CN1307595A - 从聚酰胺制备物中除去不需要的单酰胺化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了在约2到约6的pH下,通过使用能将酰胺分子转化成酸分子的诱导的微生物菌株的纯培养物,将酰胺单体化合物转化成对应酸化合物,而从聚酰胺或聚合酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体化合物的方法。

Description

从聚酰胺制备物中除去不需要的单酰胺化合物的方法
1. 发明领域
本发明涉及从聚合的酰胺或聚酰胺制备物中除去不需要的单酰胺化合物，如使用能从聚合制备物中除去单体化合物的诱导微生物株的纯培养物来从约2到小于6的pH的聚丙烯酰胺制备物中除去不需要的丙烯酰胺单体的方法。
2. 发明背景
腈是可用于合成各种各样的化合物，包括胺、酰胺、脒、羧酸、酯、醛、酮、亚胺和杂环的用途极多的化合物。商业上最重要的腈之一是乙腈，它是一种常用溶剂。其它腈化合物被用作除草剂或用于合成去污剂或防腐剂。另一种商业上最重要的腈是丙烯腈，它被用来制造丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸纤维、共聚物树脂和腈橡胶。
一种生产丙烯腈的方法是使用SOHIO/BP过程，它需要在催化剂存在下，通过空气中的氨蒸汽对丙烯直接进行氨氧化反应(a/k/a丙烯)(一般见 丙烯腈，1979，加工经济学计划报告，Stanford Research International，Menlo Park，CA；Weissermel和Arpe，1978， 工业有机化学，Verlag Chemie-Weinheim New York，pp.266-270)。这种加工得到的废液中含有腈的复杂混合物，包括高浓度的二腈、酰胺和酸。更具体说，废液一般含有乙腈、丙烯腈、琥珀腈和富马腈等腈和丙烯酰胺。另外，常常存在各种浓度和/或高浓度的氰化物。废液常含有高浓度和/或各种浓度的硫酸铵。这种有害废液由于其毒性，不能释放入环境，而且在美国，常通过注入地下岩层的深井来埋掉。这种埋藏不能被认为是废液“处理”，而只是类似于填埋过程。
在美国之外，通过将废液稀释到约250ppm或更低的低总腈浓度，并用常规通气生物废液系统(即活性污水污泥)处理(在潮湿/空气氧化除去挥发物，并部分氧化许多有机组分后)来“处理”丙烯腈生产中的废液已是一般惯例。由于下列理由，这种“处理”方法并不适于充分处置腈生产设备废液：(1)潮湿/空气氧化导致挥发性化合物挥发，产生了空气污染问题；(2)废液的稀释需要大型废水处理设备来解决获得充分“处理”所需的流动和长停留时间；和(3)潮湿/空气氧化联合活化污水污泥生物处理导致高处理费用。在腈生产工业中对高效的、成本实在的、环境保护良好的处置腈生产厂废液的方法，仍有长期和急切的需要。
早已知道，某些微生物可用于将腈化合物生物转化成其对应的酰胺或酸化合物。科学和专利文献有许多描述转化腈的微生物在生产具体化学药品，如从丙烯腈生产酰胺和丙烯酸或丙烯酸酯中的用途。一般见，Kobayshi等，1992，生物技术趋势，10：402-408。已显示，转化腈的微生物含有包括：腈酶(将腈化合物转化成其对应酸化合物)；腈水解酶(将腈化合物转化成其对应酰胺化合物)；和酰胺酶(将酰胺化合物转化成其对应酸化合物)等活性。
然而，对于本发明者的知识，在所有这些使用腈降解微生物的具体化学生产中，只有一种化合物已被用来诱导相关活性和仅转化了一种腈化合物来生产一种所需具体化合物。
2.1. 能利用腈化合物的微生物
文献含有某些参考文献，它们公开了许多可利用腈或酰胺化合物作为碳和/或氮的唯一来源的微生物。
例如，Asano等，1982，农业生物化学，46：1165-1174描述了一种能用乙腈作为唯一碳和氮来源生长的节杆菌(Arthrobacter)。
Nawaz等，1989，43rd Purdue Ind.Waste Conf.Proc.，pp251-256(Nawaz，1989)，描述了能利用各种腈化合物，包括乙腈，作为碳和能量的唯一来源的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的分离。然而，该菌株不能利用其它腈化合物，如丙烯腈、丙烯酰胺、苄腈和丙二腈。
Nawaz等，1992，应用环境微生物学，58：27-31(Nawaz)，描述了一种在用苄腈驯化后，能降解苄腈和另一种选自丁腈、乙腈、戊二腈、丙腈、琥珀腈和甲基丙烯腈的混合物的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pnoeumonia)NCTR1菌株。和不需要存在芳族腈的目前诱导方法完全相反，Nawaz的微生物需要苄腈来诱导降解苄腈和另一种腈的混合物的活性。另外，而且更重要的是，为了实现任何腈混合物的降解，苄腈必须存在。因为腈生产设备的废液中不含苄腈，Nawaz公开的这种微生物和方法将是完全不实际的，而且实际上，对于处理这种废液是无效的。
Chapatwala等，1993，应用生物化学，生物技术39/40：655-666，描述了能利用乙腈作为碳和氮唯一来源的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株的分离。然而，没有公开该菌株对任何其它含腈化合物的利用。
Narayanasamy等，1990，印度实验生物学杂志，28：968-971，公开了节杆菌亚种对丙烯腈、乙腈、丙烯酰胺和乙酰胺的利用。但未指出该菌株能否降解二腈或腈混合物。
O’Grady和Pembroke，1994，生物技术通信16：47-50，描述了土壤杆菌亚种的分离，和该分离菌株利用或分别分裂许多不同腈化合物的能力。但未指出该分离菌株能否利用或分裂腈化合物的混合物。
Martinkova等，1992，Folia Microbiol，37：373-376，公开了几种细菌菌株，包括棒状杆菌亚种(Corynebacterium sp.)3B株和放射形土壤杆菌8/4/1株(它们能利用乙腈作为碳和氮的唯一来源)的分离。但未公开这些菌株能否利用任何其它腈化合物或腈化合物的混合物。
Nawaz等，1994，应用环境微生物学，60：3343-3348，描述了从被除草剂草不绿(alachlor)污染的土壤中分离的一种临时命名为红球菌亚种(Rhodococcussp.)的细菌。显示该细菌能利用丙烯腈作为碳和氮的唯一来源。
Nawaz等，1993。加拿大微生物杂志，39：207-212，描述了一种假单胞菌亚种和嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilla)的分离。它们各自都能利用丙烯腈作为碳和氮的唯一来源。
Armitage等，国际专利出版物WO 97/06248(1997年2月20日出版)，公开了通过在酰胺或酰胺前体，如腈，或其混合物存在下，在酰胺或酰胺前体形成至少20％摩尔和优选基本全部碳的连续培养、碳有限的条件下，培养合适微生物，来产生酰胺酶的方法。合适的微生物包括假单胞菌、红球菌等。还公开了通过在腈或腈前体、或其混合物存在下，在连续培养、碳有限培养条件下培养微生物，来产生腈酶的方法。合适的微生物包括诺卡菌，红球菌亚种，包括红球菌ATCC 39484等。然后特别用这些诱导的酶来将腈或酰胺转化成其对应酸。
虽然利用腈化合物的微生物可能能从一种含腈组合物中除去一种腈化合物，但并不期待用这些生物体来帮助腈生产设备处置废液，因为腈的利用取决于对一种所用的腈化合物有特异性的腈酶或腈水解酶的表达。特异性腈酶或腈水解酶的表达并不能确保该微生物将有能力转化腈生产设备的废液中以高浓度存在的腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物。
2.2. 包括腈生产厂废液的腈废料的处理
许多参考文献描述了曾尝试提供一种微生物学方法，来从腈生产厂废液的腈废料中除去腈。
Kato等在美国专利号3,940,332(Kato)中描述了采用分离的细菌菌株深红红球菌(Nocardia rubropertincta)ATCC登录号21930，联合污水处理站的活化污泥来降解含腈和无机氰化物的废液。Kato还指出该菌株能降解腈，包括乙腈、丙烯腈、丙腈、丁腈、丁烯腈、富马腈、戊腈、戊二腈和苄腈，虽然未指出这些腈各自的量，或降解腈的条件，或是否可一起降解腈。未指出Kato公开的菌株能否降解或去除腈化合物的混合物的毒性。另外，Kato处理的腈废料是低强度废料，50-250ppm总腈浓度。另外，本发明者已测试了Kato公开的菌株，发现该菌株不能以本发明方法所达到的同样效率从腈混合物中除去乙腈。
Sunarko和Meyer，1989，DECHMA生物技术会议，3：859-862，公开了分枝杆菌UBT5、芽胞杆菌UBT2、棒状杆菌UBT9和屈挠杆菌UBT4的冻干细胞(其已通过使细胞在2-戊烯腈存在下生长而被诱导)能降解实验室HPLC柱废液中发现的少量乙腈。
Brown等，1980，水研究，14：775-778，公开了以0.5ppm到5ppm浓度将丙烯酰胺加到环境的天然和污染水中，导致丙烯酰胺的降解。
Kincannon等，1983，WPCF杂志，55：157-163公开了一种从城市活性污水处理站分离到的微生物混合物在一个月的驯化期后，能降解丙烯腈。另外，该作者还显示了该微生物混合物同样能降解丙烯醛。
Donberg等，1992，环境毒物化学，11：1583-1594，公开了在土壤中发现的微生物混合物能在有氧条件下降解丙烯腈。一些混合物能在2天内降解10-100ppm的丙烯腈。然而，对于高浓度的丙烯腈(1000ppm)，降解被抑制。作者推测抑制是由于亲代丙烯腈化合物的抑制作用。
Knowles和Wyatt，欧洲专利号274 856 B1和Wyatt和Knowles，1995，生物降解6：93-107，描述了用微生物混合物降解腈生产厂(使用丙烯腈生产的BP/SOHIO过程)废液的腈和酰胺混合物。使用微生物混合物，而不用纯培养物，是Knowles和Wyatt的方法的严重缺点。维持混合培养物是困难的，因为随着反应条件的变化，在混合培养物中的某些菌株将在不同生长时间占优势，从而使降解效率下降。
有许多缺点与上面的参考文献有关。例如，上述许多单个微生物菌株能降解的腈或酰胺化合物的范围有限。降解/利用腈和酰胺化合物所需的时间是以天或周计的。另外，用传统活性污泥处理的方法具有其自身的缺点，如产生大量最终也需处置的生物物质。而且最重要的，使用微生物混合物，而不使用纯培养物，使处置非常困难，因为难于维持该混合培养物。由于反应条件变化，混合培养物中的某些菌株将在不同的生长时间占优势，从而使混合培养物的特性随时间变化，降解效率下降。混合培养物不容易再生或维持。
2.3. 处理聚丙烯酰胺制备物来除去丙烯酰胺单体
许多参考文献描述了提供微生物方法，来从聚丙烯酰胺制备物中除去不需要的丙烯酰胺单体。
聚丙烯酰胺聚合物被广泛用于许多工业，包括污水处理、造纸、采矿和生物学和化学研究中。然而，其应用受到限制，而且不能将其用于食料有关的工业，因为它们通常被未反应的丙烯酰胺单体(它是累积性神经毒素和致癌原)污染。一种减少未反应单体量的方法是“热处理”方法。然而，该处理增加了制造费用，并由于产生不需要的聚合物分枝而降低了聚合物生产的效率。
另一种方法是利用从微生物获得的酰胺酶。例如，Carver等，欧洲专利出版物EP 272,025 A2和EP 2072,026 A2，描述了用从曾加热到温度40℃到80℃的嗜甲基菌亚种(Methylophilis sp.)等生物体获得的酰胺酶分解聚丙烯酰胺制备物中的丙烯酰胺。然而，Carver等描述的该方法不能在其天然pH值(即约4的天然pH)下，从阳离子聚丙烯酰胺制备物中除去丙烯酰胺单体。见EP 272,025 A2的图6，其清楚的显示，为了从阳离子聚合物中除去丙烯酰胺单体，必须将pH从pH4提高到pH6。
Westgrove等的美国专利号4,687,807和4,742,114描述了用于从已形成的丙烯酰胺聚合物中除去不需要的丙烯酰胺单体的酰胺酶油包水乳剂的生产。
Farrar等，欧洲专利出版物EP 329,325 A2描述了获自表达酰胺酶的微生物的酰胺酶水凝胶，除去聚丙烯酰胺中的丙烯酰胺单体。Farrar，国际专利出版物WO 92/05205，描述了通过将酰胺酶加入用于聚(甲基)丙烯酰胺放热聚合反应的可聚合混合物中，来减少聚合的(甲基)丙烯酰胺中残余的(甲基)丙烯酰胺单体。
Armitage等，国际专利出版物WO 97/06248(1997年2月20出版)，还公开了在丙烯酰胺聚合反应中或反应后，通过在酰胺或酰胺前体(如腈)，或其混合物存在下，在连续培养，碳源有限条件下(其中酰胺或酰胺前体形成至少20％摩尔和优选基本全部碳源)培养该微生物，而获得的合适微生物中受诱导的酰胺酶，可将甲基(丙烯酰胺)转化成甲基(丙烯酸)铵。合适的微生物包括假单胞菌、红球菌等。然而，未提供成功的例子(其中诱导出的酶确实转化聚丙烯酰胺制备物中的丙烯酰胺单体)，况且，未公开其转化反应发生的pH范围。
本申请中的第2节或任何一节引用的参考文献或鉴定都不能被当成是承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。
3. 发明简述
本发明提供了从聚酰胺或聚合的酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体，例如，从聚丙烯酰胺制备物中除去丙烯酰胺单体的方法。一示范性方法需要使含有丙烯酰胺单体的聚丙烯酰胺制备物(所述聚丙烯酰胺制备物具有约2到小于6的pH)，与已被多重诱导的微生物菌株的纯培养物或粗抽提物接触充分时间，通过将丙烯酰胺转化成对应丙烯酸来减少丙烯酰胺单体的量。优选的，聚丙烯酰胺制备物具有约2到约5的pH，更优选的是约3到约4的pH。还有，聚丙烯酰胺制备物中的丙烯酰胺单体量优选被减少至100ppm以下。
可在含有腈化合物或腈和酰胺化合物的混合物的完全营养培养基上培养微生物菌株的纯培养物，来多重诱导用于从聚丙烯酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体的微生物菌株。另外，可在含有腈化合物或腈和酰胺化合物的混合物，作为唯一碳源和能源和/或氮源的极限培养基上培养微生物菌株的纯培养物，来多重诱导用于从聚丙烯酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体的微生物菌株。该多重诱导方法不需要芳族腈的存在。
在诱导后，可将微生物的纯培养物储藏一段时间，即，在正常冷藏温度下，即，约4℃，至少4个月，在正常冷冻温度下，即-20℃或更低，或当使用冻干或低温时贮藏，更长时间(年)，而不损失除去酰胺的活性。某些微生物能利用至少一种腈化合物作为碳和能量的唯一来源。某些微生物能利用至少一种腈或酰胺化合物作为碳和能量和氮的唯一来源。
根据本发明，一旦被诱导，对于除去酰胺单体，该纯微生物培养物不一定必须活跃的分裂增殖，或者即使死亡也可以。这种细菌生长与除去酰胺单体的分离使得抑制生长的条件下也能快速除去不需要的酰胺单体；例如，在腈化合物非常高的浓度下，强碱性或酸性pH，高温，如55℃等条件下。另外，这种分离：(1)意味着由于不需要细胞生长来除去酰胺单体，因此不需大量产生细胞(生物体)或细胞生产可最小化。当细胞大量生长时，还必须处理因生长而产生的废生物物质；(2)因为细胞不再生长，可不规则的除去不起生长底物作用的化合物；和(3)该方法导致产生较少的毒性或非毒性中间产物，这种中间产物易于自然降解(在反抗中降解，毒性亦同)
3.1. 定义
如本申请中所用，“腈”化合物将包括含有一个或多个腈基团，即C≡N基团，和除C≡N之外的至少一个碳原子。如本文使用的，术语“腈”包括丙烯醛氰醇等化合物。注意到在反应性氰化物存在下的丙烯醛以丙烯醛氰醇的形式存在。腈解毒微生物能将氰醇的腈转化成相应的酸。例如，将丙烯醛氰醇转化成丙烯酸。如本文所用，术语“腈”包括但不限于，乙腈、丙烯腈、富马腈、琥珀腈、丁烯腈、己二腈、苄腈、丁腈、β-丙烯磺酰腈、异戊腈、戊腈、苯基腈、丙烯醛氰醇等。
如本申请所用，“阴离子”聚酰胺制备物是含有一条阴离子主链和/或侧链基团的聚酰胺制备物，并具有净负电荷。
如本申请所用，“阳离子”聚酰胺制备物是含有一条阳离子主链和/或侧链基团的聚酰胺制备物，并具有净正电荷。
如本申请所用，“非离子”聚酰胺制备物是不含阴离子和/或阳离子主链和/或侧链基团，或如果存在一个或多个这些基团，具有净中性电荷的聚酰胺制备物。3.2. 发明目的
本发明的一个目的是提供：通过从pH约2至小于6的聚酰胺制备物中将酰胺单体转化成对应的酸化合物，除去不需要的酰胺单体的方法。
本发明的其它目的和/或优点对本领域技术人员是明显的。
4. 发明详述
本发明包括通过使用一种受诱导而能将单酰胺分子转化成酸分子的微生物菌株的纯培养物，从pH约2至小于6的聚酰胺或聚合的酰胺制备物中，将酰胺单体转化成对应的酸化合物，来除去不需要的酰胺单体的方法。
可使用任何本领域技术人员已知的方法，如用气-液色谱和火焰电离检测器(GLC-FID)检测酰胺，和用高效液相层析(HPLC)检测对应的酸化合物评估单酰胺化合物的消失，和/或对应的酸化合物的同时出现，从而监测单酰胺从制备物中的除去情况。转化成对应的酸导致各原先存在的酰胺基团产生可化学计量的氨。可用Fawcett和Scott，1960，临床病理学，13：156-159的技术测量氨释放量，来监测酰胺化合物转化的程度。如果由于氨或铵盐的存在，不能测量氨释放，那么可用本领域技术人员已知的方法，包括但不限于GLC-FID等来监测存在的酰胺的浓度。另外，可通过评估对应酸化合物的产生(可衍生酸化合物并用GLC-FID检测衍生产物来监测)来测定酰胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲硅烷基化，可衍生酰胺和酸，用于GLC-FID分析(常见，Supelco层析产物分类，1997，653-656页(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
然后，如需要，可将酸和其它非聚酰胺化合物进一步降解成CO2、H2O和生物物质。
为了公开内容清晰，和不受限制，将本发明分成下面几节予以详述：
(1)诱导和鉴定具有去除酰胺能力的微生物菌株的方法；
(2)分离的微生物菌株的特征分析；和
(3)除去酰胺单体所用的诱导的微生物菌株的应用和方法。
4.1. 诱导和鉴定具有除酰胺能力的微生物菌株的方法
通过在腈化合物的混合物存在下，或腈和酰胺化合物的混合物存在下培育某微生物菌株，可分离并获得用于从聚酰胺或聚合酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体化合物的微生物菌株。惊人的是已发现，为了诱导广谱去除酰胺的能力，即去除各种单酰胺的能力，必须用一种以上腈化合物补充培养基。更具体的说，已发现：可使用腈和酰胺化合物的混合物来诱导微生物除去广谱单酰胺的能力。多重诱导后，纯培养菌株能从聚酰胺或聚合的酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体化合物。所选的受诱导的微生物菌株可选自己知来源，或可以是新分离的微生物，还可以是嗜热的或其它嗜极端细菌，如嗜卤素菌或嗜酸菌。有利的是，多重诱导方法不需要芳族腈，如苄腈。
已注意到，能被多重诱导而具有去除酰胺单体能力的微生物看来在含有腈或酰胺作为碳的唯一来源或作为碳和氮的唯一来源的培养基中，与在含有易于利用的碳源如糖类等的培养基的生长比较时，生长较慢。优选的，将可被多重诱导而具有去除酰胺单体能力的微生物菌株培养在含有易于利用的碳源(如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乙酸酯、苯甲酸酯等)的培养基中。以递增量或连续加入碳和氮源，从而使反应体系中的碳和氮水平低于1％。以这种方式可迅速和低廉的产生大量细胞。一旦达到所需的细胞量，可根据在下文4.1.1或4.1.2节中描述的方法多重诱导该微生物，例如在一个生产循环的最后20个小时中。
4.1.1. 使用腈或腈和酰胺化合物和完全营养培养基的诱导
一种诱导去除酰胺单体能力的方法包括：使用补充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的完全营养培养基。更具体的说，该方法包括：在补充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的完全营养培养基中培养微生物，并收集培养的微生物。当在琼脂平板上培养时，在腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物存在下，培养该微生物约24到48小时。当在发酵罐中培养时，在加入腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物之前，在完全营养培养基中培养该微生物1到48+小时，优选1到20小时，更优选16到20小时；然后在加入腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物4到5个小时后收集该微生物。如果需要更大的生物量，可在加入腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物之前，在发酵罐中更长时间的培养该微生物。如本领域技术人员所知，如需要可加入额外的营养物来维持生长。
在另一个方法中，在补充了腈化合物的混合物的完全营养培养基中诱导微生物。有用的腈化合物的混合物包括下列：约50到约500ppm的乙腈；约50到500ppm的丙烯腈；和约25到约100ppm的琥珀腈。可任选的，可在混合物中加入约1-10ppm的KCN或NaCN。虽然不是要受任何具体机制的限制，本发明人相信，诱导过程中KCN或NaCN的存在使微生物对无机氰化物驯化。另外可任选的，可在混合物中加入约1-25ppm浓度的钴。还可任选的，可在混合物中加入浓度约1-10克/升的尿素。
优选的，用含有浓度各约150ppm的乙腈和丙烯腈，和浓度各约50ppm的琥珀腈和富马腈的腈化合物的至少一种的混合物补充完全营养培养基。更优选的，腈混合物含有各约150ppm的乙腈和丙烯腈，和浓度约50ppm的琥珀腈。可任选的，在培养基中加入浓度各约10ppm的KCN和钴，和浓度约7克/升的尿素。而更优选的，用各约150ppm的乙腈和丙烯腈，和约50ppm浓度的琥珀腈，各约10ppm的KCN和钴，和约7g/l的尿素补充完全营养培养基(它是BACTOTMR2A培养基(Difco，Detriot，Michigan)，或YEMEA培养基、或含有YEMEA各成分的比率，但不含琼脂的培养基。
在另一种方法中，在补充了腈和酰胺化合物的混合物的完全营养培养基中诱导微生物。有用的腈和酰胺化合物的混合物包括：(1)约25到100ppm的琥珀腈，约50到150ppm的乙腈和约50到150ppm的丙烯腈中的至少一种；和(2)约50到500ppm的乙酰胺和约50到500ppm的丙烯酰胺。可任选的，可以约1到10ppm加入KCN或NaCN。也可任选的，以约1到25ppm加入钴，而且可以约1-10克/升加入尿素。优选的，用50ppm琥珀腈和各150ppm的乙酰胺和丙烯酰胺补充完全营养培养基。
完全营养培养基是为微生物提供了所有生长必需的营养物，如碳，和/或氮的生长培养基。例如，但不是为了限制，含有葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、酪蛋白氨基酸、酵母抽提物、可溶性淀粉和丙酮酸钠的BACTOTM R2A培养基(Difco，Detroit，Michigan)是一种合适的完全营养培养基。另一种可用于本发明的完全营养培养基是YEMEA培养基，它含有葡萄糖、麦芽抽提物和酵母抽提物，而不含琼脂。另一种用于本发明的完全营养培养基是含有葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、可溶性淀粉和丙酮酸钠的完全营养培养基。可使用本领域技术人员已知的任何完全营养培养基。
在包括：3.0和11.0之间的pH，优选约6.0和8.0之间；4℃和55℃之间的温度，优选约15℃和37℃之间的条件下培养微生物。另外，溶氧张力应在0.1％和100％之间，优选4％和80％，更优选4％和30％之间。可监测溶氧张力，并以空气、纯氧、过氧化物、和/或其它能释放氧的过氧组合物形式提供氧，而将其维持在所需范围内。
在培养期末，通过刮、离心、过滤等，或通过本领域技术人员已知的方法收集并浓缩培养的微生物。
在一个示范性方法中，4℃收集细胞，将其制备成细胞浓缩液，然后快速冷冻(干冰和乙酮)，然后储藏在-20℃或以下。可使用冷冻细胞浓缩液或然后可将其固定。
一旦根据上述方法多重诱导，可通过在培养的微生物中加入一种或多种底物来稳定所收集的微生物的除酰胺单体能力。虽然不是要受任何机制所限，本发明人注意到，酰胺酶通常在底物存在时最稳定，这是本领域技术人员熟知的。因此，例如加入酸性化合物，如异丁烯酸，能稳定酰胺酶，使其活性能长期保持。
可将诱导的微生物固定在聚丙烯酰胺或丙烯酰胺块中，或固定在已与聚乙烯亚胺交联的海藻酸盐中，来实现稳定化。优选固定在与聚乙烯亚胺交联的海藻酸盐中来稳定细胞。
4.1.2. 使用腈或腈和酰胺化合物和极限培养基的诱导
另一种诱导去除酰胺单体能力的方法包括：使用补充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的极限培养基。更具体的说，该方法包括：在补充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的极限培养基中培养微生物，并收集培养的微生物。当在琼脂平板上培养时，将微生物培养约24到48小时。当在发酵罐中培养时，在补充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的极限培养基中培养微生物1到48+小时，优选1到20小时，更优选16到23小时；然后在加入腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物后4到5个小时收获。如果需要更大的生物量，可在发酵罐中更长时间的培养微生物。
有用的腈化合物的混合物包括：约50到约500ppm的乙腈；约50到500ppm的丙烯腈；和约25到约100ppm的琥珀腈。可任选的，可在混合物中加入1-10ppm的KCN或NaCN。还可任选的，可在混合物中加入约1-25ppm浓度的钴。也可任选的，可在混合物中加入浓度约1-10克/升的尿素。
优选的，用含有浓度各约150ppm的乙腈和丙烯腈的至少一种，和浓度各约50ppm的琥珀腈和富马腈的腈化合物的混合物补充极限培养基。更优选的，腈混合物含有各约150ppm的乙腈和丙烯腈，和浓度约50ppm的琥珀腈。可任选的，在培养基中加入浓度各约10ppm的KCN和钴，和浓度约7克/升的尿素。
在另一种方法中，在补充了腈和酰胺化合物的混合物的极限培养基中诱导微生物。有用的腈和酰胺化合物的混合物包括：(1)约25到100ppm的琥珀腈，约50到150ppm的乙腈和约50到150ppm的丙烯腈中的至少一种；和(2)约50到500ppm的乙酰胺和约50到500ppm的丙烯酰胺。可任选的，可以约1到10ppm加入KCN或NaCN。也可任选的，以约1到25ppm加入钴，而且可以约1-10克/升加入尿素。优选的，用50ppm琥珀腈和各150ppm的乙酰胺和丙烯酰胺补充极限培养基。
极限培养基是营养不完全的培养基，它不向微生物提供其生长所需的有机碳。因此，必须用微生物能用作碳源和/或能源的化合物补充极限培养基。例如，但不是为了限制，Stanier’s极限培养基(Stanier等，1966，遗传微生物学杂志， 43：159-271)和磷酸缓冲盐(PBS)是可接受的用于该诱导方法的极限培养基。
在包括：3.0和11.0之间的pH，优选约6.0和8.0之间；4℃和55℃之间的温度，优选约15℃和37℃之间的条件下培养微生物。另外，溶氧张力应在0.1％和100％之间，优选4％和80％，更优选4％和30％之间。可监测溶氧张力，并以空气、纯氧、过氧化物、和/或其它能释放氧的过氧组合物形式提供氧，而维持其在所需范围内。
在培养期末，通过刮、离心、过滤等，或通过本领域技术人员已知的方法收集并浓缩培养的微生物。
一旦根据上述方法多重诱导，可通过在培养的微生物中加入一种或多种底物来稳定所收集微生物的去除酰胺单体能力。虽然不是要受限于任何机制，本发明人注意到，酰胺酶通常在底物存在时最稳定，这是本领域技术人员熟知的。因此，例如加入酸性化合物，如异丁烯酸，能稳定酰胺酶，使其活性能长期保持。
可通过将诱导的微生物固定在聚丙烯酰胺或丙烯酰胺块中，或固定在已与聚乙烯亚胺交联的海藻酸盐中，来实现稳定化。优选固定在与聚乙烯亚胺交联的海藻酸盐中来稳定细胞。
4.1.3. 有用的微生物的鉴定
根据一个实施例，本发明提供了筛选微生物，来鉴定和分离可用于从聚酰胺或聚合的酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体化合物的方法。该方法通常需要将测试微生物暴露于上文4.1.1和4.1.2节中所述的，用来多重诱导去除酰胺能力的条件下，然后评估推测已受到“诱导”的测试微生物从聚酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体的能力。
筛选可用于从聚酰胺制备物中除去酰胺单体的微生物的方法包括：在补充了腈化合物的第一混合物(见上文4.1.1和4.1.2节)的完全营养培养基或极限培养基中，在琼脂平板上，有利生长的条件下培养测试的微生物约24到48小时，来获得推定性诱导的微生物；并使所述微生物与含有酰胺单体的聚酰胺制备物接触，和监测酰胺单体的消失，来评估推测已受到诱导的微生物从聚酰胺制备物中除去酰胺单体的能力，其中制备物中酰胺单体化合物的消失表明，测试微生物具有从聚酰胺制备物中除去酰胺单体化合物的能力。优选的，聚酰胺制备物含有聚丙烯酰胺和单体丙烯酰胺，而所有酰胺单体在约30分钟内消失表明，测试微生物具有从聚酰胺制备物中除去酰胺单体的能力。最优选的，聚酰胺制备物中所有酰胺单体在约10分钟内消失表明该微生物具有所需的能力。如果需要微生物在硫酸铵存在下，具有除去酰胺单体的能力，可在第二混合物中包括约1-8％的硫酸铵。
根据本发明的一个优选例，用含有浓度各为150ppm的乙腈和丙烯腈，和浓度各约50ppm的琥珀腈和富马腈的至少一种的混合物的腈化合物的第一混合物补充完全营养或极限培养基。更优选的，腈的第一混合物含有各约150ppm的乙腈和丙烯腈，和浓度约50ppm的琥珀腈。可任选的，在培养基中加入浓度约10ppm的KCN。
根据该优选例的另一个优选模式，用腈和酰胺化合物的第一混合物(见上文4.1.1和4.1.2节)补充完全营养或极限培养基。
上文4.1.1和4.1.2节中描述了有用的完全营养培养基和极限培养基。在包括：pH约2.0和11.0之间，优选约2.0和小于6.0之间；和约4℃和55℃之间的温度，优选约15℃和37℃之间的条件下培养试验微生物。
可使用Fawcett和Scott，1960，临床病理学杂志，13：156-159的技术测量氨释放，来监测除去单酰胺化合物的程度。如果由于存在氨或铵盐，而不能测量氨释放，可通过本领域技术人员已知的方法，包括但不限于，GLC-FID等来监测存在的酰胺浓度。另外，可通过评估对应酸化合物的产生((可衍生酸化合物并用GLC-FID检测该衍生产物来监测)来测定酰胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲硅烷基化，可衍生酰胺和酸，用于GLC-FID分析(常见，Supelco层析产物分类，1997，653-656页(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
4.2. 微生物菌株的特征确定
已发现，下文所述的从已知来源分离或获得的微生物菌株，在如上文4.1节所述多重诱导后，具有使酰胺单体化合物转化成对应的酸化合物，而从聚酰胺制备物中除去酰胺单体化合物的能力。
下文表I和II给出了两种红球菌菌株，DAP 96622和DAP 96253(分别衍生自从美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，ATCC登录号33278和ATCC登录号39484获得的两种菌株，已发现它们在如上所述多重诱导后，具有使酰胺单体转化成对应酸化合物，而从聚酰胺制备物中除去酰胺单体的能力)的某些特异性菌株特征。在一个说明性例子中，用各150ppm的丙烯腈、乙腈，和50ppm琥珀腈，用或不用50ppm KCN多重诱导了这两种红球菌菌株。
用 普通细菌学方法手册，1981，Philip Gerhardt，编，Am.Soc.Microbiol.，Washington，D.C.中描述的方案进行了糖利用试验。通过将微生物在补充了各150ppm的乙腈和丙烯腈，和50ppm琥珀腈的完全营养培养基上培养，来诱导菌株后，进行了腈利用试验。在补充有特定的试验化合物作为碳和/或能量的唯一来源的极限培养基上进行了实际利用试验。
                           表I
        紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)株DAP 96622：
差异特征                              结果
过氧化氢酶/氧化酶                       (+)/(-)
柠檬酸利用                              (+)
三糖铁琼脂                              无变化
生长于：                   5℃          (-)
                           25℃         (+)
                           35℃         (+)
                           45℃         (+)
利用：                     葡萄糖       (+)
                           蔗糖         (+)
                           果糖         (+)
                           乳糖         (+)
                           甘露糖醇     (+)
                           甘露糖       (+)
                           阿拉伯糖     (-)
                           肌醇         (+)，无气体
                           鼠李糖       (+)，无气体
脲酶                                    (-)
腈降解                                  (-)
明胶水解                                (-)
抗生素抗性：
                           庆大霉素     S
                           红霉素       S
                           链霉素       S
                           妥布拉霉素   S
                           利福霉素     S
                           青霉素       S
                       四环素                       S对碳和氮的利用：含有腈作为唯一碳和氮源的Stanier’s极限培养基丙烯腈                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)乙腈                      (150ppm/300ppm)              (+)/(+)琥珀腈                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)富马腈                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)丙烯腈/乙腈/琥珀腈        (各150ppm/300ppm)            (+)/(+)丙烯腈/乙腈/富马腈        (各150ppm/300ppm)            (+)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈/富马腈 (各150ppm/300ppm)            (-)/(-)碳源利用含1g/l硫酸铵的Stanier’s极限培养基P-甲酚                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)甲苯                      (150ppm/300ppm)              (NT)/(NT)苯乙烯                    (150ppm/300ppm)              (NT)/(NT)甲苯/苯乙烯               (各150ppm/300ppm)            (NT)/(NT)乙酸酯                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)丙烯酸酯                  (150ppm/300ppm)              (+)/(+)琥珀酸酯                  (150ppm/300ppm)              (+)/(+)富马酸酯                  (150ppm/300ppm)              (+)/(+)碳源利用：含1g/l硫酸铵和10ppm KCN的Stanier’s极限培养基富马腈                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)琥珀腈                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)碳源利用：不含1g/l硫酸铵但含10ppm KCN的Stanier’s极限培养基富马腈                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)琥珀腈                    (150ppm/300ppm)              (+)/(+)
                          表II
                  红球菌亚种菌株DAP 96253： 差异特征                                                 结果过氧化氢酶/氧化酶                                          (+)/(-)柠檬酸利用                                                 (+)三糖铁琼脂                                                 无变化生长于：                       5℃                         (-)
                           25℃                        (+)
                           35℃                        (+)
                           45℃                        (+)利用：                         葡萄糖                      (+)
                           蔗糖                        (+)
                           果糖                        (+)
                           乳糖                        (+)
                           甘露糖醇                    (+)
                           甘露糖                      (+)
                           阿拉伯糖                    (-)
                           肌醇                        (+)，无气体
                           鼠李糖                      (+)，无气体脲酶                                                       (-)腈降解                                                     (-)明胶水解                                                   (-)抗生素抗性：
                           庆大霉素                    I*
                           红霉素                      S
                           链霉素                      S
                           妥布拉霉素                  S
                           利福霉素                    S
                           青霉素                      S
                         四环素                         S*I表示在敏感和抗性“之间”对碳和氮的利用：含有腈作为唯一碳和氮源的Stanier’s极限培养基丙烯腈                       (150ppm/300ppm)                (+)/(+)乙腈                         (150ppm/300ppm)                (+)/(+)琥珀腈                       (150ppm/300ppm)                (+)/(-)富马腈                       (150ppm/300ppm)                (+)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈           (各150ppm/300ppm)              (+)/(+)丙烯腈/乙腈/富马腈           (各150ppm/300ppm)              (-)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈/富马腈    (各150ppm/300ppm)              (-)/(-)碳源利用含1g/l硫酸铵的Stanier’s极限培养基P-甲酚                       (150ppm/300ppm)                (+)/(+)甲苯                         (150ppm/300ppm)                (+)/(+)苯乙烯                       (150ppm/300ppm)                (+)/(+)甲苯/苯乙烯                  (各150ppm/300ppm)              (+)/(+)乙酸酯                       (150ppm/300ppm)                (+)/(+)丙烯酸酯                     (150ppm/300ppm)                (+)/(+)琥珀酸酯                     (150ppm/300ppm)                (+)/(+)富马酸酯                     (150ppm/300ppm)                (+)/(+)碳源利用：含1g/l硫酸铵和10ppm KCN的Stanier’s极限培养基富马腈                       (150ppm/300ppm)                (+)/(+)琥珀腈                       (150ppm/300ppm)                (+)/(+)碳源利用：不含1g/l硫酸铵但含10ppm KCN的Stanier’s极限培养基富马腈                       (150ppm/300ppm)                (+)/(+)琥珀腈                       (150ppm/300ppm)                (+)/(+)
已发现下文表中给出特征的下列微生物菌株，在如上所述多重诱导后，具有使酰胺单体转化成对应酸化合物，而从聚酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体的能力。在WO96/18724中描述了这些微生物的分离。简单说，在同一工业区的污染土壤中分别培养了200种以上纯微生物分离物。将所有这些纯分离物合并，并与含有芳族、硝基芳族、卤素-芳族、脂肪族和卤素-脂肪族化合物混合物的污泥/废料一起有氧培养。从培养材料中收集微生物的混合培养物，并维持在BACTOTM R2A培养基(Difco，Detroit，Michigan)上。
称为DAP-2的混合培养物(已保藏于美国典型培养物保藏中心，指定ATCC登录号55644)，能有氧降解至少下列化合物或其混合物中的一种：苯、甲苯、二甲苯、乙苯、萘、氯苯、苯酚、甲酚、硝基苯、苯胺、蒽、二甲基苯酚、苯乙烯、卤素萘、2-，3-或4-氯甲苯、2-，3-或4-氯苯甲酸酯、1，3-二氯苯甲酸酯、1，2-，1，3-或1，4-二硝基苯、1-氯-2-硝基苯、1-氯-4-硝基苯、1-或2-甲基萘、芘、苊、荧蒽、菲、苯并-(b)-荧蒽、二香豆酮、_、邻苯二酚、m-甲苯酸、乙酸肉桂酯、香草醛、反-肉桂醛、均三甲苯、水杨酸酯、密胺、氰尿酸、δ-(-)-苎烯、十六烷、甲醛和三氯甲烷。
在补充了各150ppm的硝基苯、萘和甲苯的BACTOTM R2A培养基上通过分离单菌落，从称为DAP2的混合培养物中分离并确定了下列纯培养物的特征。
微生物DAP 623：
DAP623是一种革兰氏阴性可运动性杆菌，通常是小的单杆菌，虽然可见一些成对。染色可以是不均匀的，有一些絮状物形成。菌落在BACTOTM R2A培养基上呈白色至奶油色。另外，该生物体能利用下列物质：均三甲苯、乳酸、琥珀酸、苎烯、m-甲苯酸、氯苯、水杨酸酯、2-，3-和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作为碳和能量的唯一来源。DAP 623保藏在美国典型培养物保藏中心，指定了ATCC登录号55722，并进一步如表III所示确定了特征。
                           表III
                           DAP R23 差异特征                                                       结果过氧化氢酶/氧化酶                                                (+)/(-)柠檬酸利用                                                       (+)三糖铁琼脂                                                       来自葡萄糖的酸生长于：                       15℃                              (-)
                           25℃                              (+)
                           35℃                              (+)
                           41℃                              (+)利用：                         葡萄糖                            (+)
                           果糖                              (+)
                           乳糖                              (-)
                           甘露糖醇                          (+)
                           甘露糖                            (+)
                           2-甲基萘                          (-)
                           α-酮戊二酸                       (+)
                           谷氨酸酯                          (+)
                           乙醇                              (-)
                           十六烷                            (-)NO3-NO2                                                        (+)精氨酸脱羧酶                                                     (+)赖氨酸脱羧酶                                                     (+)鸟氨酸脱羧酶                                                     (+)明胶水解                                                         (+)脲酶                                                             (+)抗生素抗性：
                           HgCl2                            (-)
                           氨苄青霉素                        R
                           卡那霉素                          (-)
                           四环素                            R
                           壮观霉素                          R
                                   链霉素                      (-)
微生物DAR 626：
DAP 626是一种革兰氏可变杆菌，其尺寸可变，以单个或成对出现。可见在鞭毛平板上生长，表明其鞭毛运动性。另外，该微生物体能利用下列物质：均三甲苯、乳酸、琥珀酸、苎烯、乙酸肉桂酯、邻苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作为碳和能量的唯一来源。DAP 626保藏于美国典型培养物保藏中心，指定了ATCC登录号55723，并如表4中所示，进一步确定了特征。
                              表IV
                             DAP 626 差异特征                                                     结果过氧化氢酶/氧化酶                                              (+)/(+)柠檬酸利用                                                     (-)三糖铁琼脂                                                     产生H2S生长于：                           15℃                        (+)
                               25℃                        (+)
                               35℃                        (+)
                               41℃                        (+)利用：                             葡萄糖                      (-)
                               果糖                        (+)
                               乳糖                        (-)
                               甘露糖醇                    (+)
                               甘露糖                      (-)
                               2-甲基萘                    (-)
                               α-酮戊二酸                 (+)
                               谷氨酸酯                    (+)
                               乙醇                        (+)
                               十六烷                      (+)NO3-NO2                                                      (-)精氨酸脱羧酶                                                      (-)赖氨酸脱羧酶                                                      (-)鸟氨酸                                                            (-)明胶水解                                                          (-)脲酶                                                              (+)抗生素抗性：
                             HgCl2                           (-)
                             氨苄青霉素                       R
                             卡那霉素                         (-)
                             壮观霉素                         R
                             链霉素                           (-)
微生物DAP 629：
DAP 629是小型革兰氏阴性可运动性杆菌，几乎是球杆菌。当在BACTOTM R2琼脂上生长时，菌落呈带微弱荧光的白色。另外，该微生物体能利用下列物质：荧蒽、均三甲苯、乳酸、琥珀酸、苎烯、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作为碳和能量的唯一来源。DAP 629保藏于美国典型培养物保藏中心，指定了ATCC登录号55726，并如表V中所示，进一步确定了特征。
                              表V
                             DAP 629 差异特征                                                           结果过氧化氢酶/氧化酶                                                  (+)/(+)柠檬酸利用                                                         (-)三糖铁琼脂                                                         无发酵生长于：                         15℃                              (+)
                             25℃                              (+)
                             35℃                              (+)
                             41℃                              (-)利用：                           葡萄糖                            (+)
                                果糖                        (-)
                                乳糖                        (-)
                                甘露糖醇                    (-)
                                甘露糖                      (-)
                                2-甲基萘                    (-)
                                α-酮戊二酸                 (+)
                                谷氨酸酯                    (+)
                                乙醇                        (-)
                                十六烷                      (-)NO3-NO2                                                       (+)精氨酸脱羧酶                                                    (-)赖氨酸脱羧酶                                                    (+)鸟氨酸脱羧酶                                                    (-)明胶水解                                                        (+)脲酶                                                            (-)抗生素抗性：
                                HgCl2                      (-)
                                氨苄青霉素                  R
                                卡那霉素                    (-)
                                四环素                      (-)
                                壮观霉素                    (-)
                                链霉素                      (-)
微生物DAP 632：
DAP 632是革兰氏可变可运动性细长杆菌，可见单个或成对。当在BACTOTMR2琼脂上生长时，菌落呈微黄色至奶油色。另外，该微生物体能利用下列物质：荧蒽、苊、均三甲苯、乳酸、苎烯、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作为碳和能量的唯一来源。DAP 632保藏于美国典型培养物保藏中心，指定了ATCC登录号55727，并如表VI中所示，进一步确定了特征。
                              表VI
                              DAP 632 差异特征                                                    结果过氧化氢酶/氧化酶                                           (+)/(-)柠檬酸利用                                                  (+)三糖铁琼脂                                                  无发酵生长于：                           15℃                     (+)
                               25℃                     (+)
                               35℃                     (+)
                               41℃                     (+)利用：                             葡萄糖                   (-)
                               果糖                     (-)
                               乳糖                     (-)
                               甘露糖醇                 (-)
                               甘露糖                   (-)
                               2-甲基萘                 (-)
                               α-酮戊二酸              (-)
                               谷氨酸酯                 (+)
                               乙醇                     (-)
                               十六烷                   (-)NO3-NO2                                                   (-)精氨酸脱羧酶                                                (-)赖氨酸脱羧酶                                                (-)鸟氨酸脱羧酶                                                (-)明胶水解                                                    (+)脲酶                                                        (+)抗生素抗性：
                               HgCl2                   R
                               氨苄青霉素               R
                      卡那霉素                             R
                      四环素                               R
                      壮观霉素                             R
                      链霉素                               R微生物DAP 115：
DAP 115是革兰氏阴性可运动性杆菌，可见单个或成对。可观察到在鞭毛平板上生长，表明其鞭毛运动性。当在BACTOTM R2琼脂上生长时，菌落呈白色，但在营养肉汤中生长时呈黄色。另外，该微生物体能利用下列物质：苯并-(b)-荧蒽、荧蒽、二香豆酮、苊、水杨酸酯、乳酸、琥珀酸、乙醛酸、均三甲苯、香草醛、苎烯、乙酸肉桂酸、邻苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作为碳和能量的唯一来源。DAP 115保藏于美国典型培养物保藏中心，指定了ATCC登录号55724，并如表VII中所示，进一步确定了特征。
                             表VII
                             DAP 115 差异特征                                                          结果过氧化氢酶/氧化酶                                                 (+)/(+)柠檬酸利用                                                        (+)三糖铁琼脂                                                        产生H2S，从葡萄糖产生
                                                              酸和气体生长于：                        15℃                              (+/-)
                            25℃                              (+)
                            35℃                              (+)
                            41℃                              (+)利用：                          葡萄糖                            (+)
                            果糖                              (+)
                            乳糖                              (-)
                            甘露糖醇                          (+)
                            甘露糖                            (+)
                              2-甲基萘                         (+)
                              α-酮戊二酸                      (+)
                              谷氨酸酯                         (+)
                              乙醇                             (-)
                              十六烷                           (+)NO3-NO2                                                          (+)精氨酸脱羧酶                                                       (-)赖氨酸脱羧酶                                                       (-)鸟氨酸脱羧酶                                                       (+)明胶水解                                                           (+)脲酶                                                               (+)抗生素抗性：
                               HgCl2                          R
                               氨苄青霉素                      R
                               卡那霉素                        R
                               四环素                          R
                               壮观霉素                        R
                               链霉素                          R
微生物DAP 120：
DAP 120是革兰氏阴性可运动性杆菌。可观察到在鞭毛平板上生长，表明其鞭毛运动性。另外，该微生物体能利用下列物质：_、芘、乳酸、琥珀酸、乙醛酸、水杨酸酯、均三甲苯、香草醛、苎烯、乙酸肉桂酸、邻苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作为碳和能量的唯一来源。DAP 120保藏于美国典型培养物保藏中心，指定了ATCC登录号55725，并如表VIII中所示，进一步确定了特征。
                               表VIII
                                DAP 120 差异特征                                                          结果过氧化氢酶/氧化酶                                                 (+)/(+)柠檬酸利用                                                   (+)三糖铁琼脂                                                   产生H2S生长于：                         15℃                        (+)
                             25℃                        (+)
                             35℃                        (+)
                             41℃                        (+)利用：                           葡萄糖                      (+)
                             果糖                        (+)
                             乳糖                        (-)
                             甘露糖醇                    (+)
                             甘露糖                      (-)
                             2-甲基萘                    (+)
                             α-酮戊二酸                 (+)
                             谷氨酸酯                    (+)
                             乙醇                        (-)
                             十六烷                      (+)NO3-NO2                                                    (+)精氨酸脱羧酶                                                 (-)赖氨酸脱羧酶                                                 (-)鸟氨酸脱羧酶                                                 (-)明胶水解                                                     (+)脲酶                                                         (+)抗生素抗性：
                             HgCl2                      R
                             氨苄青霉素                  R
                             卡那霉素                    R
                             四环素                      R
                             壮观霉素                    (-)
                             链霉素                      (-)
下文表IX显示了从称为DAP 2的混合培养物中分离出来的，上文确定特征的纯培养物能在补充了各150ppm的乙腈和丙烯腈的Stanier’s极限培养基上单独生长。培养物在25-27℃生长，14天后测定菌落大小。数值代表各次测定中5个重复菌落的平均值。
                                表IX
                           乙腈和丙烯腈的利用
    培养物                      生长 *                     菌落大小
   DAP 626                      +++                        5.3mm
   DAP 115                      +++                        6.3mm
   DAP 632                      +++                        6.2mm
   DAP 623                      +++                        5.0mm
   DAP 120                      +/++a                     a
   DAP 629                      +++                        5.3mm
*生长记分为：++++繁茂，+++好，++良，+中等，+/-稀少，-无生长
a菌株DAP 120的生长非常薄，但扩散迅速，因此，不可能精确定量测定。
如表IX中所示，该菌株能利用乙腈和丙烯腈作为碳和氮的唯一来源。
4.3. 用微生物从聚酰胺制备物中除去酰胺单体化合物的应用和方法
根据本发明的一个实施例，提供了一种通过使酰胺单体转化成对应的单体酸化合物(该酸化合物易于通过任何本领域技术人员已知的化学分离方法从制备物中除去)，除去聚酰胺或聚合的酰胺制备物(该酰胺制备物中含有不需要或不想要的酰胺单体)中的酰胺单体的方法。例如，可将丙烯酰胺转化成丙烯酸而作为铵盐轻易除去。
该方法包括：使含有不需要的酰胺单体化合物的聚酰胺或聚合的酰胺制备物，与如4.1.1和4.1.2节中所述多重诱导的有用微生物菌株的纯培养物接触足够的时间，来将酰胺单体转化成对应的酸。该方法对纯化聚酰胺或聚合的酰胺制备物，如含有丙烯酰胺的聚丙烯酰胺制备物或共聚物特别有用。可根据本发明的该实施例处理任何含有不需要单体的聚酰胺或聚合的酰胺制备物，包括：pH约2到小于6，优选pH约3到约5，更优选的pH约3到约4的阳离子、阴离子和非离子聚酰胺制备物。有利的，可在pH小于约6.0，优选pH约2到4，和最优选pH约3到约4下处理含有酰胺单体的阳离子聚酰胺或聚合酰胺，从而使阳离子侧链基团在除去不需要的单体之前，不像pH被调整到约6或以上时那样丧失其官能性。
受诱导的微生物菌株可以是正在生长(即，正在活跃分裂)或正在休眠(即，不活跃分裂)或死亡的。当方法需要使用活跃生长的微生物培养物时，与聚酰胺或聚合的酰胺制备物接触的条件应能支持细菌生长。这些条件包括：例如，pH在2.0和11.0之间，优选在约2.0和小于6.0之间；温度在4℃和55℃之间，优选在约15℃和37℃之间；溶氧张力饱和度在0.1％和100％之间，优选在约4％和80％之间，更优选在4％和40％之间，其中，可使用含氧或释氧组合物来补充氧。含氧或释氧组合物可以是：空气、纯氧、过氧化氢、或其它能释放氧的过氧化合物或其混合物。另外，可搅拌或不搅拌培养液，视溶氧张力为正或为负。
当方法需要使用不活跃分裂的微生物培养物时，与含有不需要酰胺单体的聚酰胺制备物接触的条件应能支持除酰胺(酶)的活性。例如，将温度保持在约0℃和65℃之间，优选约4℃和55℃之间。pH可以是碱性或酸性，而且最佳保持在约pH2到小于6的范围内。该具体实施例是可能的，因为酰胺单体的除去不是生长依赖性的，即，一旦诱导了除去酰胺的活性，不再需要微生物生长来除去酰胺单体。可在厌氧条件下进行该具体方式。
可将微生物的纯培养物包裹或固定，而不是自由泳动，以便于收集和重新使用。在一个优选例中，将该微生物固定。可通过吸附、静电结合、共价结合等，将纯培养物固定在固相载体上以帮助从反应混合物中回收微生物。合适的固相载体包括但不限于：颗粒状活性炭，灰泥、木材剩余产物(如木块、熔核、铡碎托板或树木)，氧化铝、钌、氧化铁、离子交换树脂(如AmberliteTM IRA-93或IRA-96(Rohm&Haas)，DowexTM(Dow Chemical Co，Inc.)，DEAE纤维素、DEAE-SEPHADEXTM(Pharmacia，Inc.)、陶瓷珠、交联聚丙烯酰胺珠或块或其它凝胶形式、海藻酸珠、κ-角叉菜胶块以及由于其固有的磁性能从水溶液中被回收的固体颗粒。海藻酸珠可以是Ca++海藻酸珠或硬化的海藻酸珠。κ-角叉菜胶块可以是硬化的κ-角叉菜胶块。作为一个说明性例子，可将海藻酸钠溶液和氯化钙与受诱导的微生物的纯培养物混合，使微生物被固定在海藻酸珠中。在优选例中，将受诱导的微生物固定在已用聚乙烯亚胺交联的海藻酸珠中，或固定在聚丙烯酰胺型的聚合物中。
根据本发明的另一个实施例，从聚酰胺或聚合的酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体的方法包括：使按照本发明多重诱导的，有用的微生物菌株的纯培养物的抽提物，与含有不需要的酰胺单体的聚酰胺或聚合酰胺制备物接触足够时间，来将酰胺单体转化成对应的酸。优选的，该抽提物是一种微生物的粗抽提物。制备微生物的抽提物可通过本领域技术人员已知的方法，包括但不限于下列方法：通过超声、碾压、使用弗氏压碎器等，来打碎受诱导的微生物的纯培养物样品中的细胞，产生细胞裂解液。过滤或离心裂解液，以除去细胞碎片和未裂解的细胞，得到粗抽提物。也可如上所述象完整细胞那样，固定裂解物，或用固定酶所用的已知技术固定。
在如上所述本发明应用的具体说明性实施例中，使用了该除去方法来将聚丙烯酰胺制备物中不需要的丙烯酰胺单体转化成丙烯酸。使本文所述经多重诱导和固定的有用微生物菌株的纯培养物或抽提物，与含有不需要的丙烯酰胺单体的聚丙烯酰胺制备物(所述制备物具有约2到小于6的pH)接触足够时间，来减少聚丙烯酰胺制备物中的丙烯酰胺单体量至100ppm以下。另外，使本文所述经多重诱导和固定的有用微生物菌株的纯培养物或抽提物，在约2到小于6的pH下，同时与丙烯酰胺单体制备物和聚合剂(导致酰胺单体聚合成聚丙烯酰胺的试剂)接触，从而使剩余的丙烯酰胺单体(在聚合反应后)转化成对应的丙烯酸。这些聚合剂包括但不限于：过硫酸盐、硫酸盐、溴酸盐、盐酸盐、过氧化物或其混合物等试剂。聚丙烯酰胺制备物中丙烯酰胺单体的浓度可高达100,000ppm，而且通常在不足10,000ppm到约40,000ppm，用本发明的方法，可将丙烯酰胺单体的水平降低到1000ppm以下，优选降到100ppm以下。
优选抽提物是一种微生物菌株的粗抽提物。本申请上文中描述了制备微生物菌株抽提物的方法。优选使用上文4.2节所述，受诱导的微生物的纯培养物或抽提物。另外，使用了4.1.3节中所述筛选方法鉴定的，能从聚丙烯酰胺制备物中除去酰胺单体化合物的微生物的纯培养物或抽提物。任选的，可用本领域已知的酶纯化方法，如离子交换柱层析，在接触前进一步纯化该粗抽提物。
在一个优选例中，固定了微生物菌株或其抽提物。在本申请上文中描述了固定微生物菌株或其抽提物的方法。更优选的，将诱导的微生物或其抽提物固定在聚乙烯亚胺交联的海藻酸珠中，或固定在聚丙烯酰胺型聚合物或DowexTM(DowChemical Co.，Inc.)，一种离子交换树脂上。另外，在另一个实施例中，将微生物或其抽提物固定在材料的平坦表面上。使聚酰胺(如聚丙烯酰胺制备物)通过具有固定化微生物或其抽提物的平坦表面。在一个实施例中，聚酰胺制备物是水相制备物。在一个说明性实施例中，平坦表面是材料的一薄板形式，或一系列薄板，在其上固定了诱导的微生物或抽提物。在一实施例中，通过简单的使新制备物从平坦表面流过，可轻易的重新使用固定的多重诱导的微生物或抽提物，而且不需要从聚酰胺产物中回收多重诱导的微生物或其抽提物。固定化能最大限度的保持和重新使用微生物或其抽提物，来除去更多单体，从而减少了使用的微生物或其抽提物的量，从而降低了成本。另外，混合对赋予额外能量的需要和对聚酰胺制备物中微生物或其抽提物的量的需要降至最小。还有，通过接触酰胺单体制备物和聚合剂以及交联剂来固定微生物或其抽提物，从而使微生物或其抽提物固定在所得到的聚酰胺制备物中，而除去其中剩余的酰胺单体。
另外，在聚丙烯酰胺制备物的制造中，也可能存在不需要的剩余单体腈化合物，除存在的剩余酰胺单体化合物外，上文详述的除去方法也可使这些腈单体化合物转化成对应的酸化合物，从而易于以其盐形式被除去。
根据本发明可使用任何能使诱导的微生物菌株和含有聚酰胺和单酰胺的化合物接触的方法。这些接触方法包括但不限于：在密封容器或器皿中接触，或与含有诱导的菌株的装置接触等。
本发明的方法还可包括：通过用本领域技术人员已知的任何方法，如用带有火焰电离探头的气—液色谱(GLC-FID)检测酰胺，和高效液相层析(HPLC)检测对应酸化合物，来评估单酰胺化合物的消失和/或对应酸化合物的同时出现，监测单酰胺化合物转化成对应的酸化合物。转化成对应的酸导致各原先存在的酰胺基团产生可化学计量的氨。可用Fawcett和Scott，1960，临床病理学，13：156-159的技术测量铵释放量，来监测酰胺化合物转化的程度。如果由于氨或铵盐的存在，不能测量氨释放，那么可用本领域技术人员已知的方法，包括但不限于GLC-FID等来监测存在的酰胺的浓度。另外，可通过评估对应酸化合物的产生(可衍生酸化合物并用GLC-FID检测该衍生产物来监测)来测定酰胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲硅烷基化，可衍生酰胺和酸，用于GLC-FID分析(一般见，Supelco层析产物分类，1997，653-656页(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
含有不需要的酰胺单体的聚酰胺或聚合酰胺制备物可以是固体、液体、和/或气体形式。当聚酰胺制备物是气体和/或液体形式时，可以将其吸附到材料，如固体上。
可通过例如，赋予机械能量，如搅拌；赋予声学能量，如在液体中设置持续声波；或赋予电场或静电场来赋予能量。
可在不同时间点采样并通过本领域技术人员已知的方法，如GLC-FID等测量酰胺单体或聚酰胺或聚合的酰胺化合物的浓度。
4.3.1. 操作方式
可以各种方式，包括分批方式，依次分批方式，或半连续方式，和用生物滤膜流通方式，来实施从聚酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体化合物的方法。
在所有操作方式中，可定时取出样品内容物，来监测感兴趣化合物的除去情况。另外，搅动和/或混合反应内容物可导致发泡。就此而言，可加入抗发泡剂来防止发泡。合适的抗发泡剂包括含有抗发泡乳剂(如，DowANTIFOAM-A_；基于硅的抗发泡剂)的硅。
4.3.1.1. 分批方式操作
分批方式操作需要将含有不需要的酰胺单体化合物的液体置于一容器(如生物反应器)中，用4.1节中所述诱导的微生物接种，培养混合物以培养能除去不需要的酰胺单体化合物的微生物。在预定时间后，停止培育，取出内容物，如果存在固体，可通过过滤将其从液体中分离出来。然后可从固相和液相中取出样品并用GLC-FID测试，来评估单酰胺化合物的水平，并确定单酰胺化合物已被除去。随后对反应物固体进行脱水，并进一步加工成填埋废渣或可作为接种的细菌菌种，用于下一批方式。在分批方式中，重新以约2％-40％重量或体积，优选约5％-20％加入脱水固体残余物。可将空气或氧气泵入反应物中，并机械搅动生物反应器中的内容物。
4.3.1.2. 依次分批方式操作
与分批方式相同操作依次分批方式，除了在培育期结束后将反应物沉降一段时间，通常约15分钟，并除去反应内容物顶部的60％-95％，剩下底部沉降的固体(如存在)，作为下一批中和液体的接种物。优选除去70％和90％之间的内容物。依次分批方式是除去含有不需要酰胺单体的液体的一种优选实施方案，因为减少了滞后或驯化期，在反应物中保留了高水平的生物物质，更好的容纳了废料进样组合物中的变化性，大大减少了生物处理后剩余的残余固体。
4.3.1.3. 半—连续/连续方式
半—连续/连续方式与分批和依次分批方式相似。然而，不在预定时间后停止培育，而是将含有不需要酰胺单体的新鲜液体以一段给定时间内的固定量泵入生物反应器，而将处理后的液体从生物反应器中抽出。这提供了不需要停止除去过程的连续液体处理。
4.3.2. 生物滤膜
可用生物滤膜来从废料如空气、水蒸气、烟雾、和水或水溶液中的聚酰胺或聚合酰胺制备物中除去酰胺单体化合物。例如，如果存在挥发性酰胺单体，可从发现它们的固体或水溶液中除去该挥发物，并以将挥发物捕获在生物滤膜中的方式来实施这些步骤。一旦挥发物被捕获，可将其与多重诱导的微生物菌株的纯培养物或抽提物接触，来除去单酰胺化合物。可用经典型生物滤膜，其中使含有聚酰胺制备物(含不需要的酰胺单体)的空气通过生物滤膜装置。可用涓流床生物滤膜，其中使含有不需要的酰胺单体的空气和水相聚酰胺溶液通过生物滤膜装置。
生物滤膜可包括：具有上述方法诱导的微生物的纯培养物或其抽提物，固定于固相载体上的装置。微生物可以是正在活跃分裂或不活跃分裂的。该微生物也可在与生物滤膜结合前已冻干。合适的固相载体包括但不限于：颗粒状活性碳、灰泥、木材剩余产物(如木块、熔核、铡碎托板或树木)，氧化铝、钌、氧化铁、离子交换树脂(如AmberliteTM IRA-93或IRA-96(Rohm&Haas)，DowexTM(Dow Chemical Co，Inc.)，DEAE纤维素、DEAE-SEPHADEXTM(Pharmacia，Inc.)、陶瓷珠、聚丙烯酰胺珠、海藻酸珠、κ-角叉菜胶块以及由于其固有的磁性能从水溶液中回收的固体颗粒。优选的固相载体是聚乙烯亚胺交联的海藻酸珠。另外，可将微生物或其抽提物固定在材料的平坦表面上。生物滤膜装置可具有流入和流出口，从而使要处理的材料可流过该装置。优选的，粘着在固相载体上的微生物选自：具有ATCC登录号55899，55898，55722，55723，55726，55727，55724，和55725的微生物，它们已如上文所述受过诱导。
在一方法中，可采用此生物滤膜，此法包括使含有聚酰胺或聚合酰胺制备物和不需要的酰胺单体化合物的废液，流过含有上述诱导的微生物的纯培养物，或其抽提物(固定在固相载体上的)的装置的生物滤膜。该方法还可包括监测废液，来确定确实已除去了酰胺单体化合物。优选的粘着在固相载体上的微生物选自：具有ATCC登录号55899，55898，55722，55723，55726，55727，55724和55725的微生物，其已如上所述受过诱导。
仅为了说明，而不是为了在任何方面限制本发明的范围，给出了下列实施例。
5. 实施例：完整细胞在聚丙烯酰胺中的固定
将红球菌菌株DAP 96253的完整细胞固定在聚丙烯酰胺中，将细胞锚定在稳定的基质中。另外，聚丙烯酰胺提供了机械完整性和强度，这导致将细胞更有效的保持在反应容器中，并能稳定细胞中的酰胺酶活性。
将10克DAP96253多重诱导的细胞(湿重)悬浮在40毫升蒸馏水中。将这40毫升细胞加到含有4.5克丙烯酰胺和0.5克N-，N-亚甲基双丙烯酰胺的蒸馏水中。在该80毫升溶液中，加入5毫升α-二甲基氨基丙腈和10毫升2.5％的过硫酸钾溶液，猛烈搅拌得到的混合物，然后将其置于冰上。在溶液聚合后，将聚合溶液切成小块，用蒸馏水洗涤，除去任何未聚合的单体。
6. 从阳离子聚丙稀酰胺制备物中除去污染的丙烯酰胺单体6.1 固定化抽提物的使用
在一系列实验中，将如上文4.1节所述，在补充了150ppm的丙烯腈，150ppm的乙腈和50ppm的琥珀腈的完全营养培养基上培养细胞，获得多重诱导的DAP96253细胞的粗抽提物，将其固定在DOWEXTM离子交换树脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。直接将固定化的抽提物加到pH约3.5的商品阳离子聚丙烯酰胺制备物中。将制备物和固定化抽提物25℃-27℃混合2小时，来进行该反应。
2小时后，阳离子聚丙烯酰胺制备物中的剩余丙烯酰胺单体浓度降低了约50％到60％。
在另一系列实验中，如下获得了多重诱导的DAP 96253细胞的细胞粗抽提物。如上文4.1节所述，在补充了150ppm乙腈、150ppm的丙烯腈和50ppm的琥珀腈的完全营养培养基中多重诱导细胞。收获细胞，洗涤并重悬浮在磷酸缓冲盐中。裂解多重诱导的细胞，如4.1节中所述，获得了该细胞的粗抽提物。
如下将粗抽提物固定在DOWEXTM离子交换树脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。用50％乙醇预洗1克DOWEXTM WR2阴离子树脂，然后与150微克的粗抽提物接触，使其反应并洗涤两次。评估固定化粗抽提物在pH7，30℃将丙烯酰胺转化成丙烯酸的能力，测定了固定化粗抽提物的酰胺酶活性。该固定化抽提物显示了20单位/克的酰胺酶活性(1单位等于在pH7，30℃每分钟转化1微摩尔丙烯酰胺)。
直接在两种不同的商品阳离子聚丙烯酰胺制备物(Cytec Industries，Stamford，CT)(各具有小于4的pH，并具有剩余浓度为1000-1100ppm的单丙烯酰胺)中加入约0.5克固定化抽提物(10.3单位)。将制备物与固定化抽提物混合进行反应，并在各时间点取样，用气—液色谱测定丙烯酰胺浓度。
360分钟内，第一阳离子聚丙烯酰胺制备物中的剩余丙烯酰胺单体浓度降到了1ppm以下。在第二制备物中，360分钟内，丙烯酰胺单体的浓度降到了约400ppm。
在另一系列实验中，当该具体抽提物未固定时，该具体抽提物在pH小于4时，不显示具有除去单酰胺的活性。
6.2 固定化微生物的使用
将如上文13节中所述获得的多重诱导的细胞DAP 96253固定在DOWEXTM离子交换树脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。将固定化细胞直接加到商品阳离子聚丙烯酰胺制备物中，其pH为约3.5。将制备物与固定化细胞在环境温度(如25-27℃)下混合足够时间(如2小时)，进行反应，并监测酰胺单体的浓度。
7. 微生物保藏
1996年12月10日，将下列菌种保藏在美国典型培养物保藏中心，(ATCC)，Rockvill，MD，并指定了登录号：微生物                          ATCC登录号红球菌亚种DAP 96253             55899紫红红球菌DAP 96622             55898
1995年11月30日，将下列菌种保藏在美国典型培养物保藏中心，(ATCC)，Rockvill，MD，并指定了登录号：微生物                          ATCC登录号DAP 623                         55722DAP 626                         55723DAP 629                         55726DAP 632                         55727DAP 115                         55724DAP 120                         55725
本文描述的和要求权利的本发明范围不受本文公开的具体实施例的限制，因为这些实施例只是本发明几个方面的说明。任何等价实施例都将在本发明的范围内。事实上，除本文显示和描述的例子以外，对本发明的各种修改从前面的描述来看，对本领域技术人员是显而易见的。这些修改也将落在权利要求的范围内。
本文引用了一些文献，在此全部引入以供参考。
                           国际申请号：PCT/    /
                          微生物在说明书第 51页，第 26-31行和第 52页，第 3-8行提到了有关的微生物1
A.保藏鉴定在附加页上指出了其它保藏物2
保藏单位姓名3美国典型培养物保藏中心
保藏单位地址(包括邮政编码和国家)410801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209美国
保藏日期5 1995年11月28日登录号6 55722
B.附加指定7(如不使用，保持空白)。该信息续在另一附加页上
C.作出指定的指定州8(如果不指定所有州)
D.另外附加的指定9(如不用，保持空白)
下面列出的指定将在以后递交国际局9(载明指示，如“保藏物登录号”)
E.□ 当提交时，该页与国际申请一起收到(由受理局核对)＿＿＿＿＿＿(授权官员)□国际局收到日期(从申请人)10为＿＿＿＿＿＿(授权官员)
PCT/RO/134表(1981年1月)国际申请号：PCT/    /PCT/RO/134表(续)美国典型培养物保藏中心10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209美国
登录号                                               保藏日期
55723                                             1995年11月28日
55724                                             1995年11月28日
55725                                             1995年11月28日
55726                                             1995年11月28日
55727                                             1995年11月28日
55898                                             1996年12月11日
55899                                             1996年12月11日

Claims (27)

1.一种通过将酰胺单体转化成对应的酸，而从含有所述单体的聚酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体的方法，其特征在于，该方法包括：使多重诱导的微生物的纯培养物或抽提物与含有酰胺单体的聚酰胺制备物接触足够时间，将κ-酰胺单体转化成对应的酸，所述聚酰胺制备物具有约2到小于6的pH。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯培养物或抽提物被包裹或固定。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纯培养物或抽提物被固定在选自颗粒状活性炭、木片、氧化铝、钌、氧化铁、陶瓷珠、海藻酸珠、κ-角叉菜胶块和离子交换树脂的固相载体上。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养物或抽提物被固定在平坦表面上。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚酰胺制备物是聚丙烯酰胺制备物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物选自具有美国典型培养物保藏中心登录号55899、55898、55722、55723、55726、55727、55724和55725的微生物，而且所述微生物已被多重诱导。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过一种方法，所述方法包含：在补充了含有浓度各为约150ppm的乙腈和丙烯腈，和浓度各为约50ppm的琥珀腈和富马腈的至少一种的腈化合物的混合物的培养基中，培养所述微生物的纯培养物，来获得多重诱导的微生物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基补充有各约150ppm的乙腈和丙烯腈，和约50ppm的琥珀腈的腈化合物的混合物。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基还补充有约1-10ppm的KCN或NaCN。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过一种方法，该方法包含：在补充了含有(a)约50ppm的琥珀腈、约150ppm的乙腈和约150ppm的丙烯腈的至少一种和(b)各150ppm的乙酰胺和丙烯酰胺的，腈和酰胺化合物的混合物的培养基中，培养所述微生物的纯培养物，获得多重诱导的微生物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述培养基补充有约50ppm的琥珀腈和约150ppm的乙酰胺和约150ppm丙烯酰胺的腈和酰胺化合物的混合物。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述培养基还补充有约1-10ppm的KCN或NaCN。
13.一种通过将酰胺单体转化成对应酸，从含有所述单体的聚酰胺制备物中除去不需要的酰胺单体的方法，其特征在于，该方法包括：在约2到小于6的pH下，使多重诱导的微生物的纯培养物或抽提物，与酰胺单体和聚合剂接触。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述纯培养物或抽提物是被包裹或固定的。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述纯培养物或抽提物被固定在选自颗粒状活性炭、木片、氧化铝、钌、氧化铁、陶瓷珠、海藻酸珠、κ-角叉菜胶块和离子交换树脂的固相载体上。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述培养物或抽提物被固定在平坦表面上。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述酰胺单体是丙烯酰胺。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微生物选自具有美国典型培养物保藏中心登录号55899、55898、55722、55723、55726、55727、55724和55725的微生物，而且所述微生物已被多重诱导。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，通过一种方法，该方法包括：在补充了含有浓度各为约150ppm的乙腈和丙烯腈，和浓度各为约50ppm的琥珀腈和富马腈的至少一种的腈化合物的混合物的培养基中，培养所述微生物的纯培养物，来获得多重诱导的微生物。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述培养基补充有各约150ppm的乙腈和丙烯腈，和约50ppm的琥珀腈的腈化合物的混合物。
21.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基还补充有约1-10ppm的KCN或NaCN。
22.如权利要求13所述的方法，其特征在于，通过一种方法，该方法包括：在补充了含有(a)约50ppm的琥珀腈、约150ppm的乙腈和约150ppm的丙烯腈的至少一种和(b)各150ppm的乙酰胺和丙烯酰胺的，腈和酰胺化合物的混合物的培养基中，培养所述微生物的纯培养物，获得多重诱导的微生物。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述培养基补充有约50ppm的琥珀腈和约150ppm的乙酰胺和约150ppm丙烯酰胺的腈和酰胺化合物的混合物。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述培养基还补充有约1-10ppm的KCN或NaCN。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺制备物含有浓度约1,000-40,000ppm的丙烯酰胺单体。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺制备物还含有不需要的腈单体，而且通过将单体转化成对应酸除去了所述腈单体。
27.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺制备物还含有不需要的腈单体，而且通过将单体转化成对应酸除去了所述腈单体。
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