CN1433479A - 生产甘氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了用于生产甘氨酸的方法，其特征在于在微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反应系统中进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，其中该水解反应系统含有至少一种抑制该微生物酶的有机杂质化合物，该有机杂质化合物具有分子量95或以上，并且含有至少一个选自腈基、羧基、酰胺基、氨基、羟基和亚丙基胺结构的成员，该水解反应是在这样的条件下进行的，其中在水解反应期间，抑制微生物酶的有机杂质化合物在水解反应系统中的含量保持在10重量％或以下的水平，基于水解反应系统的重量而言。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及生产甘氨酸的方法。更确切地，本发明涉及生产甘氨酸的方法，该方法包含在微生物酶的作用下，使甘氨腈(glycinonitrile)水溶液在水解反应系统中进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，其中该水解反应系统含有至少一种抑制该微生物酶的有机杂质化合物，该有机杂质化合物的分子量为95或以上，并且含有特定的结构，该水解反应是在这样的条件下进行的，其中在水解反应期间，抑制微生物酶的有机杂质化合物在水解反应系统中的含量保持在10重量％或以下的水平，基于水解反应系统的重量而言。利用本发明的方法，能够容易和高效地在商业规模上生产高纯度的甘氨酸，可用作食品添加剂和用作合成药物、农药与洗涤剂的原料，而不会对环境造成严重的负担。
背景技术
按照惯例，生产甘氨酸的方法包含：通过斯特雷克法从甲醛、氰化氢和氨合成甘氨腈；通过碱(例如苛性苏打)水解转化所合成的甘氨腈为甘氨酸苏打和氨；用酸(例如硫酸)中和甘氨酸苏打，得到甘氨酸；通过晶体-沉积回收甘氨酸(参见未审日本专利申请说明书No.昭43-29929、昭51-19719、昭49-14420和昭49-35329)。由上显而易见，这样一种采用碱的常规水解方法使用一种碱和一种酸，用量各自等于所生成的甘氨酸的量。因此，这类方法具有一个问题在于，伴随产生大量的盐，副产物的处理对环境造成严重的负担。进而，由于副产物盐的溶解度接近于甘氨酸，不能通过单一步骤的晶体-沉积回收甘氨酸，因此，烦琐的操作是回收甘氨酸所必要的，例如重复包含晶体-沉积和母液循环的周期(参见未审日本专利申请说明书No.昭51-34113(相当于DE 2541677-B和NL 7511023-B))。另外，作为中间体的甘氨腈水溶液在pH2.5或以上时是不稳定的，并且已知温度越高，甘氨腈经历变性作用的可能性越大，例如分解和变色(参见未审日本专利申请说明书No.昭49-14420、昭54-46720和昭54-46721)。根据日本化学会出版的《工业化学杂志》第70卷第54页(1967)的记载，氰化氢有可能在碱性条件下因聚合作用而变性，随着聚合作用的进行生成黑色固体。进而，日本化学会出版的《实验化学讲座》第1版第347页描述了甘氨腈等的氰甲基有可能在碱性条件下因加成聚合作用而变性，导致吡啶化合物和嘧啶化合物的生成。未审日本专利申请说明书No.昭62-212357(相当于美国专利No.4,661,614)公开了从甲醛、氰化氢和氨能够合成亚胺化合物，例如亚氨基二乙腈。已审日本专利申请公报说明书No.昭51-244815公开了当加热甘氨腈时，甘氨腈生成氨和亚胺化合物(例如亚氨基二乙腈)，进一步加热导致该亚胺化合物变性，导致黑色化合物的生成。因此，在常规方法中，由上述分解和变性引起的甘氨酸收率降低是不可避免的。进而，常规方法具有一个缺点在于，采用活性炭或特殊的离子交换树脂的烦琐处理是除去变色物质所必要的(参见未审日本专利申请说明书No.平3-190851和未审日本专利申请说明书No.平4-226949(相当于EP 459803-B))。
至于不使用大量碱和酸在适度条件下水解甘氨腈的方法，已知这样一种方法，其中使用具有水解腈基活性的微生物简单地水解甘氨腈，从而得到甘氨酸和铵。已审日本专利申请公报说明书No.昭58-15120(相当于法国专利No.225585)公开了这样一种方法，其中使用悬浮在反应介质液体中的短杆菌R312进行水解反应，反应介质液体已经用苛性钾等调节pH值为8。未审日本专利申请说明书No.平3-62391(相当于EP 187680-B)公开了这样一种方法，其中使用悬浮在反应介质液体中的棒杆菌N-774进行水解反应，反应介质液体是pH值为7.7的磷酸盐缓冲液。未审日本专利申请说明书No.平3-280889(相当于EP 450885-B)公开了这样一种方法，其中使用能够水解腈基的微生物从甘氨腈生产甘氨酸，该微生物属于红球菌属、节杆菌属、乳酪杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、产碱菌属、棒杆菌属或链霉菌属，其中该微生物是悬浮在反应介质液体中的，后者是pH值为7.7的磷酸盐缓冲液。不过，正如这些专利文献的实施例所示，这些方法要求冻干微生物的用量等于或大于甘氨酸的量，或者作为替代选择，使用大量冻干微生物进行反应30小时，也就是5重量％或以上，基于甘氨酸的重量而言。进而，也正如这些专利文献的实施例所示，这些方法要求向反应系统中连续加入中和剂，以保持反应系统的pH在中性范围内，以便维持微生物的活性。一般来说，为了中和甘氨酸的铵盐，向反应系统中加入硫酸或磷酸，因此大量硫酸铵或磷酸铵有可能剩余在反应系统中。因此，使用微生物生产甘氨酸的上述方法的不利之处在于必须使用大量的酸和必须弃去大量废液。进而，使用微生物的上述方法具有下列问题。在使用微生物的上述方法中，用于回收甘氨酸的操作除了浓缩步骤以外还需要加入甲醇等的步骤，以致用于回收甘氨酸的操作变得比上面提到的碱水解法更加复杂(参见已审日本专利申请公报说明书No.昭58-15120(相当于法国专利No.225585))。进而，上述方法使用大量的微生物，这导致废液量的进一步增加。另一方面，已知有这样一种方法，它采用微生物和电透析，并且其中甘氨酸和氨是单独回收的，同时回收碱(参见未审日本专利申请说明书No.昭10-179183(相当于美国专利No.5,932,454和EP852261-A))。这种方法是用于生产甘氨酸的方法，包含下列步骤：使用微生物生产有机酸(包括甘氨酸)的铵盐的步骤；转化铵盐为碱金属盐的步骤，从而排除氨；回收所排除的氨的步骤；通过电透析使碱和有机酸彼此分离的步骤；用有机溶剂萃取有机酸的步骤；和从有机溶剂中分离有机酸的步骤。在上述专利文献的实施例中，从培养在20g甘油培养基中的微生物仅得到0.3摩尔有机酸，说明微生物的活性是非常低的。因而，这种方法具有缺点在于，多个步骤和烦琐操作是必要的，消耗大量的电，使用和弃去大量微生物。
由上显而易见，利用微生物从甘氨腈生产甘氨酸的常规方法具有缺点在于，每单位数量冻干微生物的活性和每单位时间的活性都是很低的，并且必须弃去大量的培养基和微生物。另外，在不采用电透析的方法的情况下，存在一些问题在于，由于为了调节反应系统的pH或者为了回收甘氨酸而使用中和剂，氨的回收是困难的，并且除去中和剂的步骤是必要的。即使在采用电透析的方法的情况下，氨的回收不仅需要电，而且需要烦琐的多步操作。因此，这种方法的商业化实施不能令人满意地进行。
发明概述
在这种情形下，本发明人进行了广泛而深入的研究，以发现能够解决上述问题的反应方法和反应条件，发现适合用在这样一种反应方法中的微生物。结果意外地发现，一种用于生产甘氨酸的方法能够达到上述目的，该方法包括：在微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反应系统中进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，其中该水解反应系统含有至少一种抑制该微生物酶的有机杂质化合物，该有机杂质化合物的分子量为95或以上，并且含有特定的结构，该水解反应是在这样的条件下进行的，其中在水解反应期间，抑制微生物酶的有机杂质化合物在水解反应系统中的含量保持在10重量％或以下的水平，基于水解反应系统的重量而言。也就是说，已经惊人地发现，利用上述方法，实现的优点不仅在于生产甘氨酸能够无需使用和弃去大量的微生物、培养基、酸、碱等，而且在于能够抑制甘氨酸的变色，每单位重量微生物的甘氨酸生产活性和每单位时间的甘氨酸生产活性都变高了，能够化学计量地生产甘氨酸和氨而不会分解或消耗，并且能够单独和容易回收。基于上述新发现，完成了本发明。
因此，本发明的主要目的是提供用于生产甘氨酸的方法，它的有利之处不仅在于能够高效与化学计量地生产高纯度甘氨酸和高纯度氨，并能够单独回收，而且在于该方法不会对环境造成严重的负担。
通过下列详细的说明书和权利要求书并结合附图，本发明的上述和其他目的、特征和优点对本领域技术人员来说将是显而易见的。
附图的简要说明
附图中：
图1显示用在生产甘氨酸的实施例12中的生产系统。
参考号码的说明
1： 甲醛水溶液
2： 液态氰化氢
3： 氢氧化钠
4： 气态氨
5： 微生物悬液
6、7、8： 高压釜
9： 闪蒸设备
10： 液态氨
11、16： 中间罐
12： 水解反应釜
13： 连续离心机
14： 所要弃去的微生物
15： 循环型超滤设备
17： 活性炭柱
18： 连续晶体-沉积(crystal-deposition)设备
19： 已被蒸发和回收的水
20： 吹风
21： 滤液
22： 甘氨酸晶体
发明的详细说明
本发明在一方面提供用于生产甘氨酸的方法，包括：
提供水溶液形式的甘氨腈，
在具有水解腈基活性的微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反应系统中进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，
该水解反应系统含有至少一种抑制该微生物酶的有机杂质化合物，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物的分子量为95或以上，并且含有至少一个选自腈基、羧基、酰胺基、氨基、羟基和亚丙基胺(trimethyleneamine)结构的成员，其中该亚丙基胺结构具有由下式(1)代表的骨架：
其中n代表整数1或以上，
该水解反应是在这样的条件下进行的，其中在水解反应期间，抑制微生物酶的有机杂质化合物在水解反应系统中的含量保持在10重量％或以下的水平，基于水解反应系统的重量而言，和
从水解反应系统中分离甘氨酸。
为了易于理解本发明，本发明的必要特征和各种优选实施方式列举如下。
1、用于生产甘氨酸的方法，包括：
提供水溶液形式的甘氨腈，
在具有水解腈基活性的微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反应系统中进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，
该水解反应系统含有至少一种抑制该微生物酶的有机杂质化合物，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物的分子量为95或以上，并且含有至少一个选自腈基、羧基、酰胺基、氨基、羟基和亚丙基胺结构的成员，其中该亚丙基胺结构具有由下式(1)代表的骨架：
其中n代表整数1或以上，
该水解反应是在这样的条件下进行的，其中在水解反应期间，抑制微生物酶的有机杂质化合物在水解反应系统中的含量保持在10重量％或以下的水平，基于水解反应系统的重量而言，和
从水解反应系统中分离甘氨酸。
2、根据上面第1项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物是在至少一种反应中作为副产物而生成的，该反应选自从氰化氢、甲醛和氨合成甘氨腈和甘氨腈水解为甘氨酸和氨。
3、根据上面第1或2项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物包含由下式(2)代表的化合物：
NH3-n(CH2Y1)n (2)
其中每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；n代表整数2或3。
4、根据上面第1或2项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物包含至少一种选自由下列化合物(a)和(b)组成的组的化合物：
(a)由下式(3)代表的化合物：
其中：
Y1代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数0或以上；
该Z1或每个Z1独立地是由下式(4)或(5)代表的： 或
其中每个Y2独立地代表氨基或羟基，和
(b)由下式(6)或(7)代表的化合物：
或
其中每个Y2独立地代表氨基或羟基；
每个Z2独立地是由下式(8)或(9)代表的： 或
Z1 n-H (9)
其中：
Y2代表氨基或羟基；
该Z1或每个Z1是如式(3)所定义的；
n代表整数0或以上。
5、根据上面第1或2项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物包含至少一种选自由下列化合物(c)和(d)组成的组的化合物：
(c)由下式(10)或(11)代表的化合物： 或
其中每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基，和
(d)由下式(12)代表的化合物：
(HCN)n (12)
其中n代表整数4或以上。
6、根据上面第1或2项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物包含这样的化合物，在其分子中具有至少一个选自由下列骨架(e)和(f)组成的组的骨架：
(e)由下式(13)代表的骨架：
其中每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
n代表整数2或以上，和
(f)由下式(14)或(15)代表的骨架：
或
其中：
该Y1或每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数1或以上。
7、根据上面第1或2项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物包含这样的化合物，在其分子中具有至少一种骨架，选自由下列骨架(g)和(h)组成的组：
(g)由下式(16)代表的骨架：
其中：
每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数2或以上，和
(h)由下式(17)或(18)代表的骨架： 或
其中：
该Y1或每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数1或以上。
8、根据上面第1或2项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物包含六亚甲基四胺。
9、根据上面第1至8项之任意一项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物在重水中测量的13C-NMR波谱中53ppm与100ppm之间表现峰。
10、根据上面第1至9项之任意一项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物在关于水解反应系统测量的紫外-可见吸收光谱中340nm与380nm之间和440nm与480nm之间表现最大吸收。
11、根据上面第1至10项之任意一项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物的分子量为130或以上。
12、根据上面第1至11项之任意一项的方法，其中该至少一种抑制微生物酶的有机杂质化合物的量为1重量％或以下，基于水解反应系统的重量而言。
13、根据上面第1至12项之任意一项的方法，其中该水解反应系统中溶解有5重量ppm或以下的氧，基于水解反应系统的重量而言。
14、根据上面第1至13项之任意一项的方法，其中水解作用是利用密闭反应系统、用惰性气体加压的反应系统、流通惰性气体的反应系统或在低于大气压的压力之下的反应系统进行的，以便抑制溶解在水解反应系统中的氧量。
15、根据上面第1至14项之任意一项的方法，其中水解作用是在其中溶解有氨的水解反应系统中进行的。
16、根据上面第1至15项之任意一项的方法，其中水解作用是在含有2重量％或以下电解质的水解反应系统中进行的，基于甘氨腈的重量而言。
17、根据上面第1至16项之任意一项的方法，其中具有水解腈基活性的微生物酶是从属于下列属的微生物衍生的，所述属选自不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)和假丝酵母属(Candida)。
18、根据上面第17项的方法，其中不动杆菌属的微生物菌株是不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Japan)中，保藏号为FERM BP-2451，或不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK227，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-7413。
19、根据上面第17项的方法，其中红球菌属的微生物菌株是海洋红球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-5219。
20、根据上面第17项的方法，其中棒杆菌属的微生物菌株是棒杆菌(Corynebacterium sp.)C5，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-7414，或Corynebacteriumnitrilophilus，保藏在美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，U.S.A.)中，保藏号为ATCC 21419。
21、根据上面第17项的方法，其中产碱菌属的微生物菌株是粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-4750。
22、根据上面第17项的方法，其中分枝杆菌属的微生物菌株是分枝杆菌(Mycobacterium sp.)AC777，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-2352。
23、根据上面第17项的方法，其中红假单胞菌属的微生物菌株是球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)，保藏在美国典型培养物保藏中心中，保藏号为ATCC 11167。
24、根据上面第17项的方法，其中假丝酵母属的微生物菌株是热带假丝酵母(Candida tropicalis)，保藏在美国典型培养物保藏中心中，保藏号为ATCC 20311。
25、根据上面第1至24项之任意一项的方法，其中在进行从水解反应系统中分离甘氨酸的同时，独立于甘氨酸回收地回收伴随产生的氨。
26、根据上面第25项的方法，其中甘氨酸和氨是通过至少一个操作而单独回收的，该操作选自蒸馏、反应性蒸馏(reactivedistillation)、被惰性气体夹带、离子交换、提取、利用不良溶剂再沉淀和通过浓缩或冷却的晶体-沉积。
27、根据上面第26项的方法，其中氨是通过蒸馏、反应性蒸馏或被惰性气体夹带而回收的，甘氨酸是通过使氨回收之后剩余的液体进行通过浓缩或冷却的晶体-沉积而回收的。
28、根据上面第1至27项之任意一项的方法，该方法包括：
(1)在密闭的反应系统内，在碱催化剂(alkali catalyst)的存在下，使氰化氢与甲醛在水性介质中反应，得到水溶液形式的乙醇腈，
(2)向乙醇腈的水溶液中加入氨，进行乙醇腈与氨之间的反应，从而得到水溶液形式的甘氨腈，同时生成水，
(3)通过蒸馏从所得甘氨腈的水溶液中分离大部分氨和一部分水，从而得到水解反应系统，含有水溶液形式的甘氨腈和剩余未分离的氨，其中回收所分离的氨，用于再循环至步骤(2)，
(4)在由加入到处于密闭系统内的水解反应系统中的微生物产生的微生物酶的作用下，使水解反应系统进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，
(5)通过至少一个操作分离微生物和微生物酶，该操作选自离心过滤和膜过滤，其中回收微生物和微生物酶，用于再循环至步骤(4)，
(6)通过至少一个操作分离一部分在步骤(1)至(5)中伴随产生的、抑制微生物酶的有机杂质化合物，该操作选自膜过滤和吸附剂分离(adsorbent-separation)，
(7)通过蒸馏分离在步骤(4)中伴随产生的氨和在步骤(4)后剩余在水解反应系统中的过量的水，其中回收所分离的氨，用于再循环至步骤(2)，
(8)在步骤(7)后或者与此同时，通过晶体-沉积分离甘氨酸，和
(9)干燥甘氨酸的晶体。
29、用于生产甘氨酸的方法，包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，和从水解反应系统中分离甘氨酸，其中甘氨腈的水解作用是在氨的存在下进行的。
30、根据上面第29项的方法，其中氨的量为0.001至5mol，相对于1摩尔甘氨腈而言。
31、用于生产甘氨酸的方法，包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，和从水解反应系统中分离甘氨酸，其中在进行从水解反应系统中分离甘氨酸的同时，在碱和酸缺乏下，独立于甘氨酸回收地回收伴随产生的氨。
32、根据上面第31项的方法，其中甘氨酸和氨是通过至少一个操作而单独回收的，该操作选自蒸馏、反应性蒸馏、被惰性气体夹带、离子交换、提取、利用不良溶剂再沉淀和通过浓缩或冷却的晶体-沉积。
33、根据上面第32项的方法，其中氨是通过蒸馏、反应性蒸馏或被惰性气体夹带而回收的，甘氨酸是通过使氨回收之后剩余的液体进行通过浓缩或冷却的晶体-沉积而回收的。
下面将详细描述本发明。
本发明中优选的是，甘氨腈是从氰化氢、甲醛和氨合成的。甘氨腈可以通过常规方法合成。具体来说，甘氨腈例如可以通过这样一种方法合成，其中从氰化氢和甲醛合成乙醇腈(羟基乙腈)，然后向乙醇腈加入氨并与之反应，从而得到甘氨腈；或者其中直接从氰化氢、甲醛和氨合成甘氨腈。
用在本发明中的水解反应系统包含乙醇腈、甘氨腈、甘氨酸、氨、水、催化剂、抑制微生物酶的有机杂质化合物等。
含在水解反应系统中的、抑制微生物酶的有机杂质化合物可逆地抑制微生物酶的化合物，或不可逆地抑制微生物酶的化合物，使微生物酶失活和不可能再使用。这类有机杂质化合物的分子量为95或以上，并且含有至少一个选自由腈基、羧基、酰胺基、氨基、羟基和亚丙基胺结构组成的组的成员。例如，有机杂质化合物可以是任意下列物质：用于生产甘氨酸的原料；含在催化剂等中的添加剂；和含在原料中的杂质。另外，有机杂质化合物可以是任意下列物质：在从氰化氢、甲醛和氨合成甘氨腈期间伴随产生的化合物；和在甘氨腈(氨基乙腈)水解为甘氨酸和氨期间伴随产生的化合物。进而，有机杂质化合物可以是任意下列物质：在具有水解腈基活性的微生物酶产生期间伴随产生的化合物；和从分离与纯化甘氨酸步骤再循环的副产物。
含在本发明水解反应系统中的有机杂质化合物的具体实例包括至少一种选自由下列化合物(A)至(F)组成的组的化合物。
(A)由下式(2)代表的化合物：
NH3-n(CH2Y1)n (2)
其中每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；n代表整数2或3。
由上式(2)代表的化合物是含有亚胺(-NH-)结构或次氮基(-N＝)结构的缩合化合物和通过其水解作用生成的化合物。作为这类缩合化合物的实例，可以提到亚氨基二乙腈和次氮基三乙腈，它们已知是通过乙醇腈与甘氨腈之间的缩合反应生成的。通过这类缩合化合物腈基的水解作用生成的化合物实例包括亚氨基二乙酸、氰基甲基氨基乙酸、亚氨基二乙酰胺、氰基甲基氨基乙酰胺、氨基甲酰基甲基氨基乙酸、次氮基三乙酸、N-(氰基甲基)亚氨基二乙酸、N，N-双(氰基甲基)氨基乙酸、N-(氨基甲酰基甲基)亚氨基二乙酸、N，N-双(氨基甲酰基甲基)氨基乙酸、次氮基三乙酰胺、N-(氰基甲基)亚氨基二乙酰胺、N，N-双(氰基甲基)氨基乙酰胺等。
(B)至少一种选自由下列化合物(a)和(b)组成的组的化合物：
(a)由下式(3)代表的化合物：
其中：
Y1代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数0至100；
该Z1或每个Z1独立地是由下式(4)或(5)代表的：
或
其中每个Y2独立地代表氨基或羟基，和
(b)由下式(6)或(7)代表的化合物：
或
其中每个Y2独立地代表氨基或羟基；
每个Z2独立地是由下式(8)或(9)代表的：
或
Z1 n-H (9)
其中：
Y2代表氨基或羟基；
该Z1或每个Z1是如式(3)所定义的；
n代表整数0至100。
由上式(3)代表的化合物是加成聚合化合物和通过该加成聚合化合物腈基的水解作用生成的化合物。由式(6)代表的化合物是具有嘧啶骨架的加成环化化合物——它是通过上述加成聚合化合物的环化作用生成的——和通过这样的加成环化化合物腈基的水解作用生成的化合物。由式(7)代表的化合物是具有吡啶骨架的加成环化化合物——它是通过上述加成聚合化合物的环化作用生成的——和通过这样的加成环化化合物腈基的水解作用生成的化合物。例如，苯乙腈的加成反应描述在日本化学会出版的《实验化学讲座》第1版第18-2卷第347页中，这类加成化合物已知是通过这样一种机理生成的，氰基甲基经历加成二聚作用或加成三聚作用，之后是可选的环化作用或聚合作用。
由上式(3)代表的加成二聚物实例包括通过乙醇腈与甘氨腈之间的加成反应所得到的化合物，也就是1，3-二氨基-2-亚氨基-丁腈、1，3-二羟基-2-亚氨基-丁腈、1-氨基-2-亚氨基-3-羟基丁腈和3-氨基-2-亚氨基-1-羟基丁腈。通过上述化合物腈基的水解作用生成的化合物实例包括1，3-二氨基-2-亚氨基-丁酸、1，3-二羟基-2-亚氨基-丁酸、1-氨基-2-亚氨基-3-羟基丁酸、3-氨基-2-亚氨基-1-羟基丁酸、1，3-二氨基-2-亚氨基-丁酰胺、1，3-二羟基-2-亚氨基-丁酰胺、1-氨基-2-亚氨基-3-羟基丁酰胺、3-氨基-2-亚氨基-1-羟基丁酰胺等。
作为由上式(3)代表的并且含有由上式(4)代表的结构、即其中腈基被加成键合到亚甲基上的结构的加成三聚物的实例，可以提到1，3，5-三氨基-2，4-二亚氨基己腈、1，3-二氨基-2，4-二亚氨基-5-羟基己腈、1，5-二氨基-2，4-二亚氨基-3-羟基己腈、3，5-二氨基-2，4-二亚氨基-1-羟基己腈、1-氨基-2，4-二亚氨基-3，5-二羟基己腈、3-氨基-2，4-二亚氨基-1，5-二羟基己腈、5-氨基-2，4-二亚氨基-1，3-二羟基己腈、2，4-二亚氨基-1，3，5-三羟基己腈等。通过上述化合物腈基的水解作用生成的化合物实例包括1，3，5-三氨基-2，4-二亚氨基己酸、1，3-二氨基-2，4-二亚氨基-5-羟基己酸、1，5-二氨基-2，4-二亚氨基-3-羟基己酸、3，5-二氨基-2，4-二亚氨基-1-羟基己酸、1-氨基-2，4-二亚氨基-3，5-二羟基己酸、3-氨基-2，4-二亚氨基-1，5-二羟基己酸、5-氨基-2，4-二亚氨基-1，3-二羟基己酸、2，4-二亚氨基-1，3，5-三羟基己酸、1，3，5-三氨基-2，4-二亚氨基己酰胺、1，3-二氨基-2，4-二亚氨基-5-羟基己酰胺、1，5-二氨基-2，4-二亚氨基-3-羟基己酰胺、3，5-二氨基-2，4-二亚氨基-1-羟基己酰胺、1-氨基-2，4-二亚氨基-3，5-二羟基己酰胺、3-氨基-2，4-二亚氨基-1，5-二羟基己酰胺、5-氨基-2，4-二亚氨基-1，3-二羟基己酰胺、2，4-二亚氨基-1，3，5-三羟基己酰胺等。
作为由上式(3)代表的并且含有由上式(5)代表的结构、即其中腈基被加成键合到亚氨基上的结构的加成三聚物的实例，可以提到2，4-二氨基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁腈、2-氨基-4-羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁腈、4-氨基-2-羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁腈、2，4-二羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁腈、2，4-二氨基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁腈、2-氨基-4-羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁腈、4-氨基-2-羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁腈、2，4-二羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁腈等。通过上述化合物腈基的水解作用生成的化合物实例包括2，4-二氨基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酸、2-氨基-4-羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酸、4-氨基-2-羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酸、2，4-二羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酸、2，4-二氨基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酸、2-氨基-4-羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酸、4-氨基-2-羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酸、2，4-二羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酸、2，4-二氨基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酰胺、2-氨基-4-羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酰胺、4-氨基-2-羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酰胺、2，4-二羟基-3-(2-氨基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酰胺、2，4-二氨基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酰胺、2-氨基-4-羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酰胺、4-氨基-2-羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酰胺、2，4-二羟基-3-(2-羟基-1-亚氨基乙基亚氨基)丁酰胺等。
由上式(3)代表的化合物实例还包括这样的加成聚合化合物，其中甘氨腈或乙醇腈的腈基被加成键合到上述化合物的甲基或亚氨基上。由上式(3)代表的这类化合物可以具有无规共聚物构型，其中由上式(4)代表的结构单元和由上式(5)代表的结构单元交替排列在分子中，或者具有嵌段共聚物构型，其中该分子含有至少两个不同的聚合物嵌段，它们各自独立地含有至少一个由式(4)和(5)代表的结构单元。
作为由上式(6)代表的、具有通过腈基末端的环化作用生成的嘧啶骨架的加成环化化合物实例，可以提到4，5-二氨基-2，6-双(氨基甲基)嘧啶、4-氨基-5-羟基-2，6-双(氨基甲基)嘧啶、5-氨基-4-羟基-2，6-双(氨基甲基)嘧啶、4，5-二氨基-2-氨基甲基-6-羟基甲基嘧啶、4-氨基-5-羟基-2-氨基甲基-6-羟基嘧啶、5-氨基-4-羟基-2-氨基甲基-6-羟基嘧啶、4，5-二氨基-6-氨基甲基-2-羟基甲基嘧啶、4-氨基-5-羟基-6-氨基甲基-2-羟基嘧啶、5-氨基-4-羟基-6-氨基甲基-2-羟基嘧啶、4，5-二氨基-2，6-双(羟基甲基)嘧啶、4-氨基-5-羟基-2，6-双(羟基甲基)嘧啶、5-氨基-4-羟基-2，6-双(羟基甲基)嘧啶等。由上式(6)代表的化合物的进一步实例包括通过这样一种反应生成的加成环化化合物，其中腈基被加成键合到任意上述化合物的1-位亚甲基上，并且所得化合物被由上式(8)或(9)代表的取代基取代。由上式(6)代表的这类化合物可以具有无规共聚物构型，其中由上式(4)代表的结构单元和由上式(5)代表的结构单元交替排列在分子中，或者具有嵌段共聚物构型，其中该分子含有至少两个不同的聚合物嵌段，它们各自独立地含有至少一个由式(4)和(5)代表的结构单元。另外，通过上述加成环化化合物腈基的水解作用生成的化合物也可以被提到作为由式(6)代表的化合物实例。
作为由上式(7)代表的、具有通过腈基末端的环化作用生成的吡啶骨架的加成环化化合物实例，可以提到2，3，4，5-四氨基-6-氨基甲基吡啶、2，3，4-三氨基-5-羟基-6-氨基甲基吡啶、2，4，5-三氨基-3-羟基-6-氨基甲基吡啶、2，4，5-三氨基-3，5-二羟基-6-氨基甲基吡啶、2，3，4，5-四氨基-6-羟基甲基吡啶、2，3，4-三氨基-5-羟基-6-羟基甲基吡啶、2，4，5-三氨基-3-羟基-6-羟基甲基吡啶和2，4，5-三氨基-3，5-二羟基-6-羟基甲基吡啶。由上式(7)代表的化合物的进一步实例包括通过这样一种反应生成的加成环化化合物，其中腈基被加成键合到任意上述化合物的6-位亚甲基上，并且所得化合物被由上式(8)或(9)代表的取代基取代。由上式(7)代表的这类化合物可以具有无规共聚物构型，其中由上式(4)代表的结构单元和由上式(5)代表的结构单元交替排列在分子中，或者具有嵌段共聚物构型，其中该分子含有至少两个不同的聚合物嵌段，它们各自独立地含有至少一个由式(4)和(5)代表的结构单元。另外，通过上述加成环化化合物腈基的水解作用生成的化合物也可以被提到作为由式(7)代表的化合物的实例。
(C)至少一种选自由下列化合物(c)和(d)组成的组的化合物：
(c)由下式(10)或(11)代表的化合物：
或
其中每个Y1独立地腈基、羧基或酰胺基，和
(d)由下式(12)代表的化合物：
(HCN)n (12)
其中n代表整数4至200。
由上式(10)或(11)代表的化合物是氰化氢的四聚物和通过该四聚物腈基的水解作用生成的化合物。由上式(12)代表的化合物是氰化氢的聚合物。
由上式(10)或(11)代表的化合物(即氰化氢的四聚物)的实例包括二氨基马来腈(maleonitrile)及其互变异构体，也就是氨基亚氨基琥珀腈。通过氰化氢四聚物腈基的水解作用生成的化合物实例包括二氨基马来酸、2，3-二氨基-3-氰基丙烯酸、2，3-二氨基-3-氰基丙烯酰胺、2，3-二氨基-3-氨基甲酰基丙烯酸、2，3-二氨基-3-氨基甲酰基丙烯酰胺、氨基亚氨基琥珀酸、2-氨基-3-亚氨基-3-氨基甲酰基丙酰胺、2-氨基-3-亚氨基-3-氰基丙酸、2-氨基-3-亚氨基-3-氰基丙酰胺、2-氨基-3-亚氨基-3-氨基甲酰基丙酸、3-氨基-2-亚氨基-3-氰基丙酸、3-氨基-2-亚氨基-3-氰基丙酰胺和3-氨基-2-亚氨基-3-羰基丙酸。
由上式(12)代表的氰化氢聚合物实例包括下列化合物。若n＝4，则除了由上式(10)或(11)代表的化合物以外，还可以提到3-氨基-2，4-二亚氨基丁酸；若n＝5，则可以提到3-氨基-3-氰基-2，4-二亚氨基丁酸和3-氨基-2，4，5-三亚氨基庚酸；若n＝6，则可以提到3，4-二氨基-3，4-二氰基-2-亚氨基丁酸、3-氨基-3-氰基-2，4，5-三亚氨基庚酸等。由上式(12)代表的氰化氢聚合物的进一步实例包括其中n是7或以上的氰化氢聚合物。
(D)这样一种化合物，在其分子中具有至少一个选自由下列骨架(e)和(f)组成的组的骨架：
(e)由下式(13)代表的骨架：
其中每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
n代表整数2至120，和
(f)由下式(14)或(15)代表的骨架：
或
其中：
每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数1至70。
在其分子中具有由上式(13)代表的骨架的化合物实例包括氰化氢的聚合物和通过氰化氢聚合物腈基的水解作用生成的聚合物。作为这样一种氰化氢聚合物的具体实例，可以提高这样一种聚合物，它具有至少一个选自由氨基氰基亚甲基结构、氨基氨甲酰基亚甲基结构和氨基羧基亚甲基结构组成的组的结构，并且具有2个或以上重复单元。上面提到的氰化氢聚合物可以是在重水中测量的13C-NMR波谱中70ppm与90ppm之间表现一个峰的化合物，其中该峰归因于亚甲基结构。
在其分子中具有由上式(14)或(15)代表的骨架的化合物实例包括多环化合物和通过该多环化合物腈基的水解作用生成的化合物。作为这类化合物的具体实例，可以提到这样一种多环化合物，其中具有3，4，4，5-四氨基-4-(氰基、羧基或氨基甲酰基)-3，4，5，6-四氢吡啶骨架的6-元环5-位和6-位分别是相邻6-元环的2-位和3-位，和这样一种多环化合物，其中3，7，9，10-四氨基-3，4，6，7，9，10-六氢吡啶并[2，3-e]吡啶骨架的6-位、7-位、8-位和9-位分别是相邻吡啶骨架的5-位、10-位、4-位和3-位。这样一种多环化合物可以是在重水中测量的13C-NMR波谱中60ppm与80ppm之间表现一个峰的化合物，其中该峰归因于亚甲基结构。这样一种多环化合物可以是在紫外-可见光谱中380nm与460nm之间表现最大吸收的化合物。
上述氰化氢聚合物等的生成机理描述在日本化学会出版的《工业化学杂志》(Kogyo Kagaku Zasshi)第70卷第54页(1967)中。
(E)这样一种化合物，在其分子中具有至少一个骨架，该骨架选自由下列骨架(g)和(h)组成的组：
(g)由下式(16)代表的骨架：
其中：
每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数2至120，和
(h)由下式(17)或(18)代表的骨架：
或
其中：
每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数1至70。
在其分子中具有由上式(16)代表的骨架的化合物是通过氧化聚合作用生成的化合物(即氧化聚合产物)和通过该氧化聚合产物腈基的水解作用生成的化合物。这些化合物已知是通过亚甲基的氧化偶联反应生成的。这类化合物的实例包括2，3-二氨基琥珀腈和2-氨基-3-羟基琥珀腈(它们是通过乙醇腈和甘氨腈的氧化偶联生成的)；和通过上述化合物的水解作用生成的化合物，例如2，3-二氨基琥珀酸、2，3-二氨基-3-氨基甲酰基丙酰胺、2，3-二氨基-3-氰基丙酸、2，3-二氨基-3-氨基甲酰基丙酸、2，3-二氨基-3-氰基丙酰胺、2-氨基-3-羟基-3-氰基丙酸、2-氨基-3-羟基-3-氨基甲酰基丙酸、2-氨基-3-羟基-3-氰基丙酰胺、3-氨基-2-羟基-3-氰基丙酸、3-氨基-2-羟基-3-氨基甲酰基丙酸和3-氨基-2-羟基-3-氰基丙酰胺。化合物(E)的进一步实例包括具有这样一种结构的氧化聚合产物，在该结构中亚甲基化合物被偶联到任意上述在其分子中具有由式(16)代表的骨架的化合物上，还包括通过这类氧化聚合产物腈基的水解作用生成的化合物。这样一种化合物的具体实例是这样的化合物，它具有至少一个选自由氨基氰基亚甲基结构、氨基氨基甲酰基亚甲基结构、氨基羧基亚甲基结构、羟基氰基亚甲基结构、羟基氨基甲酰基亚甲基结构和羟基氨基羧基亚甲基结构组成的组的结构，并且具有2个或以上重复单元。上面提到的这样一种氧化聚合产物可以是在重水中测量的13C-NMR波谱中70ppm与90ppm之间表现一个峰的化合物，其中该峰归因于亚甲基结构。
在其分子中具有由式(17)或(18)代表的骨架的化合物是通过上述氧化聚合产物氰基的加成环化作用生成的。这类化合物是在其分子中具有由上式(17)或(18)代表的骨架的多环化合物和通过该多环化合物腈基的水解作用生成的化合物。作为这类化合物的实例，可以提到这样一种多环化合物，其中具有3，4，4，5-(氨基和/或羟基)-4-(氰基、羧基或氨基甲酰基)-3，4，5，6-四氢吡啶骨架的6-元环5-位和6-位分别是相邻6-元环的2-位和3-位，和这样一种多环化合物，其中3，7，9，10-(氨基和/或羟基)-3，4，6，7，9，10-六氢吡啶并[2，3-e]吡啶骨架的6-位、7-位、8-位和9-位分别是相邻吡啶骨架的5-位、10-位、4-位和3-位。这样一种多环化合物可以是在重水中测量的13C-NMR光谱中60ppm与80ppm之间表现一个峰的化合物，其中该峰归因于亚甲基结构。另外，这样一种多环化合物可以是在紫外-可见光谱中340nm与380nm之间和440nm与480nm之间表现最大吸收的化合物。
(F)六亚甲基四胺和具有亚丙基胺结构的化合物，它具有由下式(1)代表的骨架：
其中n代表整数1至150。
这类化合物已知是通过甲醛与氨的缩合作用生成的。具有由上式(1)代表的结构的化合物实例包括下列化合物。若n＝1，则可以提到N-氨基甲基-六氢-1，3，5-三嗪；若n＝2，则可以提到N，N’-双氨基甲基-六氢-1，3，5-三嗪、五亚甲基四胺和六亚甲基五胺；若n＝3，则可以提到N，N’，N”-三氨基甲基-六氢-1，3，5-三嗪；若n＝4，则可以提到六亚甲基四胺和七亚甲基五胺。
正如上面详细解释的，含在用在本发明中的水解反应系统中的有机杂质化合物的实例包括通过羟基与氨基之间的缩合反应生成的化合物、通过腈基与活化亚甲基之间的加成反应生成的化合物、通过腈基与活化亚甲基之间的环化反应生成的化合物、通过亚甲基的氧化反应生成的化合物、通过亚甲基的环化反应生成的化合物和通过上述化合物腈基的水解作用生成的化合物。有机杂质化合物的进一步实例包括通过上述反应的组合生成的化合物，也就是下列化合物(I)至(V)：
(I)通过由式(3)、(6)、(7)、(10)或(11)代表的化合物或由式(13)至(18)之任一代表的骨架的氨基与由式(3)、(6)或(7)代表的化合物或由式(14)至(18)之任一代表的骨架的羟基之间的缩合反应生成的化合物；
(II)通过由式(2)、(3)和(10)至(12)之任一代表的化合物或由式(13)、(14)、(16)或(17)代表的骨架的腈基的加成反应生成的化合物；
(III)通过由式(2)、(3)和(10)至(12)之任一代表的化合物或由式(13)、(14)、(16)或(17)代表的骨架的腈基与由式(3)、(6)、(7)或(11)代表的化合物的亚氨基之间的加成反应生成的化合物；
(IV)通过由式(2)、(3)和(10)至(12)之任一代表的化合物或由式(13)、(14)、(16)或(17)代表的骨架的腈基与由式(1)至(3)、(6)和(7)之任一代表的化合物的亚甲基之间的加成反应生成的化合物；
(V)通过一种或多种由(1)至(3)、(6)和(7)之任一代表的化合物的亚甲基的氧化偶联作用生成的化合物。
这样一种化合物可以是在重水中测量的13C-NMR光谱中53ppm与100ppm之间表现一个峰的化合物。进而，由于通过环化反应生成的化合物变色，因此作为有机杂质化合物的环化化合物可以是在紫外-可见光谱中340nm与380nm之间和440nm与480nm之间表现最大吸收的化合物。
含在本发明水解反应系统中的有机杂质化合物是分子量为95或以上的多官能化合物，这样的化合物显著降低微生物酶的活性。本发明中，甘氨酸是在这样的条件下生产的，其中分子量为95或以上、优选为130或以上的有机杂质化合物在水解反应系统中的含量基于水解反应系统的重量而言，保持在10重量％或以下、优选为5重量％或以下、更优选为1重量％或以下的水平，以便提高微生物酶的活性。
关于用于保持有机杂质化合物在水解反应系统中的含量基于水解反应系统的重量而言在10重量％或以下的方法，可以提到这样一种方法，其中将溶解在水解反应系统中的氧量抑制到5重量ppm或以下，基于水解反应系统的重量而言。在大气压下溶解在水解反应系统中的氧量一般为8重量ppm至10重量ppm。若将溶解在水解反应系统中的氧量抑制到5重量ppm或以下，则减少副产物的生成。为了抑制对微生物酶的水解活性等的抑制作用，优选的是溶解在水解反应系统中的氧量为0.5重量ppm或以下，更有利为0.05重量ppm或以下，基于水解反应系统的重量而言。
本发明中，作为用于抑制溶解在水解反应系统中的氧量的方法，可以采用这样一种方法，其中水解作用是利用隔绝空气的密闭反应系统、用惰性气体加压的反应系统、流通惰性气体的反应系统或在低于大气压的压力之下的反应系统进行的。作为惰性气体的实例，可以提到稀有气体，例如氦气和氩气；天然气，例如甲烷气、乙烷气和丙烷气；低沸点醚，例如二乙醚；和氮气。这些气体可以单独或联合使用。从安全性等观点来看，氮气是优选的。在使用密闭反应系统的情况下，隔绝反应系统与空气可以更有效地通过用惰性气体向反应系统加压来进行。关于向反应系统加压应当达到的压力水平，不存在特别的限制。不过，鉴于所用微生物酶的压力耐受性，优选的是加压后的反应系统的压力在超计大气压至1.0MPa的范围内，更有利为超计大气压至0.5MPa。另一方面，若使用在低于大气压的压力之下的反应系统，则反应系统的压力可以在大于0.7kPa(0.7kPa是水在0℃下的蒸气压)至小于大气压的范围内，优选为大于4.0kPa至小于大气压。
本发明中，为了抑制溶解在水解反应系统中的氧量，不仅有必要隔绝反应系统与空气，而且有必要除去溶解在原料等中的氧。为了从反应系统中除去氧，可以采用各种常规方法。例如，可以提到蒸馏脱气法，其中通过蒸馏除去溶解在反应系统中的氧；惰性气流处理法，其中使惰性气体流通反应系统，从而用惰性气体代替溶解在系统中的氧；和还原性化合物加入处理法，其中向反应系统中加入还原性化合物，从而通过还原作用消耗氧。可以用于还原性化合物加入处理的还原性化合物实例包括还原性生化化合物、甲酸的化合物和亚硫酸的化合物。关于可以用于还原性化合物加入处理的还原性生化化合物，不存在特别的限制。例如，可以使用L-抗坏血酸；L抗坏血酸酯，例如L-抗坏血酸硬脂酸酯；盐，例如L-抗坏血酸钠；谷胱甘肽；L-半胱氨酸；半胱氨酸盐，例如盐酸L-半胱氨酸一水合物；半胱氨酸酯，例如氯化L-半胱氨酸乙酯和氯化L-半胱氨酸甲酯；和N-取代的半胱氨酸，例如N-乙酰基-L-半胱氨酸。这些化合物中，L-抗坏血酸是优选的。向反应系统中加入还原性生化化合物的量因溶解在系统中的氧量而并；不过，从甘氨腈的稳定化观点来看，还原性生化化合物的加入量为0.001至5mol％，优选为0.01至2mol％，基于甘氨腈的摩尔量而言。关于可以用于还原性化合物加入处理的还原性甲酸化合物，不存在特别的限制。例如，可以使用甲酸；甲酸盐，例如甲酸铵；和甲酸酯，例如甲酸甲酯和甲酸乙酯。这些化合物中，甲酸和甲酸铵是优选的。向反应系统中加入还原性甲酸化合物的量因溶解在系统中的氧量而异；不过，从甘氨腈的稳定化观点来看，还原性甲酸化合物的加入量为0.002至8mol％，优选为0.02至4mol％，基于甘氨腈的摩尔量而言。关于可以用于还原性化合物加入处理的亚硫酸化合物，不存在特别的限制。例如，可以使用二氧化硫、亚硫酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢钾和亚硫酸铵。这些化合物中，亚硫酸铵是优选的。由于亚硫酸化合物是电解质，并且表现促进副产物产生的作用，因此向反应系统中加入亚硫酸化合物的量为0.001至2重量％，优选为0.01至1重量％，其中应当对加入量加以选择，以便满足下述关于反应系统中电解质总量的要求。
进而，作为另一种用于保持有机杂质化合物在水解反应系统中的含量在基于水解反应系统的重量而言10重量％或以下的水平的方法，可以提到这样一种方法，其中使用氨作为甘氨腈的稳定剂。若加热甘氨腈，则生成氨和亚胺化合物(例如亚氨基二乙腈)，进一步加热导致亚胺化合物变性，导致黑色化合物的生成。因此，利用溶解有氨的水解反应系统可以稳定甘氨腈。向反应系统中加入氨的量可以因反应温度和反应时间而异，但是优选的是氨的用量为0.001至5mol、更有利地为0.01至2mol/mol甘氨腈/升。一般来说，过量的氨在甘氨腈的合成之后会剩余其中。过量的氨本身可以用作稳定剂，无需从甘氨腈中分离过量的氨。
另外，作为进一步用于保持有机杂质化合物在水解反应系统中的含量在基于水解反应系统的重量而言10重量％或以下的水平的方法，可以提到这样一种方法，其中将反应系统中电解质的量保持在2重量％或以下的水平，基于甘氨腈的重量而言。电解质已知促进从腈化合物产生副产物。用在本发明中的电解质实例不仅包括碱金属盐、碱土金属盐和两种或多种金属盐的混合物(例如磷酸盐缓冲液)，而且包括能够生成甘氨酸盐的碱金属化合物与碱土金属化合物(例如苛性苏打)和无机酸(例如硫酸、盐酸和硝酸)。向反应系统中加入这类电解质促进从腈化合物生成副产物，作为这种促进作用的原因之一，注意到向水溶液中加入电解质导致溶解在水溶液中的氧量增加(参见《化学手册》(Kagaku Benran)修订第4版第II-159页表8.54，日本化学会出版)。因此，优选的是在使用微生物酶之前，通过洗涤减少在微生物酶的产生中用作培养基或缓冲液并且剩余在微生物酶中的电解质至预定水平，减少含在甘氨腈水溶液中的碱催化剂的量，和抑制加入到反应介质液体中以调节其pH值的磷酸盐缓冲液的量至尽可能低的水平。含在水解反应系统中的电解质总量被调节至2重量％或以下，优选为1重量％或以下，更优选为0.5重量％或以下，基于甘氨腈的重量而言。
上述抑制溶解在水解反应系统中的氧量的方法、上述向水解反应系统中溶解氨的方法和上述控制水解反应系统的电解质浓度的方法可以联合使用。优选的是联合使用所有这些方法。
关于用于产生用在本发明中的微生物酶——其中该酶具有水解腈基的活性——的微生物，不存在特别的限制。例如，可以适当地使用属于如下属的微生物，所述属选自由不动杆菌属、红球菌属、棒杆菌属、产碱菌属、分枝杆菌属、红假单胞菌属和假丝酵母属组成的组。不过，微生物并不限于它们。微生物的具体实例包括下列微生物菌株(1)至(9)：
(1)不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226(参见已审日本专利申请公报说明书No.昭63-2596)，于1985年5月28日(原始保藏日)保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(邮编No.305-0046))中，保藏号为FERM BP-2451；
(2)不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK227(参见已审日本专利申请公报说明书No.昭63-2596)，于1985年5月28日(原始保藏日)保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(邮编No.305-0046))中，保藏号为FERM BP-7413；
(3)海洋红球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9(参见未审日本专利申请说明书No.平7-303491和平7-303496)，于1993年11月2日(原始保藏日)保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(邮编No.305-0046))中，保藏号为FERM BP-5219；
(4)棒杆菌(Corynebacterium sp.)C5(参见已审日本专利申请公报说明书No.平6-65313)，于1986年8月28日(原始保藏日)保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(邮编No.305-0046))中，保藏号为FERM BP-7414；
(5)Corynebacterium nitri lophilus(参见未审日本专利申请说明书No.平2-84198)，保藏在美国典型培养物保藏中心(UniversityBoulevard，Manassas VA(邮编No.10801))中，保藏号为ATCC 21419；
(6)粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111(参见未审日本专利申请说明书No.平6-70856)，于1994年7月22日(原始保藏日)保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(邮编No.305-0046))中，保藏号为FERM BP-4750；
(7)分枝杆菌(Mycobacterium sp.)AC777(参见未审日本专利申请说明书No.平2-84918和美国专利No.5,283,193)，于1989年3月27日(原始保藏日)保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(邮编No.305-0046))中，保藏号为FERM BP-2352；
(8)球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)(参见未审日本专利申请说明书No.平6-303991)，保藏在美国典型培养物保藏中心(University Boulevard，Manassas VA(邮编No.10801))中，保藏号为ATCC 11167；
(9)热带假丝酵母(Candida tropicalis)(参见未审日本专利申请说明书No.平6-303991)，保藏在美国典型培养物保藏中心(University BouleVard，Manassas VA(邮编No.10801))中，保藏号为ATCC 20311。
可以用常规培养基培养产生用在本发明中的微生物酶的微生物。作为碳源，例如可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖、果糖、有机酸(例如乙酸)、糊精和麦芽糖。作为氮源，可以使用氨及其盐、尿素、硫酸盐、硝酸盐、有机氮源(例如酵母浸膏、麦芽浸膏、蛋白胨、大豆油和肉浸膏)。另外，适当地选择无机营养素，例如磷酸盐、钠、钾、铁、镁、钴、锰和锌，和维生素，并加入到培养基中。将微生物需氧培养，pH值为4至10，优选为6至8，温度为5至50℃，优选为20至35℃。进而，可以向培养基中加入酶诱导剂，例如内酰胺化合物(γ-内酰胺、δ-内酰胺、ε-己内酰胺等)、腈化合物和酰胺化合物。关于在本发明的商业化实施的情况下用于产生用在本发明中的微生物酶的微生物，原始形式的微生物可以用于产生微生物酶，或者从其衍生的突变菌株可以用于产生微生物酶。例如，利用适当的诱变剂通过诱导自发突变或者通过遗传工程技术可以得到组成型产生酶的突变菌株。作为用在本发明中的微生物酶，可以使用下列产物之一：从培养肉汤回收的微生物的细胞(微生物细胞)，和微生物制备物。微生物制备物的实例包括微生物的匀浆、从匀浆分离的酶、固定化的微生物和固定化的酶，后者酶是通过从微生物中分离和提取酶再将所提取的酶固定在载体上而得到的。微生物细胞可以通过常规方法从培养肉汤回收。
本发明中，以上述方式得到的微生物细胞或微生物制备物可以以微生物水悬液的形式贮存，将微生物细胞或微生物制备物悬浮在蒸馏水或缓冲液中即可制备水悬液。为了减少反应后弃去的废液量，优选的是上述微生物悬液是用蒸馏水制备的，尤其是再循环的蒸馏水，它是通过这样一种方法得到的，其中在晶体-沉积操作等期间，在反应混合物完全隔绝空气的条件下进行蒸馏。为了提高贮存稳定性，可以向微生物悬液中加入稳定剂。为了减少反应后弃去的废液量，优选地使用甘氨酸作为上述稳定剂。
本发明中，利用任意下述方法之一，可以快速地进行甘氨腈的水解以生成甘氨酸：这样一种方法，其中将甘氨腈水溶液或含氨的甘氨腈水溶液(以上述方式得到)加入到微生物细胞或微生物制备物的水悬液(以上述方式得到)中；这样一种方法，其中将微生物细胞或微生物制备物的水悬液加入到甘氨腈水溶液中；和这样一种方法，其中将微生物细胞或微生物制备物(以上述方式得到)固定在载体上，使甘氨腈水溶液流动，同时接触所固定的微生物细胞或微生物制备物。一般来说，将0.01至5重量％上述微生物细胞或微生物制备物——以微生物的干重计——和1至40重量％甘氨腈(酶底物)装入反应釜内，在例如0至60℃、优选为10至50℃的温度下进行反应1至24小时，优选为3至8小时。可以使用这样一种反应方法，其中将甘氨腈装入反应釜内，得到低浓度的甘氨腈，然后在反应过程中逐渐装入另外的甘氨腈，或者这样一种反应方法，其中反应温度随着时间变化。当甘氨腈水解为甘氨酸和氨时，反应系统的pH值比引发水解反应之前反应系统的pH值升高。为了防止反应系统的pH值随着反应进程而增加，可以在引发反应之前向反应系统中加入缓冲剂，或者作为替代选择，可以在反应期间向反应系统中加入酸或碱。不过，从减少废液量的观点来看，优选的是不向水解反应系统中加入缓冲剂、酸或碱。水解作用可以在开放型反应釜内进行；不过，从防止伴随产生的氨分散到空气中导致环境污染这一问题的观点、高效回收氨的观点和高效隔绝反应系统与空气的观点来看，优选的是水解反应是在密封的反应釜内利用密闭反应系统进行的，以便导致伴随产生的氨蓄积在反应釜内。
氨和甘氨酸可以通过至少一种操作而单独回收，该操作选自由蒸馏、反应性蒸馏、被惰性气体夹带、离子交换、提取、利用不良溶剂再沉淀和通过浓缩或冷却的晶体-沉积组成的组。从易于操作和避免使用有机溶剂、酸和碱的观点来看，优选的是首先，通过蒸馏、反应性蒸馏或被惰性气体夹带回收氨，然后，使在氨的回收之后剩余的液体进行通过浓缩或冷却的晶体-沉积，从而回收甘氨酸。作为用于进行反应性蒸馏的反应釜，可以使用单柱塔、多级塔或填充塔，带有用于通过冷却回收氨和水的冷却器。优选的是反应性蒸馏是以连续方式或间歇方式进行的，压力等于或高于反应混合物的沸腾压力，例如在60℃下为20.0kPa或更高，在0℃下为0.6kPa或以上。更优选的是在12.6kPa至1.3kPa的压力下进行真空反应性蒸馏。若氨是通过被惰性气体夹带回收的，则从反应混合物中回收氨可以通过这样一种方法进行，其中所用反应釜带有用于引入惰性气体的喷嘴和用于从惰性气体中回收氨和水的冷却盘，氨被惰性气体以连续方式或间歇方式带出，压力在轻微超大气压至减压的范围内，从而从反应混合物中分离氨。进而，为了促进氨的分离，可以在惰性气体的流动中进行真空反应性蒸馏。反应模式可以是分批模式或流动反应模式，或者这两种模式的组合。
因而，用于水解反应的反应模式可以因用于加入微生物或甘氨腈的方法和用于分离与回收氨的方法而异。若使用微生物细胞或微生物制备物的水悬液时或者若通过反应性蒸馏或被惰性气体夹带回收氨时，一般来说，水解反应可以主要通过分批反应模式或采用多级搅拌容器的多级流动反应模式进行。若使用固定化的微生物，则水解反应可以主要通过采用管状反应釜的流动反应模式进行。上述反应模式可以联合使用。用于水解反应的反应模式并不限于上述那些。
通过本发明的方法，甘氨腈水解得到甘氨酸的收率大约为100mol％。所有伴随产生的氨可以以甘氨酸的铵盐形式蓄积在密封的反应釜内，其中甘氨酸在反应釜内是以高度浓缩的甘氨酸水溶液形式存在的。作为替代选择，所有或大部分伴随产生的氨可以在反应同时与通过反应性蒸馏或被惰性气体夹带从反应混合物中分离，所分离的氨可以通过冷却回收。若微生物含有腈水合酶作为微生物酶，则甘氨酸在反应系统中被腈水合酶水解生成甘氨酰胺。在这种情况下，通过向反应系统中加入具有水解甘氨酰胺活性的微生物或微生物酶，可以将甘氨酰胺完全转化为甘氨酸和氨。从含有甘氨酸的铵盐的高度浓缩的甘氨酸水溶液中回收甘氨酸例如可以通过这样一种方法进行，包括通过离心过滤和/或膜过滤分离微生物或微生物酶，和通过晶体-沉积、离子交换或利用不良溶剂的再沉淀回收甘氨酸。伴随产生的氨以及一部分水可以通过蒸发分离，然后通过蒸馏或提取回收。用于生产甘氨酸的本发明方法的优选实施方式例如包括下列步骤：
(1)在密闭的反应系统内，在碱催化剂的存在下，使氰化氢与甲醛在水性介质中反应，得到水溶液形式的乙醇腈，
(2)向乙醇腈的水溶液中加入氨，进行乙醇腈与氨之间的反应，从而得到水溶液形式的甘氨腈，同时生成水，
(3)通过蒸馏从所得甘氨腈的水溶液中分离大部分氨和一部分水，从而得到水解反应系统，其含有水溶液形式的甘氨腈和剩余未分离的氨，其中回收所分离的氨，用于再循环至步骤(2)，
(4)在由加入到处于密闭系统内的水解反应系统中的微生物产生的微生物酶的作用下，使水解反应系统进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，
(5)通过至少一个操作分离微生物和微生物酶，该操作选自由离心过滤和膜过滤组成的组，其中回收微生物和微生物酶，用于再循环至步骤(4)，
(6)通过至少一个操作分离一部分在步骤(1)至(5)中伴随产生的、抑制微生物酶的有机杂质化合物，该操作选自由膜过滤和吸附剂分离组成的组，
(7)通过蒸馏分离在步骤(4)中伴随产生的氨和在步骤(4)后剩余在水解反应系统中的过量的水，其中回收所分离的氨，用于再循环至步骤(2)，
(8)在步骤(7)后或者与此同时，通过晶体-沉积分离甘氨酸，和
(9)干燥甘氨酸的晶体。
本发明在另一方面提供用于生产甘氨酸的方法，该方法包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，和从水解反应系统中分离甘氨酸，其中甘氨腈的水解作用是在氨的存在下进行的。这种方法中，优选的是氨的量为0.001至5mol，相对于1摩尔甘氨腈而言。利用本发明的方法，有可能使甘氨腈稳定，高效和化学计量地生产甘氨酸。
本发明在另一方面提供用于生产甘氨酸的方法，包括使甘氨腈的水溶液进行水解反应，从而转化甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，和从水解反应系统中分离甘氨酸，其中在进行从水解反应系统中分离甘氨酸的同时，在碱和酸缺乏下，独立于甘氨酸回收地回收伴随产生的氨。在这种情况下，优选的是甘氨酸和氨是通过至少一个操作而单独回收的，该操作选自由蒸馏、反应性蒸馏、被惰性气体夹带、离子交换、萃取、利用不良溶剂再沉淀和通过浓缩或冷却的晶体-沉积组成的组。另外，优选的是氨是通过蒸馏、反应性蒸馏或被惰性气体夹带而回收的，甘氨酸是通过使氨回收之后剩余的液体进行通过浓缩或冷却的晶体-沉积而回收的。利用本发明的方法，有可能使氨再循环，减少对环境造成的负担。
实施发明的最佳方式
下面，将参照下列实施例和对比例更加详细地描述本发明，但是它们不应被解释为限制本发明的范围。
在实施例和对比例中，为了防止氧进入反应系统，所有基本反应操作都是在氮气氛下进行的。另外，在第一次向反应系统中加入水溶液之前，通过对水溶液进行氮净化操作将溶解在水溶液中的氧用氮净化(也就是说，降低氧浓度至0.01ppm或以下)，该操作例如包含反复若干次的循环，所述循环包含用氮气向水溶液加压，然后恢复压力至大气压。不过，应当注意在商业规模的过程中(实施例12)，用于制备水溶液的水是从浓缩甘氨腈步骤和用于甘氨酸晶体-沉积的浓缩步骤再循环的蒸馏水，因此，没有必要进行任何特殊的操作(为了除去氧)，除了在氮气氛下贮存水溶液等。
在下列实施例和对比例中，各种操作是以下列方式进行的。
(1)氨和水的蒸发和回收
氨和水的蒸发和回收是在减压下利用薄膜蒸馏设备(由ShibataScientific Technology Inc.，Japan制造和销售)进行的，停留时间为1分钟或以下。
(2)反应混合物的浓缩
30ml或以下反应混合物的浓缩是在减压下利用旋转蒸发器进行的，它带有用于操作旋转蒸发器的循环搅拌器(由Tokyo RikakikaiCo.，Ltd.，Japan制造和销售)。
(3)微生物的分离
甘氨腈的水解反应之后的微生物分离是利用冷冻离心机(由Hitachi Ltd.，Japan制造和销售)通过在10,000rpm下离心反应混合物达15分钟进行的。
(4)蛋白质的除去
在实施例1至11中，利用注射器用超滤滤器(由Terumo Corp.，Japan制造和销售)在压力下过滤除去蛋白质。在实施例12中，利用循环超滤设备(超滤膜：“SIP-1013”，由Asahi Kasei Kabushiki Kaisha，Japan制造和销售)除去蛋白质。
(5)液相色谱
甘氨酸、甘氨腈、乙醇腈、亚氨基二乙腈、亚氨基二乙酸、六亚甲基四胺、氨、硫酸离子、钠离子等是通过离子对色谱加以分析的。作为分析仪器，利用液相色谱设备(LC-6A型，RI和UV检测器，各自由Shimadzu Corporation，Japan制造和销售)和柱子(ODS柱，由Tosoh Corp.，Japan制造和销售)。在离子对色谱中，使用戊磺酸钠作为离子对试剂。
(6)凝胶渗透色谱
通过凝胶渗透色谱(GPC)分析分子量为55的乙醇腈和分子量为4,000或以下的有机杂质化合物。作为凝胶渗透色谱设备，可以利用LC-9A型(由Shimadzu Corporation，Japan制造和销售)和GPC-IR型，RI和UV检测器(各自由Nicolet Instrument Corporation，U.S.A.制造和销售)。作为柱子，可以利用“Asahipak GS-220 NQ柱”(Showdex柱，由Showa Denko K.K.，Japan制造和销售)。
(7)变色化合物的分析
利用紫外-可见分光光度计(U-3120型，由Hitachi，Ltd.，Japan制造和销售)，测量水解反应系统在200nm与800nm之间的紫外-可见吸收光谱。通过测定最大吸收处的波长和峰的高度，分析含在水解反应系统中的变色化合物。
(8)NMR
通过在重水中测量各自的1H-NMR光谱和13C-NMR光谱，分析有机杂质化合物。1H-NMR分析是利用“J NM-α400”(由JEOL LTD.，Japan制造和销售)进行的，13C-NMR分析是利用“AC-200”(由BrukerInstruments，Germany制造和销售)进行的。NMR样品是这样制备的，在减压下干燥水解反应系统，得到干燥物，将所得干燥物溶于重水，向其中加入4，4-二甲基-4-硅烷-戊磺酸钠盐(δ＝0.015ppm)作为内标。
实施例1
(1)甘氨腈的合成
使用带有搅拌器和夹套的8-升高压釜(其中高压釜是由AsahiKasei Kabushiki Kaisha，Japan制造和销售的)作为反应釜。将反应釜的内部用氮气净化，向反应釜内加入1,200g 37％甲醛水溶液和与甲醛等量的氰化氢，使甲醛与氰化氢彼此反应，从而得到乙醇腈水溶液。向所得乙醇腈水溶液中加入5,000g 25％氨水溶液，反应进行2小时，从而得到含有所合成的甘氨腈的反应混合物。下面，借助薄膜蒸馏设备在减压下除去反应混合物中存在的未反应的氨和过量的水，从而得到30重量％甘氨腈水溶液。通过液相色谱分析所得甘氨腈水溶液，分析显示除了甘氨腈以外，甘氨腈溶液还含有0.8重量％的亚氨基二乙腈。进而，通过凝胶渗透色谱分析甘氨腈水溶液，分析显示在甘氨腈水溶液中含有1.2重量％至少一种分子量为95或以上的有机杂质化合物。
另外，通过13C-NMR分析甘氨腈水溶液。发现除了归因于甘氨腈和亚氨基二乙腈的峰以外，在NMR光谱中60nm至70nm附近还存在一个峰。当测定甘氨腈水溶液的吸光度时，发现在344nm和468nm观察到最大吸收，在344nm和468nm的吸光度以利用10mm石英池测量的值计，分别为0.297和0.08。
(2)微生物的培养
在具有下列组成的培养基中，将不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226(FERM BP-2451)在30℃下培养1天。
培养基
(培养基是这样制备的，将下述组分溶于蒸馏水，pH值为7.5)富马酸 1.0重量％肉浸膏 1.0蛋白胨 1.0氯化钠 0.1ε-己内酰胺 0.3磷酸钾(I) 0.2硫酸镁七水合物 0.02氯化铵 0.1硫酸铁(II)七水合物 0.003氯化锰四水合物 0.002氯化钴六水合物 0.002
(3)甘氨腈的水解
通过离心从培养肉汤收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有18.0重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。将200ml玻璃高压釜内部用氮气净化，在氮气氛下向其中加入53.3g上步(1)中合成的30重量％甘氨腈水溶液和46.7g蒸馏水。随后，向高压釜内加入1.0g微生物悬液，在40℃下引发反应。此时，高压釜内反应系统的pH值大约为7。反应开始后，反应系统的pH值开始增加。反应开始后两小时，pH值变为10。使反应进行10小时，从而得到100g的反应混合物。取出2g反应混合物。关于所取出的反应混合物，通过液相色谱测定作为原料的甘氨腈和所生产的甘氨酸的量，通过奈斯勒氏法(Nessler’smethod)测定氨的量。液相色谱的结果显示用作原料的甘氨腈已经完全从反应系统中消失，甘氨酸的收率为99％。氨是化学计量地产生的。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为117g/g，甘氨酸生产的活性为12g/g·Hr。
将其余98g反应混合物离心，同时冷却，从而分离微生物和回收上清液。借助超滤膜在压力下过滤所回收的上清液，从而从上清液中除去残留的微生物细胞和蛋白质，得到滤液。取出2ml滤液，进行紫外-可见吸收光谱的测量，发现在468nm的吸光度为0.79。借助薄膜蒸馏设备蒸馏其余滤液，从而通过蒸发从滤液中分离氨和过量的水。其结果是，当将冷凝物和冰与在干冰-乙醇捕集器内回收的液体合并在一起时，得到48g氨水溶液。从蒸馏设备底部回收43g浓甘氨酸溶液。将浓甘氨酸溶液冷却至室温，从而通过晶体-沉积分离甘氨酸。干燥通过仅进行一次晶体-沉积操作所得到的晶体，从而得到16.5g甘氨酸晶体。所得甘氨酸的纯度为99.99％。
对比例1
以下列方式分析有机杂质化合物的影响，它们是含在甘氨腈水溶液中的副产物。在氮气流下，将按与实施例1相同方式得到的30重量％甘氨腈水溶液在90℃下加热。利用干冰-乙醇捕集器截留通过加热产生并被氮气驱使的蒸汽。在加热开始后15分钟、30分钟和1小时的时间点取10ml被加热的甘氨腈溶液作为样本，之后每30分钟进一步进行取样，直至加热开始后5小时。将溶液样本(总计11份样本)在冷却下贮存。
将一部分溶液样本各自通过液相色谱、凝胶渗透色谱、紫外-可见吸收光谱和13C-NMR加以单独分析。加热30分钟或更长时间的甘氨腈溶液具有氨味。尽管甘氨腈溶液是随着时间的推移而浓缩的，不过被加热的甘氨腈溶液的甘氨腈浓度在30至35重量％的范围内。从这些结果发现，含在甘氨腈溶液中的甘氨腈已被加热变性。进而，分子量为95或以上的有机杂质化合物的量随着加热时间的推移而增加。有机杂质化合物包括亚氨基二乙腈，进一步包括至少一种在13C-NMR光谱中50ppm与90ppm之间表现一个峰的化合物和至少一种在紫外-可见吸收光谱中380nm和468nm表现最大吸收的化合物。
关于每种上面所得11份加热的甘氨腈水溶液样本和一份不加热的甘氨腈水溶液样本(也就是总计12份样本)，评价微生物从甘氨腈水溶液生产甘氨酸的水解活性，关于所表现的水解活性，在这12份样本中进行对比。程序如下。利用氮盒，将各为5.0ml的甘氨腈溶液样本单独装入试管内，向其中加入5.0ml蒸馏水。下面，使用不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226，按与实施例1相同的方式制备微生物悬液，含有12.5重量％的微生物，以微生物的干重计。向每支试管内加入0.5ml所制备的微生物悬液，将试管用Parafilm热密封。将热密封的试管放置在置于氮盒中的恒温摇动器内，在30℃下进行水解反应达8小时，从而在每支试管内得到反应混合物。取出2g反应混合物，通过液相色谱分析。结果如表1所示。如表1所示，发现甘氨酸的收率取决于有机杂质化合物的浓度，若有机杂质化合物的浓度超过10重量％，则甘氨酸的收率显著降低(见样本11和12的结果)。反应混合物中除甘氨酸以外的几乎所有物质都是未反应的甘氨腈，从受到作用的甘氨腈，从这个事实得出结论，有机杂质化合物显著抑制微生物酶的活性。另一方面，若有机杂质化合物的浓度为5重量％或以下，则甘氨酸的收率为90％或以上，若有机杂质化合物的浓度为1重量％或以下，则甘氨酸的收率与在不加热的甘氨腈溶液的情况下所得收率相同。
表1
| 样本No. | 加热时间(Hr) | 有机杂质化合物的浓度(重量％) | 甘氨酸的收率 |
| 1 | 0.0 | 0.5％ | 98％ |
| 2 | 0.25 | 1.0％ | 98％ |
| 3 | 0.5 | 1.5％ | 96％ |
| 4 | 1.0 | 2.0％ | 96％ |
| 5 | 1.5 | 3.0％ | 90％ |
| 6 | 2.0 | 5.0％ | 91％ |
| 7 | 2.5 | 6.5％ | 84％ |
| 8 | 3.0 | 7.0％ | 80％ |
| 9 | 3.5 | 9.0％ | 79％ |
| 10 | 4.0 | 10.0％ | 70％ |
| 11 | 4.5 | 13.0％ | 13％ |
| 12 | 5.0 | 18.0％ | 4％ |
实施例2
(1)甘氨腈的合成
按与实施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培养
按与实施例1相同的方式培养不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226。
(3)甘氨腈的水解
通过离心从培养肉汤收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有5.0重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。将用作反应釜的耐压Schlenk’s管内部用氮气净化，在氮气氛下向其中加入1.0ml微生物悬液和16ml蒸馏水，然后加入3ml甘氨腈水溶液。然后，将耐压Schlenk’s管热密封，在20℃下引发反应。此时，耐压Schlenk’s管内反应系统的pH值大约为7。反应开始后两小时，pH值变为10.1。取出一部分反应系统，通过液相色谱分析。液相色谱的结果显示用作原料的甘氨腈已经从反应系统中消失，化学计量地生成甘氨酸。基于上述结果，在反应期间每2小时重复这样一种操作，包括升高反应温度5℃和同时向反应釜内加入3ml 30重量％甘氨腈水溶液(酶底物)，直至该操作进行4次。反应总计进行10小时，从而得到32ml反应混合物。取出2ml反应混合物，按与实施例1相同的方式进行分析。结果发现用作原料的甘氨腈已经完全从反应系统中消失，甘氨酸的收率为100％。氨是化学计量地产生的。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为120g/g，甘氨酸生产的活性为12g/g·Hr。
将其余30ml反应混合物离心，同时冷却，得到上清液，对所得上清液进行超滤，从而得到滤液。利用旋转蒸发器浓缩所得滤液，从而得到浓甘氨酸溶液。冷却浓甘氨酸溶液，从而通过晶体-沉积分离甘氨酸。过滤回收晶体，然后干燥，从而得到4.6g甘氨酸晶体。所得甘氨酸的纯度为99.99％。
实施例3
(1)甘氨腈的合成
按与实施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培养
按与实施例1相同的方式培养不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226。
(3)甘氨腈的水解
通过离心从培养肉汤收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。将200ml玻璃高压釜内部用氮气净化，在氮气氛下向其中加入53.3g上步(1)中合成的30重量％甘氨腈水溶液和41.7g蒸馏水。随后，向高压釜内加入5g微生物悬液，在50℃下引发反应。此时，高压釜内反应系统的pH值大约为7。反应开始后，反应系统的pH值开始增加。反应开始后一小时，pH值变为10。使反应进行8小时，从而得到100g的反应混合物。取出2g反应混合物，按与实施例1相同的方式加以分析。结果发现用作原料的甘氨腈已经完全从反应系统中消失，甘氨酸的收率为99％。氨是化学计量地产生的。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为168g/g，甘氨酸生产的活性为21g/g·Hr。
按与实施例1相同的方式对反应混合物进行离心、超滤和薄膜蒸馏，从而得到48g氨水和43g浓甘氨酸溶液。将含在浓甘氨酸溶液中的甘氨酸结晶和干燥，从而得到17g甘氨酸晶体。所得甘氨酸的纯度为99.99％。
实施例4
将实施例3中通过离心回收的微生物细胞用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到5g微生物悬液。利用所得微生物悬液，按基本上与实施例3相同的方式生产甘氨酸。具体来说，将200ml玻璃高压釜内部用氮气净化，在氮气氛下向其中加入50.0g按实施例1步骤(1)合成的30重量％甘氨腈水溶液和45.0g蒸馏水。随后，向高压釜内加入5g微生物悬液，在50℃下引发反应。使反应进行8小时，从而得到100g的反应混合物。取出2g反应混合物，按与实施例1相同的方式加以分析。结果发现用作原料的甘氨腈已经完全从反应系统中消失，甘氨酸的收率为99％。氨是化学计量地产生的。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为157g/g，甘氨酸生产的活性为27g/g·Hr。实施例3和4中每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量之和为335g/g，甘氨酸生产的总体活性为20g/g·Hr。
按与实施例1相同的方式对其余反应混合物进行离心、超滤和薄膜蒸馏，从而得到48g氨水和42g浓甘氨酸溶液。将含在浓甘氨酸溶液中的甘氨酸结晶和干燥，从而得到16g甘氨酸晶体。所得甘氨酸的纯度为99.99％。
实施例5
将实施例4中通过离心回收的微生物细胞用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到5g微生物悬液。利用所得微生物悬液，按基本上与实施例3相同的方式生产甘氨酸。具体来说，将200ml玻璃高压釜内部用氮气净化，在氮气氛下向其中加入43.3g按实施例1步骤(1)合成的30重量％甘氨腈水溶液和51.7g蒸馏水。随后，向高压釜内加入5g微生物悬液，在50℃下引发反应。使反应进行8小时，从而得到100g的反应混合物。取出2g反应混合物，按与实施例1相同的方式加以分析。结果发现用作原料的甘氨腈已经完全从反应系统中消失，甘氨酸的收率为99％。氨是化学计量地产生的。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为136g/g，甘氨酸生产的活性为17g/g·Hr。实施例3、4和5中每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量之和为461g/g，甘氨酸生产的总体活性为26g/g·Hr。
实施例6
(1)甘氨腈的合成
按与实施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培养
在具有下列组成的培养基中，将海洋红球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9(FERM BP-5219)在30℃下培养1天。
培养基
(培养基是这样制备的，将下述组分溶于蒸馏水，pH值为7.5)甘油 1.0重量％肉浸膏 1.0蛋白胨 1.0氯化钠 0.1ε-己内酰胺 0.3磷酸钾(I) 0.2硫酸镁七水合物 0.02氯化铵 0.1硫酸铁(II)七水合物 0.003氯化锰四水合物 0.002氯化钴六水合物 0.002
(3)甘氨腈的水解
通过离心从培养肉汤中收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有6.0重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。利用1.0ml所得微生物悬液，按基本上与实施例2相同的方式生产甘氨酸。具体来说，使甘氨腈的水解反应进行10小时，从而得到32g的反应混合物。取出2g反应混合物，按与实施例1相同的方式加以分析。结果发现用作原料的甘氨腈已经完全从反应系统中消失，甘氨酸的收率为100％。氨是化学计量地产生的。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为100g/g，甘氨酸生产的活性为10.0g/g·Hr。
按与实施例1相同的方式处理其余反应混合物，从而得到4.6g甘氨酸晶体。
实施例7
(1)甘氨腈的合成
按与实施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培养
按与实施例6相同的方式培养Corynebacterium nitrilophilus(ATCC 21419)。
(3)甘氨腈的水解
通过离心从培养肉汤中收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有8.0重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。利用1.0ml所得微生物悬液，按基本上与实施例2相同的方式生产甘氨酸。具体来说，使甘氨腈的水解反应进行10小时，从而得到32g的反应混合物。取出2g反应混合物，按与实施例1相同的方式加以分析。结果发现用作原料的甘氨腈已经完全从反应系统中消失，甘氨酸的收率为99％。氨是化学计量地产生的。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为75g/g，甘氨酸生产的活性为8g/g·Hr。
按与实施例1相同的方式处理其余反应混合物，从而得到4.6g甘氨酸晶体。
实施例8
(1)甘氨腈的合成
按与实施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培养
按与实施例6相同的方式培养棒杆菌(Corynebacterium sp.)C5。
(3)甘氨腈的水解
通过离心从培养肉汤中收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。提供这样一种反应釜，由带有搅拌器的1000ml可分离三颈烧瓶、用于保持恒温的夹套、延伸至可分离烧瓶底部的氮气引入喷嘴、与干冰捕集器连接的湿气分离器、温度计和用于对反应混合物取样的管子组成。向可分离烧瓶内装入9ml微生物悬液，然后向其中加入30ml 30重量％甘氨腈水溶液和161ml蒸馏水。在30℃下引发反应，在进行反应的同时利用气流计以3升/小时的速率向可分离烧瓶内输送氮气。反应开始后1小时，向可分离烧瓶内进一步加入30ml 30重量％甘氨腈水溶液。每隔1小时再进行甘氨腈水溶液的加入达3次，反应总计进行5小时，从而得到反应混合物和副产物。在干冰捕集器内回收副产物，合并在干冰捕集器内所回收的冰和液体后，得到15g副产物。将所得副产物溶于50ml水，关于所得溶液，通过奈斯勒氏法测定氨的量。发现在干冰捕集器内已经回流了14g氨。得到305g的反应混合物。取出2g反应混合物，按与实施例1相同的方式加以分析。结果发现用作原料的甘氨腈已经从反应系统中消失，甘氨酸的收率为99％。进而，痕量氨残留在反应混合物中。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为53g/g，甘氨酸生产的活性为11g/g·Hr。
按与实施例1相同的方式处理其余303g反应混合物，从而得到47g甘氨酸晶体。
实施例9
(1)甘氨腈的合成
按与实施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培养
按与实施例6相同的方式培养粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111(FERM BP-4750)。
(3)甘氨腈的水解
通过离心从培养肉汤中收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。提供这样一种反应釜，由带有搅拌器的1000ml可分离三颈烧瓶、用于保持恒温的夹套、延伸至可分离烧瓶底部的氮气引入喷嘴、通过干冰捕集器与真空泵连接的单柱蒸馏塔、压力传感器、温度计和用于对反应混合物取样的管子组成，其中该管子与液体转移泵连接。向可分离烧瓶内装入11ml微生物悬液，然后向其中加入30ml 30重量％甘氨腈水溶液和159ml蒸馏水。在30℃下引发反应，在进行反应的同时利用气流计以3升/小时的速率向可分离烧瓶内输送氮气。反应开始后1小时，向可分离烧瓶内进一步加入30ml 30重量％甘氨腈水溶液。每隔1小时再进行甘氨腈水溶液的加入达3次，反应总计进行5小时，从而得到反应混合物和副产物。在干冰捕集器内回收副产物，合并在干冰捕集器内所回收的冰和液体后，得到25g副产物。将所得副产物溶于50ml水，关于所得溶液，通过奈斯勒氏法测定氨的量。发现在干冰捕集器内已经回收了15g氨。得到295g的反应混合物。取出2g反应混合物，按与实施例1相同的方式加以分析。结果发现用作原料的甘氨腈已经从反应系统中消失，甘氨酸的收率为99％。进而，痕量氨残留在反应混合物中。每克(干重)微生物生产的甘氨酸的量为42g/g，甘氨酸生产的活性为9g/g·Hr。
按与实施例1相同的方式处理其余293g反应混合物，从而得到48g甘氨酸晶体。
实施例10
(1)甘氨腈的合成
按与实施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培养
按与实施例6相同的方式单独培养下述微生物。
微生物
不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK227(FERM BR-7413)
分枝杆菌(Mycobacterium sp.)AC777(FERM BR-2352)
球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)(ATCC 11167)
热带假丝酵母(Candida tropicalis)(ATCC 20311)
假单胞菌(Pseudomonas sp.)88-SB-CN5
支顶孢(Acremonium sp.)D9K
克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)D5B
(3)甘氨腈的水解
关于每种所培养的微生物，下列程序都是单独进行的。通过离心从培养肉汤收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。利用所得微生物悬液，按下列方式生产甘氨酸。将200ml玻璃高压釜内部用氮气净化，在氮气氛下向其中加入53.3g上步(1)中合成的30重量％甘氨腈水溶液和42.7g蒸馏水。随后，向高压釜内加入4.0g微生物悬液，在40℃下引发反应。使反应进行8小时，从而得到100g的反应混合物。取出2g反应混合物。关于所取出的反应混合物，通过液相色谱法测定作为原料的甘氨腈的量和所生产的甘氨酸的量，通过奈斯勒氏法测定氨的量。结果如表2所示。如表2所示，在任意所采用的微生物的情况下，用作原料的甘氨腈都已经完全从反应系统中消失，生产甘氨酸的收率高。进而，氨是化学计量地产生的。
表2
| 所用微生物菌株 | 甘氨腈的转化(％) | 甘氨酸的收率(％) |
| 不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK227 | 100 | 100 |
| 分枝杆菌(Mycobacterium sp.)AC777 | 100 | 99 |
| 球形红假单胞菌(Rhodopseudomonasspheroides) | 100 | 97 |
| 热带假丝酵母(Candida tropicalis) | 100 | 97 |
| 假单胞菌(Pseudomonas sp.)88-SB-CN5 | 100 | 100 |
| 支顶孢(Acremonium sp.)D9K | 100 | 97 |
| 克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)D5B | 100 | 97 |
实施例11
(1)甘氨腈的合成
按与实施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
测定甘氨腈水溶液在468nm下的吸光度。发现利用10mm石英池在1mol甘氨腈每升的浓度下测量的吸光度为0.08。
(2)微生物的培养
按与实施例6相同的方式单独培养下述微生物。
微生物
不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226(FERM BP-2451)
海洋红球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9(FERM BP-5219)
棒杆菌(Corynebacterium sp.)C5(FERM BP-7414)
Corynebacterium nitrilophilus(ATCC21419)
产碱菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111(ATCC 8750)
(3)甘氨腈的水解
关于每种所培养的微生物，下列程序都是单独进行的。通过离心从培养肉汤收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物悬液，以微生物的干重计。利用所得微生物悬液和表3所示还原性化合物，按下列方式生产甘氨酸。将200ml玻璃高压釜内部用氮气净化，在氮气氛下向其中加入53.3g上步(1)中合成的30重量％甘氨腈水溶液和42.7g蒸馏水，然后加入表3所示还原性化合物。然后，向高压釜内加入表3所示量(重量)的微生物悬液。若所用微生物悬液的量小于5g，则还向高压釜内加入蒸馏水，以便微生物悬液和蒸馏水的总重量达到5g。在30℃下引发反应，进行10小时。关于每种所用的微生物，还进行不使用还原性化合物的实验，供对比。进而，关于不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226，为了进行在利用开放反应系统所得效果与利用密闭反应系统所得效果之间的对比，还利用开放反应系统而不使用还原性化合物进行了实验。每次实验得到100g反应混合物，取出2g反应混合物。关于所取出的反应混合物，通过奈斯勒氏法测定氨的量，通过液相色谱法测定作为原料的甘氨腈的量和所生产的甘氨酸的量。
按与实施例1相同的方式对其余反应混合物进行冷冻离心和超滤，从而得到甘氨酸溶液。取出一部分所得甘氨酸溶液，在468nm下进行吸光度测量。通过进行薄膜蒸馏、晶体-沉积(一次)和干燥，从剩余甘氨酸溶液中回收甘氨酸晶体。测定所回收的甘氨酸的纯度。结果如表3所示。
加入还原性化合物大大抑制甘氨酸的变色。进而，甘氨酸的收率大大提高了，甘氨酸晶体的纯度为99.99％。另一方面，若反应是在开放反应系统中进行的，则得到变为褐色的反应混合物，甘氨酸的收率也降低了。在变为褐色的反应混合物的情况下，反应混合物的超滤是困难的，所得甘氨酸晶体变色，其纯度降低至99％。
表3
| 微生物 | 微生物悬液(g) | 还原性化合物 | 加入量(mg) | 反应前的吸收 | 反应后的吸收* | 甘氨酸的收率(％) | 甘氨酸的纯度(％) |
| 不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226 | 2.4 | 开放反应系统中的反应 | 0 | 0.08 | 3.40 | 90 | 99.00 |
| 无 | 0 | 0.08 | 0.79 | 97 | 99.99 | ||
| L-抗坏血酸 | 101 | 0.08 | 0.10 | 100 | 99.99 | ||
| 亚硫酸二铵一水合物 | 43 | 0.08 | 0.10 | 100 | 99.99 | ||
| 海洋红球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9 | 3.0 | 无 | 0 | 0.08 | 0.79 | 97 | 99.99 |
| 甲酸 | 53 | 0.08 | 0.12 | 100 | 99.99 | ||
| 亚硫酸钠 | 36 | 0.08 | 0.19 | 99 | 99.99 | ||
| Corynebacteriumnitrilophilus | 4.0 | 无 | 0 | 0.08 | 0.79 | 96 | 99.99 |
| L-半胱氨酸 | 70 | 0.08 | 0.11 | 100 | 99.99 | ||
| 甲酸甲酯 | 69 | 0.08 | 0.33 | 100 | 99.99 | ||
| 棒杆菌(Corynebacteriumsp.)C5 | 5.0 | 无 | 0 | 0.08 | 0.79 | 96 | 99.99 |
| 谷胱甘肽 | 175 | 0.08 | 0.11 | 100 | 99.99 | ||
| 甲酸铵 | 72 | 0.08 | 0.14 | 100 | 99.99 | ||
| 亚硫酸钾 | 37 | 0.08 | 0.33 | 99 | 99.99 | ||
| 粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis) | 6.25 | 无 | 0 | 0.08 | 0.79 | 95 | 99.99 |
| 盐酸L-半胱氨酸一水合物 | 100 | 0.08 | 0.11 | 100 | 99.99 | ||
| 甲酸乙酯 | 85 | 0.08 | 0.19 | 100 | 99.99 |
*：在468nm下的吸光度(利用10mm石英池在1mol甘氨酸每升的浓度下测量的值)
实施例12
下面参照图1所示生产系统详细解释甘氨酸的连续生产。
(1)甘氨腈的合成
1-升不锈钢高压釜6、7和8独立带有搅拌器、水位传感器、压力计、安全阀和温度指示计，它们和闪速蒸馏设备9是彼此串联的。按下列方式合成甘氨腈。在进行反应之前，将高压釜6、7和8和连接高压釜彼此的导管内部用氮气净化。提供三个隔膜泵，这些隔膜泵分别用于向高压釜6连续输送37重量％甲醛水溶液1(含有小于10重量％的甲醇)，进料速率为100g/hr(甲醛水溶液1预先已被处理过，用氮置换溶解其中的氧)；液态氰化氢2，进料速率为33.3g/hr；和含有100ppm4％氢氧化钠的蒸馏水3，进料速率为240g/hr。将反应温度设置在40℃，引发用于生产乙醇腈的反应。反应开始后立即观察到产热，但是之后反应在所设置的反应温度下进行。利用水位控制器调节停留时间为1小时，利用泵将含有乙醇腈的反应混合物从高压釜7输送到高压釜8内，同时在0.2MPa压力下向高压釜7连续输送氨气4，通过质流控制器控制进料速率为82标准升/hr。将高压釜7的反应温度设置在55℃，引发用于生产甘氨腈的反应。在反应开始时观察到由氨的吸收引起的产热，但是之后反应在所设置的反应温度和压力下进行。利用水平控制器调节停留时间为1小时，利用泵将反应混合物从高压釜7输送到高压釜8内。将高压釜8的温度设置在55℃。经过1小时的停留时间后，利用泵从高压釜8中连续抽取含有甘氨腈的反应混合物。收集从反应开始的前6个小时期间所得初始反应混合物作为废液，将反应开始6小时后所得反应混合物和以后所得反应混合物输送到设置在大气压下的闪速蒸馏设备9内。将闪速蒸馏设备9的柱顶温度设置在-20℃，在闪速蒸馏设备9的柱顶冷却反应混合物。通过用冰冷却反应混合物，除去含在反应混合物中的水分，通过干冰-乙醇捕集器回收湿氨气，从而得到液态氨10。将所回收的液态氨10用作原料，输送到高压釜7内。从闪速蒸馏设备的柱底回收含有少量氨的甘氨腈水溶液，将所回收的甘氨腈溶液贮存在5℃的中间罐11内。关于贮存，向中间罐11内的甘氨腈溶液中加入100ppm10重量％硫酸作为稳定剂。得到33重量％甘氨腈溶液。所得甘氨腈溶液含有0.9重量％亚氨基二乙腈和1.3重量％至少一种分子量为95或以上的有机杂质化合物。
(2)微生物的培养
按与实施例1相同的方式培养不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226(FERM BP-2451)。通过离心从培养肉汤中收集所培养的微生物细胞，用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物悬液5，以微生物的干重计。
(3)水解反应和微生物的分离
使用10-升高压釜作为水解反应釜12，它带有搅拌器、温度计和pH传感器。在氮气流下向水解反应釜12内装入5,400g贮存在中间罐11内的甘氨腈水溶液，然后，向其中加入60g上步(2)中制备的微生物悬液5。在设置为50℃的反应温度下引发甘氨腈的水解反应。进行8小时反应后，将所得反应混合物转移到连续离心机3内(TA1-02型，由Westfalia Separator Inc.，U.S.A.制造和销售)，在那里通过离心过滤从反应混合物中分离微生物。将五分之一所分离的微生物(微生物浆液)弃去(所要弃去的微生物14)，其余微生物用蒸馏水洗涤三次。然后，向洗涤后的微生物加入蒸馏水，以便得到48g所回收的微生物悬液。将12g按与上步(2)相同的方式制备的微生物悬液与所回收的微生物悬液混合，从而得到60g微生物悬液。将所得60g微生物悬液装入水解反应釜12，在那里按与上述相同方式进行甘氨腈的水解。如此这般重复反应操作，包括上述用于分离和再循环微生物的操作。将通过离心过滤所得滤液(也就是含有甘氨酸的反应混合物)转移到循环型超滤设备15内(利用超滤膜：“SIP-1013”，由Asahi KaseiKabushiki Kaisha，Japan制造和销售)，在那里浓缩，同时循环。将所得浓反应混合物转移到中间罐16内，贮存在那里。当循环液体的体积减少到500ml时，向其中加入500ml蒸馏水，以便混合物的总体积变为1000ml，再次浓缩混合物，直至循环液体的体积变为500ml。这种包含在超滤设备内稀释液体、然后浓缩稀释后的液体的循环进行2次，然后弃去500ml剩余在超滤设备15内的循环液体。
重复上述用于生产甘氨酸的步骤(3)，得到如下所示结果，其中步骤(3)的一个循环花费12小时。
浓反应混合物含有83重量％甘氨酸的铵盐和0.9重量％至少一种分子量为95或以上的有机杂质化合物。
(4)甘氨酸晶体的回收
上步(1)中的反应开始18小时后，在中间罐16内得到大约6kg浓反应混合物。然后，使用中间罐16内的浓反应混合物引发甘氨酸的连续晶体-沉积。程序如下所述。使浓反应混合物流经活性炭柱17，从而得到已被活性炭处理的浓缩液。将所得经过活性炭处理的浓缩液输送到连续晶体-沉积设备18内，流速为425g/hr，用于进行晶体-沉积操作。连续晶体-沉积设备18带有搅拌器、水位传感器、温度计和真空蒸馏柱。通过真空蒸发从中除去含在浓缩液中的过量水和液态氨，速率分别为大约200g/hr和大约20g/hr。将蒸发后的水和液态氨分别回收为蒸馏水19和液态氨10，蒸馏水19和液态氨10都再循环用于上述步骤(1)。浆液(甘氨酸浓度：40重量％)蓄积在晶体-沉积容器内。通过抽吸从晶体-沉积容器底部间歇地抽取一部分蓄积在晶体-沉积容器内的浆液，以便晶体-沉积容器内浆液的表面保持在预定的容器内上下水平之间。对所抽取的浆液进行过滤，同时加热，得到滤液。排放所得滤液(排放液20)，直至其重量减少4％从而得到滤液21，将滤液21再循环至晶体-沉积容器。从晶体-沉积操作开始3小时后，晶体-沉积操作达到稳态，甘氨酸晶体沉积在晶体-沉积容器内。从晶体-沉积设备18中取出所沉积的甘氨酸晶体，干燥，从而得到甘氨酸晶体22。测定甘氨酸晶体22的纯度为99.99％。在这种生产系统中，生产甘氨酸的平均速率为82g/hr(54g/g微生物)，甘氨酸的总收率为90％(其中总收率(％)是减去所有步骤中所有损失(％)的计算值)。
工业实用性
利用本发明的方法，能够生产高纯度的可用作食品添加剂和合成药物、农药与洗涤剂的原料的甘氨酸，同时实现如下优点：每单位重量微生物的甘氨酸生产活性和每单位时间的甘氨酸生产活性都变高了，能够化学计量地生产甘氨酸和氨而不会分解或消耗，并且能够单独和容易回收。进而，能够按商业规模生产甘氨酸，不会对环境造成严重的负担。
Claims (33)
1、用于生产甘氨酸的方法，包括：
提供水溶液形式的甘氨腈，
在具有水解腈基活性的微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反应系统中进行水解反应，从而转化所述甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，
所述水解反应系统含有至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物具有95或以上的分子量，并且含有至少一个选自腈基、羧基、酰胺基、氨基、羟基和亚丙基胺结构的成员，其中所述亚丙基胺结构具有由下式(1)代表的骨架：
其中n代表整数1或以上，
所述水解反应是在这样的条件下进行的，其中在所述水解反应期间，抑制所述微生物酶的所述有机杂质化合物在所述水解反应系统中的含量保持在10重量％或以下的水平，基于所述水解反应系统的重量而言，和
从水解反应系统中分离甘氨酸。
2、根据权利要求1的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物是在至少一种反应中作为副产物而生成的，该反应选自从氰化氢、甲醛和氨合成甘氨腈和甘氨腈水解为甘氨酸和氨。
3、根据权利要求1或2的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物包含由下式(2)代表的化合物：
NH3-n(CH2Y1)n (2)
其中每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；n代表整数2或3。
4、根据权利要求1或2的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物包含至少一种选自下列化合物(a)和(b)的化合物：
(a)由下式(3)代表的化合物：
其中：Y1代表腈基、羧基或酰胺基；每个Y2独立地代表氨基或羟基；n代表整数0或以上；该z1或每个z1独立地是由下式(4)或(5)代表的： 或其中每个Y2独立地代表氨基或羟基，和(b)由下式(6)或(7)代表的化合物： 或
其中每个Y2独立地代表氨基或羟基；
每个Z2独立地是由下式(8)或(9)代表的： 或
Z1 n-H (9)
其中：
Y2代表氨基或羟基；
该Z1或每个Z1是如式(3)所定义的；
n代表整数0或以上。
5、根据权利要求1或2的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物包含至少一种选自下列化合物(c)和(d)的化合物：
(c)由下式(10)或(11)代表的化合物：
或
其中每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基，和
(d)由下式(12)代表的化合物：
(HCN)n (12)
其中n代表整数4或以上。
6、根据权利要求1或2的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物包含在其分子中具有至少一个选自下列骨架(e)和(f)的骨架的化合物：
(e)由下式(13)代表的骨架：
其中每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
n代表整数2或以上，和
(f)由下式(14)或(15)代表的骨架：
或
其中：
该Y1或每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数1或以上。
7、根据权利要求1或2的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物包含在其分子中具有至少一个选自下列骨架(g)和(h)的骨架的化合物：
(g)由下式(16)代表的骨架：
其中：
每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数2或以上，和
(h)由下式(17)或(18)代表的骨架：
或
其中：
该Y1或每个Y1独立地代表腈基、羧基或酰胺基；
每个Y2独立地代表氨基或羟基；
n代表整数1或以上。
8、根据权利要求1或2的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物包含六亚甲基四胺。
9、根据权利要求1至8之任一项的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物在重水中测量的13C-NMR光谱中53ppm与100ppm之间表现出峰。
10、根据权利要求1至9之任一项的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物在关于所述水解反应系统测量的紫外-可见吸收光谱中340nm与380nm之间和440nm与480nm之间表现最大吸收。
11、根据权利要求1至10之任一项的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物的分子量为130或以上。
12、根据权利要求1至11之任一项的方法，其中所述至少一种抑制所述微生物酶的有机杂质化合物的量为1重量％或以下，基于所述水解反应系统的重量而言。
13、根据权利要求1至12之任一项的方法，其中所述水解反应系统中溶解有5重量ppm或以下的氧，基于所述水解反应系统的重量而言。
14、根据权利要求1至13之任一项的方法，其中所述水解作用是利用密闭反应系统、用惰性气体加压的反应系统、流通惰性气体的反应系统或在低于大气压的压力之下的反应系统进行的，以便抑制溶解在所述水解反应系统中的氧量。
15、根据权利要求1至14之任一项的方法，其中所述水解作用是在其中溶解有氨的所述水解反应系统中进行的。
16、根据权利要求1至15之任一项的方法，其中所述水解作用是在含有2重量％或以下电解质的所述水解反应系统中进行的，基于甘氨腈的重量而言。
17、根据权利要求1至16之任一项的方法，其中所述具有水解腈基活性的微生物酶是从属于以下属的微生物衍生的，所述属选自不动杆菌属、红球菌属、棒杆菌属、产碱菌属、分枝杆菌属、红假单胞菌属和假丝酵母属。
18、根据权利要求17的方法，其中所述不动杆菌属的微生物菌株是不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK226，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-2451，或不动杆菌(Acinetobacter sp.)AK227，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-7413。
19、根据权利要求17的方法，其中所述红球菌属的微生物菌株是海洋红球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-5219。
20、根据权利要求17的方法，其中所述棒杆菌属的微生物菌株是棒杆菌(Corynebacterium sp.)C5，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-7414，或Corynebacteriumnitrilophilus，保藏在美国典型培养物保藏中心中，保藏号为ATCC21419。
21、根据权利要求17的方法，其中所述产碱菌属的微生物菌株是粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-4750。
22、根据权利要求17的方法，其中所述分枝杆菌属的微生物菌株是分枝杆菌(Mycobacterium sp.)AC777，保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号为FERM BP-2352。
23、根据权利要求17的方法，其中所述红假单胞菌属的微生物菌株是球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)，保藏在美国典型培养物保藏中心中，保藏号为ATCC 11167。
24、根据权利要求17的方法，其中所述假丝酵母属的微生物菌株是热带假丝酵母(Candida tropicalis)，保藏在美国典型培养物保藏中心中，保藏号为ATCC 20311。
25、根据权利要求1至24之任一项的方法，其中在进行从所述水解反应系统中分离甘氨酸的同时，独立于甘氨酸回收地回收伴随产生的氨。
26、根据权利要求25的方法，其中甘氨酸和氨是通过至少一个操作而单独回收的，所述操作选自蒸馏、反应性蒸馏、被惰性气体夹带、离子交换、提取、利用不良溶剂再沉淀和通过浓缩或冷却的晶体-沉积。
27、根据权利要求26的方法，其中氨是通过蒸馏、反应性蒸馏或被惰性气体夹带而回收的，甘氨酸是通过使氨回收之后剩余的液体进行通过浓缩或冷却的晶体-沉积而回收的。
28、根据权利要求1至27之任一项的方法，该方法包括：
(1)在密闭的反应系统内，在碱催化剂的存在下，使氰化氢与甲醛在水性介质中反应，得到水溶液形式的乙醇腈，
(2)向乙醇腈的水溶液中加入氨，进行乙醇腈与氨之间的反应，从而得到水溶液形式的甘氨腈，同时生成水，
(3)通过蒸馏从所得甘氨腈的水溶液中分离大部分氨和一部分水，从而得到水解反应系统，该水解反应系统含有水溶液形式的甘氨腈和剩余未分离的氨，其中回收所分离的氨，用于再循环至步骤(2)，
(4)在由加入到处于密闭系统内的所述水解反应系统中的微生物产生的微生物酶的作用下，使所述水解反应系统进行水解反应，从而转化所述甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，
(5)通过至少一个操作分离所述微生物和所述微生物酶，所述操作选自离心过滤和膜过滤，其中回收所述微生物和所述微生物酶，用于再循环至步骤(4)，
(6)通过至少一个操作分离一部分在步骤(1)至(5)中伴随产生的、抑制所述微生物酶的有机杂质化合物，所述操作选自膜过滤和吸附剂分离，
(7)通过蒸馏分离在步骤(4)中伴随产生的氨和在步骤(4)后剩余在所述水解反应系统中的过量的水，其中回收所分离的氨，用于再循环至步骤(2)，
(8)在步骤(7)之后或者同时，通过晶体-沉积分离所述甘氨酸，和
(9)干燥所述甘氨酸的晶体。
29、用于生产甘氨酸的方法，包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液进行水解反应，从而转化所述甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，和从水解反应系统中分离甘氨酸，其中所述甘氨腈的水解作用是在氨的存在下进行的。
30、根据权利要求29的方法，其中氨的量为0.001至5mol，相对于1摩尔甘氨腈而言。
31、用于生产甘氨酸的方法，包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液进行水解反应，从而转化所述甘氨腈为甘氨酸，同时伴随产生氨，和从水解反应系统中分离甘氨酸，其中在进行从所述水解反应系统中分离甘氨酸的同时，在碱和酸缺乏下，独立于甘氨酸回收地回收伴随产生的氨。
32、根据权利要求31的方法，其中甘氨酸和氨是通过至少一个操作而单独回收的，所述操作选自蒸馏、反应性蒸馏、被惰性气体夹带、离子交换、提取、利用不良溶剂再沉淀和通过浓缩或冷却的晶体-沉积。
33、根据权利要求32的方法，其中氨是通过蒸馏、反应性蒸馏或被惰性气体夹带而回收的，甘氨酸是通过使氨回收之后剩余的液体进行通过浓缩或冷却的晶体-沉积而回收的。
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