CN1149278C - 环境净化用的新微生物及其方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有下列特征的新微生物：形态(球、杆状)，革兰氏染色(+)，孢子形成(-)，运动性(-)，与氧的关系(需氧型)，氧化酶检测(-)，过氧化氢酶检测(+)，抗酸性(-)，杆-球循环(+)，DNA中GC含量(mole%)(73(通过HPLC))，它可以降解氯乙烯。此微生物可以在24小时内降解30ppm的三氯乙烯，可以降解100ppm三氯乙烯的50%。

Description

环境净化用的新微生物及其方法
发明领域
本发明涉及新的微生物，它能有效降解有机卤代化合物例如三氯乙烯，并涉及一种降解有机卤代化合物的方法，特别是土壤、地下水或废水中的三氯乙烯。
发明背景
近年来，工业上使用有机溶剂，通过在国家的许多部分丢弃这些化合物或含有这些化合物的废水，已产生环境污染问题。尤其是有机氯代化合物产生的土壤污染是一种重要的社会问题，恢复污染土壤的技术已变得更为必要。净化污染土壤的方法包括物理方法和生物方法。
物理方法包括空气-剥脱法(即净化的空气进入挖出的污染土壤中使含在其中的有机氯代化合物挥发出来，并通过活性炭的吸收而除去它们的一种方法)，真空提取法(即将管子插入污染的土壤中以产生降压的状态使有机氯代化合物挥发出来并从土壤中提取。然而这些方法需要大量的动力以净化空气等等，并且有以下缺点，前者需要挖出土壤，后者在低浓度的污染物中提取效率低。净化过程不能顺利进行。此外这两种方法只是将污染物质吸附到活性炭上，所以需要另一种方法解除污染物质的毒性。
最近已经报导了正在发展中的生物处理方法，它利用微生物的能力降解物质，并且能完全降解或解除污染物质的毒性，此外与物理方法相比，处理时只需较少的能量。而且生物方法即使在低浓度的污染物中也可以净化，因此做为一种低费用的土壤净化方法，希望是很大的。已知的生物方法包括固相处理法(挖出的土壤与磷、氮、微生物等混合以促进微生物降解污染物)。稀泥处理法(挖出的土壤与水、磷、氮微生物等混合以液体形式处理以提高微生物净化污染物的速度)、原位(on-site)处理法(甲烷、空气、磷、氮被注射进土壤，而并不把土壤挖出，以促进微生物降解污染物)。
在传统使用的生物处理方法中，固相处理方法和稀泥处理方法需要挖出土壤，此外只有很窄的应用范围，处理和设备的费用相对较高。
另一方面，在原位处理法中，由于使用土生土长微生物做为降解者，与上述方法相比在处理和设备上较为便宜，并能应用于一种较宽的范围之内。但是由于处在土壤中微生物的绝对数量很少的条件下，原位处理法的净化速率降低。尤其在难以降解的化合物的情况下，例如有机卤代化合物，当土壤中没有成活的微生物能够降解所说的污染物时，净化是不可能的。在这种情况下，为了提高土壤净化的速率，我们认为把有能力降解有机卤代化合物的微生物接种到土壤中是有必要的。
已知能降解三氯乙烯的微生物包括发孢甲基弯菌OB3(日本未审查专利公开(Kohyo)号，4(1992)-501667，日本未审查专利公开号，5(1993)-212371)，和发孢甲基弯菌TUKUBA(日本未审查专利公开号，2(1990)-92274，日本未审查专利公开号，3(1991)292970)，它是能降解甲烷的生物体，恶臭假单胞菌F1(日本未审查专利公开号，64(1989)-34499)，恶臭假单胞菌BH(Fujita et al.，化学工程，39(6)：494-498，1994)，恶臭假单胞菌UC-R5，UC-P2(日本未审查专利公开号No.62(1987)-84780)，恶臭假单胞菌KWI-9(日本未审查专利公开号，6(1994)-70753)，门多萨假单胞菌KR1(日本未审查专利公开号，2(1990)-503866，5(1993)-502593)，洋葱假单胞菌G4(日本未审查专利公开号，4(1992)-502277)、洋葱假单胞菌KK01(日本未审查专利公开号，6(1994)-296711)，它属于假单胞菌属，真养产碱杆菌JMP134(A.R. Harker，应用和环境微生物学，56(4)：1179-1181，1990)，真养产碱杆菌KS01(日本未审查专利公开号，7(1995)-123976)，欧洲亚硝化单胞菌(D.Arciero et al.，生物化学与生物物理研究通讯.，159(2)：640-643，1989)它是一种氨-氧化细菌，棒状杆菌J1(日本未审查专利公开号，8(1996)-66182)和其它等等。
这些已知微生物三氯乙烯的降解能力不是非常高，这些微生物的大部分只在液体培养基中能降解5ppm的三氯乙烯。此外，因为在特异环境如土壤中，三氯乙烯的降解能力是必需的，所以用于生物修复的微生物有必要不仅有足够降解三氯乙烯的能力，而且即使在土壤中也能保留三氯乙烯的降解能力。然而，已知微生物的大部分其中方面没有足够能力。
已报道洋葱假单胞菌KK01在液体培养基中能降解起始浓度在30ppm至15ppm的三氯乙烯，在土壤中能降解起始浓度在5ppm至1ppm的三氯乙烯(日本未审查专利公开号，6(1994)-296711)。此外，已报道真养产碱杆菌KS01在液体培养基中能降解起始浓度在50ppm至低于检测水平以下的三氯乙烯，在土壤中能降解起始浓度在1ppm至低于检测水平以下的三氯乙烯(日本未审查专利公开号，7(1995)-123976)。
已经确认这些微生物比传统微生物有更高的降解能力，这些能力即使在土壤中也能表现出来。然而为了诱导这些微生物的降解能力，则需要向土壤中添加至少一种或多种芳香化合物。但是芳香化合物本身是污染物，所以有引起二次污染的危险。对实际应用来说，这是一种需要解决的大挑战，所以要获得一种微生物，或者当芳香化合物加入时它能使芳香化合物完全降解并随三氯乙烯一起去除，或者允许不添加芳香化合物而把三氯乙烯降解掉。
相应地，为了把三氯乙烯的生物净化推向实际应用，有必要获得一种微生物，它有高的降解能力，并且当加入芳香化合物时，能使芳香化合物完全降解并随三氯乙烯一起去除，或者允许不添加芳香化合物而把三氯乙烯降解掉。
此外，在很多情况下，升高微生物的浓度至与所需处理能力相当的水平是很困难的，因为原生动物的捕食和土生土长微生物的竞争效应，在土壤中弥散微生物的浓度被抑制得很低。为了增加浓度许多方法被实施，例如把空气和营养泵入土壤的压力法。但是尽管需要大量的能量，单独这些方法很难提高细菌的浓度，因此微生物的降解能力维持在很低的水平。在封闭的系统例如反应器和开放系统中，为了保持高的细菌浓度，大量的能量是必需的，例如补充营养物、充气等等。
如果每单位量细菌的降解能力升高，那么即使在低的细菌浓度下也可获得足够的降解能力，这样避免了为了保持细菌的浓度而投入大量能量的需要。通过表达能降解这些物质的酶，微生物可以降解三氯乙烯，酶的表达需要诱导物。已知在培养时加入诱导物并使微生物与所说诱导物相接触，微生物表现出降解能力，但是以前的研究从未关注过接触时间的长度和增加每单位量细菌降解能力的方法。
包含扩散三氯乙烯-降解微生物进入土壤以影响三氯乙烯降解等的生物-扩增(Bio-augmentation)目前很难得到社会接受，因为释放特异的微生物进入环境就有对生态系统产生难以控制的影响的潜在危险性。但是喷洒经灭菌处理已完全丧失繁殖能力的微生物只相当于喷洒有机物质，因此被认为对生态系统几乎没影响，在日本审查后专利公开号，8(1996)-3012公开的发明声称通过把降解细菌压碎，然后洒进土壤可以最大程度减少对生态系统不合需要的影响。但是应很容易理解的是微生物的压碎过程需要广泛的设备，大量的时间和劳动力，因此实际上喷洒大量降解细菌进入污染的土壤将十分困难。
上述发明通过赞扬压碎的细菌比完整的细菌更易渗透进土壤来进一步列举有利影响，但所说发明并未提及压碎后细菌所保留的降解能力的持久性。而且已知的三氯乙烯-氧化酶需要NAD做为辅酶。因为辅酶十分昂贵，因此提供辅酶至一定浓度将极为困难，此浓度对压碎细菌后从细菌中释放出的酶的降解反应是必需的。
发明内容
因此，本发明的目的是提供新的微生物，它能比传统已知的微生物以更有效的方式降解有机卤代化合物例如三氯乙烯，并提供一种利用所说微生物降解有机卤代化合物的方法。本发明另一种目的是提供一种便宜的方法使得特定微生物释放到环境中后将它对生态系统的影响减至最小。
为了解决上述提到的问题，在广泛研究后发明者成功分离了一种新的微生物，它不属于已知微生物种类中的任一种，与传统已知微生物中任一种相比有很高的降解三氯乙烯的能力，所以完成了本发明。
这样本发明提供一种细菌，它有以下分类学特性：
                      表1
形态                          球形，杆状
革兰氏染色                    +
孢子形成                      -
运动性                        -
与氧的关系                    需氧的
氧化酶检测                    -
过氧化氢酶检测                +
抗酸性                        -
杆-球循环                     +
空气中菌丝体形成              -
细胞壁的肽聚糖类型            内消旋-二氨基庚二酸
羟乙酰基(Glycolyl)检测        -(乙酰基类型)
霉菌酸                        -
DNA中GC含量(mole％)           73(通过HPLC)而且可以降解三氯乙烯。此细菌的一种代表菌株是菌株MO7(FERMBP-5624)。
本发明进一步提供一种方法用以降解有机卤代化合物和/或芳香化合物，所说的方法包括允许所说的细菌作用于所说的有机卤代化合物或/和芳香化合物。其中情况下，有机卤代化合物主要是三氯乙烯，芳香化合物优选酚。
本发明进一步提供一种方法用于在含有有机卤代化合物的土壤、废水、或其它废物中降解有机卤代化合物，该方法包括把所说细菌的培养物加到土壤、废水或其它废物中。就实际应用而言，其中重要的有机卤代化合物是三氯乙烯。
用其中的细菌培养物优选培养的细菌培养的细菌团，可以是活着的细菌团，或是无菌的细菌团。
本发明也提供一种方法用于降解含有有机卤代化合物的土壤、废水或其它废物中的有机卤代化合物，所说的方法包括接种本发明的细菌到该土壤、废水、或其它废物中，加入一种芳香化合物或一种可降解的碳源或它们的混合物到该土壤、废水或其它废物中，然后培养所接种的微生物。其中所用的芳香化合物优选酚的化合物，例如酚，可降解的碳源其中优选糖类，例如葡萄糖。
本发明也提供一种方法用以降解有机卤代化合物和/或芳香化合物，其中能够降解有机卤代化合物和/或芳香化合物的一种微生物无菌化培养的细菌团，允许作用于该有机卤代化合物或芳香化合物。本发明也提供一种方法用以降解含有有机卤代化合物和/或芳香化合物的土壤，废水、或其它废物中的有机卤代化合物和/或芳香化合物，其中能够降解有机卤代化合物和/或芳香化合物的一种微生物无菌化培养的细菌团加入到所说的土壤、废水、或其它废物中。上述方法中，所说的无菌化处理可以是，例如紫外线照射。
本发明也提供了一种有机卤代化合物和/或芳香化合物的降解剂，该降解剂包括本发明细菌的培养细菌细胞。该细菌团可以是成活的细菌团或灭菌化的细菌团。它们的灭菌化处理可以是，如紫外照射。从储存的角度来看，该降解剂中所含的细菌团优选是干燥或冷冻形式的细菌团。
附图简述：
图1表明本发明的MO7菌株在用NJ(邻近结合)方法所构建的种系发生树中的位置。
图2表明本发明的MO7菌株在用UPGMA(平均距离)方法所建的种系发生树中的位置。
图3图示使用本发明的MO7菌株，表明三氯乙烯的初始浓度对降解速率的影响。
图4图示使用本发明的MO7菌株，表明pH对三氯乙烯(初始浓度30ppm)降解速率的影响。
图5图示使用本发明的MO7菌株，表明温度对三氯乙烯(初始浓度30ppm)降解速率的影响。
图6图示使用本发明MO7菌株的死亡细菌细胞(用紫外线照射灭菌)，表明三氯乙烯的初始浓度对三氯乙烯(30ppm的初始浓度)降解速率的影响。
图7图示使用本发明MO7菌株的灭菌(用紫外线照射)和未灭菌培养的细菌细胞表明正在降解的三氯乙烯残存活性的时间过程。
图8图示表示当本发明的MO7菌株培养在含有酚和三氯乙烯的培养基中时的生长曲线(OD)，酚消耗的时间过程和三氯乙烯的降解速率。
图9是图示表示当本发明的MO7菌株培养在含有酚的培养基中时的生长曲线(OD)和酚消耗的时间过程。
图10图示表明依照图9所设定的培养时间过程中，细菌被培养不同时间后由每单位细菌细胞(OD＝1.0)产生的特定的三氯乙烯的降解速率。
图11图示依照图9所提出的培养时间过程中，细胞被培养不同时间后由全部细菌细胞产生的三氯乙烯的降解速率。
图12图示当本发明的MO7菌株培养在含酚(500ppm)的培养基中，当酚消耗完毕后加酚继续培养时的生长曲线(OD)和酚消耗的时间过程。
图13图示在依照图12所提出的培养时间过程中，当细胞被培养不同时间后由每单位细菌细胞(OD＝1.0)所产生的三氯乙烯的特定降解速率。
图14图示在图12的培养时间过程中，当细胞被培养不同时间后由全部细菌细胞产生的三氯乙烯的降解速率。
图15图示通过把本发明的MO7菌株所培养的细菌细胞加入含有三氯乙烯的土壤中，当三氯乙烯被降解时，细菌细胞的量和被降解的三氯乙烯的量之间的关系。
图16图示把本发明的MO7菌株所培养的细菌细胞加入一次和二次时被降解的三氯乙烯的量。
图17图示通过加入本发明的MO7菌株所培养的细菌团，当三氯乙烯被降解时，在土壤中三氯乙烯不同初始浓度下，接种的细菌细胞的量和三氯乙烯降解速率之间的关系。
图18图示通过加入本发明的MO7菌株所培养的细菌细胞至含有三氯乙烯的土壤中，当三氯乙烯被降解时，土壤中残存的三氯乙烯的时间过程。
图19示氯乙烯、1，1-二氯乙烯、顺式-1，2-二氯乙烯和反式-1，2-二氯乙烯的分析方法流程图。
图20示二氯乙酸和三氯乙酸的分析方法流程图。
图21示三氯乙醇分析方法流程图。
图22示水合氯醛分析方法流程图。
图23图示通过加入本发明的MO7菌株所培养的细菌细胞或其灭菌产物到含有三氯乙烯的土壤中，当三氯乙烯被降解时的结果。
图24图示通过加入本发明的MO7菌株所培养的细菌细胞至含有三氯乙烯的土壤中，当三氯乙烯被降解时，温度对三氯乙烯降解速率的影响。
图25图示通过把本发明的MO7菌株所培养的细菌细胞的少量以及诱导剂(酚)加入到含三氯乙烯的土壤中，当三氯乙烯被降解时得到的结果。
图26图示通过把本发明的MO7菌株所培养的细菌群体或生长在谷氨酸上的MO715菌株加入到含三氯乙烯土壤中，当三氯乙烯被降解时得到的结果。
详细说明
本发明的一种有代表性的细菌菌株MO7可以以下列方式分离。例如，分离的来源如土壤或活性污泥培养在含酚的培养基中，在其中繁殖的微生物得到分离。分离物接下来孵育在含有三氯乙烯的培养基中以选择有能力降解三氯乙烯的微生物。微生物分离的方法在实施例1中得到
详细说明。
分离的MO7菌株有以下分类学特性：
                      表2
形态                          球形，杆状
革兰氏染色                    +
孢子形成                      -
运动性                        -
与氧的行为                    需氧的
氧化酶检测                    -
过氧化氢酶检测                +
抗酸性                        -
杆-球循环                     +
空气中菌丝体                  -
细胞壁的肽聚糖类型            内消旋-二氨基庚二酸
羟乙酰基检测                  -(乙酰基类型)
霉菌酸                        -
细胞DNA中GC含量(摩％)         73(通过HPLC)
而且MO7菌株有以下特性：
菌落的颜色                      无特征性菌落颜色形成
菌落周围细胞的延伸              -
细胞壁的阿拉伯半乳聚糖聚合物    -(#1)
#1：使用整个细菌团的一种酸水解产物来评估
调查了MO7菌株的形态学和生理学特征，得到的结果显示于表2。根据上述描述的结果，依据出版物(N.R.Krieg和J.G.Holt，“Bergy’s系统细菌学手册”，第1卷(1984)，Williams和Wilkins；J.G.Holt，N.R.Krieg，P.H.A.Senath，J.T.Staley和S.T.Williams，“Bergy’s系统细菌学手册”，第9版(1984)，Williams和Wilkins)，进行菌株的鉴定，得到的结果是分离出的MO7菌株与任何已知的属或种类并不一致。又克隆了16SrRNA基因，它的序列与已知微生物的序列相比较发现最近的相关者是显示于图1和2中的肿大地杆菌。然而即使是这个生物体最多只有95％的同源性，因此可以断定分离的菌株不属于该种类。因此本发明的细菌菌株被证实为一种新的种类，它不同于任何已知的细菌。
在本发明的方法中，通过允许本发明的细菌作用于有机卤代化合物和/或芳香化合物使有机卤代化合物和/或芳香化合物被降解。被本发明细菌降解的有机卤代化合物包括三氯乙烯，二氯乙烯和氯乙烯。从实际来看，三氯乙烯是最重要的，就芳香化合物而言有酚类化合物，例如酚。
根据本发明的一种实施方案，提供了一种方法用于降解土壤、废水、或其它废物中的有机卤代化合物，该方法包括把本发明的细菌培养物加到土壤、废水或其它废物中。细菌培养物其中包括培养本发明细菌得到的培养物液体，从该培养物液体中分离的细菌团，或存在于培养液体中的灭菌细菌，或分离的灭菌的培养细菌团。
对于本发明细菌的培养，该细菌能够繁殖的任何培养基都可以使用。培养基可以包括碳源，如葡萄糖或蔗糖，一种有机氮源，例如酵母提取液、蛋白胨、或肉汁提取液，或一种无机氮源如铵盐或硝酸盐。也可以含有无机盐包括阳离子如钾离子，钠离子、钙离子、或镁离子，阴离子如氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子。碳源的浓度依照细菌种类在大约0.1％-1％的范围内变化，氮源的浓度依照细菌种类大约在0.01％-1％的范围内变化。无机盐的浓度依照细菌种类在大约0.001％-1％的范围内变化。
培养优选通过有氧的液体培养来进行。有氧的条件可以通过传统方法来确保，例如充气、搅拌、充气和搅拌、或振荡。为了诱导有机卤代化合物三氯乙烯和芳香化合物如酚的降解能力，最好把芳香化合物如酚加到培养基中。在这种情况下，芳香化合物如酚，可以在除了别的碳源以外加入，也可以做为唯一的碳源来加入。加入到培养基中酚的量优选在大约100ppm到1000ppm的范围内。
在一些情况下，本发明的微生物可以以细菌团的形式使用，该细菌团可以通过传统分离细菌细胞的方法来分离，例如离心。当细菌团使用之前储存时，可以转换成冰冻或干燥形式的细菌团。在这种情况下，干燥细菌团的传统方法可以采用，例如冰冻干燥或喷雾干燥。在本发明的实际应用中，为了最大程度减小对环境(微生物相)的影响，可以使用灭菌培养物或灭菌细菌。为了此目的而灭菌的方法中，可以采用传统的方法例如紫外线照射成活的细菌。这样灭菌的细胞或培养物也可以包括在本发明所定义的“培养物”中。
当把本发明的培养物加到要处理的受体时，成活的细菌优选以每克要处理的受体加入106-109个细胞的量，或者有相应降解有机卤代化合物能力的灭菌细菌。
作为一种方法以允许本发明的微生物作用于有机卤代化合物如三氯乙烯，为了降解固体如土壤、液体例如废水(其中引用做为要处理的对象)中所含的有机卤代化合物，只需把本发明的培养物加到或与要处理的对象混合。
根据本发明另一实施方案，通过把本发明的微生物接种到要处理的对象，例如土壤、废水、或其它废物中，然后允许该有机体在其中繁殖，含在要处理对象中的有机卤代化合物例如三氯乙烯可以被降解。因此本发明也提供一种方法降解含有有机卤代化合物的土壤、废水或其它废物中的有机卤代化合物，该方法包括接种本发明的细菌至土壤、废水和其它废物中，加入一种芳香化合物，一种可降解的碳源或它们的混合物到土壤、废水或其它废物中，然后培养接种的微生物。
在这种情况下，糖类例如葡萄糖优选做为可降解的碳源。相对于要处理对象的量而言，碳源的量大约是0.1％-1％。此外当一种芳香化合物加入要处理的对象时，该芳香化合物需要被加入。作为一种芳香化合物，酚，甲苯酚以及诸如此类可以使用。在这种情况下，有机卤代化合物降解以后，加入的芳香化合物还有剩余，那将引起另一种环境污染。所以芳香化合物过多量的加入并不是必需的，相对于要处理的对象，加入芳香化合物的量优选大约100至500ppm。
本发明人已发现，照以上说明制备的本发明培养细菌团，不管是成活还是灭菌的细菌团，都保存降解有机卤代化合物和/或芳香化合物的能力。因此，本发明提供一种方法用以降解含有有机卤代化合物和/或芳香化合物的土壤、废水或其它废物中的有机卤代化合物和/或芳香化合物，其中能够降解有机卤代化合物和/或芳香化合物的微生物灭菌的培养细菌团加入到该土壤、废水或其它废物中。
所使用的灭菌方法包括紫外线照射、环氧乙烷处理、放射、以及诸如此类的方法。灭菌产物有一种出人意料的特性，即在储存过程中对其降解有机卤代化合物的能力而言有更高的稳定性。
本发明也提供了一种有机卤代化合物和/或芳香化合物的降解剂，该降解剂包括本发明的细菌培养物。培养物优选一培养细菌团，它可以是成活细菌团或灭菌细菌团。灭菌处理可以由紫外线照射、环氧乙烷处理、放射或上述描述的其它方法来施行。从储存的观点来看，本发明的降解剂优选选择冷冻或干燥形式，依照上述提到的传统方法可以得到干燥产物。
菌株MO715，本发明的一种代表性的突变(其中做为一种组成性的突变体来引用)，在诱导三氯乙烯降解时并不需要芳香化合物(例如酚)，它可以依照下列方法分离：通过紫外线、放射或有突变活性的化学物质如亚硝基胍的作用使MO7菌株突变，基本突变体从产生的突变体中选择。微生物分离的方法在实施例18中有详细说明。
本发明组成性突变体的培养可以依照母本菌株MO7同样的方式来施行，除了前者的培养并不需要芳香化合物来诱导降解三氯乙烯的能力。培养所用的可降解的碳源优选选择糖类如葡萄糖或氨基酸如谷氨酸。使用的方法也与母本菌株MO7完全相同除了前者的培养不需要芳香化合物来诱导降解三氯乙烯的能力。应当注意的是就降解有机卤代化合物的能力而言，其成活细菌或灭菌细菌有和母本菌株MO7同样的效果。
上述微生物菌株MO7已根据布达佩斯条约的章程于1996年8月12日国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所，保藏号为FERM BP-5624。而上述的微生物菌株MO715，也已根据布达佩斯条约的章程，国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所，保藏号FERM BP-5928。
实施例
参考以下实例本发明将更易理解，然而这些实例只想用来说明解释此发明，不用来限制本发明的范围。
实施例1. 分离MO7菌株并对其16S rDNA进行菌落与测序
本发明使用的微生物以下列方法从活性污泥中分离出来的，此活性污泥来自日本爱知县的废水处理厂。收集的活性污泥的0.1毫升接种于含1％(体积/体积)的维生素溶液(成分显示于表5)的6毫升NMS培养基中，此NMS培养基中加有500ppm的酚，存放于30毫升的小瓶中。
小瓶用丁基橡皮塞塞住，用铝盖密封。然后于3)℃下，160r.p.m振荡培养一段时间，可以从几天到大约十二天。当培养基中观察到混浊，即使是最轻微的混浊后，培养物传代到相同的培养基中，接下来在振荡中继续培养。传代重复四次。第四次传代结束后，培养基做适当稀释，铺板于琼脂板上，此琼脂板通过把1.5％的琼脂加入到含有500ppm的酚的NYG培养基(它的组成显示于表5)中而制备的。出现的菌落挑到琼脂板上并孵育。此操作重复几次以分离微生物。除了上述NYG培养基，在选择培养微生物的最佳条件以后，另一种培养基例如营养培养基也可以使用。
                  表3
             NMS培养基
七水硫酸镁                0.1g
二水硫酸钙                0.2g
硝酸钾                    0.23g
硫酸铵                    0.65g
磷酸二氢钾                0.272g
十二水磷酸氢二钠          0.727g
微量元素溶液              0.5ml
去离子水                  1L
           微量元素溶液
二水乙二胺四乙酸二钠      500mg
七水硫酸铁(II)            200mg
七水硫酸锌                10mg
四水二氯化锰              3mg
硼酸                      30mg
六水氯化钴(II)            20mg
六水氯化镍(II)            2mg
二水钼化钠                3mg
去离子水                  1L
*微量元素溶液分开灭菌，在其它成分灭菌以后再加入。
               表4
           维生素溶液
盐酸硫胺素                3mg
对氨基苯甲酸              13mg
腺嘌呤                    1000mg
NAD                       250mg
维生素B12                 10mg
二磷酸硫胺                100mg
去离子水                  1L
                表5
             NYG培养基
酵母提取液                0.5g
葡萄糖                    0.18g
NMS培养基                 1L
使用白金圈挑出琼脂板上的一种菌落，分离的微生物接种进10毫升NMS培养基中，此培养基含有0.05％的酵母提取液和500ppm的酚，放于18厘米试管中。30℃，130r.p.m振荡培养5天以后，5000r.p.m离心10分钟收获细菌团，然后在4毫米的NMS培养基中重新悬浮。细菌团的悬浮液存放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯的量是使得所有成分同时溶解于液相后三氯乙烯为30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用一铝盖密封。30℃下过夜培养后，小瓶中的气相用配有FID或ECD检测器的气相色谱仪分析。
从得到的结果来看，筛选出了有降解三氯乙烯高能力的细菌菌株，检定了形态学和生理方面的特性得到显示于表2的结果。
基于该结果，参考出版物(N.R.Krieg和J.G.Holt，“Bergy’s系统细菌学手册”第一卷(1984)Williams和Wilkins，J.G.Holt，N.R.Krieg，P.H.A.Senath，J.T.Stanley和S.T.Williams，“Bergy’s系统细菌学手册”第九版(1984)Williams和Wilkins)进行签定，发现此菌株不属于已知的任一种类。此菌种命名为MO7菌株，并于1996年8月12日根据布达佩斯条约的规章，国际保藏于日本通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所，保藏号为FERM BP-5624，
此外，本发明微生物的16S rDNA序列得到确定，并与已知微生物的序列相比较。结果概括如下。
依据Hiraishi(日本微生物生态学联合会杂志Vol.10(1)：31-42，1995)的方法利用PCR扩增本发明微生物的16S rDNA，PCR引物有如下碱基序列：5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3′(SEQ ID NO：1)，和5′-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CGG CAG GTT-3(SEQ IDNO：2)。PCR反应使用热循环仪(Perkin Elmer)依据下列程序来进行：即90℃预热30秒后，96℃，60秒/55℃，120秒/72℃，180秒，30个循环，然后72℃加热300秒。
使用QIA quick(Quiagen)净化扩增的PCR片段，依据Hiraishi的方法(日本微生物生态学联合会杂志Vol.10(2)：81-02，1995)进行测序，此方法直接利用PCR做为模板。用于测序反应的引物有如下碱基序列：5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3′(SEQ ID NO：1)、5′-GGC CGG ACG GGT GAG T-3′(SEQ ID NO：3)、5′-TAC GGG AGGCAG CAG-3′(SEQ ID NO：4)、5′-CTG CCA GCA GCC GCG CG-3′(SEQ ID NO：5)；5′-G ATT AGA TAC CCT GGT AG-3′(SEQ ID NO：6)，5′-ACT CAA AGG AAT TGA CGG-3′(SEQ ID NO：7)、5′-GCAACG AGC GCA ACC C-3′(SEQ ID NO：8)，或5′-TGT ACA CAC CGCCCG T-3′(SEQ ID NO：9)。依据试剂盒中指导的步骤，使用染料终止剂循环测序试剂盒(Perkin Elmer)进行PCR反应，测序样品进行电泳，并使用ABI 373A测序仪(Perkin Elmer)进行序列分析。通过这些程序确定的本发明微生物的16S rDNA碱基序列显示于表6(SEQID NO：10)。
                                  表6
序列：1466个碱基；352A；355C；288T；467G
AACGCTGGCG GCGTGCTTAA CACATGCAAG TCGAACGGTG AAGCTTGGAG CTTGCTTCGA
GTGGATCAGT GGCGAACGGG TGAGTAACAC GTGAGCAACC TGCCCCAGAC TCTGGAATAA
GCGCTGGAAA CGGCGTCTAA TACTGGATAT GTGACGGACC TGCATGGGTA CCGTCTGGAA
AGTTTTTCGG TTTGGGATGG GCTCGCGGCC TATCAGCTTG TTGGTGAGGT AATGGCTCAC
CAAGGCGACA ACGGGTANCC GGCCTGAGAG GGCGACCGGC CACACTGGGA CTGAAACACG
GCCCAAACTC CTACGGGAGG CACCAGTGGG GAAATATTGC ACAATGGGCG AAAGCCTGAT
GCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCCT TCGGGTTGTA AACCTCTTTC AGCAGGGAAG
AAGCGAAAGT GACGGTACCT GCAGAATAAG CACCGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG
TAATACGTAG GGTGCGAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGAGCTT GTAGGCGGTT
TGTCGCGTCT GCTGTGAAAA TCCGGGGCTC AACCCCGGAC TTGCAGTGGG TACGGGCAGA
CTAGAGTGTG GTAGGGGAGA CTGGAATTCC TGGTGTAGCG GTGAAATGCG CAGATATCAG
GAGGAACACC GATGGCGAAG GCAGGTCTCT GGGCCACTAC TGACGCTGAG AAGCGAAAGC
ATGGGGAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCATGC CGTAAACGTT GGGCGCTAGG
TGTGGGACTC ATTCCACGAG TTCCGTGCCG CAGCTAACGC ATTAAGCGCC CCGCCTGGGG
CAGTACGGCC GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGCGGAG
CATGCGGATT AATTCGATGC AACGCGAAGA ACCTTACCAA GGCTTGACAT ATACCGGAAA
CTTCCAGAGA TGGTTGCCCC CTTTGGGTCG GTATACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC
TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTCGTT CTATGTTGCC
AGCACGTCAT GGTGGGGACT CATGGAAGAC TGCCGGGGTC AACTCGGAAG AAGGTGGGGA
TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGTCT TGGGCTTCAC GCATGCTACA ATGGCCGGTA
GAAAGGGCTG CGATACCGCA AGGTGGAGCG AATCCCCAAA AAACCGGTCT CAGTTCGGAT
TGGGGTCTGC AACTCGACCC CATGAAGTCG GAGTCGCTAG TAATCGCAAA TCAGCAACGC
TGCGGTGAAT ACTTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT CAAGTCACGA AAGTTCGGTA
ACACCCGAAG CCGGTGGCCC AACCCTTGTG GGGGGAGCCG TC
得到的碱基序列与国立遗传研究所(DDBJ+DDBJ NEW)的DNA信息库中的信息进行比较，使用程序“blast”在缺少分类等级的情况下进行同源菌株研究。最初选出50个种类具有最高同源性。从它们中间那些被认为与生理分类检测绝对不同的菌株(分支杆菌属有产生霉菌酸的特性)被排除在外。然后对剩余的菌株以及被认为密切相关种类的类型菌株进行多次排序分析。
从得到的结果来看，使用NJ(邻近结合)的方法(图1)或UPGMA(平均距离)方法(图2)(在5′-末端序列排序后进行排序分析)建立种系发生树。最相关的生物体证实为肿大地杆菌(种系发生树包括沉淀分枝杆菌做为参考)。相关菌株(属于同一组的微生物)使用Genetryx-Mac 8.0再一次进行同源研究。但是即使是最相近的肿大地杆菌，其基因同源也只达到95％，判定不是相同的属，因此，可以肯定本发明的微生物是不同于已知任何微生物的一种新微生物。
微生物降解了污染在培养基中约100ppm高浓度三氯乙烯的50％，在24小时内完全降解了约30ppm的三氯乙烯。为了在降解三氯乙烯时伴有微生物的繁殖，有必要把至少一种芳香化合物例如酚加入到含有三氯乙烯的培养基(培养基、土壤、水等等)中。
参考下面的实例，在本发明中使用的微生物将得到更详细的说明。
实施例2
含有0.05％酵母提取液和500ppm酚的100毫升NMS培养基放于500毫升锥形烧瓶中，接种本发明微生物一种菌落的一白金圈菌量，此微生物通过在琼脂板上传代而储存，琼脂板是通过把1.5％的琼脂加到含有500ppm酚的NYG培养基中制备的，或者接种1.0毫升预培养液，此预培养液是通过在30℃含有500ppm酚的NYG培养基中振荡过夜培养本发明微生物而获得的。30℃130r.p.m下振荡培养3天，5000r.p.m离心10分钟收获细菌团，然后重新悬浮在与培养基有相同量的NMS培养基中。
悬浮液的OD600是0.5(细胞数是1×109c.f.u/毫升)细菌团4毫升的悬浮液放在20毫升小瓶中，三氯乙烯加入其中使得所有成分都溶于液体相后其浓度分别为10，50，或30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住并用铝盖密封。30℃振荡过夜培养后，瓶中的气相通常由配有ECD检测器的气相色谱仪来分析。
结果显示于图3，此微生物在24小时内完全降解三氯乙烯。50ppm和100ppm高浓度的三氯乙烯在24小时内分别降解70％和50％。即使三氯乙烯初始浓度高至50至100ppm时，本微生物所降解三氯乙烯的量与三氯乙烯初始浓度为30ppm时降解的量相比并不降低，表明在高浓度的三氯乙烯出现时，本微生物能抵抗降解抑制。因为还没有报告表明高达100ppm的三氯乙烯被微生物降解，本微生物的降解能力是极高的。
实施例3
照实施例2同样方法培养的细菌团通过5000r.p.m离心10分钟而收获，然后重悬于制备的各种不同pH值的M9培养基(Na2HPO4·7H2O12.8克/升，KH2PO4 3克/升，NaCl 0.5克/升，NH4Cl 1.0克/升)中，其体积等于原培养液体。4毫升细菌团的悬浮液存放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液体相后三氯乙烯的浓度为30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用铝盖密封。30℃振荡培养过夜后，瓶中的气相通常由配有ECD检测器的气相色谱仪来分析。按图4所显示，结果表明在pH5或更低活力急剧下降，而在pH6至9降解速率高达100％，即使在pH10活力只略微降至90％。
因此证明MO7菌株剩余细菌降解三氯乙烯最佳pH值在6和9之间，表明在高的pH条件显示高的降解活力。由三氯乙烯的需氧降解产生的三氯乙烯氧化物在碱性环境中自发降解，产生无害的乙醛酸。相反，在酸性条件下它自发降解产生卤酸。因此本微生物三氯乙烯的需氧降解优选在碱性环境中进行。本微生物对于碱性环境下降解三氯乙烯是有用的，因为它在高pH条件下显示出高的降解能力。
实施例4
照实施例2同样方法培养的细菌团通过5000r.p.m离心10分钟而收获，然后悬浮到与培养液体相同体积的NMS培养基中。4毫升细菌团的悬浮液存放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液体相后三氯乙烯的浓度为30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用铝盖密封。每一组在不同温度下于细菌培养箱中振荡培养。三氯乙烯残存浓度通常用配有ECD检测器的气相色谱仪分析瓶中气相来监控。
按图5所显示，结果表明4℃下经过7天三氯乙烯的降解进行缓慢。在37℃下降解在一天内中止，降解速率很低。另一方面，在20℃和30℃下80％至90％在一天内被降解。但是20℃下的降解活性比30℃下高大约10％。被三氯乙烯等污染正在产生问题的地下土壤的温度据说稳定在15至20℃。然而在大多数关于三氯乙烯-降解的报告中，微生物的降解能力在30℃被评估，此温度高于土壤的温度，极少有研究表明在与土壤环境相同温度下降解能力维持在与评估实验相类似的水平。
因为代表微生物降解基本反应的酶反应的反应速率伴随温度下降10℃而降低一半，所以推测比评估实验温度低的土壤中的微生物的三氯乙烯降解速率要下降。在与土壤环境相同的温度下降解能力并未有所下降，本微生物表明有高的实用特征，尽管其机制并不明了。
实施例5
照实施例2同样方法培养的细菌团通过5000r.p.m离心10分钟而收获，然后悬浮到与培养液体相同体积的NMS培养基中。细菌团的悬浮液放在佩特里细菌培养皿中，展开呈大约1毫米的厚度，然后在260纳米波长、时间不少于60秒，距离光源40厘米的条件下用15W紫外线灯照射灭菌。4毫升细菌团的悬浮液在灭菌后放于20毫升小瓶中。加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液相后三氯乙烯的浓度为30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用铝盖密封。30℃下振荡培养，瓶中的气相通常用配有ECD检测器的气相色谱仪来分析。
按图6所显示，结果表明灭菌后细菌团保存了成活细菌80％或更多的三氯乙烯-降解活性。此外，在实验中，以NYG培养基1/100的量取出灭菌细菌团悬浮液接种或悬浮液铺板至NYG琼脂培养基中，30℃下培养，未观察到培养液体混浊度的升高和菌落形成，因此肯定是完全灭菌。灭菌细菌悬浮液储存于4℃时存留的活性与成活细菌团储存三天时几乎相同，该悬浮液比成活细菌团储存七天时有着更高的活性。该结果表明，尽管死亡细菌的初始活性降至成活细菌团的80％，因为在储存过程中死细菌的活性降低的更少一些，所以在储存时保留了比成活细菌团更高的降解三氯乙烯的活性。
通过对微生物进行灭菌而没有破坏具有细胞外环境的细菌团的边缘结构如细胞壁，有可能保存了辅酶等等，这些辅酶在对于表达酶活性所必需的浓度下对三氯乙烯的降解反应是必需的。因此为了维持三氯乙烯降解的活性而补充辅酶是不必要的，散布培养的细菌是唯一所需要的。因此在最低费用和对生态系统最低影响下可能影响三氯乙烯等的净化。
实施例6
含有0.05％酵母抽提液和500ppm酚的4毫升pH培养基(组成见表8)放于20毫升小瓶中，通过从琼脂板上挑取本微生物一种菌落的一白金圈菌量接种本微生物，此琼脂板通过把1.5％的琼脂加到含有500ppm酚的NYG培养基中而制备，或者接种0.01毫升(细菌数是106细胞/毫升)预培养液，此预培养液是通过在30℃，含有500ppm酚的NYG培养基中振荡过夜培养本微生物而获得的。
                  表7
              pH培养基
七水硫酸镁                0.2g
硫酸钙                    0.1g
六水氯化铁                0.02g
磷酸氢二钾                1.0g
硫酸铵                    1.0g
氯化钠                    0.1g
去离子水                  1L
加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液相再同时加上接种以及500ppm酚以后三氯乙烯浓度为30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用铝盖密封。30℃下振荡培养，三氯乙烯的浓度通常用配有ECD检测器的气相色谱仪分析瓶中气相而测量。通过用0.45μ滤膜过滤培养液，往1毫升过滤液中按顺序加入0.1毫升K3Fe(CN)6/0.1M甘氨酸水溶液、1毫升4-氨基安替比林水溶液，然后混合，于505纳米下测量吸收值确定酚浓度。
显示于图8中的结果表明随着细菌团的繁殖，酚和三氯乙烯下降，培养31小时后它们完全降解。因此可以肯定在有诱导三氯乙烯能力的芳香化合物如酚存在条件下繁殖时，本微生物有着高的降解三氯乙烯的活性。与已知的微生物相比，除了报道洋葱假单胞菌KK01在2天内把30ppm的三氯乙烯降解至15ppm和报道真养产碱杆菌KS01(日本未审查专利公开号7(1995)-123976)在4天内完全降解50和25ppm的三氯乙烯外，所有报告都只谈论到在10ppm的低浓度下降解三氯乙烯。
在由真养产碱杆菌(日本未审查专利公开号7(1995)-123976)降解三氯乙烯时，接种到培养基中微生物的量是108个细胞/毫升，相当于实施例6中叙述的本微生物的100倍。为了降解三氯乙烯所要求的本发明微生物的细菌的量远远少于真养产碱杆菌KS01。其好处是降低了培养的费用。也可以肯定的是加入并混合的酚被降解到检测水平以下，因此几乎没有了由酚这个环境污染物所造成的环境污染的危险性。
为了提高微生物的降解能力，此微生物在土壤中有降解三氯乙烯的能力，并制备有降解能力的微生物，此微生物能处理高浓度的污染，发明者在接种前集中并调查培养方法。做为一种结果我们发现在接种以前有一种微生物培养时间最佳值，并且通过向培养基中加入诱导物增强降解三氯乙烯的能力，我们已完成了本发明。参考下列例子，本发明会得到更完全的解释。
实施例7
含有0.05％酵母抽提液和500ppm酚的100毫升pH培养基放于500毫升锥形烧瓶中，接种本发明微生物一种菌落的一白金圈菌量，此微生物通过在琼脂板上传代而储存，琼脂板是通过把1.5％的琼脂加到含有500ppm酚的NYG培养基中制备的，或者接种1.0毫升预培养液，此预培养液是通过在30℃，含有500ppm酚的NYG培养基中振荡过夜培养本发明微生物而获得的。在30℃，130r.p.m振荡培养时，按照实施例6中相同的方法确定培养液的混浊度和酚的浓度。通过5000r.p.m离心10分钟收获培养液中的细菌，然后悬浮到与培养基相同体积的NMS培养基中。悬浮液的OD600是0.2(细菌数是1×108c.f.u/毫升)。
细菌团的悬浮液放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液相后三氯乙烯的浓度为30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用铝盖密封。30℃下振荡培养24小时后，瓶中的气相由配有ECD检测器的气相色谱仪来分析。结果显示于图9至图11。图9中的线图代表培养液的混浊度和酚的浓度。图10中的条状图代表在各个不同培养时间的收获的本发明微生物每单位量细菌团的降解活性(比活性)。图11中的条状图代表在各个不同培养时间收获的本发明微生物每单位量培养液的降解活性(总活性)。
从上述获得的关于三氯乙烯降解活性的结果来看，从诱导期到对数生长期特异活性显著增加，以后在一定水平上持平。但是在残余的酚变成零后它逐渐降低。然而当酚的浓度变为零时，在静止期总活性仍保持最高值。这些观察表明在接种进土壤以前，培养的同时监控培养液的混浊度和酚的浓度，并在混浊度的增长停止进入静止期以及酚浓度大约降为零时终止培养，可以获得有着三氯乙烯降解高活性的细菌团。
实施例8
本发明微生物按照类似于实施例7的方法培养培养液的混浊度和酚浓度按类似于实施例6的方法测定。此外，在培养中当酚浓度接近零时500ppm的酚再次加入，培养继续进行。5000r.p.m.离心10分钟收获培养液中的细菌团，然后重悬到与培养基相同体积的NMS培养基。
悬浮液的OD600是0.2(细菌数是2.5×108c.f.u/毫升)。细菌团的悬浮液放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液相后三氯乙烯的浓度为30ppm，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住后，用铝盖密封。30℃下振荡培养24小时后，瓶中的气相由配有ECD检测器的气相色谱仪分析。
结果显示于图12至图14。图12中的线图代表收获以前培养阶段培养液的混浊度和酚的浓度。图10中的条状图代表在各个不同培养时间收获的本发明微生物的比活性。图14中的条状图代表在各个不同培养时间收获的本发明微生物的总活性。培养45小时当残存酚变为零时，500ppm的酚加入培养液，酚的浓度再次降低，培养液的混浊度升高。当69小时时再次加入酚，既没有观察到培养液混浊度的升高，也没有观察到酚浓度的降低。
关于三氯乙烯降解活性，按图13中所显示，在41至60小时之间的静止期，当仍保留有足够酚时可获得高的比活性，但是当酚浓度降低以后比活性降低。在93小时时加入酚，细菌团的量和比活性都降低。然而在93至114小时此期间当仍有残存酚时，比活性高于45至69小时时大部分酚被降解时的特异活性。另一方面，假如总活性比只在培养开始时加酚的总活性高2.5倍，当细菌的量和比活性都高时，总活性在60小时时最好。
参考下列实施例，下面将会解释土壤中三氯乙烯的降解。
实施例9
往100毫升小瓶中加入人为用三氯乙烯污染的30克沙土(空气干燥)。本发明微生物于30℃在1.5毫升，4.5毫升，7.5毫升，15毫升或30毫升NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm的酚和0.05％酵母抽提液，离心收获细胞，重悬于合适量的NMS培养基中使得在细菌的悬浮液加入以后土壤中水含量为25％。细菌团的悬浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，并用铝盖紧封，然后允许在30℃下保持一定时间。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去离子水，此去离子水是用通过活性碳和10毫升正己烷的空气充气，然后密封小瓶。小瓶在超声波清洗机上超声处理10分钟，然后在振荡器上振荡10分钟。分离出的正己烷用配有ECD检测器的气相色谱仪分析，显示于图15的结果表明直至细菌的密度达到2.5×108cfu/克湿土壤(15毫升培养液)三氯乙烯的降解和细菌的密度才相互关联，但当密度达到约5×108cfu/克湿土壤(30毫升培养液)或更高，则变为饱和。因此表明当本发明微生物用于降解三氯乙烯时，大约2.5×108cfu/克湿土壤的细菌密度是最合适的，并且本发明微生物有一特征，对于净化土壤中给定浓度污染物所需细菌有一最小的评估值。
实施例10
往100毫升小瓶中加入人为用三氯乙烯污染的30克沙土(空气干燥)。本发明微生物于30℃在7.5毫升NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm酚和0.05％酵母抽提液，然后离心收获细胞，重悬于合适量的NMS培养基中使得在细菌的悬浮液加入以后土壤中水含量为25％。细菌的悬浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，并用铝盖紧封，然后允许在30℃下保持一定时间。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去离子水，此去离子水是用通过活性碳和10毫升正己烷的空气充气，然后密封小瓶。小瓶在超声波清洗机上超声处理10分钟，然后在振荡器上振荡10分钟。分离出的正己烷用配有ECD检测器的气相色谱仪分析。显示于图16中的结果表明对应于7.5毫升培养液的细菌团向土壤中加入两次，其降解速率等于对应于15毫升培养液的细菌团加入一次。就实际所需要的量而言(污染土壤实际的量多于几十立方米)，一次补充降解污染土壤中所含三氯乙烯所需培养液的量是很困难的，降解微生物必需连续培养并加入土壤中。结果表明本发明微生物的连续加入产生了与所需细菌团一次加入时相同的效果。因此，通过重复加入小量的培养液体，本发明的微生物可以处理大面积的污染地点，而这样的地点对于一次性培养和加入细菌团则是不够的。
实施例11
往100毫升小瓶中加入人为用所需浓度的三氯乙烯污染的30克沙粒状土壤(空气干燥)。土壤中污染物的浓度分别设为15、30、45、100和150毫克/千克。本发明微生物于30℃在15、30和45毫升NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm酚和0.05％的酵母抽提液，然后离心收获细胞，重悬于合适量的NMS培养基中使得在细菌团的悬浮液加入以后土壤中水含量为25％。细菌团的悬浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，并用铝盖紧封，然后允许在30℃下保持一定时间。土壤中细菌团的浓度为9.4×108，1.9×109，2.8×109cfu/克湿土壤，分别对应于15、30和45毫升培养液。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去离子水，此去离子水是用通过活性碳和10毫升正己烷的空气充气，然后密封小瓶。小瓶在超声波清洗机上声处理10分钟，然后在振荡器上振荡10分钟。分离出的正己烷用配有ECD检测器的气相色谱仪分析。显示于图17中的结果表明土壤中非常高浓度(约150毫克/千克)的三氯乙烯能被降解。上述结果表明因为三氯乙烯降解量的增加与加到土壤中细菌团的量成正比，所以通过增加加入细菌的量或者连续加入来加强高浓度(约150毫克/千克)污染物的净化。
实施例12
往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人为用三氯乙烯污染的30克沙土(空气干燥)。本发明微生物于30℃下在NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm酚和0.05％的酵母抽提液，然后离心收获细胞，重悬于合适量的NMS培养基中使得在细菌团的悬浮液加入以后土壤中水含量为25％。细菌团的接种量为108至109细胞/克湿土壤。细菌团的悬浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允许在30℃下保持一定时间。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去离子水，此去离子水是用通过活性碳和10毫升正己烷的空气充气，然后密封小瓶。小瓶在超声波清洗机上声处理10分钟，然后在振荡器上振荡10分钟。分离出的正己烷用配有ECD检测器的气相色谱仪分析，通过在同一时间内制备多个样品，经过给定的时间后抽提部分样品的整个体积，接着测定来确定土壤中三氯乙烯浓度改变的时间过程，抽提前样品储存于4℃。
土壤中三氯乙烯浓度的测定使用涉及土壤污染的环境标准(土壤环境标准)中所指示的方法来施行。这样土壤样品和溶剂(盐酸加到净化的水中，pH调至5.8至6.3)以10％的重量体积比加到带有螺旋插口的锥形烧瓶中，螺旋插口带一搅拌棒，烧瓶立刻密封。此时应小心使得混合物的体积不少于500毫升，以尽量减少相对于混合物体积的带有螺旋插口的锥形烧瓶中头部空间。制备的样品液体保持在常温常压下用磁力棒连续搅拌4小时。
样品液体允许放置30分钟后，抽取到一种玻璃注射器中。带有0.45μ孔径滤膜的滤器连到注射器上，压挤活塞以排除空气和开始几毫升液体，滤出液体分部收集到带有塞子的试管中，从中称出用以测量的量，用气相色谱仪进行分析，显示于图19中的结果表明加入细菌团后一天之内土壤中全部三氯乙烯的90％被降解。
它表明通过把本发明微生物加入土壤来净化三氯乙烯的方法是一项技术，它有着高的净化能力，几乎等于一天之内降解土壤中约18毫升/千克三氯乙烯的能力。依据国家(环境标准，涉及土壤污染的土壤环境标准)设计的分析方法测定放置7天时的土壤样品，三氯乙烯的浓度低于基础值(0.03ppm)。做为一种结果，它表明通过使用本发明微生物来净化污染的土壤，三氯乙烯可以净化到满足环境标准的水平。目前公认物理处理方法例如真空抽提不能从低浓度中净化，但是使用本发明微生物可以使净化达到低于基础值的水平。
实施例13
往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人为用三氯乙烯污染的30克沙土(空气干燥)。本发明微生物于30℃下在NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm酚和0.05％的酵母抽提液，然后离心收获细胞，重悬于合适量的NMS培养基中使得在细菌团的悬浮液加入以后土壤中水含量为25％，细菌团的接种量为108至109细胞/克湿土壤。细菌团的悬浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允许在30℃下放置特定的时间。此后对据说伴随土壤中三氯乙烯降解而形成的副产品进行分析。
土壤中的副产品按以下分析：氯乙烯，1，1-二氯乙烯，顺式-1，2-二氯乙烯和反式-1，2-二氯乙烯按图19中显示的方法进行分析。二氯乙酸和三氯乙酸、三氯乙醇和水合氯醛分别按图20、21和22中显示的方法进行分析。显示于表9中的结果表明所有副产品都低于检测范围以下。
在厌氧条件下三氯乙烯的脱氯反应导致二氯乙烯的聚集，此物毒性更大。已知在有氧条件下以形成三氯乙烯氧化酶为起始的降解过程产生二氯乙酸等等做为中间产物，对于由本发明微生物在土壤中降解三氯乙烯，无有害物质的积累。尽管除了测定过物质以外其它物质的出现还未知，但此技术是一种高度安全的方法。
                       表8
分析的项目            结果        检测极限
氯乙烯                未检测到    0.01ppm
1，1-二氯乙烯         未检测到    0.01ppm
顺式-1，2-二氯乙烯    未检测到    0.01ppm
反式-1，2-二氯乙烯    未检测到    0.01ppm
二氯乙酸              未检测到    0.05ppm
三氯乙醇              未检测到    0.01ppm
三氯乙酸              未检测到    0.05ppm
水合氯醛              未检测到    0.05ppm
实施例14
往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人为用三氯乙烯污染的30克沙土(空气干燥)。本发明微生物于30℃下在NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm酚和0.05％的酵母抽提液，然后离心收获细胞，重悬于合适量的NMS培养基中使得在细菌团的悬浮液加入以后土壤中水含量为25％，细菌团的接种量为108至109细胞/克湿土壤。把细菌团的悬浮液铺盘于佩特里细菌培养皿中呈约1毫米厚度，然后在260纳米波长，时间不少于60秒，距离光源40厘米的条件下用15W紫外灯照射灭菌。本发明微生物的细菌团悬浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允许在30℃下放置一定的时间。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去离子水，此去离子水是通过活性碳和10毫升正己烷的空气充气，然后密封小瓶。小瓶在超声波清洗机上声处理10分钟，然后在振荡器上振荡10分钟。分离出的正己烷用配有ECD检测器的气相色谱仪分析。此外，在实验中，灭菌细菌团悬浮液以NYG培养基1/100的量取出接种或悬浮液铺板至NYG琼脂培养基中，30℃下培养，未观察到培养液体混浊度的升高和菌落形成，因此肯定是完全灭菌。显示于图23中的结果表明死细胞和活细胞产生相同程度的三氯乙烯的降解。
尽管使用微生物的大多数净化方法包括把成活生物体加到土壤中，但目前从公众接受的观点来看把细菌加入土壤是困难的。担心通过释放特异微生物进入环境就存在对生态系统产生难以控制的影响的潜在危险性。但是加入经灭菌处理已完全丧失繁殖能力的微生物只相当于加入有机物质，因此被认为对生态系统几乎无影响。所以进行一项实验，其中研究把用紫外线灭菌的降解微生物加入土壤中，结果表明死亡细菌的加入被证实是一种极其有用的方法。
发表在日本未审查专利公开号8(1996)-3012的发明声称通过把降解细菌压碎，然后洒进土壤可以最大程度减少对生态系统的影响。但是应很容易预想的是把大量降解细菌喷洒进污染的土壤中实际是困难的，因为微生物的压碎需要广泛的设备，大量的时间和劳动力。而且已知有三氯乙烯-氧化活性的酶需要NAD做为辅酶。因为辅酶十分昂贵，因此提供辅酶至一定浓度将极为困难，此浓度对压碎细菌后从细菌群体中释放出的酶的降解反应是必需的。另一方面，使用本发明微生物的方法没有这样的问题，可以使三氯乙烯等的净化在低费用、及对生态系统产生最小影响的情况下进行。
实施例15
往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升瓶中加入人为用三氯乙烯污染的30克沙土(空气干燥)。本发明微生物于30℃下在NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm酚和0.05％的酵母抽提液，然后离心收获细胞，重悬于合适量的NMS培养基中使得在细菌团的悬浮液加入以后土壤中水含量为25％，细菌团的接种量为108至109细胞/克湿土壤。把细菌团的悬浮液铺盘于佩特里细菌培养皿中呈约1毫米厚度，然后在260纳米波长，时间不少于60秒，距离光源40厘米的条件下用15W紫外灯照射灭菌。
本发明灭菌微生物的悬浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允许在30℃下放置一定的时间。此后，土壤中的三氯乙烯降解，并对被认为伴随三氯乙烯降解而形成的副产品按实施例13相类似的方法进行分析。此外，在实验中，灭菌细菌团悬浮液以NYG培养基1/100的量取出接种，或悬浮液铺板至NYG琼脂培养基中，30℃下培养，未观察到培养液体混浊度的升高和菌落的形成，因此肯定是完全灭菌。
显示于表10中的结果表明所有副产品都低于检测范围以下，在无氧条件下三氯乙烯的脱氯反应导致二氯乙烯的聚集，此物毒性更大。已知在有氧条件下以形成三氯乙烯氧化酶为起始的降解过程产生二氯乙酸等做为中间产物。对于由本发明微生物在土壤中进行的三氯乙烯的降解，无有害物质的积累。尽管除了测定过的物质以外其它物质的出现还未知，但仍表明此技术是一种高度安全的方法。
                      表9
分析的项目            结果         检测限度
氯乙烯                未检测到     0.01ppm
1，1-二氯乙烯         未检测到     0.01ppm
顺式-1，2-二氯乙烯    未检测到     0.01ppm
反式-1，2-二氯乙烯    未检测到     0.01ppm
二氯乙酸              未检测到     0.05ppm
三氯乙醇              未检测到     0.01ppm
三氯乙酸              未检测到     0.05ppm
水合氯醛              未检测到     0.05ppm
实施例16
往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人为用三氯乙烯污染的30克沙土(空气干燥)。本发明微生物于30℃下在NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm酚和0.05％的酵母抽提液，然后离心收获细胞，重悬于合适量的NMS培养基中使得在细菌团的悬浮液加入以后土壤中水含量为25％，细菌团的接种量为108至109细胞/克湿土壤。本发明微生物的悬浮液(不合酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允许在20℃下放置一定的时间。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去离子水，此去离子水是用通过活性碳和10毫升正己烷的空气充气，然后密封小瓶。小瓶在超声波清洗机上声处理10分钟，然后在振荡器上振荡10分钟。分离出的正己烷用配有ECD检测器的气相色谱仪分析。
显示于图24中的结果表明，三氯乙烯在20℃时被降解的程度等于30℃下降解的程度。因为这表明三氯乙烯在土壤温度下充分降解，所以与其它相比，本发明微生物被证实有高的实际应用性。
实施例17
往100毫升小瓶中加入人为用三氯乙烯污染的30克沙粒状土壤(空气干燥)。本发明微生物于30℃下在NMS培养基中振荡培养3天，NMS培养基中含有500ppm酚和0.05％的酵母抽提液，在土壤中分别含有500ppm，0.02％和1mM酚、酵母抽提液和葡萄糖的培养液以NMS培养基(或pH培养基)1/100的体积加入，然后加到土壤中。细菌密度设定为106细胞/克湿土壤。水含量在培养液加入时设定为25％。
小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮隔塞住，然后允许在30℃下保持一定时间。此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去离子水，此去离子水是用通过活性碳和10毫升正己烷的空气充气，然后密封小瓶。小瓶在超声波清洗机上声处理10分钟，然后在振荡器上振荡10分钟。分离出的正己烷用配有ECD检测器的气相色谱仪分析。
显示于图25中的结果表明土壤中的三氯乙烯在NMS培养基和pH培养基中很相似地从14毫克/千克降至1毫克/千克。由于酚加入到土壤中，土生土长的微生物也参与了三氯乙烯的降解，但结果表明更大的效果来自于MO7菌株的加入。尽管存在土生土长的微生物，可以很清楚地排除这个可能性，即菌株既在灭菌培养基中又在自然环境中施加影响。可以肯定既使在自然环境下，菌量为106细胞/克湿土壤，加入酚可充分诱导MO7菌株的活性。
实施例18建立一种组成性突变体
挑取本发明微生物一种菌落一白金圈菌量，此菌通过在含1.5％琼脂的琼脂板上传代而储存，接种于含2ml 1/3 LB培养基(其成分见表11)的试管中。30℃，130r.p.m.振荡过夜培养以后，液体培养基中的一小份按适当比例稀释，然后铺板于含1.5％琼脂的1/3 LB培养基上。30℃下培养后计录细胞的数目。液体培养基剩余部分铺盘于佩特里细菌培养皿中，然后在260纳米波长，照射时间3分钟，距离光源30厘米的条件下接受15W紫外灯的照射。
            表10
1/3                 LB培养基
蛋白胨              3.0克
酵母抽提液          1.5克
氯化钠              3.0克
去离子水            1.0升
然后液体培养基按适当比例稀释后，铺板于含1.5％琼脂的1/3 LB培养基上。30℃下培养计录细胞的数目以确定死亡率。当观察到99％或更高的死亡率时，可以认为有足够的突变。从此点的液体培养基中选择所需要的突变型。
邻苯二酚2，3-二加氧酶(C230)通过metafission把氧引入邻苯二酚形成2-羟基己二烯二酸半醛。产物是黄色。当C230喷洒后表明时，很容易变为黄色。利用酚的三氯乙烯-降解细菌的三氯乙烯降解酶已知是酚羟化酶(PH)，它能把酚转换成邻苯二酚(M.Fujita et al.，发酵生物工程杂志，79：100，1995；V.Shingler et al.，细菌学杂志，174：711，1992)。
已知一种例子，C230通过一种操纵子来表达，其中操纵子中尽管C230本身不直接参与三氯乙烯的降解，但C230基因邻近PH基因(M.Fujita et al.，发酵生物工程杂志，79：100，1995；V.Shingler et al.，细菌学杂志，174：711，1992)。如果C230伴随PH而表达，则有可能使用C230做为指示剂来选择三氯乙烯-降解酶表达的菌株。当使用酚做为唯一碳源来培养时，本发明的微生物会降解酚，液体培养基随着细菌的生长而变黄。这使得所说的选择方法应用于微生物。
相应的，突变后细菌团悬浮液按适当比例稀释后，铺板于含1.5％琼脂的1/3 LB培养基上。30℃下培养1至3天后，喷洒邻苯二酚溶液(0.1％(重量/体积)乙醚溶液)。
当死亡率达到99.99％时，研究紫外线照射后出现的约10000个菌落，选择出16个黄色菌落。
当菌落在1/3 LB液体培养基中培养以后，铺板于含1.5％琼脂的1/3 LB培养基上。30℃下培养以后，出现的菌落用邻苯二酚溶液喷洒，再次分离黄色菌落以得到能基本表达C230的菌株。
挑取一白金圈能基本表达C230的菌株，接种进装在20毫升小瓶的M培养基中(成分显示于表12)，M培养基中含有4毫升谷氨酸钠(0.1％)。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住后，用铝盖密封，然后30℃下振荡培养2天。然后加入三氯乙烯使得所有成分都溶于液相后三氯乙烯浓度为30ppm。30℃下培养5天，三氯乙烯的浓度按实施例6中方法来确定。
            表11
                      M培养基
硝酸铵                3.0克
磷酸氢二钠            2.2克
磷酸二氢钾            0.8克
七水硫酸铁(II)        10.0毫克
二水硫酸钙            10.0毫克
七水硫酸镁            10.0毫克
酵母抽提液            50.0毫克
去离子水              1.0升，pH7.0
结果表明母本MO7菌株几乎不降解三氯乙烯，但基本表达C230的一些菌能降解30ppm三氯乙烯中的52至34％。这些微生物证实是起源于母本MO7菌株的突变体，在不需要酚时能降解三氯乙烯。
参考这个实施例，使用具有降解三氯乙烯最高活性的MO715菌株说明土壤中三氯乙烯的降解。
实施例19由组成性突变体进行三氯乙烯的降解
按例9中制备人为用三氯乙烯(11毫克/千克土壤)污染的土壤。MO715菌株于30℃，100毫升含有谷氨酸钠(0.1重量/体积％)的M培养基中振荡培养2天，然后离心收获细胞，重悬于合适量的M培养基中使得土壤中水含量为25％。细菌悬浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮隔塞住，允许在30℃下放置一定的时间。三氯乙烯按类似于实施例9中的方法来分析。培养于酚和MO7菌株上的液体培养基也按类似方法分析。
做为一种结果，用谷氨酸钠培养的MO715菌株细菌悬浮液加入以后，12小时内约35％三氯乙烯降解，48小时内60％三氯乙烯降解。生长于谷氨酸钠上的MO7菌株几乎没有降解三氯乙烯。这表明本发明微生物不需要酚的诱导，也能在土壤中降解三氯乙烯。
从前面叙述中可以判断，本发明是一种非常安全的技术，因为不把有毒物质例如酚扩散进入环境，也可以降解三氯乙烯。
参照布达佩斯条约下的国际保藏
国际保藏机构：日本通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所
地址：日本赤城县筑波市东1丁目1番3号
鉴定号      保藏号             保藏日期
MO7         FERM BP-5624       1996年8月12日
MO715       FERM BP-5928       1997年4月24日
                      序列表
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TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGTCT TGGGCTTCAC GCATGCTACA ATGGCCGGTA    1200
CAAAGGGCTG CGATACCGCA AGGTGGAGCG AATCCCCAAA AAACCGGTCT CAGTTCGGAT    1260
TGGGGTCTGC AACTCGACCC CATGAAGTCG GAGTCGCTAG TAATCGCAAA TCAGCAACGC    1320
TGCGGTGAAT ACTTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT CAAGTCACGA AAGTTCGGTA    1380
ACACCCGAAG CCGGTGGCCC AACCCTTGTG GGGGGAGCCG TC                       1422

Claims (34)

1.一种具有如下特征的细菌，
形态                       球形，杆状
革兰氏染色                 +
孢子形成                   -
运动性                     -
与氧的关系                 需氧型
氧化酶检测                 -
过氧化氢酶检测             +
抗酸性                     -
杆-球循环                  +
空气中菌丝体形成           -
细胞壁的肽聚糖类型         内消旋-二氨基庚二酸
羟乙酰基检测               -，乙酰基类型
霉菌酸                     -
DNA中GC含量，mole％        73，通过HPLC，它可以降解三氯乙烯。
2.权利要求1的细菌，其为MO7菌株，保藏号为FERMBP-5624。
3.一种降解三氯乙烯和/或酚化合物的方法，包括使三氯乙烯和/或酚化合物接受权利要求1或2的细菌的作用。
4.一种降解含有三氯乙烯的土壤、废水或其它废物中的三氯乙烯的方法，包括将权利要求1或2的细菌的培养物加到土壤、废水或其它废物中。
5.权利要求4的方法，其中酚化合物加到培养基中用于培养，以获得细菌的培养物。
6.权利要求5的方法，其中一可降解的碳源被加到培养基中用以获得细菌的培养物。
7.权利要求6的方法，其中可降解的碳源是葡萄糖。
8.权利要求4至7任一项的方法，其中培养物是培养的细菌细胞。
9.权利要求8的方法，其中培养的细菌细胞是成活的细菌细胞。
10.权利要求8的方法，其中培养的细菌细胞是灭菌化的培养的细菌细胞。
11.权利要求10的方法，其中灭菌处理是紫外线照射。
12.一种降解含有三氯乙烯的土壤，废水或其它废物中的三氯乙烯的方法，包括以下几步：接种权利要求1或2的细菌至土壤、废水或其它废物中，加入一种酚化合物、一种可降解的碳源或它们的混合物至土壤、废水或其它废物中，然后培养接种的微生物。
13.权利要求12的方法，其中可降解的碳源是葡萄糖。
14.降解三氯乙烯和/或酚化合物的方法，其中培养的权利要求1或2的细菌的细胞被允许作用于三氯乙烯和/或酚化合物。
15.一种降解含有三氯乙烯和/或酚化合物的土壤、废水或其它废物中三氯乙烯和/或酚化合物的方法，其中灭菌的、培养的权利要求1或2的细菌的细胞被加入到所说的土壤、废水或其它废物中。
16.权利要求15的方法，其中灭菌处理是紫外线照射。
17.一种三氯乙烯和/或酚化合物的降解剂，包括权利要求1或2的细菌的培养物。
18.权利要求17的降解剂，其中培养物是培养的细菌细胞。
19.权利要求18的降解剂，其中培养物是成活的细菌细胞。
20.权利要求18的降解剂，其中培养的细菌细胞是灭菌化的细菌细胞。
21.权利要求20的降解剂，其中灭菌处理是紫外线照射。
22.权利要求17至21任一项的降解剂，它是干燥细菌细胞的形式。
23.一种细菌，它是菌株MO715，保藏号为FERM BP-5928。
24.一种降解三氯乙烯和/或酚化合物的方法，包括允许权利要求23的细菌作用于三氯乙烯和/或酚化合物。
25.一种降解含有三氯乙烯的土壤、废水或其它废物中三氯乙烯的方法，包括把权利要求23的细菌的培养物加到土壤、废水或其它废物中。
26.权利要求25的方法，其中没有酚化合物加到培养基中用以培养以获得所说细菌的培养物。
27.权利要求26的方法，其中一可降解的碳源被加到培养基中用以培养以获得所说细菌的培养物。
28.权利要求27的方法，其中可降解的碳源是谷氨酸。
29.权利要求25至28任一项的方法，其中培养物是培养的细菌细胞。
30.权利要求29的方法，其中培养的细菌细胞是活的细菌细胞。
31.权利要求29的方法，其中培养的细菌细胞是灭菌化的细菌细胞。
32.权利要求31的方法，其中灭菌处理是紫外线照射。
33.一种降解含有三氯乙烯的土壤、废水或其它废物中的三氯乙烯的方法，包括以下几步：接种权利要求23的细菌至土壤、废水或其它废物中，加入一种可降解的碳源至土壤、废水或其它废物中，然后培养接种的微生物。
34.权利要求33的方法，其中可降解的碳源是谷氨酸。
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