abfallströmen von Acrylnitrilproduktionsanlagen, die das SOHIO/BP-Produktionsverfahren verwenden, in Konzentration von bis zu 8% (Gew./Gew.) gefunden. Um die Wirkung, soweit vorhanden, von Ammoniumsulfat auf Nitrilentgiftung zu bestimmen, wurden Entgiftungsreaktionen mit verschiedenen Ammoniumsulfatkonzentrationen von 0 bis 8% (Gew./Gew.) durchgeführt.
Induzierte Zellen von Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 wurden auf ihre Fähigkeit, ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, nämlich 164,3 ppm Acrylnitril, 159,9 ppm Acetonitril, 51,4 ppm Acrylamid, 53,5 ppm Acrolein, 51 ppm Fumarnitril und 101,9 ppm Succinnitril bei verschiedenen Konzentrationen von Ammoniumsulfat von 0 bis 8% (Gew./Gew), geprüft. Das Verschwinden der Nitril- und Amidverbindungen wurde durch GLC-FID überwacht.
Bei sämtlichen der verschiedenen Konzentrationen von Ammoniumsulfat, die geprüft wurden, wurde keine Wirkung auf die Entgiftungsfähigkeit des induzierten Mikroorganismusstammes festgestellt (Ergebnisse nicht gezeigt)

8.4. SAUERSTOFF

Induzierte Zellen von Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 oder induzierte Zellen von Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 wurden auf ihre Fähigkeit, ein Testgemisch von Nitril- und Amidverbindungen, nämlich 164,3 ppm Acrylnitril, 159,9 ppm Acetonitril, 51,4 ppm Acrylamid, 53,5 ppm Acrolein, 51 ppm Fumarnitril und 101,9 ppm Succinnitril in Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff, geprüft. Die Zellen der zwei Stämme wurden induziert, wie in Abschnitt 5.1 oben beschrieben, geerntet und konzentriert. Die konzentrierten Zellen wurden in zwei gleiche Pellets gespalten. Bei anaerober Prüfung wurde das Pellet erneut mit stickstoffgereinigtem Stanier-Medium suspendiert und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde daraufhin mit Stickstoff gereinigt und in ein Rohr eingesetzt, das daraufhin mit einer Kappe versehen wurde. Die Reagenzflaschen, die in der anaeroben Prüfung verwendet wurden, wurden mit minimiertem Gasluftraum autoklaviert. Nach der Autoklaven-Behandlung wurden die Flaschen geleert, während sie noch heiß waren, und mit einer Kappe versehen.
Das entlüftete Pellet wurde mit entlüftetem, stickstoffgereinigten Medium, das das Testgemisch enthielt, gemischt, und das belüftete Pellet wurde mit dem Testgemisch gemischt. Das belüftete Pellet wurde mit dem Testgemisch, dass nicht entlüftet worden war, gemischt. Die Reaktionen wurden ohne Rühren inkubiert. Das Verschwinden der Nitril- und Amidverbindungen wurde durch GLC-FID überwacht.
Es wurde kein bedeutender Unterschied bei den Entgiftungsreaktionen bei Abwesenheit beziehungsweise Gegenwart von Sauerstoff festgestellt. Zwar wird Sauerstoff für das Wachstum der Mikroorganismen benötigt, jedoch war Sauerstoff für die Entgiftung nicht erforderlich.
Die Ergebnisse der Experimente, die in diesem Abschnitt beschrieben sind, zeigen deutlich, dass die Entgiftungsreaktion bei einer Vielzahl von verschiedenen Bedingungen erfolgen können.

9. BEISPIEL: ENTGIFTUNG EINES GEMISCHES VON NITRIL- UND AMIDVERBINDUNGEN

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit eines induzierten Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253, ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entgiften. Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 wurde mehrfach induziert, indem der Stamm auf einem vollständigen YEMEA-Nährmedium, das mit 150 ppm Acetonitril, 150 ppm Acrylnitril und 50 ppm Succinnitril ergänzt war, gewachsen wurde. Die induzierten Zellen wurden gesammelt, und Zellen mit einem Trockengewicht von 100 mg wurden mit 300 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend ein Gemisch von Nitrilverbindungen, nämlich 164,3 ppm Acrylnitril, 159,9 ppm Acetonitril, 51,4 ppm Acrylamid, 53,5 ppm Acrolein, 51 ppm Fumarnitril und 101,9 ppm Succinnitril, in Kontakt gebracht. Die Reaktion wurde bei 25ºC und einem anfänglichen pH von 7 durchgeführt. Das Verschwinden von Acrolein, Acetamid, Acrylnitril, Acetonitril, Succinnitril und Fumarnitril wurde durch GLC-FID überwacht. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Fig. 3 zeigt, dass der mehrfach induzierte Mikroorganismusstamm, der wie oben beschrieben induziert war, fähig war, ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen in 360 Minuten zu fast nichtfeststellbaren Niveaus zu entgiften. Die gezeigte Fumarnitrilanalyse ist nicht genau, da die Auflösung von Fumarnitril in dem Gemisch von Nitrilen und Amiden bei Niveaus unter 50 ppm mit dem besonderen verwendeten Feststellverfahren schwierig ist.

10. BEISPIEL: ENTGIFTUNG VON ABFALLSWASSERKOLONNENGRUND

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit eines mehrfach induzierten Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622, ein Gemisch von Nitrilverbindungen aus einem Abfallwasserkolonnengrund bei zwei unterschiedlichen Konzentrationen zu entgiften. Ein Abfallwasserkolonnengrund (WWCB), der von einer Acrylnitrilproduktionsanlage, die das SOHIO/BP-Verfahren der Acrylnitrilproduktion verwendet, erhalten wurde, ergänzt mit Acrylnitril und Acetonitril, entweder in voller Stärke oder 1 : 5 mit Wasser verdünnt, wurde mittels induzierter Zellen des Mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 entgiftet. Eine Reinkultur des Mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 wurde mehrfach induziert, wie in Abschnitt 5.1 oben beschrieben, indem der Mikroorganismus auf vollständigem YEMEA-Nährmedium, das mit 150 ppm Acetonitril, 150 ppm Acrylnitril und 50 ppm Succinnitril ergänzt war, kultiviert wurde. Die induzierten Zellen wurden geerntet und den Testgemischen von Nitrilen (als Gemisch A und B bezeichnet) zugefügt, die entgiftet werden sollten, enthaltend eine der zwei verschiedenen Konzentrationen von WWCB, jeweils ergänzt mit Acetonitril und Acrylnitril. Gemisch A war WWCB- Material in voller Stärke, das mit jeweils 200 ppm Acrylnitril und Acetonitril ergänzt war. Gemisch B war ein Verdünnung von WWCB (1 : 5 mit Wasser verdünnt), das mit Acetonitril und Acrylnitril zu jeweils 150 ppm ergänzt war. Das Verschwinden von Acetonitril, Acrylnitril, Succinnitril und Fumarnitril aus jedem Gemisch wurde durch GLC-FID überwacht. Die Ergebnisse sind für Gemisch A in Fig. 4A und für Gemisch B in Fig. 4B gezeigt.
Die in Fig. 4A und 4B gezeigten Ergebnisse zeigen deutlich, dass der induzierte Rhodococcus rhodochrous Stamm DAP 96622 fähig ist, ein Gemisch von Nitrilverbindungen, das sowohl in verdünntem als auch Vollstärken-WWCB gefunden wird, innerhalb von Minuten bis Stunden gilt zu entgiften.

11. BEISPIEL: ENTGIFTUNG VON REINABSTREIFGRUND

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit von einem mehrfach induzierten Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253, ein Gemisch von Nitrilverbindungen von einem Reinabstreifgrund zu entgiften. Ein Reinabstreifgrund (Net Stripper Bottom - NSB), der von einer Acrylnitrilproduktionsanlage erhalten wurde, die das SOHIO/BP-Verfahren der Acrylnitrilproduktion verwendet (mit Acrylnitril und Acetonitril ergänzt), wurde entgiftet mittels ruhender induzierter Zellen des Mikroorganismus Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253. Rhodococcus Sp. Stamm DAP 96253 war mehrfach induziert durch Kultivieren des Mikroorganismus auf vollständigem YEMEA-Nährmedium, das mit 150 ppm Acetonitril, 150 ppm Acrylnitril und 50 ppm Succinnitril ergänzt war. Nach Induktion wurden die Zellen 6 oder 60 Tage bei 4ºC gelagert und als ruhende Zellen bezeichnet. Das NSB-Reaktionsgemisch, das entgiftet werden sollte, enthielt zum Zeitpunkt Null Acrylnitril zu 15 ppm, Acetonitril zu 15 ppm und Succinnitril zu 17 500 ppm. Die ruhenden Zellen wurden dem NSB bei Bedingungen von 25ºC und einem anfänglichen pH von 7 zugefügt. Zu dem Zeitpunkt von 140 Minuten wurden dem Reaktionsgemisch jeweils 100 ppm von Acetonitril und Acrylnitril zugefügt. Zu der Zeit enthielt das NSB-Reaktionsgemisch Acrylnitril zu 100 ppm, Acetonitril zu 100 ppm und Succinnitril zu 0 ppm. Das Verschwinden von Acetonitril, Acrylnitril und Succinnitril wurde durch GLC-FID überwacht. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 für Zellen, die 60 Tage lang gelagert wurden, gezeigt.
Die Ergebnisse, die in Fig. 5 dargestellt sind, zeigen, dass ein mehrfach induzierter Mikroorganismusstamm, der nicht mehr aktiv teilend ist, fähig ist, ein Gemisch von Nitrilverbindungen innerhalb von einigen Stunden zu entgiften. Zellen, die 6 Tage lang gelagert wurden, zeigten ähnliche Entgiftungsaktivität. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass Entgiftungsaktivität von Wachstum abgekoppelt ist. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass Entgiftungsaktivität keinen Sauerstoff benötigt.

12. BEISPIEL: IMMOBILISIERUNG VON GANZEN ZELLEN IN POLYACRYLAMID

Ganze Zellen von Rhodococcus Stamm DAP 96253 wurden in Polyacrylamid immobilisiert, um die Zellen in einer stabilen Matrix zu verankern. Zusätzlich bietet Polyacrylamid mechanische Integrität und Stärke, was zu effektiverer Retention der Zellen in dem Reaktionsgefäß führt und dazu dient, die Nitrilase- und Amidaseaktivität in den Zellen zu stabilisieren.
Mehrfach induzierte DAP 96253 Zellen mit einem Nassgewicht von 10 Gramm wurden in 40 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die 40 ml von Zellen wurden 40 ml destilliertem Wasser, enthaltend 4,5 g Acrylamid und 0,5 g N-,N-Methylenbisacrylamid, zugefügt. Der 80 ml Lösung wurden 5 ml α- Dimethylaminoproprionitril und 10 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfatlösung zugefügt, und das resultierende Gemisch wurde kräftig gerührt und dann auf Eis gesetzt. Nachdem die Lösung polymerisiert war, wurde die polymerisierte Lösung in kleine Würfel geschnitten, welche mit destilliertem Wasser gewaschen wurden, um jegliches nicht polymerisierte Monomer zu entfernen.

13. BEISPIEL: VORSERIEN-MASSENPRODUKTION VON MEHRFACH INDUZIERTEN MIKROORGANISMEN

Dieses Beispiel beschreibt eine Vorserien-Massenproduktion einer mehrfach induzierten Kultur von DAP Stamm 96253. Das Anfangsmedium, das zu Beginn der Produktion von Mikroorganismen verwendet wurde, enthielt Folgendes:

(Gramm/Liter)

Hefeextrakt 0,5
Proteose Pepton #3 0,5
Casaminosäuren 0,5
Dextrose 0,5
Lösliche Stärke 0,5
Natriumpyruvat 0,3
K&sub2;HPO&sub4; 0,3
MgSO&sub4; 0,05
CoCl&sub2; 10 mg
Harnstoff 7,5
Tabelle XIII unten zeigt Zufügungen zu dem Grundmedium, die im Verlauf eines 46-Stunden-Produktionsdurchlaufs erfolgten. Ein Antischaummittel, das durch die Mikroorganismen nicht abgebaut wurde und nicht giftig für sie war, wurde zugefügt. TABELLE XIII
* Kohlenstoffergänzung: Hefeextrakt = 16 g Malzextrakt = 63,9 g Dextrose = 26,6 g Destilliertes Wasser = 1,0 Liter
** Induktorgemisch: Acetonitril = 3,82 ml Acrylnitril = 3,72 ml Succinnitril = 1,015 g KCN oder NaCN = 0,02 g Destilliertes Wasser = 100 ml
*** ANTIFOAM ATM (Antischaummittel auf Silikonbasis, Dow Chem. Corp.)

14. BEISPIEL: ENTFERNUNG VON VERSCHMUTZENDEN ACRYLNITRIL AUS ACRYLAMIDLÖSUNG

Mehrfach induzierte Zellen DAP 96253, die wie oben in Abschnitt 13 beschrieben erhalten wurden, wurden entweder in Polyacrylamid oder in gehärtetem Alginat immobilisiert. Die Zellen wurden dann mit 50%iger Acrylamidlösung, enthaltend etwa 150 ppm Acrylnitril, bei 25ºC reagieren lassen. In 15 Minuten war die Acrylnitrilkonzentration < 50 ppm für die Zellen, die in Polyacrylamid immobilisiert waren, und < 1 ppm für die Zellen, die in gehärtetem Alginat immobilisiert waren.

15. HINTERLEGEN VON MIKROORGANISMEN

Die folgenden Mikroorganismen wurden am 10. Dezember 1996 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD hinterlegt und ihnen wurden die folgenden Nummern zugewiesen:

Mikroorganismus ATCC Nummer

Rhodococcus Sp. DAP 96253 55899
Rhodococcus rhodochrous DAP 9662255898

Claims

1. Verfahren zum Umsetzen eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen zu entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen oder einem Gemisch davon, umfassend das in Kontakt bringen einer Reinkultur eines mehrfach induzierten Mikroorganismus oder eines Extrakts eines mehrfach induzierten Mikroorganismus mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um die Nitrilverbindung bzw. -verbindungen zu entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen oder einem Gemisch davon umzusetzen, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus durch ein Verfahren erhalten wird, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist.

2. Verfahren zum Umsetzen eines Gemisches von Nitrilverbindungen oder eines Gemisches von Nitril- und Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen, umfassend das in Kontakt bringen einer Reinkultur eines mehrfach induzierten Mikroorganismus oder eines Extrakts eines mehrfach induzierten Mikroorganismus mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um die Nitrilverbindungen oder die Nitril- und Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen umzusetzen, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus durch ein Verfahren erhalten wird, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist.

3. Verfahren zum Umsetzen eines Gemisches von Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen, umfassend das in Kontakt bringen einer Reinkultur eines mehrfach induzierten Mikroorganismus oder eines Extrakts eines mehrfach induzierten Mikroorganismus mit einem Gemisch von Amidverbindungen während eines ausreichenden Zeitraums, um die Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen umzusetzen, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus durch ein Verfahren erhalten wird, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Reinkultur eine Kultur eines mehrfach induzierten Mikroorganismus oder der Extrakt ein Extrakt eines mehrfach induzierten Mikroorganismus ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mikroorganismen mit ATCC Nummern 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 und 55725 besteht, und der mehrfach induziert wurde.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Reinkultur oder der Extrakt eingekapselt oder immobilisiert ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Reinkultur immobilisiert ist auf einem Festträger, der ausgewählt wurde aus der Gruppe bestehend aus körniger Aktivkohle, Holzspänen, Aluminiumoxid, Ruthenium, Eisenoxid, Keramikkugeln, Alginatkugeln und α-Carrageenanwürfeln.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus erhalten wird durch ein Verfahren, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen, enthaltend wenigstens eine Verbindung von Acetonitril und Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril und Fumarnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 50 ppm, ergänzt ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Kulturmedium mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen, enthaltend Acetonitril und Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril zu etwa 50 ppm, ergänzt ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Kulturmedium des Weiteren mit etwa 1-10 ppm KCN oder NaCN ergänzt ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Kulturmedium Minimalmedium ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Kulturmedium ein vollständiges Nährmedium ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus erhalten wird durch ein Verfahren, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, enthaltend

(a) wenigstens eine Verbindung von Succinnitril zu etwa 50 ppm, Acetonitril zu etwa 150 ppm and Acrylnitril zu etwa 150 ppm und (b) Acetamid und Acrylamid zu jeweils etwa 150 ppm, ergänzt ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Kulturmedium mit einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, enthaltend Succinnitril zu etwa 50 ppm und Acetamid zu etwa 150 ppm und Acrylamid zu etwa 150 ppm, ergänzt ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das Kulturmedium des Weiteren mit etwa 1-10 ppm KCN oder NaCN ergänzt ist.

15. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das Kulturmedium Minimalmedium ist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das Kulturmedium ein vollständiges Nährmedium ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Gemisch aus Nitril- und Amidverbindungen einen Abfallstrom von einer Nitrilproduktionsanlage umfasst, der Acrylamid zu etwa 10-1500 ppm, Acetonitril zu etwa 0-4500 ppm, Acrylnitril zu etwa 5-1250 ppm, Succinnitril zu etwa 50-40000 ppm, Fumarnitril zu etwa 20-1500 ppm und Acrolein zu etwa 10-1200 ppm enthält.

18. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Gemisch aus Nitril- und Amidverbindungen eine Amidzubereitung umfasst, enthaltend eine unerwünschte Nitrilverbindung.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, des Weiteren umfassend das Erwärmen des mehrfach induzierten Mikroorganismus auf etwa 55ºC bis etwa 60ºG vor oder gleichzeitig mit dem in Kontakt bringen der Amidzubereitung.

20. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Amidzubereitung eine Acrylamidzubereitung ist, enthaltend eine Nitrilverbindung, welche Acrylonitril ist.

21. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Amidzubereitung eine Acetamidzubereitung ist, enthaltend eine Nitrilverbindung, welche Acetonitril ist.

22. Verfahren zum Induzieren eines Mikroorganismus, so dass dieser die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen oder einem Gemisch davon umzusetzen, umfassend das Kultivieren einer Probe eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen, enthaltend wenigstens eine von Acetonitril und Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril und Fumarnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 50 ppm, ergänzt ist.

23. Verfahren zum Induzieren eines Mikroorganismus, so dass dieser die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen oder einem Gemisch davon umzusetzen, umfassend das Kultivieren einer Probe eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen, enthaltend Acetonitril und Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril zu etwa 50 ppm, ergänzt ist.

24. Verfahren zum Induzieren eines Mikroorganismus, so dass dieser die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder ein Gemisch von Amidverbindungen zu entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen oder einem Gemisch davon umzusetzen, umfassend das Kultivieren einer Probe eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, enthaltend (a) wenigstens eine von Succinnitril in einer Konzentration von etwa 50 ppm, Acetonitril in einer Konzentration von etwa 150 ppm und Acrylnitril in einer Konzentration von etwa 150 ppm und (b) Acetamid und Acrylamid in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm, ergänzt ist.

25. Verfahren gemäß Anspruch 22, 23 oder 24, wobei das Kulturmedium Minimalmedium ist.

26. Verfahren gemäß Anspruch 22, 23 oder 24, wobei das Kulturmedium ein vollständiges Nährmedium ist.

27. Mehrfach induzierter Mikroorganismus, der durch das Verfahren gemäß Anspruch 22, 23 oder 24 erhalten wird.

28. Verfahren zum Durchmustern von Mikroorganismen, um einen Mikroorganismus zu identifizieren und zu isolieren, der ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen zu entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen oder einem Gemisch davon umsetzen kann, umfassend:

(a) das Kultivieren eines Testmikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem ersten Gemisch von Nitrilverbindungen, enthaltend wenigstens eine von Acetonitril und Acrylnitril in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm und Succinnitril in einer Konzentration von etwa 50 ppm, ergänzt ist, unter günstigen Wachstumsbedingungen, um einen mutmaßlich induzierten Mikroorganismus zu erhalten; und

(b) Beurteilen der Fähigkeit des mutmaßlich induzierten Mikroorganismus, ein Gemisch von Nitrilverbindungen umzusetzen, durch

(i) in Kontakt bringen des mutmaßlich induzierten Mikroorganismus mit einem zweiten Gemisch von Nitrilverbindungen, umfassend Acrylnitril in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 40000 ppm, Acetonitril in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 40000 ppm, Fumarnitril in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 40000 ppm und Succinnitril in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 40000 ppm; und

(ii) Überwachen des Verschwindens jeder der Nitrilverbindungen in dem zweiten Gemisch,

wobei das Verschwinden von wenigstens zwei Nitrilverbindungen in dem Gemisch anzeigt, dass der Testmikroorganismus die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Nitrilverbindungen zu entsprechenden Amid- oder Säureverbindungen oder einem Gemisch davon umzusetzen.

29. Verfahren zum Durchmustern von Mikroorganismen, um einen Mikroorganismus zu identifizieren und zu isolieren, der ein Gemisch von Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen umsetzen kann, umfassend:

(a) das Kultivieren eines Testmikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem ersten Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, enthaltend (a) wenigstens eine Verbindung von Succinnitril in einer Konzentration von etwa 50 ppm und Acetonitril in einer Konzentration von etwa 150 ppm und Acrylnitril in einer Konzentration von etwa 150 ppm und (b) Acetamid und Acrylamid in einer Konzentration von jeweils etwa 150 ppm, ergänzt ist; und

(b) Beurteilen der Fähigkeit des mutmaßlich induzierten Mikroorganismus, ein Gemisch von Amidverbindungen umzusetzen durch

(i) in Kontakt bringen des mutmaßlich induzierten Mikroorganismus mit einem zweiten Gemisch von Amidverbindungen, umfassend Acetamid in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 20000 ppm und Acrylamid in einer Konzentration von etwa 1 ppm bis etwa 20000 ppm; und

(ii) Überwachen des Verschwindens jeder der Amidverbindungen in dem zweiten Gemisch,

wobei das Verschwinden der Amidverbindungen anzeigt, dass der Testmikroorganismus die Fähigkeit hat, ein Gemisch von Amidverbindungen zu entsprechenden Säureverbindungen oder einem Gemisch davon umzusetzen.

30. Kit, umfassend eine Reinkultur eines Mikroorganismusstammes, der mehrfach induziert wurde durch ein Verfahren, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist, und welcher fähig ist ein Gemisch von Nitrilverbindungen oder ein Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen oder Amidverbindungen zu entgiften.

31. Kit gemäß Anspruch 30, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Mikroorganismen mit ATCC Nummern 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 und 55725, und welcher mehrfach induziert wurde.

32. Biofilter, der eine Vorrichtung umfasst, mit einer Reinkultur von mehrfach induzierten Mikroorganismen oder einen Extrakt davon, immobilisiert auf einem Festträger, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus erhalten wird durch ein Verfahren, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist.

33. Biofilter gemäß Anspruch 32, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mikroorganismen mit ATCC Nummern 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 und 55725, und welcher mehrfach induziert wurde.

34. Chemisch/biologisches Hybridverfahren zur Herstellung von Acrylamid aus Acrylnitril, umfassend das in Kontakt bringen einer Lösung, die etwa 30% Acrylamid und etwa 10% Acrylnitril umfasst, mit einem mehrfach induzierten Mikroorganismus, welcher gegebenenfalls behandelt worden ist, um Amidaseaktivität zu deaktivieren, während eines ausreichenden Zeitraums, um die Konzentration von Acrylnitril auf weniger als 100 ppm zu reduzieren, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus erhalten wird durch ein Verfahren, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist.

35. Verbessertes Verfahren zur Herstellung eines Amides wie Acetamid oder Acrylamid, wobei die Verbesserung das in Kontakt bringen einer intermediären Lösung umfasst, die während eines chemischen Syntheseprozesses zum Herstellen eines Amides gebildet wurde, wobei die Lösung etwa 50% Amid und etwa 10% Nitril mit einem mehrfach induzierten Mikroorganismus umfasst, der gegebenenfalls behandelt wurde, um Amidaseaktivität zu deaktivieren, wobei das in Kontakt bringen während eines Zeitraums erfolgt, der ausreichend ist, um die Konzentration von Nitril auf weniger als 100 ppm zu reduzieren, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus erhalten wird durch ein Verfahren, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitrilverbindungen oder einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen ergänzt ist.

36. Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei der mehrfach induzierte Mikroorganismus erhalten wird durch ein Verfahren, umfassend das Kultivieren einer Reinkultur eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das mit einem Gemisch von Nitril- und Amidverbindungen, enthaltend (a) wenigstens eine Verbindung von Succinnitril zu etwa 50 ppm, Acetonitril zu etwa 150 ppm und Acrylnitril zu etwa 150 ppm und (b) Acetamid und Acrylamid zu jeweils etwa 150 ppm, ergänzt ist.

37. Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei das Amid Acrylamid ist und das Nitril Acrylnitril ist.

38. Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei das Amid Acetamid ist und das Nitril Acetonitril ist.