CN103571915A - 一种基于双酶偶联高通量检测微生物生产二元酸的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产二元酸的新方法，具体涉及利用二元酸氧化酶和过氧化物酶偶联，在相应缓冲溶液中与二元酸的反应，产生荧光底物Resorufin。双酶偶联反应在96孔黑色微孔板中进行，利用酶标仪读取Ex/Em 490/585(nm)处的荧光值。二元酸与双酶偶联反应生成产物在Ex/Em 490/585(nm)处的荧光值与其浓度成线性关系，能够根据标准曲线计算浓度，并利用酶标仪和96孔黑色微孔板进行高通量检测。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物筛选和开发利用领域，特别涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检查微生物生产二元酸的检测方法。
技术背景
从自然界筛选并在实验室诱变进化一直是发现和创新工业微生物菌种的重要途径，是工业生物技术产业的基础。代谢工程极大的促进了应用于工业的各种化合物的工程菌株的改进。特别是近数十年来，代谢工程迈向了新的阶段——系统代谢工程。系统代谢工程与具有全局理念的系统生物学、具有精细设计能力的合成生物学以及理性-随机突变的进化工程有机整合一起，使得代谢工程有了更广泛的应用，能够更加省时省力地生产天然的以及非天然的化学品、燃料和聚合物。例如，关键酶通过系统与合成生物学的方法协同改造或者构建，然后通过系统生物学的研究方法找出提高产量的瓶颈或者抑制细胞生长的未知因素来改变全局代谢网络；通过进化工程获得的菌株可以利用系统生物学的方法阐明突变进化位点，等等。尽管随着代谢工程和合成生物学的发展，各种生物基化学品生产菌的构建和合成变得相对比较容易，但是由于生物体的复杂性和人类认识的局限性，设计合成得到的工程菌经常不能完全达到高效生产的要求，仍然需要通过诱变或进化的方法实施进一步优化，弥补设计和合成的不足。要实现生物基化学品生产菌的高效诱变和进化改造、优化通常离不开高通量筛选方法。只有高通量筛选方法的建立，并结合先进的现代自动化技术和仪器设备才能大大突破人工筛选在速度、效率和标准化等方面的限制，这将是微生物菌种筛选和改造的一次技术革命。一个方便快捷的筛选检测方法不但可以简化筛选步骤，减少科研人员的工作量，而且可以大大促进代谢工程的发展。
二元酸在工业和能源方面有着重要应用，在能源日益枯竭的今天，利用生物质来产生这些工业原料以及能源有着举足轻重的意义。用微生物细胞工厂生产二元酸，原料来自可再生的生物质资源，而不必消耗石油等不可再生资源，生产过程完全采用生物过程，不使用有毒有害的化学试剂，也不产生任何环境污染物。一旦经济上可行的生物合成生产工艺被推广使用，可以促进经济的发展和解决困扰制约国家国民经济发展的生态环境问题，保持国家安全、稳定和可持续发展，创造重大的社会经济效益。
但是传统定性或定量检测二元酸的方法非常有限，以丁二酸为例，主要的检测方法有液相色谱法、气相色谱法、反相高效液相色谱法以及试剂盒检测。液相色谱法操作比较繁琐，灵敏度较低，如果检测样品较多，也会存在保留时间的偏移等问题。使用试剂盒检测丁二酸不但价格昂贵，而且对样品的纯度要求严格，会受其他物质的干扰。试剂盒检测需要依赖于NADH，但是NADH相当昂贵，且需要在340nm出测定吸光值，因此就需要紫外检测器，增加了检测的费用。因此，研究建立简便、快速、准确和应用广泛的二元酸分析方法倍受重视，不仅可以促进生物法生产二元酸的理论研究及产业化，同时对于其他生物产品，如支链醇、氨基酸的检测和工程菌株筛选等也有很好的借鉴作用。
发明内容
【本发明的目的】
本发明的目的在于提供一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产以丁二酸为代表的二元酸的新方法。通过二元酸氧化酶和过氧化物酶偶联的方法测定二元酸，高通量筛选目标微生物。与传统微生物筛选方法相比，基于双酶偶联反应的高通量筛选方法具有成本低、效率高、目的性强的优点，而使用荧光信号检测大大增加了检测的灵敏度，能够从广泛的自然界中筛选性能优良的菌株。
【本发明的思路】
利用二元酸氧化酶和过氧化物酶偶联的方法，测定二元酸含量。该方法包含两个方面内容。一方面，在氧气存在条件下，二元酸被其氧化酶氧化，生成过氧化氢，形成的过氧化氢与4-安替比林和苯酚在过氧化氢酶作用下形成一种红色物质醌亚胺。醌亚胺是一种红色物质，在500nm处有特征吸收值。另一方面，二元酸被其氧化酶作用形成的过氧化氢与AmplexUltraRed在过氧化物酶作用下形成Resorufin。Resorufin是一种荧光底物，在给定了激发光波长后，检测Ex/Em490/585(nm)处的荧光值，即可反映出待检测二元酸的量。基于双酶偶联的荧光法与化学显色法相比具有更高的灵敏度和精确度，本专利着重讲述前者。微生物代谢产生的二元酸通过96孔黑色微孔板和酶标仪，利用双酶偶联方法分析检测代谢产物，筛选高产各种二元酸的菌株，为基础和应用研究提供宝贵的菌种资源。
【本发明的技术路线】
本发明的技术路线如下：
(1)利用培养基将待筛选样品进行活化培养12-24小时；
(2)将富集培养的混合菌利用无菌水进行稀释(获得单菌落)，涂布到固体培养基，培养6-12小时；
(3)将固体培养基上长出的单菌落转接到含有液体培养基的96深孔培养板中，每个孔接种一个单菌落，用硅胶盖盖好，培养6-24小时；
(4)将96深孔培养板利用冷冻离心机进行离心，使菌体沉淀；
(5)取96深孔培养板中的上清液与延胡索酸还原酶和过氧化物酶在96孔黑色微孔板中反应，37℃保温30分钟；
(6)将反应结束的96孔黑色微孔板利用酶标仪测定Ex/Em(490/585)处荧光值，并将测定的荧光值与利用延胡索酸还原酶和过氧化物酶测定醇的标准曲线进行对比，查到丁二酸的浓度；
(7)将测定产二元酸浓度高的生产菌株进行保存。
【本发明的优点】
本发明的优点是：
(1)效率高，二元酸氧化酶和过氧化物酶偶联能够快速检测二元酸的含量。
(2)灵敏度高，利用AmplexUltraRed与H2O2反应，可以精确检测到1μM的底物。
(3)通量高，96深孔培养板和96孔黑色微孔板并结合酶标仪一起使用，使得目的菌株的筛选速度大大提高。
(4)成本低，能够以较低成本获得大量菌种。
(5)可以获得更多菌株，为基础和应用研究提供菌种资源。
具体实施
以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。
实施例1
双酶偶联的荧光法与化学显色法比较。
(1)荧光法。试剂A：AmplexUltraRed：0.1mM，过氧化物酶：9U/mL，PBS：pH 7.4。过氧化氢溶液：0.1mM。步骤：在96孔黑色微孔板上依次加入不同浓度的H2O2(PBS稀释)50uL，试剂A 50μL，总体积为100μL，测定Ex/Em490/585(nm)荧光值。建立Ex/Em 490/585(nm)荧光值与H2O2浓度的标准曲线(附图1)，R2＝0.992，说明双酶偶联的荧光法可以检测到μM级的H2O2。
(2)化学显色法。Buffer I中各物质含量为：苯酚：6mmol/mL，EDTA：75mg/L，磷酸盐缓冲液：pH＝7.5，0.1mol/L。BufferII中各物质含量为：过氧化氢酶：600U/L，4-安替比林：3.5m mol/L，磷酸盐缓冲液0.1mol/L pH＝7.5。步骤：在96孔酶标板中先后加入不同浓度的H2O2 25μL，Buffer I 100μL，Buffer II50μL。测定OD500nm处吸光值，建立OD500nm吸光值与H2O2浓度的标准曲线，R2＝0.0351(附图2)，说明浓度为uM级别的H2O2与OD500nm处的吸收值无线性关系。为检测化学显色法能够测定H2O2的最低浓度，将H2O2浓度增加10倍，重复上述实验，测定OD500nm处吸光值，建立OD500nm吸光值与H2O2浓度的标准曲线，R2＝0.991(附图3)，说明化学显色法能够较准确的测定10μM级的H2O2，也说明双酶偶联的荧光法比化学显色法灵敏10倍以上。
实施例2
利用延胡索酸还原酶和过氧化物酶偶联的方法测定丁二酸的荧光值随时间变化及测定时间的确定。试剂A：AmplexUltraRed：0.1mM，过氧化物酶：9U/mL，PBS：pH 7.4。延胡索酸还原酶粗酶液：重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-30a-frd)诱导表达后用蛋白抽提试剂处理获取粗酶液。配制丁二酸溶液1mM。步骤：在96孔黑色微孔板上依次加入PBS 20μL，1mM丁二酸(PBS稀释)10μL，50μL试剂A，延胡索酸还原酶粗酶液20μL，总体积100uL。对照组不加丁二酸。设置酶标仪温度为37℃，读取0-30min每隔5min的Ex/Em 490/585(nm)荧光值。从时间变化图(附图4)中可以看出，延胡索酸还原酶粗酶液对丁二酸有明显的氧化作用，且荧光值在25min时稳定，因此设定双酶偶联作用时间为30min后检测荧光值是可取的。
实施例3
利用延胡索酸还原酶和过氧化物酶偶联的方法测定丁二酸的标准曲线。试剂A：AmplexUltraRed：0.1mM，过氧化物酶：9U/mL，PBS：pH 7.4。延胡索酸还原酶粗酶液：重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-30a-frd)诱导表达后用蛋白抽提试剂处理获取粗酶液。配制丁二酸溶液1mM。步骤：在96孔黑色微孔板上依次加入不同浓度丁二酸(PBS稀释)30μL，试剂A 50uL，延胡索酸还原酶粗酶液20μL，总体积100uL。37℃保温30min，读取Ex/Em 490/585(nm)荧光值。建立Ex/Em 490/585(nm)荧光值与丁二酸浓度的标准曲线(附图5)，R2＝0.998，说明丁二酸浓度在一定范围内与测定的Ex/Em 490/585(nm)荧光值呈显著线性关系。
实施例4
LB培养基及M9盐基本培养基对利用延胡索酸还原酶和过氧化物酶偶联的方法测定丁二酸方法的影响。试剂A：AmplexUltraRed：0.1mM，过氧化物酶：9U/mL，PBS：pH 7.4。延胡索酸还原酶粗酶液：重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-30a-frd)诱导表达后用蛋白抽提试剂处理获取粗酶液。配制丁二酸溶液1mM，LB培养基，LB培养基稀释10倍，M9盐培养基，M9盐培养基稀释10倍。步骤：在96孔黑色微孔板上依次加入不同浓度丁二酸(PBS稀释)30μL，试剂A 50uL，延胡索酸还原酶粗酶液20μL，总体积100μL，并将PBS依次替换为M9盐培养基，M9盐培养基稀释10倍，LB培养基，LB培养基稀释10倍。所有样品37℃保温30min，读取Ex/Em 490/585(nm)荧光值。LB培养基由于组分的复杂性，其对双酶偶联的方法干扰较大(附图6)，因此不适合作为筛选二元酸的基本培养基。而M9盐培养基则对双酶偶联检测方法的影响较小(附图7)，可以忽略，是筛选二元酸的最适基本培养基。
实施例5
取一株本实验室产丁二酸的大肠杆菌菌株(命名为CK，Kan+)做此酶联方法验证。5mL LB培养基(含Kan抗性)过夜活化，培养条件为37℃，200rpm。以5％的接种量接种至30mL M9盐培养基中，进行产丁二酸的发酵。(接种前需做去除LB培养基的处理：12000rpm离心2min，弃上清，用M9盐培养基重悬。)发酵条件为37℃，200rpm。取12h发酵液，12000rpm离心4min，保留上清。
分别利用延胡索酸还原酶和过氧化物酶偶联的方法以及高效液相法测定丁二酸浓度。双酶偶联的步骤：在96孔黑色微孔板上依次加入待测菌液30uL，试剂A 50uL，延胡索酸还原酶粗酶液20μL，总体积100μL，。反应体系置37℃，30min，测定Ex/Em 490/585(nm)荧光值。双酶偶联的方法及高效液相法得到的丁二酸浓度分别为0.02259mM，0.022941Mm(附图8)。两个数据基本吻合，在误差范围内，说明双酶偶联的方法测定丁二酸在一定条件下是可靠的。
附图说明：
附图1：荧光法检测H2O2的标准曲线。
附图2：显色法检测H2O2的标准曲线(1)。
附图3：显色法检测H2O2的标准曲线(2)。
附图4：丁二酸与双酶偶联反应产物在Ex/Em 490/585(nm)荧光值随时间的变化曲线。
附图5：丁二酸浓度与双酶偶联反应产物在Ex/Em 490/585(nm)荧光值之间建立的标准曲线。
附图6：LB培养基对延胡索酸还原酶和过氧化物酶双酶偶联方法检测丁二酸的影响。
附图7：M9盐培养基对延胡索酸还原酶和过氧化物酶双酶偶联方法检测丁二酸的影响。
附图8：延胡索酸还原酶和过氧化物酶双酶偶联方法及高效液相法测定大肠杆菌12h发酵液中丁二酸浓度的比较。
Claims (9)
1.一种利用二元酸氧化酶和过氧化物酶偶联反应的检测微生物生产二元酸的高通量检测新方法，步骤如下：
(1)将培养基活化菌群经稀释后涂布到固体培养基中，待单菌落长出后接种到96深孔培养板中培养；
(2)将96深孔培养板利用冷冻离心机在合适的条件下离心，取其上清液进行测定；
(3)利用双酶偶联的方法，在96孔黑色微孔板中结合试剂A测定上述上清液中二元酸含量；
2.按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的96深孔培养板是体积为3mL，但是每孔中加入0.5-2mL的培养基；
3.按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的冷冻离心机能够直接离心96深孔培养板；
4.按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的离心条件为4℃，4000rpm离心10-60min；
5.按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的上清液中不能含有菌体；
6.按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的双酶是二元酸氧化酶和过氧化物酶；
7.按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的试剂A中各物质含量为：AmplexUltraRed：0.05-1.0mM，过氧化物酶：0.1-10U/mL，PBS：pH 7.4。
8.按权利要求1中所述的方法，其特征是：待试剂A、二元酸氧化酶及样品加入到其中后在37℃下反应5-60min；
9.按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的测定条件为：Ex/Em 490/585(nm)。
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