DE69733194T2

DE69733194T2 - Neuer mikroorganismus und seine benutzung in einer methode zur umweltreinigung

Info

Publication number: DE69733194T2
Application number: DE69733194T
Authority: DE
Inventors: Koichi Toyota-shi NUMATA; Yasushi Toyota-shi ODA; Masami Toyota-shi MIYATA; Yukio Toyota-shi OKAMURA; Toshiaki Toyota-shi KIMURA; Masatoshi Toyota-shi UCHIDA; Osamu Konan-si ASAMI
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1996-08-19
Filing date: 1997-08-19
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2017-08-20
Also published as: CA2232345C; MY120943A; JP3546888B2; ES2238725T3; KR100270355B1; ID18052A; CN1205032A; CA2232345A1; EP0873397A1; KR100320714B1; JPH11514532A; DE69733194D1; EP0873397B1; CN1149278C; WO1998007831A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Mikroorganismen, welche wirkungsvoll organische halogenierte Verbindungen, wie etwa Trichlorethylen abbauen, und auf ein Verfahren für den Abbau von organischen halogenierten Verbindungen, spezifisch auf den Abbau von Trichlorethylen im Boden, im Grundwasser oder in Abwässern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den vergangenen Jahren erzeugte in vielen Teilen des Landes die industrielle Nutzung von organischen Lösungsmitteln Umweltverschmutzungsprobleme durch die Freisetzung dieser Verbindungen oder von Abwässern, die diese Verbindungen enthalten. Insbesondere ist die Bodenverschmutzung durch organische chlorierte Verbindungen ein großes soziales Problem und eine Technologie für die Sanierung des kontaminierten Bodens wurde immer notwendiger. Reinigungsverfahren für kontaminierten Boden schließen physikalische Verfahren und biologische Verfahren ein.
Die physikalischen Behandlungsverfahren enthalten das Luftstrippen (ein Verfahren zum Einspülen von Luft in den kontaminierten Boden, welcher ausgehoben wurde, um die darin enthaltenen organischen chlorierten Verbindungen zu verdampfen und sie durch Adsorption an Aktivkohle zu entfernen) und das Vakuumextraktionsverfahren (ein Verfahren, in welchem Rohre in den kontaminierten Boden getrieben werden, um einen reduziertem Druckzustand zu erzeugen, so dass die organischen chlorierten Verbindungen darin verdampft und aus dem Boden extrahiert werden). Jedoch erfordern diese Verfahren eine enorme Energie zum Einspülen der Luft usw., und haben die Nachteile, dass die ersteren Verfahren den Bodenaushub erfordern, während bei den letzteren die Extraktionseffizienz gering ist und die Reinigung bei geringer Konzentration der Kontaminanten nicht gleichmäßig abläuft. Überdies absorbieren beide Verfahren die kontaminierenden Substanzen an Aktivkohle und erfordern daher getrennte Einrichtungen zur Entgiftung der kontaminierten Substanzen.
Es wurde vor kurzem berichtet, dass das in der Entwicklung befindliche biologische Behandlungsverfahren die Fähigkeit von Mikroorganismen nutzt Substanzen abzubauen, und die kontaminierenden Substanzen vollständig abbauen oder entgiften kann, und daneben wird wenig Energie für die Behandlung im Vergleich mit den physikalischen Mitteln benötigt. Überdies ermöglichen die biologischen Mittel eine Reinigung selbst bei geringen Konzentrationen der Kontaminanten und demgemäss sind die Erwartungen an das Verfahren als ein preiswertes Verfahren für die Bodenreinigung groß. Die bekannten biologischen Verfahren enthalten die Festphasebehandlung (der ausgehobene Boden wird mit Phosphor, Stickstoff, Mikroorganismen usw. gemischt, um den Abbau der kontaminierenden Substanzen durch die Mikroorganismen zu fördern), das Aufschlämmungsbehandlungsverfahren (der ausgehobene Boden wird mit Wasser, Phosphor, Stickstoff, Mikroorganismen usw. gemischt, um in der flüssigen Form behandelt zu werden, um die Reinigungsgeschwindigkeit der kontaminierten Substanzen durch die Mikroorganismen zu fördern), und das örtliche Behandlungsverfahren (Methan, Luft, Phosphor und Stickstoff werden in den Boden ohne Aushub des Bodens eingespritzt, um den Abbau der kontaminierenden Substanzen durch die Mikroorganismen zu fördern).
Von den herkömmlich verwendeten biologischen Behandlungsverfahren erfordern das Festphasenbehandlungsverfahren und das Aufschlämmungsbehandlungsverfahren den Aushub des Bodens und haben nebenbei einen engen Anwendungsbereich und die Kosten für Behandlung und Ausrüstung sind relativ hoch.
Auf der anderen Seite ist das örtliche Behandlungsverfahren, in welchem bodenständige Mikroorganismen als die Abbauer eingesetzt werden, in Behandlung und Ausrüstung verglichen mit den vorbeschriebenen Verfahren weniger teuer und kann über einen weiteren Bereich eingesetzt werden. Aber unter der Bedingung, dass die Gesamtzahl der Mikroorganismen in den Boden gering ist, sinkt die Reinigungsgeschwindigkeit der örtlichen Behandlung. Insbesondere in dem Fall von abbaubeständigen Verbindungen, wie etwa organischen chlorierten Verbindungen, ist die Reinigung unmöglich, wenn es keine lebenden Mikroorganismen in dem Boden gibt, welche diese Kontaminanten abbauen können. In diesen Fällen wird angenommen, dass das Beimpfen mit Mikroorganismen mit der Fähigkeit des Abbaus von organischen chlorierten Verbindungen in den Boden, wesentlich für die Erhöhung der Reinigungsgeschwindigkeit des Bodens ist.
Bekannte Mikroorganismen, welche Trichlorethylen abbauen, enthalten Methylosinus tricosporium OB3 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kohyo) Nr. 4(1992)-501667, japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 5(1993)-212371) und Methylosinus tricos orium TUKUBA (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 2(1990)-92274, japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 3(1991)-292970) welche methan-abbauende Organismen sind, Pseudomonas utida F1 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 64(1989)-34499), Pseudomonas putida BH (Fujita et al.; Chemical Engineering, 39(6):494, 1994), Pseudomonas utida UC-R5, UC-P2 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 62(1987)-84780, Pseudomonas putida KWI-9 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 6(1994)-70753), Pseudomonas mendocina KR1 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 2(1990)-503866, 5(1993)-502593), Pseudomonas cepacia G4 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 4(1992)-502277), und Pseudomonas cepacia KK01 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 6(1994)-296711) welche zur Gattung Pseudomonas gehören, Alcaligenes eutropus JMP134 (A.R. Harke r, Appl. Environ. Microbiol., 56(4):1179-1181, 1990), Alcaligenes eutropus KS01 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 7(1995)-123976), Nitrosomonas europaea (D. Arciero et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159(2) :640–643, 1989) welches ein Ammoniak oxidierendes Bakterium ist, Corynebacterium J1 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 8(1996)-66182) und ähnliche.
Die Trichlorethylen-Abbaufähigkeit dieser bekannten Mikroorganismen ist nicht sehr hoch und die meisten dieser Mikroorganismen können nur 5 ppm Trichlorethylen in der Flüssigkultur abbauen. Da überdies die Trichlorethylenabbaufähigkeit in einer speziellen Umgebung wie dem Boden erforderlich ist, ist es notwendig, dass die für die Biosanierung verwendeten Mikroorganismen nicht nur eine ausreichende Fähigkeit zum Abbau von Trichlorethylen haben, sondern ebenfalls, dass sie ihre Trichlorethylenabbaufähigkeit im Boden behalten. Jedoch sind die meisten der bekannten Mikroorganismen in dieser Hinsicht ungenügend.
Es ist berichtet worden, dass Pseudomonas cepacia KK01 Trichlorethylen bei einer Ausgangskonzentration von 30 ppm bis 15 ppm in der Flüssigkultur abbauen kann und Trichlorethylen bei einer Ausgangskonzentration von 5 ppm bis 1 ppm im Boden (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 6(1994)-296711). Überdies wurde berichtet, dass Alcaligenes eutropus KS01 Trichlorethylen in einer Ausgangskonzentration von 50 ppm bis unter die Nachweisgrenze in der Flüssigkultur und Trichlorethylen bei einer Ausgangskonzentration von 1 ppm unter die Nachweisgrenze im Boden abbauen kann (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 7(1995)-123976).
Es wurde bestätigt, dass diese Mikroorganismen eine höhere Abbaufähigkeit als die herkömmlichen Mikroorganismen haben, und dass diese Fähigkeiten ebenfalls im Boden aufgewiesen werden können. Jedoch ist die Zugabe von wenigstens einer oder mehr als einer aromatischen Verbindung zu der Bodenumgebung für die Induktion der Abbaufähigkeiten dieser Mikroorganismen notwendig. Die aromatischen Verbindungen sind aber selbst Kontaminanten und weisen daher das Risiko der Verursachung einer sekundären Verschmutzung auf. Es ist daher eine große, für die praktische Anwendung zu lösende Herausforderung, Mikroorganismen zu erhalten, welche, im Fall der Zugabe, eine aromatische Verbindung komplett abbauen und zusammen mit dem Trichlorethylen entfernen, oder welche den Abbau von Trichlorethylen ohne die Zugabe einer aromatischen Verbindung ermöglichen.
Demgemäss war es erwünscht, um die biologische Reinigung von Trichlorethylen praktisch umzusetzen, einen Mikroorganismus zu erhalten, welcher eine hohe Abbaufähigkeit hat und welcher es ermöglicht, eine aromatische Verbindung, bei Zugabe vollständig abzubauen und zusammen mit Trichlorethylen zu entfernen, oder welcher den Abbau von Trichlorethylen ohne Zugabe einer aromatischen Verbindung ermöglicht.
Ferner ist es in vielen Fällen extrem schwierig, die Dichte an Mikroorganismen auf ein Niveau anzuheben, welches der erwünschten Behandlungskapazität entspricht, da die Dichte der dispergierten Mikroorganismen in dem Boden aufgrund ihrer Vertilgung durch Protozoen und durch die Konkurrenzwirkungen der autochthonen Mikroorganismen herabgesenkt wird. Um die Dichte zu erhöhen, werden Verfahren eingesetzt, wie etwa das Einpumpen von Luft und Nährstoffen unter Druck in den Boden. Doch trotz der erforderlichen enormen Energie ist es schwierig, die Bakteriendichte alleine durch derartige Mittel zu erhöhen, wobei die Abbaufähigkeit der Mikroorganismen auf einem geringen Niveau gehalten wird. Enorme Mengen an Energie für die Zufuhr von Nährstoffen, Belüftung usw. sind erforderlich, um eine hohe Bakteriendichte in einen geschlossenen System, wie etwa einen Reaktor, als auch in einem offenen System zu erhalten.
Wenn die Abbaufähigkeit pro Einheitsmenge der Bakterienmasse ansteigt, kann eine ausreichende Abbaufähigkeit selbst bei geringen Dichten der Bakterienmasse erhalten werden, wodurch folglich die Notwendigkeit der Zufuhr einer enormen Menge an Energie für die Aufrechterhaltung der Dichte der Bakterienmasse überwunden wird. Obwohl Mikroorganismen, welche Trichlorethylen abbauen, dies durch die Expression des zum Abbau derartiger Substanzen befähigten Enzyms durchführen, fordert eine derartige Enzymexpression einen Induktor. Es ist bereits bekannt, dass Mikroorganismen ihre Abbaufähigkeit durch Zugabe eines Induktors und in Kontakt bringen des Mikroorganismus mit dem Induktor während der Kultivierung ausbilden können, aber keine der vorhergehenden Untersuchungen konzentrierte sich auf die Dauer des Kontakts und dadurch auf die Verfahren zur Erhöhung der Abbaufähigkeit pro Einheitsmenge der Bakterienmasse.
Die biologische Vermehrung, welche das Ausbreitung von Trichlorethylen-abbauenden Mikroorganismen in den Boden umfasst, um den Abbau von Trichlorethylen usw. zu bewirken, ist derzeitig nicht sozial akzeptiert, da sie ein potentielles Risiko der Erzeugung von weitreichenden Wirkungen auf das Ökosystem durch Freisetzung eines spezifischen Mikroorganismus in die Umwelt aufweist. Aber das Aufsprühen eines Mikroorganismus, welcher vollständig die Vermehrungsaktivität durch eine Sterilisationsbehandlung verloren hat, ist äquivalent zu der Freisetzung von organischen Materialien und es wird daher angenommen, dass er nur eine geringe Wirkung auf das Ökosystem hat. In der Erfindung, welche in der geprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 8(1996)-3012 offenbart war, wurde behauptet, dass unerwünschte Wirkungen auf das Ökosystem durch das Zerstören der abbauenden Bakterien und das Aufsprühen von ihnen auf den Boden minimiert werden können. Aber es ist leicht abzusehen, dass das Aufbrechverfahren für diese Mirkoorganismen eine aufwendige Ausrüstung, eine Menge Zeit und Arbeit erfordert, und folglich wird das Aufsprühen einer großen Menge an abbauenden Bakterien auf den kontaminierten Boden tatsächlich sehr schwierig sein.
Die vorher erwähnte Erfindung zählt weiterhin die vorteilhaften Wirkungen auf, wobei behauptet wird, dass die aufgebrochenen Bakterien einfacher als die intakte Bakterienmasse in den Boden eindringen, aber diese Erfindung erwähnt nicht die Aufrechterhaltung der Abbaufähigkeit, die durch die aufgebrochenen Bakterien aufgewiesen wird. Überdies benötigt die bekannte Trichlorethylen-Oxidase NAD als ein Coenzym. Es würde aber extrem schwierig sein, das Coenzym in der für die Abbaureaktion des Enzyms notwendigen Konzentration zuzuführen, welches von der Bakterienmasse durch das Aufbrechen der Bakterien freigesetzt würde, da das Coenzym sehr teuer ist.
Chemical Abstracts, Vol. 124, Nr. 9, Abstract 109235 offenbart einen Stamm von Mycobacterium vaccae (JOB-5), welcher in der Lage ist, verschiedene organische Verbindungen, zum Beispiel Trichlorethylen (TCE), abzubauen.
In Chemical Abstract, Vol. 122, Nr. 22, Abstract 273088 wird ein Verfahren für den biologischen Abbau von TCE unter Verwendung von Mycobacterium vaccae JOB-5 beschrieben.
Chemical Abstracts, Vol. 122, Nr. 21, Abstract 260790 ist auf den biologischen Abbau von TCE durch Mycobacterium vaccae gerichtet.
EP-A-0 523 769 offenbart verschiedene gramm-positive alkaliphile Bakterien.
DE-A-196 47 847 ist auf Verfahren und Vorrichtungen für den Abbau von organischen Verbindungen als auch auf ein Verfahren für die Isolierung eines Mikroorganismus und den entsprechenden Mikroorganismus gerichtet.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Mikroorganismen, welche organische halogenierte Verbindungen, wie etwa Trichlorethylen, wirkungsvoller als die herkömmlich bekannten Mikroorganismen abbauen können und ein Verfahren für den Abbau organischer halogenierter Verbindungen unter Verwendung dieser Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein preiswertes Verfahren für die Minimierung der Wirkungen auf das Ökosystem zur Verfügung zu stellen, nachdem ein spezifischer Mikroorganismus in die Umwelt freigesetzt wurde.
Nach intensiven Studien zur Lösung der oben erwähnten Probleme haben die Erfinder erfolgreich einen neuen Mikroorganismus isoliert, welcher nicht zu einer der bekannten Gattungen von Mikroorganismen gehört, und welcher eine sehr hohe Fähigkeit für den Abbau von Trichlorethylen, verglichen mit den herkömmlich bekannten Mikroorganismen, hat und dadurch die vorliegende Erfindung abgeschlossen.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Bakterium zur Verfügung, welches die folgenden taxonomischen Eigenschaften hat: TABELLE 1

Morphologie	kokkenähnlich; stäbchenförmig
Gramfärbung	+
Sporenbildung	–
Beweglichkeit	–
Verhältnis zu Sauerstoff	aerob
Oxidasetest	–
Katalasetest	+
Säurefestigkeit	–
Stäbchen-Kokkenzyklus	+
Luftmycelbildung	–
Peptidglykanart der Zellwand	Meso-Diaminopimelinsäure
Glycolyltest	– (Acetyltyp)
Mycolsäure	–
GC-Gehalt der DNA (Mol-%)	73 (durch HPLC),

und welches Trichlorethylen abbauert kann, und der Stamm MO7 (FERM BP-5624) ist.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für den Abbau organischer halogenierter Verbindungen und/oder aromatischer Verbindung zur Verfügung, wobei das Verfahren die Einwirkung des Bakteriums auf die organischen halogenierten Verbindungen und/oder aromatischen Verbindungen umfasst. In diesem Fall ist es wichtig, das die organische halogenierte Verbindung Trichlorethylen und eine aromatische Verbindung bevorzugt Phenol ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für den Abbau organischer halogenierter Verbindungen im Boden, in Abwässern oder in anderen Abfallprodukten zur Verfügung, die organische halogenierte Verbindungen halten, wobei das Verfahren die Zugabe einer Kultur des Bakteriums zu dem Boden, den Abwässern oder den anderen Abfallsprodukten umfasst. Eine organische halogenierte Verbindung, welche in Bezug auf seine praktische Anwendung wichtig ist, ist Trichlorethylen.
Die hierin verwendete Bakterienkultur ist bevorzugt eine kultivierte Bakterienmasse. Die kultivierte Bakterienmasse kann eine lebende oder eine sterilisierte Bakterienmasse sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren für den Abbau von organischen halogenierten Verbindungen im Boden, in Abwässern oder anderen Abfallprodukten, die organische halogenierte Verbindungen enthalten, zur Verfügung, wobei das Verfahren das Beimpfen des erfindungsgemäßen Bakteriums in den Boden, die Abwässer oder die anderen Abfallprodukte, die Zugabe einer aromatischen Verbindung oder einer abbaubaren Kohlenstoffquelle oder einer Mischung davon zu dem Boden, den Abwässern oder den anderen Abfallprodukten, und anschließend die Kultivierung der beimpften Mikroorganismen umfasst. Die aromatische Verbindung, wie hierin verwendet, ist bevorzugt eine phenolische Verbindung, zum Beispiel Phenol, und die abbaubare Kohlenstoffquelle, wie hierin verwendet, ist bevorzugt ein Saccharid, zum Beispiel Glucose.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Abbaumittel für organische halogenierte Verbindungen und/oder aromatische Verbindungen zur Verfügung, wobei das Mittel die kultivierten Bakterienzellen des erfindungsgemäßen Bakteriums umfasst. Die kultivierte Bakterienmasse kann eine lebende Bakterienmasse oder eine sterilisierte Bakterienmasse sein. Die verwendete Sterilisationsbehandlung ist zum Beispiel eine Ultraviolettbestrahlung. Die in diesem Abbaumittel enthaltende Bakterienmasse ist hinsichtlich der Lagerung bevorzugt in der Form einer getrockneten oder gefrorenen Bakterienmasse.
KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 zeigt die Position des erfindungsgemäßen Stammes MO7 im phylogenetischen Stammbaum, konstruiert unter Verwendung des NJ-Verfahrens (proximale Konjugation).
Die 2 zeigt die Position des erfindungsgemäßen Stammes MO7 im phylogenetischen Stammbaum, konstruiert unter Verwendung des UPGMA-Verfahrens (mittlerer Abstand).
Die 3 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung der Ausgangskonzentrationen an Trichlorethylen auf die Abbauwirksamkeit zeigt, erhalten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Stammes MO7.
Die 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung der pH auf die Abbaueffizienz an Trichlorethylen (Ausgangskonzentration 30 ppm) zeigt, erhalten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Stammes MO7.
Die 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung der Temperatur auf die Abbaueffizienz an Trichlorethylen (Ausgangskonzentration 30 ppm) zeigt, erhalten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Stammes MO7.
Die 6 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung der Ausgangskonzentration an Trichlorethylen auf die Abbaueffizienz an Trichlorethylen (Ausgangskonzentration 30 ppm) zeigt, erhalten unter Verwendung von toten Bakterienzellen (sterilisiert mit ultravioletter Bestrahlung) des erfindungsgemäßen Stammes MO7 zeigt.
Die 7 ist eine graphische Darstellung, welche einen zeitlichen Verlauf der Restaktivität des Trichlorethylenabbaus unter Verwendung der sterilisierten (mit ultravioletter Bestrahlung) und nicht sterilisierten kultivierten Bakterienzellen des erfindungsgemäßen Stammes MO7 zeigt.
Die 8 ist eine graphische Darstellung, welche die Wachstumskurve (OD), den zeitlichen Verlauf des Phenolverbrauchs und die Abbaueffizienz an Trichlorethylen zeigt, wenn der erfindungsgemäße Stamm MO7 in einem Medium kultiviert wurde, das Phenol und Trichlorethylen enthält.
Die 9 ist eine graphische Darstellung, welche die Wachstumskurve (OD) und einen zeitlichen Verlauf des Phenolverbrauchs zeigt, wenn der erfindungsgemäße Stamm MO7 in einem Kulturmedium kultiviert wurde, das Phenol enthält.
10 ist eine graphische Darstellung, welche die spezifische Abbaueffizienz an Trichlorethylen pro Bakterienzellen zeigt (OD = 1,0) zeigt, wenn das Bakterium für verschiedene Zeiten in dem zeitlichen Verlauf, wie in 9 dargestellt, kultiviert wurde.
Die 11 ist eine graphische Darstellung, welche die Abbaueffizienz an Trichlorethylen pro Gesamtbakterienzellen zeigt, wenn das Bakterium für verschiedene Zeiten in dem zeitlichen Verlauf der Kultivierung, wie in 9 dargestellt, kultiviert wurde.
Die 12 ist eine graphische Darstellung, welche die Wachstumskurve (OD) und einen zeitlichen Verlauf des Phenolverbrauchs zeigt, wenn der erfindungsgemäße Stamm MO7 in einem Medium kultiviert wurde, das Phenol (500 ppm) enthält und dann weiterhin durch Zugabe von Phenol kultiviert wurde, wenn das Phenol vollständig verbraucht war.
Die 13 ist eine graphische Darstellung, welche die spezifische Abbaueffizienz an Trichlorethylen pro Bakterienzellen (OD=1,0) zeigt, wenn das Bakterium verschiedene Zeiten in dem zeitlichen Verlauf der Kultur wie in 12 dargestellt, kultiviert wurde.
Die 14 ist eine graphische Darstellung, welche die Abbaueffizienz an Trichlorethylen pro Gesamtbakterienzellen zeigt, wenn das Bakterium für verschiedene Zeiten in dem zeitlichen Verlauf der 12 kultiviert wurde.
Die 15 ist eine graphische Darstellung, welche das Verhältnis zwischen der Menge an Bakterienzellen und der Menge an abgebauten Trichlorethylen zeigt, wenn Trichlorethylen durch Zugabe der kultivierten Bakterienzellen des erfindungsgemäßen Stammes MO7 in den Trichlorethylen-haltigen Boden abgebaut wurde.
Die 16 ist eine graphische Darstellung, welche die Menge an abgebauten Trichlorethylen zeigt, wenn die kultivierten Bakterienzellen des erfindungsgemäßen Stammes MO7 bei einer Zugabe und bei zwei Zugaben zugegeben wurden.
Die 17 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Menge an beimpften Bakterienzellen und der Abbaueffizienz an Trichlorethylen bei verschiedenen Ausgangskonzentrationen an Trichlorethylen im Boden zeigt, wenn das Trichlorethylen durch Zugabe der kultivierten Bakterienmasse des erfindungsgemäßen Stammes MO7 abgebaut wurde.
Die 18 ist eine graphische Darstellung, welche einen zeitlichen Verlauf des restlichen Trichlorethylens im Boden zeigt, wenn Trichlorethylen durch Zugabe der kultivierten Bakterienzellen des erfindungsgemäßen Stamms MO7 zu dem Trichlorethylen-haltigen Boden abgebaut wurde.
Die 19 zeigt ein Flussdiagramm des analytischen Verfahrens für Vinylchlorid, 1,1-Dichlorethylen, cis-1,2-Dichlorethylen und trans-1,2-Dichlorethylen.
Die 20 zeigt ein Flussdiagramm des analytischen Verfahrens für Dichloracetat und Trichloracetat.
Die 21 zeigt ein Flussdiagramm des analytischen Verfahrens für Trichlorethanol.
Die 22 zeigt ein Flussdiagramm des analytischen Verfahrens für Chloralhydrat.
Die 23 ist eine graphische Darstellung, welche ein Ergebnis zeigt, wenn Trichlorethylen durch Zugabe der kultivierten Bakterienzellen des erfindungsgemäßen Stammes oder dessen sterilisierten Produkts zu dem Trichlorethylen-haltigen Boden abgebaut wurde.
Die 24 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung der Temperatur (20°C, 30°C) auf die Abbaueffizienz an Trichlorethylen zeigt, wenn Trichlorethylen durch Zugabe der kultivierten Bakterienzellen des erfindungsgemäßen Stammes MO7 zu dem Trichlorethylen-haltigen Boden abgebaut wurde.
Die 25 ist eine graphische Darstellung, welche ein Ergebnis zeigt, wenn Trichlorethylen durch die Zugabe einer kleinen Menge der kultivierten Bakterienzellen des erfindungsgemäßen Stammes MO7 und Zugabe eines Induktors (Phenol) zu dem Trichlorethylen-haltigen Boden abgebaut wurde.
Die 26 ist eine graphische Darstellung, welche ein Ergebnis zeigt, wenn Trichlorethylen durch Zugabe der kultivierten Bakterienmasse des erfindungsgemäßen Stammes MO7 oder des Stammes MO715, welche auf Glutaminsäure wachsen gelassen wurden, zu dem Trichlorethylen-haltigen Boden abgebaut wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Ein repräsentativer Bakterienstamm der vorliegenden Erfindung, der Stamm MO7, kann auf die folgende Art und Weise isoliert werden. Zum Beispiel wird eine isolierte Quelle, wie etwa Boden oder Aktivschlamm in einem Kulturmedium, das Phenol enthält, kultiviert, und die Mikroorganismen, welche sich darin vermehren, werden isoliert. Die Isolate werden nachfolgend in einem Trichlorethylen-haltigen Medium inkubiert, um die Mikroorganismen zu selektieren, welche die Fähigkeit zum Abbau von Trichlorethylen haben. Das Verfahren für die Isolierung von Mikroorganismen wird ausführlich in Beispiel 1 beschrieben.

Der derartig isolierte Stamm MO7 hat die folgenden taxonomischen Eigenschaften: TABELLE 2

Morphologie	kokkenähnlich; stäbchenförmig
Gramfärbung	+
Sporenbildung	–
Beweglichkeit	–
Verhältnis zu Sauerstoff	aerob
Oxidasetest	–
Katalasetest	+
Säurefestigkeit	–
Stäbchen-Kokkenzyklus	+
Luftmycelbildung	–
Peptidglykanart der Zellwand	Meso-Diaminopimelinsäure
Glycolyltest	– (Acetyltyp)
Mycolsäure	–
GC-Gehalt der DNA (Mol-l)	73 (durch HPLC)

Weiterhin hat der Stamm MO7 die folgenden Eigenschaften:

Farbe der Kolonien keine charakteristische Koloniefarbe gebildet

Dehnung der Zellen, die die Kolonie umgeben –

Arabinogalactan-Polymere der Zellwand – (#1)

#1: Abgeschätzt unter Verwendung eines Säurehydrolysats der Gesamtbakterienmasse
Die morphologischen und physiologischen Kennzeichen des Stammes MO7 wurden untersucht und die erhaltenen Ergebnisse sind in der vorherigen Tabelle 2 gezeigt. Auf der Grundlage der vorher beschriebenen Ergebnisse wurde die Identifizierung des Stamms mit Hilfe der Publikationen (N.R. Krieg und J.G. Holt, „Bergy's Manual of Systematic Bacteriology" Vol. 1 (1984), Williams und Wilkins; J.G. Holt, N.R. Krieg, P.H.A. Senath, J.T. Staley und S.T. Williams, „Bergy's Manual of Systematic Bacteriology" 9. Edition (1984), Williams und Wilkins) durchgeführt, mit dem Ergebnis, dass der isolierte Stamm MO7 mit keiner bekannten Gattung oder einer Art übereinstimmt. Ebenso wurde das 16S rRNS-Gen kloniert und seine Sequenz wurde mit denjenigen von bekannten Organismen verglichen um zu finden, dass der engste Verwandte dazu Terrabacter tumesces ist, wie in den 1 und 2 gezeigt. Jedoch hatte der Organismus eine Homologie von höchstens 95%, und folglich wurde geschlossen, dass der isolierte Stamm nicht zu dieser Gattung gehört. Es wurde daher bestätigt, dass der erfindungsgemäße Stamm eine neue Gattung ist, welche unterschiedlich von jedem bekannten Bakterium ist.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden organische halogenierte Verbindungen und/oder aromatische Verbindungen durch Einwirkung des erfindungsgemäßen Bakteriums auf die organischen halogenierten Verbindungen und/oder die aromatischen Verbindungen abgebaut. Die durch das erfindungsgemäße Bakterium abgebauten organischen halogenierten Verbindungen enthalten Trichlorethylen, Dichlorethylen, und Vinylchlorid. Vom praktischen Gesichtspunkt her ist Trichlorethylen am wichtigsten. Als die aromatischen Verbindungen werden hier phenolische Verbindungen erwähnt, zum Beispiel Phenol.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für den Abbau von organischen halogenierten Verbindungen im Boden, Abwässern, oder in anderen Abfallprodukten zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Zugabe der Kultur der erfindungsgemäßen Bakterien zu dem Boden, den Abwässern oder den anderen Abfallprodukten umfasst. Die Bakterienkultur, wie hierin verwendet, enthält die Kulturflüssigkeit selbst, erhalten durch Kultivierung des erfindungsgemäßen Bakteriums, eine aus dem Kulturmedium isolierte, kultivierte Bakterienmasse oder sterilisierte Bakterien in der Kulturflüssigkeit oder eine sterilisierte kultivierte Bakterienmasse, welche isoliert wurde.
Für die Kultivierung des erfindungsgemäßen Bakteriums kann jedes Kulturmedium verwendet werden, in welchem sich das Bakterium vermehrt. Das Kulturmedium kann eine Kohlenstoffquelle, wie etwa Glucose oder Saccharose, eine organische Stickstoffquelle, wie etwa Hefeextrakt, Pepton oder Fleischextrakt oder eine anorganische Stickstoffquelle, wie etwa ein Ammoniumsalz oder Nitrat, enthalten. Es können ferner anorganische Salze mit Kationen, wie etwa Kaliumionen, Natriumionen, Calciumionen, oder Magnesiumionen, und Anionen, wie etwa Chloridionen, Sulfationen oder Phosphationen enthalten. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle, obwohl sie in Abhängigkeit von den Arten variiert, ist in dem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1%, und die der Stickstoffquelle, obwohl sie in Abhängigkeit von den Arten schwankt, ist in dem Bereich von etwa 0,01 bis 1%. Und die der anorganischen Salze, obwohl sie in Abhängigkeit von den Arten schwankt, ist in dem Bereich von etwa 0,001 bis 0,1%.
Die Kultivierung wird bevorzugt durch eine aerobe Flüssigkultur durchgeführt. Die aeroben Bedingungen können durch herkömmliche Mittel, wie etwa Belüftung, Rühren, Belüftung und Rühren, oder Schütteln sichergestellt werden. Um die Abbaufähigkeit für die organischen halogenierten Verbindungen, wie etwa Trichlorethylen und die der aromatischen Verbindungen, wie etwa Phenol zu induzieren, wird bevorzugt eine aromatische Verbindung, wie etwa Phenol, zu dem Kulturmedium zugegeben. In diesem Fall kann eine aromatische Verbindung, wie etwa Phenol, zusätzlich zu der anderen Kohlenstoffquelle zugegeben werden oder eine aromatische Verbindung, wie etwa Phenol, kann als die einzige Kohlenstoffquelle zugegeben werden. Die Menge des dem Medium zugegebenen Phenols usw. ist bevorzugt im Bereich von etwa 100 ppm bis etwa 1000 ppm.
In einem Fall, in dem die erfindungsgemäßen Mikroorganismen in der Form einer Bakterienmasse verwendet werden, kann die Bakterienmasse durch ein herkömmliches Mittel zur Abtrennung von Bakterienzellen, wie etwa Zentrifugation, isoliert werden. Wenn die Bakterienmasse vor der Verwendung gelagert wird, kann sie in die Form einer gefrorenen oder getrockneten Bakterienmasse umgewandelt werden. In diesem Fall können herkömmliche Mittel für die Trocknung einer Bakterienmasse eingesetzt werden, wie etwa Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen. In der Praxis der vorliegenden Erfindung kann eine sterilisierte Kultur oder eine sterilisierte Bakterienmasse verwendet werden, um ihre Wirkung auf die Umwelt (die mikrobielle Phase) zu minimieren. Als ein Mittel für die Sterilisation für diesen Zweck kann ein herkömmliches Verfahren, wie etwa die Ultraviolettbestrahlung der lebenden Bakterienmasse, verwendet werden. Derartige sterilisierte Zellen oder Kulturen sind ebenfalls in dem Begriff „Kultur" eingeschlossen, wie in der vorliegenden Erfindung definiert.
Wenn die erfindungsgemäße Kultur zu dem zu behandelnden Gegenstand gegeben wird, ist sie bevorzugt eine lebende Bakterienmasse in einer Menge von 10⁶ bis 10⁹ Zellen/g des zu behandelnden Gegenstandes oder eine sterilisierte Bakterienmasse mit der entsprechenden Abbaufähigkeit von organischen halogenierten Verbindungen zuzugeben.
Als ein Mittel die erfindungsgemäßen Mikroorganismen auf eine organische halogenierte Verbindung, wie etwa Trichlorethylen, einwirken zu lassen, muss die erfindungsgemäße Kultur nur zu dem zu behandelnden Gegenstand gegeben oder mit ihm gemischt werden, um die in dem Feststoff, wie etwa dem Boden, oder der Flüssigkeit, wie etwa die Abwässer (hierin als der zu behandelnde Gegenstand bezeichnet) enthaltenen organischen halogenierten Verbindungen abzubauen.
In Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können organische halogenierte Verbindungen, wie etwa Trichlorethylen, enthalten in dem zu behandelnden Gegenstand, durch Beimpfen des zu behandelnden Gegenstand mit dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus, wie etwa dem Boden, den Abwässern oder den anderen Abfallprodukte, und anschließender Vermehrung des Organismus darin, abgebaut werden. Folglich stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren für den Abbau organischer halogenierter Verbindungen im Boden, in Abwässern oder in anderen Abfallprodukten zur Verfügung, die die organischen halogenierten Verbindungen enthalten, wobei das Verfahren das Beimpfen des Bodens, der Abwässer oder der anderen Abfallprodukte mit dem erfindungsgemäßen Bakterium, die Zugabe einer aromatischen Verbindung, einer abbaubaren Kohlenstoffquelle oder einer Mischung davon zu dem Boden, den Abwässern oder den anderen Abfallprodukten und anschließend die Kultivierung des beimpften Mikroorganismen umfasst.
In diesem Fall werden Saccharide, z.B. Glucose, als die abbaubare Kohlenstoffquelle bevorzugt. Die Menge einer derartigen Kohlenstoffquelle ist etwa 0,1 bis etwa 1%, relativ zu der Menge des zu behandelnden Gegenstandes. Ferner, wenn eine aromatische Verbindung zu dem zu behandelnden Gegenstand zugegeben wird, muss die aromatische Verbindung zugegeben werden. Als eine aromatische Verbindung können Phenol, Cresol und ähnliche verwendet werden. In diesem Fall, wenn die aromatische Verbindung, welche zugegeben wurde, nach dem Abbau derartiger organischer halogenierter Verbindungen verbleibt, wird sie eine weitere Umweltverschmutzung verursachen. Daher ist die Zugabe einer übermäßigen Menge der aromatischen Verbindung nicht erwünscht und die Menge der zuzugebenden aromatischen Verbindung ist, relativ zu dem zu behandelnden Gegenstand, bevorzugt etwa 100 bis etwa 500 ppm.
Die Erfinder haben gefunden, dass die erfindungsgemäße kultivierte Bakterienmasse, hergestellt wie vorher erwähnt, egal ob sie am Leben ist oder eine sterilisierte Bakterienmasse ist, die Fähigkeit zum Abbau organischer halogenierter Verbindungen und/oder aromatischer Verbindungen aufweist. Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für den Abbau organischer halogenierter Verbindungen und/oder aromatischer Verbindungen im Boden, Abwässern oder den anderen Abfallprodukten zur Verfügung, die organische halogenierte Verbindungen und/oder aromatische Verbindungen enthalten, in welchem die sterilisierte kultivierte Bakterienmasse eines Mikroorganismus, der organische halogenierte Verbindungen und/oder aromatische Verbindungen abbauen kann, zu dem Boden, den Abwässern oder anderen Abfallprodukten gegeben wird.
Die verwendeten Sterilisationsverfahren enthalten ultraviolette Bestrahlung bzw. Ultraviolettstrahlung, Ethylenoxidbehandlung, Bestrahlung und ähnliches. Das sterilisierte Produkt hat eine unerwartete Eigenschaft einer höheren Stabilität während der Lagerung mit Bezug auf die Abbaufähigkeit organischer halogenierter Verbindungen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Abbaumittel für organische halogenierte Verbindungen und/oder aromatische Verbindungen zur Verfügung, wobei das Mittel eine Kultur des erfindungsgemäßen Bakteriums umfasst. Die Kultur ist bevorzugt eine kultivierte Bakterienmasse, welche eine lebende Bakterienmasse oder eine sterilisierte Bakterienmasse sein kann. Die Sterilisationsbehandlung wird durch ultraviolette Bestrahlung, Ethylenoxidbehandlung, Bestrahlung oder ein anderes Verfahren, wie vorher beschrieben, durchgeführt. Vom Standpunkt der Lagerung usw. ist das Abbaumittel der vorliegenden Erfindung bevorzugt in der gefrorenen oder getrockneten Form, wobei dieses getrocknete Produkt gemäß einem herkömmlichen Verfahren, wie vorher erwähnt, erhalten werden kann.
Der Stamm MO715, eine repräsentative Mutante der vorliegenden Erfindung (hiernach als die konstitutive Mutante bezeichnet) welche keine aromatische Verbindung (wie etwa Phenol) für die Induktion der Aktivität des Trichlorethylenabbaus benötigt, kann wie folgt isoliert werden: Der Stamm MO7 wird durch die Wirkung von Ultraviolettstrahlung, Strahlung oder einer chemischen Substanz, wie etwa Nitrosoguanidin, welche eine mutagene Wirkung hat, mutiert und konstitutive Mutanten werden aus den resultierenden Mutanten selektiert. Das Verfahren der Isolation von Mikroorganismen wird ausführlich in Beispiel 18 beschrieben.
Die Kultivierung der konstitutiven Mutante der vorliegenden Erfindung kann in der gleichen Art und Weise wie für den Ausgangsstamm MO7 durchgeführt werden, außer dass die Kultivierung der ersteren nicht eine aromatische Verbindung für die Induktion der Abbaufähigkeit für Trichlorethylen erfordert. Die abbaubare Kohlenstoffquelle für die Kultivierung ist bevorzugt ein Saccharid, wie etwa Glucose, oder eine Aminosäure, wie etwa Glutaminsäure. Das Verfahren der Verwendung ist ebenfalls das gleiche wie für den Ausgangsstamm MO7, außer dass die Kultivierung des ersteren nicht eine aromatische Verbindung für die Induktion der Trichlorethylenabbaufähigkeit benötigt. Es sollte beachtet werden, dass in Bezug auf die Abbaufähigkeit für organische halogenierte Verbindungen die lebende Bakterienmasse oder ihre sterilisierte Bakterienmasse die gleiche Wirkung wie der Ausgangsstamm MO7 hat.
Der vorher erwähnte Mikroorganismus, der Stamm MO7, wurde am 12. August 1996 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, als FERM BP-5624 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags international hinterlegt. Und der vorher erwähnte Mikroorganismus, der Stamm MO715, wurde ebenfalls international am 24. April 1997 beim National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, als FERM BP-5928 gemäß den Bestimmung des Budapester Vertrags hinterlegt.
BEISPIELE
Die Erfindung wird mit Bezug auf die folgenden Beispiele einfacher verstanden werden; jedoch beabsichtigen diese Beispiele die Erfindung zu veranschaulichen und sind nicht so zu interpretieren, dass sie den Umfang der Erfindung begrenzen.
Beispiel 1 Isolation des MO7 Stamms als auch Klonierung und Sequenzierung von 16S rDNA davon
Die Mikroorganismen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung wurden aus Aktivschlamm, entnommen an der Abfallwasserverhandlungsanlage in der Aichi-Präfektur, Japan, in der folgenden Art und Weise isoliert. Ein 0,1 ml-Aliquot des gesammelten geernteten Aktivschlammes wurde in 6 ml des NMS-Medium mit 1$ (v/v) einer Vitaminlösung (ihre Zusammensetzung wird in der Tabelle 5 gezeigt) in ein 30 ml Gefäß beimpft, zu welchem 500 ppm Phenol gegeben wurde.
Das Gefäß wurde mit einem Butylgummiseptum verstöpselt und mit einer Aluminiumkappe versiegelt, welches dann bei 30°C unter Schütteln bei 160 U/min für eine Dauer von einigen Tagen bis etwa ein Dutzend Tagen kultiviert wurde. Die Kultur, in welcher die Trübung, selbst die leichteste Trübung, beobachtet wurde, wurde in das gleiche Medium überführt und nachfolgend unter Schütteln kultiviert. Die Passage wurde insgesamt viermal wiederholt. Nachdem die vierte Passage vorüber war, wurde das Kulturmedium entsprechend verdünnt und auf die Agarplatte hergestellt durch Zugabe von 1,5% Agar zu dem NYG-Medium (seine Zusammensetzung wird in der Tabelle 5 gezeigt) mit 500 ml Phenol, ausplattiert. Die auftretenden Kolonien wurden von der Agarplatte gepickt und inkubiert. Dieser Vorgang wurde verschiedene Male wiederholt, um die Mikroorganismen zu isolieren.

Zusätzlich zu dem vorher erwähnten NYG-Medium kann ein anderes Medium, wie etwa ein Nährmedium, verwendet werden nachdem die optimalen Bedingungen für die Kultivierung der Mikroorganismen ausgewählt wurden. TABELLE 3 NMS-Medium

Magnesiumsulfatheptahydrat	1,0 g
Calciumsulfatdihydrat	0,2 g
Kaliumnitrat	0,23 g
Ammoniumsulfat	0,65 g
Kaliumdihydrogenphosphat	0,272 g
Dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat	0,727 g
Spurenelementlösung	0,5 ml
Destilliertes Wasser	1 Liter

Die Spurenelementelösung

EDTA-Dinatriumdihydrat	500 mg
Eisen-(II)-sulfatheptahydrat	200 mg
Zink-sulfatheptahydrat	10 mg
Mangan-(II)-chloridtetrahydrat	3 mg
Borsäure	30 mg
Kobalt-(II)-chloridhexahydrat	20 mg
Nickel-(II)-chloridhexahydrat	2 mg
Natriummolybdändihydrat	3 mg
Destilliertes Wasser	1 Liter

*Die Spurenelementelösung wurde separat sterilisiert und zugegeben, nachdem die anderen Bestandteile sterilisiert waren. TABELLE 4 Vitaminlösung

Thiaminhydrochlroid	3 mg
p-Aminobenzoesäure	13 mg
Adenin	1000 mg
NAD	250 mg
Vitamin B12	10 mg
Thiamindiphosphat	100 mg
Destilliertes Wasser	1 Liter

TABELLE 5 NYG-Medium

Hefeextrakt	0,5 g
Glucose	0,18 g
NMS-Medium	1 Liter

Der isolierte Mikroorganismus wurden 10 ml des MNS-Medium mit 0,05 Hefeextrakt und 500 ppm Phenol in einem 18 cm Reagenzröhrchen durch Picken einer Kolonie von der Agarplatte für die Isolierung unter Verwendung einer Platinöse beimpft. Nach Kultivierung bei 30°C unter Schütteln bei 130 U/min für 5 Tage, wurde die Bakterienmasse durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten geerntet und dann in 4 ml des NMS-Mediums resuspendiert. Die Suspension der Bakterienmasse wurde in ein 20 ml-Gefäß gegeben und Trichlorethylen wurde in einer Menge zugegeben, dass es 30 ppm ausmachte, nachdem alle Bestandteile in der flüssigen Phase gleichzeitig gelöst waren. Das Gefäß wurde mit einem Teflonbeschichteten Butylgummiseptum zugestöpselt und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. Nach Kultivierung über Nacht bei 30°C wurde die Gasphase in dem Gefäß durch einen Gaschromatographen, ausgestattet mit einem FID- oder einem ECD-Detektor, analysiert.
Bei den erhaltenen Ergebnissen wurde ein Bakterienstamm mit einer hohen Trichlorethylenabbaufähigkeit selektiert und hinsichtlich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften charakterisiert, um die Ergebnisse, wie in der Tabelle 2 gezeigt, zu erhalten.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde die Identifizierung mit Bezug auf die Veröffentlichung (N.R. Krieg und J.G. Holt, „Bergy's Manual of Systematic Bacteriology" Vol. 1 (1984) Williams und Wilkins, und J.G. Holt, N.R. Krieg, P.H.A. Senath, J.T. Stanley und S.T. Williams, „Bergy's Manual of Determinative Bacteriology" 9. Edition (1984) Williams und Wilkins), um zu finden, dass dieser Bakterienstamm zu keiner der bekannten Gattungen oder Arten gehört. Der Bakterienstamm wurde als der MO7 Stamm bezeichnet und am 12. August 1996 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, als FERM BP-5624 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags international hinterlegt.
Überdies wurde die Sequenz der 16S rDNA des erfindungsgemäßen Mikroorganismus bestimmt und mit der bekannter Mikroorganismen verglichen. Die Ergebnisse werden im Folgenden dargestellt.
Die 16S rDNR des erfindungsgemäßen Mikroorganismus wurde unter Verwendung der PCR gemäß dem Verfahren von Hiraishi (Journal of Japanese Society for Microbiological Ecology, vol. 10 (1): 31–42, 1995) amplifiziert. Die für die PCR verwendeten Primer hatten die Basensequenz: 5'-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3' (SEQ ID Nr. 1), und 5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CGG CAG GTT-3' (SEQ ID Nr. 2). Die PCR wurde unter Verwendung eines thermischen Zyklers (Perkin Elmer) gemäß dem folgenden Programm durchgeführt: d.h. Vorwärmen auf 90°C für 30 Sekunden, 30 Zyklen bei 96°C für 60 Sekunden/55°C für 120 Sekunden/72°C für 180 Sekunden und Erwärmen auf 72°C für 300 Sekunden.
Das amplifizierte PCR-Fragment wurde unter Verwendung von QIAquick (Quiagen) gereinigt und durch ein Verfahren sequenziert, welches eine PCR direkt als Matrize verwendet, gemäß dem Verfahren von Hiraishi (Journal of Japanese Society for Microbiological Ecology, vol. 10 (2): 81-102, 1995). Die für die Sequenzreaktion verwendeten Primer hatten die Basensequenz: 5'-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3' (SEQ ID Nr. 1), 5'-GGC CGG ACG GGT GAG T-3' (SEQ ID Nr. 3), 5'-TAC GGG AGG CAG CAG-3' (SEQ ID Nr. 4), 5'-CTG CCA GCA GCC GCG CG-3' (SEQ ID Nr. 5), 5'-G ATT AGA TAC CCT GGT AG-3' (SEQ ID Nr. 6), 5'-ACT CAA AGG AAT TGA CGG-3' (SEQ ID Nr. 7), 5'-GCA ACG AGC GCA ACC C-3' (SEQ ID Nr. 8), oder 5'-TGT ACA CAC CGC CCG T-3' (SEQ ID Nr. 9). Die PCR wurde unter Verwendung des Dye terminator cycle sequencing kit (Perkin Elmer) gemäß dem in dem Kit angewiesenen Protokoll durchgeführt. Die sequenzierten Proben wurden einer Elektrophorese und Sequenzanalyse unter Verwendung des ABI373A-Sequenzers (Perkin Elmer) unterzogen. Durch diese Vorgehen erhaltene Basensequenz der 16S rDNA des erfindungsgemäßen Mikroorganismus wird in der Tabelle 6 (SEQ ID Nr. 10) gezeigt.
TABELLE 6
Die derartig erhaltene Basensequenz wurde mit den Daten in der DNA-Datenbank des National Institute of Heredity (DDBJ+DDBJ NEW) verglichen. Die Suche nach homologen Bakterienstämme wurde unter Verwendung des Programms „Blast" mit Standardwerten durchgeführt, und zunächst wurden 50 Arten ausgewählt, welche die höchste Homologie hatten. Von ihnen wurde der Bakterienstamm (Gattung Mycobacterium, welcher die Eigenschaft hat Mycolsäure zu produzieren), von denen angenommen wurde, dass sie bestimmt unterschiedlich von den Ergebnissen der physiologischen taxonomischen Untersuchung sind, ausgeschlossen. Dann wurde die multiple Abgleichanalyse mit dem Rest der Bakterienstämme und den Typstämmen der Gattungen, von denen gedacht wurde, dass sie am engsten verwandt sind, durchgeführt.
Aus den erhaltenen Ergebnissen wurde ein phylogenetischer Baum unter Verwendung des NJ- (proximale Konjugation) Verfahren (1) oder dem UPGMA(mittlerer Abstand) Verfahren (2) durchgeführt (die Abgleichung wurde durchgeführt, nachdem die Sequenzen am 5'-Ende ausgerichtet wurden). Als der am engsten verwandte Organismus stellte sich Terrabacter tumescens heraus (der phylogenetische Baum enthält Mycobacterium sedimentalis als Bezug). Die am engsten verwandten Bakterienstämme (Mikroorganismen, die zu dem gleichen Cluster gehörten) wurden abermals einer Homologiesuche unter Verwendung von Gentryx-Mac 8.0 unterzogen. Aber die Homologie zu dem Gen des engsten Verwandten Terrabacter tumescens war bis zu 95%, und er wurde als nicht die gleiche Gattung bewertet. Daher wurde bestätigt, dass der erfindungsgemäße Mikroorganismus ein neuer Mikroorganismus ist, der sich von jedem bekannten Mikroorganismus unterscheidet.
Der Mikroorganismus baut etwa 50% Trichlorethylen bei hohen Konzentrationen von etwa 100 ppm in dem Kulturmedium ab, und baut vollständig etwa 30 ppm Trichlorethylen in 24 Stunden ab. Um Trichlorethylen in Verbindung mit der Vermehrung des Mikroorganismus abzubauen ist es notwendig, wenigstens eine aromatische Verbindung, wie etwa Phenol, dem Trichlorethylen-haltigen Kulturmedium (Medium, Boden, Wasser usw.) zuzugeben.
Der Mikroorganismus für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird ausführlicher mit Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 2
100 ml des NMS-Mediums mit 0,05 Hefeextrakt und 500 ppm Phenol enthalten in einem 500 ml Erlenmeyerkolben wurde mit einer Platinöse voll der Kolonie des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, der durch Passage auf der Agarplatte mit 1,5% Agar zugegeben zu dem NYG-Medium mit 500 ppm Phenol gelagert wurde, oder 1,0 ml der Vorkulturflüssigkeit, erhalten durch die über Nacht Kultivierung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus in dem NYG-Medium mit 500 ppm Phenol bei 30°C unter Schütteln, beimpft. Nach Kultivierung unter Schütteln bei 30°C bei 130 U/min für 3 Tage wurde die Bakterienmasse durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten geerntet und dann in NMS-Medium in einer gleichen Menge wie das Kulturmedium resuspendiert.
Die OD₆₀₀ der Suspension war 0,5 (die Zellzählung ergab 1 × 10⁹ KBE/ml). 4 ml der Suspension der Bakterienmasse wurde in einem 20 ml Gefäß gegeben und Trichlorethylen wurde dazu in einer derartigen Menge gegeben, dass es 10, 50 oder 30 ppm ausmachte, nachdem alle Bestandteile in der flüssigen Phase gelöst waren. Das Gefäß wurde mit einem Teflon-beschichteten Butylgummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. Nach Kultivierung über Nacht bei 30°C unter Schütteln wurde die Gasphase in dem Gefäß regelmäßig durch einen Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert.
Das Ergebnis wird in der 3 gezeigt. Der vorliegende Mikroorganismus baute Trichlorethylen vollständig in 24 Stunden ab. Trichlorethylen in hohen Konzentrationen von 50 ppm und 100 ppm wurde zu 70% bzw. 50% in 24 Stunden abgebaut. Selbst wenn die Ausgangskonzentration an Trichlorethylen bis zu 50 und 100 ppm war, war die Menge an abgebautem Trichlorethylen durch den vorliegenden Mikroorganismus nicht reduziert verglichen zu der, wenn die Ausgangskonzentration an Trichlorethylen 30 ppm war, was anzeigt, dass der vorliegende Mikroorganismus resistent gegenüber Abbauhemmung ist, selbst in der Anwesenheit einer hohen Konzentration an Trichlorethylen. Da es keine Berichte gibt, die beweisen, dass eine Konzentration von bis zu 100 ppm Trichlorethylen durch einen Mikroorganismus abgebaut wurde, wird angenommen, dass die Abbaufähigkeit des vorliegenden Mikroorganismus extrem hoch ist.
Beispiel 3
Die durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 kultivierte Bakterienmasse wurde durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten geerntet und dann jeweils in M9-Medium (Na₂HPO₄·7H₂O 12, 8 g/l, KH₂PO₄ 3 g/l, NaCl 0, 5 g/l, NH₄Cl 1,0 g/l), hergestellt mit variierendem pH in einer Menge gleich zu jener der Kulturflüssigkeit resuspendiert. 4 ml der Suspension der Bakterienmasse wurde in 20 ml Gefäß gegeben und Trichlorethylen wurde in einer derartigen Menge dazugegeben, dass es 30 ppm ausmachte, nachdem alle Bestandteile in der flüssigen Phase gelöst waren. Das Gefäß wurde mit einem Teflonbeschichteten Butylgummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. Nach Kultivierung über Nacht bei 30°C unter Schütteln wurde die Gasphase in dem Gefäß regelmäßig durch einen Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert. Wie in der 4 gezeigt, zeigt das Ergebnis an, dass bei einem pH 5 oder niedriger die Aktivität extrem nachlässt, während bei pH 6 bis 9 die Effizienz des Abbaus etwa 100% war und die Aktivität sehr langsam bis etwa 90%, selbst bei pH 10 abnahm.
Folglich stellte sich heraus, dass der optimale pH des Trichlorethylenabbaus durch eine ruhende Bakterienmasse des MO7 Stamms zwischen 6 und 9 ist, was anzeigt, dass eine hohe Abbauaktivität unter Bedingungen eines hohen pH aufgewiesen werden. Trichlorethylenoxid, hergestellt durch aeroben Abbau von Trichlorethylen, zersetzt sich spontan in einer alkalischen Umgebung, was unschädliche Glyoxylsäure usw. ergibt. Andererseits wird sie in einer sauren Bedingung spontan abgebaut, und erzeugt Halosäure. Demgemäss erfolgt der aerobe Abbau von Trichlorethylen durch einen Mikroorganismus bevorzugt in einer alkalischen Umgebung. Der vorliegende Mikroorganismus ist sehr nützlich für den Abbau von Trichlorethylen in einer alkalischen Umgebung, da er eine hohe Abbauaktivität bei Bedingungen eines hohen pH aufweist.
Beispiel 4
Die Bakterienmasse, kultiviert durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2, wurde durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten geerntet und dann in dem gleichen Volumen des NMS-Medium wie jenes der Kulturflüssigkeit resuspendiert. 4 ml der Suspension der Bakterienmasse wurde in ein 20 ml Gefäß gegeben und Trichlorethylen wurde in einer derartigen Menge dazugegeben, dass es 30 ppm nach Lösung aller Bestandteile in der flüssigen Phase ausmachte. Das Gefäß wurde mit einem Teflon-beschichteten Butylgummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. Es wurde unter Schütteln in einem Inkubator jeweils bei einer verschieden eingestellten Temperatur kultiviert. Die Restkonzentration an Trichlorethylen wurde regelmäßig durch Analyse der Gasphase in dem Gefäß mit einem Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert.
Wie in der 5 gezeigt, zeigt das Ergebnis an, dass der Abbau von Trichlorethylen langsamer über 7 Tage bei 4°C ablief. Bei 37°C unterblieb der Abbau in einem Tag und die Abbaueffizienz war gering. Auf der anderen Seite wurden 80 bis 90% an einem Tag bei 20°C und 30°C abgebaut. Die Abbauaktivität war bei 20°C aber etwa 10% höher als bei 30°C. Die Temperatur des Bodens, wo die Kontamination durch Trichlorethylen usw. ein Problem verursacht, ist den Angabe gemäß stabil bei 15 bis 20°C.
Jedoch wurde in den meisten Berichten über Trichlorethylen-abbauende Mikroorganismen die Abbauaktivität bei 30°C beurteilt, welches höher als die Bodentemperatur ist, und nur sehr wenige Studien haben gezeigt, dass die Abbauaktivität bei der gleichen Temperatur wie jene der Bodenumgebung in einem gleichen Grad erhalten bleibt, wie bei jener der Beurteilungsexperimente.
Da die Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion, die die Grundreaktion des mikrobiellen Abbaus darstellt, gewöhnlich bei einer Temperaturreduktion von 10°C um die Hälfte fällt, wird angenommen, dass die Abbaurate an Trichlorethylen durch einen Mikroorganismus im Boden bei einer geringeren Temperatur als die des Beurteilungsexperiments reduziert ist. Es wurde gezeigt, dass der vorliegende Mikroorganismus einen hohen praktische Nutzen hat, ohne eine Reduktion in der Abbauaktivität bei der gleichen Temperatur wie in der Bodenumgebung zu zeigen, obwohl der Mechanismus davon unbekannt ist.
Beispiel 5
Die Bakterienmasse, kultiviert in dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2, wurde durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten geerntet und dann in dem gleichen Volumen an NMS-Medium wie das der Kulturflüssigkeit suspendiert. Die Suspension der Bakterienmasse wurde auf eine Petrischale gegeben und in einer Dicke von etwa 1 mm ausgebreitet und dann einer Bestrahlung von einer 15 W Ultraviolettlampe mit einer Wellenlänge von 260 nm für nicht weniger als 60 Sekunden bei einem Abstand von 40 cm von der Lichtquelle sterilisiert. 4 ml der Suspension der Bakterienmasse nach Sterilisation wurde in ein 20 ml Gefäß gegeben und Trichlorethylen wurde in einer derartigen Menge dazugegeben, dass es 30 ppm ausmachte, nachdem alle Bestandteile in der flüssigen Phase gelöst waren. Das Gefäß wurde mit einem Teflon-beschichteten Butylgummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. Es wurde bei 30°C unter Schütteln kultiviert und die Gasphase in dem Gefäß wurde regelmäßig mit einem Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert.
Wie in der 6 gezeigt, zeigen die Ergebnisse, dass die Bakterienmasse nach Sterilisation 80% oder mehr der Trichlorethylenabbauaktivität des lebenden Bakteriums behielt. Überdies wurde in einem Experiment, in welchem die Suspension der sterilisierten Bakterienmasse in einer Menge von 1/100 des NYG-Medium beimpft oder die Suspension wie sie war auf dem NYG-Agarmedium ausplattiert und bei 30°C kultiviert wurde, weder ein Anstieg in der Trübung der Kulturflüssigkeit noch eine Koloniebildung beobachtet, und dadurch wurde bestätigt, dass es eine vollständige Sterilisation war.
Die restliche Aktivität der bei 4°C gelagerten Suspension der Bakterienmasse war nahezu die gleiche wie die der lebenden Bakterienmasse nach 3 Tagen Lagerung, und die Suspension hat eine viel höhere Aktivität als die lebende Bakterienmasse nach 7 Tagen Lagerung. Die Ergebnisse zeigen, dass obwohl die Ausgangsaktivität der toten Bakterienmasse auf 80% der lebenden Bakterienmasse gesunken ist, während der Lagerung eine höhere Trichlorethylenabbauaktivität als jene der lebenden Bakterienmasse aufgrund einer geringeren Reduktion in der Aktivität der toten Bakterienmasse erhalten bleibt.
Durch Sterilisation eines Mikroorganismus ohne Zerstörung der begrenzenden Struktur, wie etwa der Zellwand einer Bakterienmasse zu der extrazellulären Umgebung, ist es möglich Coenzyme usw. zu erhalten, welche für die Abbaureaktion von Trichlorethylen bei Konzentrationen notwendig für die Expression einer enzymatischen Aktivität erforderlich sind. Folglich ist die Zufuhr von Coenzymen für die Aufrechterhaltung der Trichlorethylenabbauaktivität nicht notwendig und nur die Ausbreitung der kultivierten Bakterienmasse ist nötig. Es ist daher möglich die Reinigung von Trichlorethylen usw. bei geringen Kosten mit einem minimalen Effekt auf das Ökosystem durchzuführen.
Beispiel 6

Zu 4 ml des PH-Mediums (siehe Tabelle 8 für seine Zusammensetzung), das 0,05 Hefeextrakt und 500 ppm Phenol in einem 20 ml Gefäß enthält, wurde der vorliegende Mikroorganismus durch Picken einer Platinöse voll der Kolonie des vorliegenden Mikroorganismus von der Agarplatte, hergestellt durch Zugabe von 1,5% Agar zu dem NYG-Medium mit 500 ppm Phenol beimpft, oder durch Beimpfen mit 0,04 ml (die Zellzahl war 10⁶ Zellen/ml) der Vorkulturflüssigkeit, erhalten durch Kultivierung des vorliegenden Mikroorganismus in dem NYG-Medium mit 500 m Phenol bei 30°C über Nacht unter Schütteln. TABELLE 7 PH-Medium

Magnesiumsulfatheptahydrat	0,2 g
Calciumsulfat	0,1 g
Eisenchloridhexahydrat	0,02 g
Dikaliumhydrogenphosphat	1,0 g
Ammoniumsulfat	1,0 g
Natriumchlorid	0,1 g
Destilliertes Wasser	1 Liter

Trichlorethylen wurde gleichzeitig mit dem Beimpfen in einer derartigen Menge, dass es 30 ppm ausmachte, nachdem alle Bestandteile in der flüssigen Phase gelöst waren, zugegeben und 500 ppm Phenol wurden zugegeben. Das Gefäß wurde mit einem Teflon-beschichteten Butylgummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. Es wurde unter Schütteln bei 30°C kultiviert und die Trichlorethylenkonzentration wurde regelmäßig durch Analyse der Gasphase in dem Gefäß mit einem Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert. Die Phenolkonzentration wurde durch Filtration der Kulturflüssigkeit über einen 0,45 μ-Filter und nacheinander Zugabe von 0,1 ml einer wässrigen Lösung an K₃Fe(CN)₆/0,1 M Glycin und 1 ml einer wässrigen Lösung von 4-Aminoantipyrin zu 1 ml des resultierenden Filtrats bestimmt, welche dann gemischt und bei einer Extinktion von 505 nm gemessen wurde.
Das in der 8 gezeigte Ergebnis zeigt an, dass mit der Vermehrung der Bakterienmasse Phenol und Trichlorethylen abnehmen und sie 31 Stunden nach Kultivierung vollständig abgebaut waren. Es wurde daher bestätigt, dass der vorliegende Mikroorganismus eine hohe Trichlorethylenabbauaktivität hat, wenn er in der Anwesenheit einer aromatischen Verbindung, wie etwa Phenol, abgebaut wird, die die Fähigkeit hat, Trichlorethylen zu induzieren. Bei Vergleich mit bekannten Mikroorganismen beziehen sich alle Berichte auf den Abbau von Trichlorethylen bei einer geringen Konzentration von bis zu 10 ppm, außer jenem Bericht, dass Pseudomonas cepacia KK01 30 ppm Trichlorethylen zu 15 ppm in 2 Tagen abbaut, und jener Bericht, dass Alcaligenes eutropus KS01 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 7(1995)-123976) 50 und 25 ppm Trichlorethylen in 4 Tagen vollständig abbaut.
Beim Abbau von Trichlorethylen durch Alcaligenes eutropus KSO1 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 7(1995)-123976) ist die Menge des in das Kulturmedium beimpften Mikroorganismus 10⁸ Zellen/ml, was etwa das 100fache der des in Beispiel 6 beschriebenen, vorliegenden Mikroorganismus ist. Die Menge der für den Trichlorethylenabbau erforderlichen Bakterienmasse des erfindungsgemäßen Mikroorganismus ist sehr viel geringer als die von Alcaligenes eutropus KS01. Daher hat er den Vorteil, dass die Kosten für die Kultivierung usw. reduziert sind. Es wurde ebenfalls bestätigt, dass das zugegebene und gemischte Phenol unterhalb der Nachweisgrenze abgebaut wurde, wodurch es ein geringes Risiko für die Umweltverschmutzung durch Phenol gibt, welches ein Umweltschadstoff ist.
Die Erfinder konzentrierten sich auf und untersuchten das Kultivierungsverfahren vor dem Beimpfen, um die Abbauaktivität eines Mikroorganismus zu erhöhen, welcher die Fähigkeit hat Trichlorethylen im Boden abzubauen, um dadurch einen Mikroorganismus zu erzeugen, welcher eine Abbauaktivität hat, die mit einer Verschmutzung in hohen Konzentrationen fertig wird. Als ein Ergebnis haben wir entdeckt, dass es einen optimalen Wert der Kultivierungszeit des Mikroorganismus vor dem Beimpfen gibt, und dass die Aktivität des Trichlorethylenabbaus durch sequenzielle Zugabe eines Induktors zu dem Kulturmedium erhöht werden kann, und wir vervollständigten die vorliegende Erfindung. Die vorliegende Erfindung wird nun vollständiger mit Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 7
In 100 ml des PH-Mediums mit 0,05 Hefeextrakt und 500 ppm Phenol, enthalten in einem 500 ml Erlenmeyer Kolben, wurde eine Platinöse voll der Kolonie des erfindungsgemäßen Mikroorganismus, welcher durch Passage auf der Agarplatte mit 1,5% Agar, zugegeben zu dem NYG-Medium mit 500 ppm Phenol, gelagert wurde, oder 1,0 ml der Vorkulturflüssigkeit, erhalten durch Kultivierung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus in dem NYG-Medium mit 500 ppm Phenol bei 30°C über Nacht unter Schütteln, beimpft. Während der Kultivierung unter Schütteln bei 30°C bei 130 U/min wurde die Trübung der Kulturflüssigkeit und die Phenolkonzentration mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 6 bestimmt. Die Bakterienmasse in der Kultur wurde durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten geerntet und dann in dem NMS-Medium mit einer Menge gleich dem Kulturmedium resuspendiert. Die OD₆₀₀ der Suspension war 0,2 (die Zellzahl ergab 1 × 10⁸ KBE/ml).
Die Suspension der Bakterienmasse wurde in ein 20 ml Gefäß gegeben und Trichlorethylen wurde dazu in einer Menge gegeben, dass es 30 ppm ausmachte, wenn alle Bestandteile in der flüssigen Phase gelöst waren. Das Gefäß wurde mit einem Teflon-beschichteten Butylgummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. Nach Kultivierung bei 30°C unter Schütteln für 24 Stunden wurde die Gasphase in dem Gefäß durch einen Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert. Die Ergebnisse sind in 9 bis 11 gezeigt. Die Liniengrafik in der 9 stellt die Trübung der Kulturflüssigkeit und die Phenolkonzentration dar. Die Säulengrafiken in der 10 stellen die Abbauaktivität pro Einheitsmenge der Bakterienmasse (spezifische Aktivität) der erfindungsgemäßen Mikroorganismus, geerntet zu der entsprechenden Kultivierungszeit, dar. Die Säulengrafiken in der 11 stellen die Abbauaktivität pro Einheitsmenge der Kulturflüssigkeit (die Gesamtaktivität) des erfindungsgemäßen Mikroorganismus dar, welcher zu den entsprechenden Kultivierungszeiten geerntet wurde.
Bei den vorher erhaltenen Ergebnissen über die Aktivität des Trichlorethylenabbaus steigt die spezifische Aktivität bemerkenswert von der Induktionsphase zu der logarithmischen Wachstumsphase an, und pendelt sich danach auf einem bestimmten Niveau ein. Aber sie nimmt schrittweise ab, nachdem das verbleibende Phenol null wurde. Jedoch blieb die Gesamtaktivität auf ihrem höchsten Wert in der stationären Phase, wenn die Phenolkonzentration etwa null wurde. Diese Beobachtungen haben gezeigt, dass eine Bakterienmasse mit einer hohen Aktivität an Trichloretyhlenabbau durch Kultivierung erhalten werden kann, während die Trübung der Kulturflüssigkeit und die Phenolkonzentration vor dem Beimpfen des Bodens beobachtet wird, und die Kultur zum Zeitpunkt wo der Anstieg in der Trübung aufhört, um die stationäre Phase zu beginnen und die Phenolkonzentration nahezu null wird, beendet wird.
Beispiel 8
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde in einer ähnlichen Art und Weise wie in Beispiel 7 kultiviert und die Trübung der Kulturflüssigkeit und die Phenolkonzentration wurden in einer ähnlichen Art und Weise wie im Beispiel 6 gemessen. Ferner wurden, wenn die Phenolkonzentration in der Mitte der Kultivierung null erreichte, wieder 500 ppm Phenol zugegeben und die Kultur wurde fortgesetzt. Die Bakterienmasse in der Kultur wurde durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten geerntet und dann in dem NMS-Medium mit einer Menge gleich jener des Kulturmediums resuspendiert.
Die OD₆₀₀ der Suspension war 0,2 (die Zellzählung ergab 2,5 × 10⁸ KBE/ml). Die Suspension der Bakterienmasse wurde in ein 20 ml Gefäß gegeben und Trichlorethylen wurde in einer Menge dazugegeben, dass es 30 ppm ausmachte, wenn alle Bestandteile in der flüssigen Phase gelöst waren. Das Gefäß wurde mit einem Teflonbeschichteten Butylgummistopfen verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. Nach Kultivierung bei 30°C unter Schütteln für 29 Stunden wurde die Gasphase in dem Gefäß durch einen Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert.
Die Ergebnisse werden in den 12 bis 14 gezeigt. Die Liniengrafiken in 12 stellen die Trübung der Kulturflüssigkeit und die Phenolkonzentration im Kulturstadium vor der Ernte dar. Die Säulengrafiken in der 13 stellen die spezifische Aktivität des erfindungsgemäßen Mikroorganismus dar, welcher zu den entsprechenden Kulturzeiten geerntet wurde. Die Säulengrafiken in der 14 stellen die Gesamtaktivität des erfindungsgemäßen Mikroorganismus dar, welcher zu den entsprechenden Kultivierungszeiten geerntet wurde. Wenn 500 ppm Phenol nach 45 Stunden Kultivierung zu der Kulturflüssigkeit gegeben wurde, wenn das restliche Phenol nahezu null war, nahm die Phenolkonzentration wieder ab und die Trübung der Kulturflüssigkeit stieg an. Daher wurde Phenol wieder nach 69 Stunden hinzugegeben, aber weder ein Anstieg in der Trübung der Kulturflüssigkeit noch eine Abnahme in der Phenolkonzentration wurde beobachtet.
Mit Blick auf die Trichlorethylenabbauaktivität wurden höchste spezifische Aktivitäten erhalten, wenn, wie in der 13 gezeigt, ausreichend Phenol etwa um die stationäre Phase während 41 Stunden bis 60 Stunden vorhanden ist, aber die spezifische Aktivität nahm danach ab, wenn die Phenolkonzentration abnahm. Wenn Phenol nach 93 Stunden zugegeben wurde, nahm sowohl die Menge der Bakterienmasse als auch die spezifische Aktivität ab. Jedoch war während des Zeitraums von 93 Stunden bis 114 Stunden, wenn es restliches Phenol gab, die spezifische Aktivität höher als während 45 Stunden bis 69 Stunden, wenn das meiste Phenol abgebaut wurde. Auf der anderen Seite, war die Gesamtaktivität am höchsten bei 60 Stunden, wenn sowohl die Menge der Bakterienmasse und die spezifische Aktivität hoch war, wobei eine 2,5-fach höhere Gesamtaktivität zur Verfügung gestellt wurde als wenn Phenol nur zum Start der Kultivierung zugegeben wird.
Als nächstes wird der Trichlorethylenabbau im Boden mit Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 9
Zu einem 100 ml Gefäß wurden 30 g sandiger Boden (luftgetrocknet) gegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen kontaminiert war. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für 3 Tage in 1,5 ml, 4,5 ml, 7,5 ml, 15 ml oder 30 ml NMS-Medium, zu welchem 500 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt gegeben wurden, kultiviert, und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer angemessenen Menge des NMS-Mediums resuspendiert wurden, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25% nach Zugabe der Suspension der Bakterienmasse war. Nach Zugabe der Suspension (die kein Phenol enthielt) der Bakterienmasse zu dem Boden wurde das Gefäß mit einem Teflon-beschichteten Gummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt und dann bei 30°C über einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen.
Danach wurde zu einem Gefäß, das 30 g des Bodens enthielt, 50 ml entionisiertes Wasser, belüftet mit der Luft, welche durch Aktivkohle geführt wurde, und 10 ml n-Hexan gegeben, und dann wurde das Gefäß versiegelt. Das Gefäß wurde mit einer Ultraschallwaschvorrichtung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und dann in einem Schüttler für 10 Minuten geschüttelt. Das abgetrennte n-Hexan wurde unter Verwendung eines Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert. Das Ergebnis, wie in der 15 gezeigt, zeigt an, dass der Trichlorethylenabbau und die Dichte der Bakterienmasse miteinander korrelierten bis die Dichte der Bakterienmasse 2,5 × 10⁸ KBE/g feuchter Boden (15 ml der Kulturflüssigkeit) erreichte, aber er wurde bei etwa 5 × 10⁸ KBE/g feuchter Boden (30 ml der Kulturflüssigkeit) gesättigt. Daher wurde gezeigt, dass die Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus' zum Abbau von Trichlorethylen, eine Dichte der Bakterienmasse von etwa 2,5 × 10⁸ KBE/g feuchter Boden am besten geeignet ist, und dass der erfindungsgemäße Mikroorganismus Eigenschaften hat, welche die Abschätzung einer minimalen Menge Bakterienmasse ermöglicht, die für die Reinigung einer gegebenen Konzentration eines Kontaminanten im Boden erforderlich ist.
Beispiel 10
Zu einem 100 ml Gefäß wurden 30 g sandiger Boden (luftgetrocknet) gegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen kontaminiert war. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für 3 Tage in 7,5 ml NMS-Medium, zu welchem 500 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt gegeben wurde, kultiviert, und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche dann in einer geeigneten Menge des NMS-Medium resuspendiert wurden, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25% nach Zugabe der Suspension der Bakterienmasse war. Nach Zugabe der Suspension (die kein Phenol enthielt) der Bakterienmasse zu dem Boden, wurde das Gefäß mit einem Teflon-beschichteten Gummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt und dann bei 30°C über einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen.
Danach wurde zu einem Gefäß, das 30 g des Bodens enthält, 50 ml entionisiertes Wasser, belüftet mit der Luft, welche durch Aktivkohle geführt wurde, und 10 ml n-Hexan gegeben, und das Gefäß wurde versiegelt. Das Gefäß wurde in einer Ultraschallwaschvorrichtung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und dann in einem Schüttler für 10 Minuten geschüttelt. Das abgetrennte n-Hexan wurde unter Verwendung eines Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert. Das Ergebnis, wie in der 16 gezeigt, zeigt an, dass wenn eine zu 7,5 ml der Kulturflüssigkeit entsprechende Bakterienmasse zweimal du dem Boden gegeben wurde, die Effizienz des Abbaus gleich zu der war, wenn die zu 15 ml der Kulturflüssigkeit entsprechende Bakterienmasse auf einmal zugegeben wurde.
Es ist schwierig, bei einmaliger Zugabe die notwendige Menge der Kulturflüssigkeit für den Abbau von Trichlorethylen enthalten im kontaminierten Boden in der tatsächlich benötigten Menge zuzuführen (die tatsächliche Menge des kontaminierten Bodens ist mehr als einige Dutzend m³), und der abbauende Mikroorganismus muss sequenziell kultiviert und zu dem Boden gegeben werden. Es wurde gezeigt, dass die sequenzielle Zugabe des erfindungsgemäßen Mikroorganismus die gleiche Wirkung ergab, als ob die erforderliche Bakterienmasse bei einer Zugabe zugegeben wurde. Daher kann durch wiederholte Zugabe einer kleinen Menge der Kulturflüssigkeit der erfindungsgemäße Mikroorganismus mit einer ausgedehnten Fläche der kontaminierten Stelle fertig werden, für welchen eine einmalige Kultivierung und Infusion der Bakterienmasse ungenügend ist.
Beispiel 11
Zu einem 100 ml Gefäß wurden 30 g Sandkornboden (luftgetrocknet) gegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen in den gewünschten Konzentrationen kontaminiert war. Die Konzentration des Kontaminanten in dem Boden wurde auf 15, 30, 45, 100 und 150 mg/kg eingestellt. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für 3 Tage in 15, 30 und 45 ml des NMS-Mediums, zu welchem 500 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt gegeben wurden, kultiviert, und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer geeigneten Menge des NMS-Medium resuspendiert wurden, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25% nach Zugabe der Suspension der Bakterienmasse war. Nach Zugabe der Suspension (die kein Phenol enthielt) der Bakterienmasse zu dem Boden wurde das Gefäß mit einem Teflonbeschichteten Gummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt und dann bei 30°C über einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen. Die Dichte der Bakterienmasse in dem Boden war 9,4 × 10⁸, 1,9 × 10⁹ bzw. 2,8 × 10⁹ KBE/g feuchter Boden für 15, 30 bzw. 45 ml der Kulturflüssigkeit.
Danach wurde zu einem Gefäß, das 30 g des Bodens enthielt, 50 ml entionisiertes Wasser, belüftet mit der Luft, welche durch Aktivkohle geführt wurde, und 10 ml n-Hexan zugegeben, und dann wurde das Gefäß versiegelt. Das Gefäß wurde in der Ultraschallwaschvorrichtung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und dann in einem Schüttler für 10 Minuten geschüttelt. Das abgetrennte n-Hexan wurde unter Verwendung eines Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert. Das Ergebnis, wie in der 17 gezeigt, zeigt an, dass eine sehr hohe Konzentration (etwa 150 mg/kg) an Trichlorethylen in dem Boden abgebaut werden konnte. Das vorherige Ergebnis zeigt an, dass die Reinigung einer hohen Konzentration (etwa 150 mg/kg) der kontaminierenden Substanz durch Erhöhung der zugegebenen Bakterienmasse oder durch sequenzielle Zugabe erhöht werden kann, da die Menge des abgebauten Trichlorethylens in Proportion zu der zu dem Boden gegebenen Bakterienmasse anstieg.
Beispiel 12
Zu einem 100 ml Gefäß, welches mit einem Teflonbeschichteten Gummiseptum versiegelt werden kann, wurden 30 g sandiger Boden (luftgetrocknet) gegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen kontaminiert war. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für 3 Tage NMS-Medium, zu welchem 500 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt zugegeben wurde, kultiviert, und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer geeigneten Menge des NMS-Medium resuspendiert wurde, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25% und die beimpfte Menge der Bakterienmasse 10⁸ bis 10⁹ Zellen/g feuchter Boden nach Zugabe der Suspension der Bakterienmasse war. Nach Zugabe der Suspension (die kein Phenol enthielt) der Bakterienmasse zu dem Boden wurde das Gefäß mit einem Teflon-beschichteten Gummistopfen versiegelt und dann bei 30°C über einen bestimmte Zeitraum stehen gelassen.
Danach wurde zu einem Gefäß, das 30 g des Bodens enthielt, 50 ml entionisiertes Wasser, belüftet mit der Luft, welche durch Aktivkohle geführt wurde, und 10 ml n-Hexan zugegeben, und das Gefäß wurde versiegelt. Das Gefäß wurde in einer Ultraschallwaschvorrichtung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und dann in einem Schüttler für 10 Minuten geschüttelt. Das abgetrennte n-Hexan wurde unter Verwendung eines Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert. Der zeitliche Verlauf der Änderungen in der Trichlorethylenkonzentration in dem Boden wurde durch Herstellung einer Vielzahl von Proben zur gleichen Zeit und Extraktion des Gesamtvolumens eines Teils der Probe nach Passage über eine bestimmte Zeit, gefolgt durch Messung, bestimmt. Sie wurden bei 4°C bis zur Extraktion gelagert.
Die Messung der Trichlorethylenkonzentration in dem Boden wurde ebenfalls unter Verwendung eines in dem Umweltstandard (dem Bodenumweltstandard) angegebenen Verfahren mit Bezug auf die Kontamination des Bodens durchgeführt. Folglich wurde die Bodenprobe und das Lösungsmittel (Chlorwasserstoffsäure wurde zu dem gereinigten Wasser gegeben und der pH wurde auf 5,8 – 6,3 eingestellt) in einem Gewichtsvolumenverhältnis von 10% in einen Erlenmeyerkolben mit einem Schraubstutzen mit einem Rührstab gegeben, und dann wurde der Kolben sofort versiegelt. Zu diesem Zeitpunkt wurde darauf geachtet, dass das Volumen der Mischung nicht weniger als 500 ml war, und den Kopfraum in dem Erlenmeyerkolben mit einem Schraubstutzen relativ zu dem Volumen der Mischung zu minimieren. Die hergestellte Bodenflüssigkeit wurde kontinuierlich für 4 Stunden mit einem magnetischen Stab gerührt, wobei die Flüssigkeit bei herkömmlicher Temperatur und herkömmlichen Druck gehalten wurde.
Nachdem die Bodenflüssigkeit für 30 Minuten stehen gelassen wurde, wurde sie in eine Glasspritze eingezogen. Ein Filterhalter, ausgestattet mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μ, war mit der Spritze verbunden und der Kolben wurde gedrückt, um die Luft und die anfänglichen wenigen ml der Flüssigkeit auszuschließen, und dann wurde das Filtrat in Fraktionen in verstopften Reagenzröhrchen gesammelt, von welchen eine Menge notwendig für die Bestimmung ausgewogen und einer Analyse durch Gaschromatographie unterzogen wurde. Die Ergebnisse, wie in 18 gezeigt, zeigen an, dass 90% des gesamten Trichlorethylens im Boden in einem Tag nach Zugabe der Bakterienmasse abgebaut war.
Es wurde daher gezeigt, dass das Verfahren der Reinigung von Trichlorethylen durch Zugabe des erfindungsgemäßen Mikroorganismus in den Boden eine Technologie ist, welche eine hohe Reinigungsfähigkeit hat, die nahezu einer Abbaukapazität von etwa 18 mg/kg Trichlorethylen im Boden in einem Tag entspricht. Wenn die Bodenprobe nach 7 Tage Stehen gemäß einem durch den Staat vorgeschriebenen analytischen Verfahren gemessen wurde (der Umweltstandard, der Bodenumweltstandard mit Bezug auf die Kontamination des Bodens), war die Konzentration von Trichlorethylen unterhalb des Grundwertes (0,03 ppm). Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass Trichlorethylen durch Reinigung des kontaminierten Bodens unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus zu einem Grad gereinigt werden kann, welcher die Umweltstandards erfüllt. Es ist allgemein anerkannt, dass die physikalischen Mittel der Behandlung, wie etwa Vakuumextraktion, ungeeignet sind, geringe Konzentrationen zu reinigen, aber die Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus ermöglicht eine Reinigung auf ein Niveau unterhalb des Grundwerts.
Beispiel 13
Zu einem 100 ml Gefäß, welches mit einem Teflonbeschichteten Gummiseptum versiegelt werden kann, wurde 30 g sandiger Boden (luftgetrocknet) gegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen kontaminiert war. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für 3 Tage in dem NMS-Medium, zu welchem 500 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt gegeben wurde, kultiviert, und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer geeigneten Menge des NMS-Mediums resuspendiert wurde, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25% und die beimpfte Menge der Bakterienmasse 10⁸ bis 10⁹ Zellen/g feuchter Boden nach Zugabe der Suspension der Bakterienmasse war. Nach Zugabe der Suspension (die kein Phenol enthält) der Bakterienmasse zu dem Boden, wurde das Gefäß mit einem Teflonbeschichteten Gummistopfen versiegelt und dann bei 30°C für eine bestimmte Dauer stehen gelassen. Danach wäre eine Analyse der Nebenprodukte durchgeführt, von denen angenommen wird, dass sie in Zusammenhang mit dem Trichlorethylenabbau im Boden gebildet werden.
Die Nebenprodukte im Boden wurden wie folgt analysiert: Vinylchlorid, 1,1-Dichlorethylen, cis-1,2-Dichlorethylen und trans-l,2-Dichlorethylen wurden in dem in der 19 gezeigten Verfahren analysiert. Dichloracetat und Trichloracetat, Trichlorethanol und Chloralhydrat wurden in dem in den 20, 21 bzw. 22 gezeigten Verfahren analysiert. Die Ergebnisse, wie in Tabelle 9 gezeigt, zeigen an, dass alle Nebenprodukte unterhalb der Nachweisgrenze waren.
Die Dechlorierungsreaktion von Trichlorethylen unter anaeroben Bedingungen führt zu einer Akkumulation von Dichlorethylenen, welche toxischer sind. Es ist ebenfalls bekannt, dass der Abbauvorgang unter aeroben Bedingungen, die mit der Bildung von Trichlorethylenoxid beginnt, Dichloracetat usw. als Zwischenprodukte erzeugt. Es gab keine Akkumulation von gefährlichen Substanzen bei dem Abbau von Trichlorethylen durch den erfindungsgemäßen Mikroorganismus im Boden. Obwohl die Anwesenheit von anderen als den gemessenen Substanzen unbekannt ist, scheint diese Technologie ein sehr sicheres Verfahren zu sein.
TABELLE 8
BEISPIEL 14
Zu einem 100 ml Gefäß, welches mit einem Teflon beschichteten Gummiseptum versiegelt werden kann, wurden 30 g sandiger Boden (luftgetrocknet) zugegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen kontaminiert war. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für 3 Tage in NMS-Medium, zu welchem 5 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt zugegeben waren, kultiviert, und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer geeigneten Menge des NMS-Mediums resuspendiert wurden, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25% und die beimpfte Menge der Bakterienmasse 10⁸ bis 10⁹ Zellen/g feuchter Boden nach Zugabe der Suspension der Bakterienmasse war. Nach Plattieren der Suspension der Bakterienmasse auf einer Petrischale in einer Dicke von etwa 1 mm wurde sie durch Bestrahlung mit einer 15W ultravioletten Lampe mit einer Wellenlänge von 260 nm für nicht weniger als 60 Sekunden bei einem Abstand von 40 cm von der Lichtquelle sterilisiert. Nach Zugabe der Suspension (die kein Phenol enthielt) des erfindungsgemäßen Mikroorganismus in dem Boden, wurde das Gefäß mit einem mit Teflon-beschichteten Gummistopfen versiegelt und bei 30°C über einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen.
Danach wurde zu einem Gefäß, das 30 g des Bodens enthielt, 50 ml entionisiertes Wasser belüftet mit der Luft, welche durch Aktivkohle geführt wurde, und 10 ml n-Hexan zugegeben und das Gefäß wurde versiegelt. Das Gefäß wurde in einer Ultraschallwaschvorrichtung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und dann in einem Schüttler für 10 Minuten geschüttelt. Das abgetrennte n-Hexan wurde unter Verwendung eines Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert. Ferner wurde in einem Experiment, in welchem die Suspension der sterilisierten Bakterienmasse in einer Menge von 1/100 des NYG Mediums beimpft wurde, oder die Suspension wurde wie sie war auf das NYG-Agarmedium ausplattiert und bei 30°C kultiviert, weder ein Anstieg in der Trübung in der Kulturflüssigkeit noch eine Koloniebildung beobachtet, und dadurch wurde bestätigt, dass die Sterilisation vollständig war. Das Ergebnis, wie in 23 gezeigt, zeigt an, dass die toten Zellen und die lebenden Zellen einen gleichen Grad an Trichlorethylenabbau ergaben.
Obwohl die meisten Reinigungsverfahren unter Verwendung von Mikroorganismen die Zugabe lebender Mikroorganismen in den Boden umfassen ist die Zugabe der Bakterienmasse in dem Boden zur Zeit hinsichtlich der öffentlichern Akzeptanz schwierig. Es wurde ebenfalls befürchtet, dass es ein potentielles Risiko der Erzeugung einer weitreichenden Wirkung auf das Ökosystem durch Freisetzung eines spezifischen Mikroorganismus in die Umwelt gibt. Aber die Zugabe des Mikroorganismus, welcher vollständig seine Vermehrungsfähigkeit durch eine Sterilisationsbehandlung verloren hat, ist äquivalent zu der einfacher organischer Materialien, und folglich wird angenommen, dass er nur geringe Wirkung auf das Ökosystem hat. Daher wurde ein Experiment durchgeführt, in welchen die Zugabe des abbauenden Mikroorganismus, sterilisiert mit ultravioletter Strahlung, in den Boden untersucht wurde. Das Ergebnis zeigt an, dass sich die Zugabe der toten Bakterienmasse als ein extrem nützliches Verfahren erweist.
Die in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 8(1996)-3012 offenbarte Erfindung behauptet, dass die Wirkung auf das Ökosystem durch Aufbrechen der abbauenden Bakterien und Aufsprühen auf den Boden minimiert werden kann. Aber es ist einfach abzusehen, dass das Aufsprühen einer großen Masse des abbauenden Bakteriums auf den kontaminierten Boden tatsächlich schwierig ist, weil das Aufbrechen von Mikroorganismen eine aufwendige Ausstattung und eine Menge Zeit und Arbeit erfordert. Die bekannten Enzyme, welche eine Trichlorethylen oxidierende Aktivität haben, benötigen NAD als ein Coenzym. Da aber das Coenzym sehr teuer ist, würde es extrem schwierig sein, das Coenzym in den Konzentrationen notwendig für die Abbaureaktion des Enzyms zuzuführen, welches durch Aufbrechen des Bakteriums aus der Bakterienmasse abgegeben wurde. Andererseits hat das Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus kein derartiges Problem und ermöglicht die Reinigung von Trichlorethylen usw. bei geringen Kosten und mit minimalen Wirkungen auf das Ökosystem.
Beispiel 15
Zu einem 100 ml Gefäß, welches mit einem Teflonbeschichteten Gummiseptum versiegelt werden kann, wurden 30 g Sandkornboden (luftgetrocknet) zugegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen kontaminiert war. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für 3 Tage in einem NMS-Medium, zu welchem 500 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt gegeben wurde, kultiviert, und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer geeigneten Menge des NMS-Medium resuspendiert wurden, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25% und die beimpfte Menge der Bakterienmasse 10⁸ bis 10⁹ Zellen/g feuchter Boden nach Zugabe der Suspension der Bakterienmasse war. Nach Plattieren der Suspension der Bakterienmasse auf einer Petrischale in einer Dicke von etwa 1 mm folgte eine Sterilisation durch Bestrahlung mit einer 15 W Ultraviolettlampe mit einer Wellenlänge von 260 nm für nicht weniger als 60 Sekunden in einem Abstand von 40 cm von der Lichtquelle.
Nach Zugabe der Suspension (die kein Phenol enthält) des sterilisierten erfindungsgemäßen Mikroorganismus in dem Boden, wurde das Gefäß mit einem Teflon-beschichteten Gummistopfen verschlossen und bei 30°C über einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen. Danach wurde das Trichlorethylen im Boden abgebaut und die Nebenprodukte, von welchen angenommen wird, dass sie sich im Zusammenhang mit dem Trichlorethylenabbau bilden, wurden in ähnlicher Art und Weise wie in Beispiel 13 analysiert. Ferner wurde in einem Experiment, in welchem die Suspension der sterilisierten Bakterienmasse in einer Menge von 1/100 zu einem NYG-Medium beimpft wurde, oder die Suspension wie sie war auf einem NYG-Agarmedium plattiert und bei 30°C kultiviert wurde, weder ein Anstieg in der Trübung der Kulturflüssigkeit noch die Koloniebildung beobachtet, und dadurch wurde bestätigt, dass es eine vollständige Sterilisation war.
Das Ergebnis, wie in der Tabelle 10 gezeigt, zeigt an, dass alle Nebenprodukte unterhalb der Nachweisgrenze waren. Die Dechlorierungsreaktion von Trichlorethylen unter aeroben Bedingungen führt zur Akkumulation von Dichlorethylenen, welche toxischer sind. Es ist ebenfalls bekannt, dass der Abbauvorgang unter aeroben Bedingungen, welcher mit der Bildung von Trichlorethylenoxid beginnt, Trichloracetat usw. als Zwischenprodukte erzeugt. Es gab keine Akkumulation von gefährlichen Substanzen bei dem Abbau von Trichlorethylen durch den erfindungsgemäßen Mikroorganismus im Boden. Obwohl die Anwesenheit von anderen als den gemessenen Substanzen unbekannt ist, wird angenommen, dass diese Technologie ein sehr sicheres Verfahren ist.
TABELLE 9
Beispiel 16
Zu einem 100 ml Gefäß, welches mit einem Teflonbeschichteten Gummiseptum verschlossen werden kann, wurden 30 g sandiger Boden (luftgetrocknet) gegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen kontaminiert war.
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für 3 Tage in einem NMS-Medium, zu welchem 500 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt gegeben wurden, kultiviert, und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer angemessenen Menge des NMS-Medium resuspendiert wurde, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25% und die beimpfte Menge der Bakterienmasse 10⁸ bis 10⁹ Zellen/g feuchter Boden nach Zugabe der Suspension der Bakterienmasse war. Nach Zugabe der Suspension (die kein Phenol enthält) des erfindungsgemäßen Mikroorganismus zu dem Boden, wurde das Gefäß mit einem Teflon-beschichteten Gummistopfen versiegelt und bei 20°C über einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen.
Danach wurde zu einem Gefäß, das 30 g des Bodens enthält, 50 ml entionisiertes Wasser belüftet mit der Luft, welche durch Aktivkohle geführt wurde, und 10 ml n-Hexan zugegeben, und das Gefäß wurde versiegelt. Das Gefäß wurde in einer Ultraschallwaschvorrichtung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und dann in einem Schüttler für 10 Minuten geschüttelt. Das abgetrennte n-Hexan wurde unter Verwendung eines Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert.
Das Ergebnis, wie in der 24 gezeigt, zeigte an, dass Trichlorethylen bei 20°C in einem Grad äquivalent zu dem bei 30°C abgebaut wurde. Da angenommen wurde, dass Trichlorethylen bei der hohen Temperatur ausreichend abgebaut wird, wurde nachgewiesen, dass der erfindungsgemäße Mikroorganismus einen hohen praktischen Nutzen im Vergleich zu anderen hat.
Beispiel 17
Zu einem 100 ml Gefäß wurden 30 g Sandkornboden (luftgetrocknet) gegeben, welcher künstlich mit Trichlorethylen kontaminiert war. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C für einen Tag in einem NMS-Medium, zu welchem 500 ppm Phenol und 0,05 Hefeextrakt zugegeben wurde, kultiviert. Die Kulturflüssigkeit wird in einem Volumen von 1/100 des NMS-Mediums (oder des PH-Mediums) mit 500 ppm, 0,02 und 1 mM Phenol, Hefeextrakt bzw. Glucose zugegeben, und dann zu dem Boden gegeben. Die Dichte der Bakterienmasse war auf 10⁶ Zellen/g feuchter Boden eingestellt und der Wassergehalt war auf 25% zum Zeitpunkt der Kulturflüssigkeitszugabe eingestellt.
Das Gefäß wurde mit einem Teflon-beschichteten Gummiseptum versiegelt und dann bei 30°C über einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen. Danach wurde zu einem Gefäß, das 30 g des Bodens enthält, 50 ml entionisiertes Wasser belüftet mit Luft, welche durch Aktivkohle geführt wurde, und 10 ml n-Hexan zugegeben, und das Gefäß wurde versiegelt. Das Gefäß wurde in einer Ultraschallwaschvorrichtung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und dann in einem Schüttler für 10 Minuten geschüttelt. Das abgetrennte n-Hexan wurde unter Verwendung eines Gaschromatographen, ausgestattet mit einem ECD-Detektor, analysiert.
Das Ergebnis, wie in der 25 gezeigt, zeigt an, dass Trichlorethylen im Boden ähnlich wie in dem NMS-Medium und dem PH-Medium von etwa 14 mg/kg bis auf etwa 1 mg/kg absinkt. Aufgrund der Zugabe von Phenol in den Boden trugen autochthone Mikroorganismen zur Reduktion des Trichlorethylens bei, aber das Ergebnis zeigte einen größeren Effekt durch die Zugabe des Stamms MO7. Daher ist es klar, dass die Möglichkeit ausgeschlossen werden kann, dass der Stamm seine Wirkung nur in dem sterilisierten Kulturmedium aufweist, sondern ebenfalls in einer natürlichen Umgebung, obwohl autochthone Mikroorganismen vorhanden sind. Es wurde bestätigt, dass die Aktivität des Stammes MO7 bei einer Menge von etwa 10⁶ Zellen/g feuchten Boden ausreichend durch Zugabe von Phenol induziert wird, selbst in der natürlichen Umgebung.
Beispiel 18 Herstellung einer konstitutiven Mutante
Eine Platinöse voll der Kolonie des erfindungsgemäßen Mikroorganismus, welcher durch Passage auf der Agarplatte mit 1,5% Agar gelagert wurde, wurde gepickt und in ein Reagenzröhrchen mit 2 ml des 1/3LB-Mediums (seine Zusammensetzung wird in der Tabelle 11 gezeigt) beimpft. Nach Kultivierung über Nacht unter Schütteln bei 30°C bei 130 U/min wurde ein Aliquot des Kulturmediums entsprechend verdünnt, welches dann auf einer Platte des 1/3LB-Mediums mit 1,5% Agar ausplattiert wurde. Nach Kultivierung bei 30°C wurde die Zellzahl gezählt. Der Rest des Kulturmediums wurde auf einer Petrischale ausplattiert, welches dann einer Bestrahlung einer 15 W Ultraviolettlampe mit einer Wellenlänge von 260 nm unter der Bedingung einer Strahlungszeit von 3 Minuten bei einem Abstand von 30 cm von der Lichtquelle unterzogen wurde. TABELLE 10

1/3LB-Medium

Trypton 3,0 g

Hefeextrakt 1,5 g

Natriumchlorid 3,0 g

Destilliertest Wasser 1 Liter
Dann wurde das Kulturmedium entsprechend verdünnt und auf die Platte des 1/3LB-Mediums mit 1,5% Agar plattiert. Nach Kultivierung bei 30°C wurde die Zellzahl gezählt, um die Todesrate zu bestimmen. Wenn eine Todesrate von 99% oder höher beobachtet wurde, wurde angenommen, dass es genug Mutationen gab. An diesem Punkt wurde die erwünschte Mutante aus dem Kulturmedium selektiert.
Catechol 2,3-Dioxygenase (C230) führt Sauerstoff in Catechol ein, um 2-Hydroxymuconsäuresemialdehyd durch Metaspaltung zu bilden. Dieses Produkt ist gelb gefärbt. Wenn C230 nach Sprühen exprimiert wird, wird es leicht gelb. Die Trichlorethylen-abbauenden Enzyme der Phenolverwertenden, Trichlorethylen-abbauenden Bakterien sind bekannterweise Phenolhydroxylase (PH), welche Phenol in Catechol umwandelt (M. Fujita et al., J. Ferment. Bioeng., 79: 100, 1995; V. Shingler et al., J. Bacteriol., 174: 711, 1992).
Als ein Beispiel ist bekannt, dass C230 durch ein Operon exprimiert wird, wenn das C230-Gen neben dem PH-Gen ist, obwohl C230 selbst nicht direkt am Abbau von Trichlorethylen beteiligt war (M. Fujita et al., J. Ferment. Bioeng., 79: 100, 1995; V. Shingler et al., J. Bacteriol., 174: 711, 1992). Wenn C230 zusammen mit dem PH exprimiert wird, ist es möglich Stämme zu selektieren, welche das Trichlorethylen-abbauende Enzym unter Verwendung der C230 Expression als ein Indikator exprimieren. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus, der unter Verwendung von Phenol als einzige Kohlenstoffquelle kultiviert wird, baut Phenol ab und das Kulturmedium wird mit dem Wachstum des Bakteriums gelb. Dies macht dieses Auswahlverfahren für den Mikroorganismus geeignet.
Dem gemäß wurde die Suspension der Bakterienmasse nach Mutation entsprechend verdünnt und auf die Platte des 1/3LB-Mediums mit 1,5% Agar plattiert. Nach Kultivierung bei 30°C von 1 bis 3 Tage wurde eine Catechollösung (0,1% (w/v) Etherlösung) aufgesprüht.
Dann, wenn die Todesrate 99,99% war, wurden 10.000 Kolonien, welche nach Ultraviolettbestrahlung auftraten, untersucht, welche zur Auswahl von 16 gelben Kolonien führten.
Nachdem die Kolonien in dem 1/3LB-Flüssigmedium kultiviert waren, wurde es auf die Platte des 1/3LB- Mediums mit 1,5% Agar plattiert. Nach Kultivierung bei 30°C wurden die auftretenden Kolonien mit einer Catechollösung besprüht und gelbe Kolonien wurden abermals isoliert, um Stämme zu erhalten, welche konstitutiv C230 exprimieren.

Eine Platinöse voll dieser Stämme, welche konstitutiv C230 exprimieren, wurde gepickt und in dem M-Medium (seine Zusammensetzung wird in Tabelle 12 gezeigt) mit 4 ml Natriumglutamat (0,1%) in ein 20 ml Gefäß beimpft. Das Gefäß wurde mit einem Butylgummistopfen verstopft und mit einer Aluminiumkappe versiegelt, welches dann bei 30°C unter Schütteln für 2 Tage kultiviert wurde. Dann wurde Trichlorethylen in einer Menge zugegeben, so dass es 30 ppm ausmachte, wenn alles in der flüssigen Phase gelöst war. Nach Kultivierung bei 30°C für 5 Tage, wurde die Trichlorethylenkonzentration wie in Beispiel 6 bestimmt. TABELLE 11 M-Medium

Ammoniumnitrat	3,0 g
Dinatriumhydrogenphosphat	2,2 g
Kaliumdihydrogenphosphat	0,8 g
Eisensulfat-(II)-heptahydrat	10 mg
Calciumsulfatdihydrat	10,0 mg
Magnesiumsulfatheptahydrat	10 mg
Hefeextrakt	50,0 mg
Destilliertes Wasser	1,0 Liter, pH 7,0

Das Ergebnis veranschaulicht, dass der Ausgangsstamm MO7 wenig Trichlorethylen abbaute, aber einige der Stämme, welche konstitutiv C230 exprimieren bauen 52 bis 34% von 30 ppm Trichlorethylen ab. Diese Mikroorganismen stellten sich als eine Mutante heraus, welche vom Ausgangstamm MO7 abgeleitet ist und welche Trichlorethylen abbauen kann, ohne Phenol zu benötigen.
Dann wird der Trichlorethylenabbau im Boden mit Bezug auf ein Beispiel veranschaulicht, in welchem der Stamm MO715 verwendet wurde, welcher die höchste Trichlorethylenabbauaktivität hat.
Beispiel 19 Abbau von Trichlorethylen durch eine konstitutive Mutante
Ein Boden, welcher künstlich mit Trichlorethylen (11 mg/kg Boden) kontaminiert war, wurde wie in Beispiel 9 hergestellt. Nach Kultivierung des Stamms MO715 wurde unter Schütteln bei 30°C für 2 Tage in 100 ml des M-Mediums mit Natriumglutamat (0,1 w/v %) wurde er dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer geeigneten Menge des M-Mediums resuspendiert wurden, so dass der Wassergehalt in dem Boden 25 % war. Nachdem die Suspension der Bakterienmasse (die kein Phenol enthält) zu dem Boden gegeben wurde, wurde das Gefäß mit einem Teflon-beschichteten Gummiseptum versiegelt und bei 30°C über einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen. Trichlorethylen wurde in einem ähnlichen Verfahren wie in dem Beispiel 9 analysiert. Das auf Phenol kultivierte Kulturmedium und der Stamm MO7 wurden in einer ähnlichen Art und Weise analysiert.
Als ein Ergebnis waren nach der Zugabe der Suspension der Bakterienmasse des mit Natriumglutamat kultivierten Stamms MO715 etwa 35% Trichlorethylen in 12 Stunden und etwa 60% in 48 Stunden abgebaut. Der auf Natriumglutamat gewachsene Stamm MO7 baute wenig Trichlorethylen ab. Folglich wurde nachgewiesen, dass der erfindungsgemäße Mikroorganismus kein Phenol für die Induktion erfordert und Trichlorethylen auch im Boden abbauen kann.
Vom Vorhergehenden kann geschlossen werden, dass die vorliegende Erfindung eine extrem sichere Technologie ist, da Trichlorethylen ohne Ausbreitung toxischer Substanzen, wie etwa Phenol, in der Umwelt abgebaut werden kann.
Hinweis auf die internationale Hinterlegung von Mikroorganismen gemäß dem Budapester Vertrag
Internationale Hinterlegungsstelle: National Institue of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology
Anschrift: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, 305, Japan
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Bakterium mit den folgenden Eigenschaften: Morphologie kokkenähnlich; stäbchenförmig Gramfärbung + Sporenbildung – Beweglichkeit – Verhältnis zu Sauerstoff aerobisch Oxidasetest – Katalasetest + Säurefestigkeit – Stäbchen-Kokkenzyklus + Luftmycelbildung – Peptidglykanart der Zellwand Meso-Diaminopimelinsäure Glycolyltest – (Acetyltyp) Mykolischer und GC-Gehalt der DNA (Mol-%) – 73 (durch HPLC),

welches Trichlorethylen abbauen kann, und welches der Stamm MO7 (FERM BP-5624) ist.
Verfahren für den Abbau organischer, halogenierter Verbindungen und/oder aromatischer Verbindungen, mit Aussetzen der organischen halogenierten Verbindungen und/oder aromatischen Verbindungen mit der Wirkung eines Bakteriums nach Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die organische halogenierte Verbindung Trichlorethylen und die aromatische Verbindung eine phenolische Verbindung ist.
Verfahren für den Abbau von organischen, halogenierten Verbindungen im Boden, Abwässern oder anderen Abfallprodukten, die organische halogenierte Verbindungen enthalten, mit Zugabe einer Kultur eines Bakteriums nach Anspruch 1 zu dem Boden, den Abwässern oder anderen Abfallprodukten.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die organische halogenierte Verbindung Trichlorethylen ist, und die Kultur kultivierte Bakterienzellen ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei eine aromatische Verbindung zu einem Kulturmedium für die Verwendung in der Kultivierung zugegeben wird, um die Bakterienkultur zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die aromatische Verbindung eine phenolische Verbindung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei eine abbaubare Kohlenstoffquelle zu einem Kulturmedium für die Verwendung in der Kultivierung zugegeben wird, um die Bakterienkultur zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die abbaubare Kohlenstoffquelle Glukose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei die Kultur kultivierte Bakterienzellen ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die kultivierten Bakterienzellen lebende Bakterienzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die kultivierten Bakterienzellen sterilisierte, kultivierte Bakterienzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Sterilisationsbehandlung ultraviolette Strahlung ist.
Verfahren für den Abbau organischer, halogenierter Verbindungen im Boden, Abwässern oder anderen Abfallprodukten, die organische halogenierte Verbindungen enthalten, mit den Schritten des Inokulierens eines Bakteriums nach Anspruch 1 in den Boden, die Abwässer oder andere Abfallprodukte, Zugabe einer aromatischen Verbindung, einer abbaubaren Kohlenstoffquelle oder einer Mischung davon zu dem Boden, den Abwässern oder anderen Abfallprodukten, und dann Kultivierung der inokulierten Mikroorganismen.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die organische halogenierte Verbindung Trichlorethylen ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die aromatische Verbindung eine phenolische Verbindung ist, und die abbaubare Kohlenstoffquelle Glukose ist.
Abbaumittel für organische, halogenierte Verbindungen und/oder aromatische Verbindungen, mit einer Kultur eines Bakteriums nach Anspruch 1.
Abbaumittel nach Anspruch 17, wobei die Kultur kultivierte Bakterienzellen ist.
Abbaumittel nach Anspruch 18, wobei die Kultur lebende Bakterienzellen ist.
Abbaumittel nach Anspruch 18, wobei die kultivierten Bakterienzellen sterilisierte Bakterienzellen sind.
Abbaumittel nach Anspruch 20, wobei die Sterilisationsbehandlung ultraviolette Bestrahlung ist.
Abbaumittel nach einem der Ansprüche 17 bis 21, welches in der Form von getrockneten Bakterienzellen ist.
Bakterium mit Abbauaktivität für organische, halogenierte Verbindungen und/oder aromatische Verbindungen in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Induktion eines Enzyms, das organische halogenierte Verbindungen abbaut, durch eine aromatische Verbindung, wobei das Bakterium durch Unterziehen des Bakteriums nach Anspruch 1 mit einer Mutationsbehandlung und einem Selektionsverfahren erhältlich ist.
Bakterium nach Anspruch 23, welches der Stamm MO715 (FERM BP-5928) ist.
Verfahren für den Abbau organischer, halogenierter Verbindungen und/oder aromatischer Verbindungen mit Wirkenlassen des Bakteriums nach Anspruch 23 oder 24 auf organische halogenierte Verbindungen und/oder aromatische Verbindungen.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die organische, halogenierte Verbindung Trichlorethylen und die aromatische Verbindung eine phenolische Verbindung ist.
Verfahren für den Abbau organischer, halogenierter Verbindungen im Boden, Abwässern oder anderen Abfallprodukten, die organische halogenierte Verbindungen enthalten, mit Zugabe einer Kultur eines Bakteriums nach Anspruch 23 oder 24 zum Boden, den Abwässern oder den anderen Abfallprodukten.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die organische, halogenierte Verbindung Trichlorethylen ist und die Kultur kultivierte Bakterienzellen ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei keine aromatische Verbindung zu dem Kulturmedium für die Verwendung in der Kultivierung zugegeben wird, um die Bakterienkultur zu erhalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei eine abbaubare Kohlenstoffquelle zu dem Medium für die Verwendung in der Kultivierung zugegeben wird, um die Bakterienkultur zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die abbaubare Kohlenstoffquelle Glutaminsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei die Kultur kultivierte Bakterienzellen ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die kultivierten Bakterienzellen lebende Bakterienzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die kultivierten Bakterienzellen sterilisierte Bakterienzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Sterilisationsbehandlung ultraviolette Bestrahlung ist.
Verfahren für den Abbau organischer halogenierter Verbindungen im Boden, Abwässern oder anderen Abfallprodukten, die organische halogenierte Verbindungen enthalten, mit den Schritten der Inokulierung des Bakteriums nach Anspruch 23 oder 24 in den Boden, die Abwässer oder die anderen Abfallprodukte, Zugabe einer abbaubaren Kohlenstoffquelle zu dem Boden, den Abwässern oder den anderen Abfallprodukten, und dann Kultivierung der inokulierten Mikroorganismen.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die organische, halogenierte Verbindung Trichlorethylen ist.
Verfahren nach Anspruch 36 bis 37, wobei die abbaubare Kohlenstoffquelle Glutaminsäure ist.