KR100320714B1 - 미생물을 이용한 환경 정화 방법 - Google Patents

미생물을 이용한 환경 정화 방법 Download PDF

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야스시 오다
마사미 미야타
유키오 오카무라
도시아키 기무라
마사토시 우치다
오사무 아사미
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와다 아끼히로
도요다 지도샤 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 다음의 성질 :형태(간상 구균), 그람 염색성(+), 포자 형성(-), 운동성(-), 산소와의 관계(호기성), 옥시다아제 시험(-), 캐탈라아제 시험(+), 내산성(-), 간상 구균 사이클(+), DNA의 GC 함량(몰%)[73 (HPLC법에 의함)]을 가지고, 트리클로로에틸렌을 분해할 수 있는 신규 미생물에 관한 것이다.
본 미생물은 24시간에 30ppm의 트리클로로에틸렌을 분해할 수 있고, 100ppm의 트리클로로에틸렌을 50% 분해할 수 있다.

Description

미생물을 이용한 환경 정화 방법{METHOD FOR ENVIRONMENTAL PURIFICATION USING MICROORGANISM}
본 발명은 트리클로로에틸렌과 같은 유기 할로겐 화합물을 효율적으로 분해하는 신규미생물 및 이 미생물을 이용한 유기 할로겐 화합물, 특히 토양, 하수 또는 폐수 중의 트리클로로에틸렌의 분해 방법에 관한 것이다.
최근, 유기 용매를 산업적으로 이용함에 따라, 많은 지역에서 이와 같은 물질 또는 이와 같은 물질이 섞인 폐액의 유출에 의한 토양 오염이 문제시 되고 있다. 특히, 유기 염소 화합물에 의한 토양오염은 큰 사회문제로서, 오염 토양의 복구기술은 더욱 필수적이 되고 있다. 오염된 토양의 정화 기술로서는 물리적 처리법과 생물적 처리법이 있다.
물리적 처리법으로서는 에어스트리핑법(굴착한 오염토양의 공기를 불어 넣어 유기 염소 화합물을 휘발시켜 활성탄 등으로 흡착 제거하는 방법), 진공추출법(오염토양에 파이프를 넣어 감압상태로 함으로써 유기 염소 화합물을 기화시켜 토양으로부터 추출하는 방법)이 존재한다. 그러나 이러한 방법은 공기불어넣기 등에 막대한 동력이 필요하며, 전자의 경우는 토양의 굴착을 필요로 하고, 후자의 경우는 오염물질의 농도가 저하하면 추출효율이 저하하여 정화가 진행되지 않는다는 결점 있다. 또한, 어느 방법도 오염물질을 활성탄 등에 흡착하는 것뿐이므로 별도의 오염물질의 무해화 처리가 필요하게 된다.
최근, 개발도상에 있는 생물적 처리법은 미생물이 가지는 물질의 분해능력을 이용하여 오염물질을 완전히 분해·무해화할 수 있고, 투입에너지도 물리적 방법에 비교하여 적다는 보고가 있다. 또한 저농도의 오염이라도 정화가능하므로 저비용인 토양정화기술로서 기대가 크다. 이 생물학적 방법으로서는 고상처리법(굴착한 토양에 인·질소·미생물 등 혼합, 미생물에 의한 오염물질의 분해를 촉진), 슬러리처리법(굴착한 토양에 물·인·질소·미생물 등 혼합, 액체 형상으로 처리함으로써 미생물에 의한 오염물질의 정화속도를 촉진) 및 원위치처리법(오염토양을 굴착하지 않고 토양 중에 메탄·공기·인·질소를 주입하여 미생물에 의한 오염물질의 분해를 촉진)이 알려져 있다.
종래의 생물처리기술 중, 고상처리법이나 슬러리처리법의 경우는 토양의 굴착이 필요하고 적용범위가 좁은 데다가 처리·설비비용도 비교적 높다.
한편, 원위치처리법은 상기 방법에 대하여 처리·설비비용 모두 낮고, 광범위에 걸친 처리가 가능하다. 그러나, 토양미생물의 절대수가 적기 때문에 정화속도가 느리다. 특히 유기 염소 화합물과 같은 난분해성 화합물에서는 토양 중에 오염물질을 분해할 수 있는 미생물이 생식하고 있지 않을 가능성이 있어 그 경우에는 정화는 불가능하다. 이러한 경우, 유기 염소 화합물의 분해능력을 가지는 미생물을 취득하여 토양에 접종함으로써 정화속도의 향상이 정화가 가능하게 되고 있다.
공지의 트리클로로에틸렌을 분해하는 미생물로서는, 메탄 자화성 균인메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus tricosporium)OB3 (일본국 특표 평4-501667, 일본국 특개 평5-212371)나메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus tricosporium)TUKUBA (일본국 특개 평2-92274, 일본국 특개 평3-292970),슈도모너스속인 슈도모너스 푸티다(Pseudomonas putida)F1 (일본국 특개 소64-34499),슈도모너스 푸티다(Pseudomonas putida)BH (후지타 등 ; 케미컬 엔지니어링, 39 (6): 494-498, 1994),슈도모너스 푸티다(Pseudomonas putida)UC-R5, UC-P2 (일본국 특개 소62-84780),슈도모너스 푸티다(Pseudomonas putida)KWI-9 (일본국 특개 평6-70753),슈도모너스 멘도시나(Pseudomonas mendocina)KRl (일본국 특개 평2-503866, 5-502593),슈도모너스 세파시아(Pseudomonas cepacia)G4 (일본국 특개 평4-502277), 슈도모너스 세파시아 (Pseudomonas cepacia) KK01 (일본국 특개 평6-296711), 기타알칼리지너스 유트로푸스 (Alcaligenes eutropus)JMP134 (A.R. Harker, Appl. Environ. Microbiol., 56 (4): 1179-1181, 1990),알칼리지너스 유트로푸스(A1ca1igenes eutropus)KS01 (일본국 특개 평7-123976), 암모니아 산화 세균인니트로소모너스 유로파에아(Nitrosomonas europaea)(D.Arciero et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 159(2): 640-643, 1989),코리네박테리움속 세균(Corynebacterium)J1 (일본국 특개 평8-66182) 등이 알려져 있다.
이러한 공지의 미생물의 대부분은 트리클로로에틸렌의 분해능력은 그다지 높지 않고, 기껏해야 초기농도로서 5ppm의 트리클로로에틸렌을 배양액 중에서 분해하는 정도이다. 또, 특히 토양이라고 하는 특수한 환경하에서 트리클로로에틸렌의 분해가 필요하기 때문에, 생물적 정화에 이용하는 미생물에는 충분한 트리클로로에틸렌의 분해활성을 가질 수 있을 뿐만 아니라, 토양 중에서도 그 분해능력을 유효하게 발휘할 수 있는 것이 요구되나, 공지의 미생물의 대부분은 그 능력이 충분하다고는 할 수 없다.
또한,슈도모너스 세파시아(Pseudomonas cepacia)KK01은 초기농도 30ppm의 트리클로로에틸렌을 배양액 중에서 15ppm까지, 초기농도 5ppm의 트리클로로에틸렌을 토양환경 중에서 1ppm 정도까지 분해한다는 보고가 있다(일본국 특개 평6-296711). 또, 알칼리지너스 유트로푸스(Alcaligenes eutropus) KS01은 초기농도 50ppm의 트리클로로에틸렌을 배양액 중에서 검출 한계 이하까지, 초기농도 1ppm의 트리클로로에틸렌을 토양환경 중에서 검출 한계 이하까지 분해한다는 보고가 있다(일본국 특개 평7-123976).
이러한 미생물은 종래의 미생물보다 높은 분해능력을 가지고, 토양환경 중에서의 분해능력도 확인되고 있으나, 분해능력 발휘를 위해서는 적어도 1종류 이상의 방향족 화합물을 토양환경 중에 첨가할 필요가 있다. 방향족 화합물 그 자체가 오염물질이기 때문에 2차 오염을 야기할 우려가 있어, 방향족 화합물을 첨가해도 트리클로로에틸렌과 함께 완전히 분해·제거되거나, 또는 방향족 화합물을 첨가하지 않아도 트리클로로에틸렌을 분해할 수 있는 미생물을 취득하는 것은 실용상 해결해야 할 큰 과제이다.
따라서, 트리클로로에틸렌의 생물정화법의 실용화를 위해서는, 높은 분해능력을 가지고, 또한, 방향족 화합물을 첨가해도 트리클로로에틸렌과 함께 완전히 분해·제거되거나, 또는 방향족 화합물을 첨가하지 않아도 토양 중에서 트리클로로에틸렌을 분해할 수 있는 미생물의 취득이 요구되고 있다.
또한, 원생 동물에 의한 포식이나 토착 미생물과의 경합에 의해, 토양에 산포된 미생물의 밀도는 현저히 억제되어, 필요 처리 능력에 맞게 미생물의 밀도를 올리기는 매우 곤란한 경우가 많다. 밀도를 높이기 위하여, 토양 중에 공기 및 영양소를 펌핑하는 가압법 등의 방법을 사용할 수 있다. 그러나, 막대한 에너지를 필요로 함에도 불구하고, 이러한 수단만으로는 균체밀도를 높이기 어렵기 때문에, 미생물의 분해 능력은 낮은 수준으로 유지된다. 개방계 뿐 아니라 반응기와 같은 폐쇄계에서 높은 균체밀도를 유지하기 위해서는 영양소의 공급, 에어레이션 등 과 같은 막대한 에너지가 필요하다.
단위 균체량 당 분해능력을 높일 수 있다면, 균체밀도가 낮아도 충분한 분해능력을 얻을 수 있기 때문에, 균체밀도 유지를 위해 막대한 에너지를 투입할 필요는 없게 된다. 트리클로로에틸렌을 분해하는 미생물은, 이와 같은 물질을 분해할 수 있는 효소를 발현시킴으로써 트리클로로에틸렌을 분해하나, 이 효소를 발현시키기 위해 유도물질을 필요로 한다. 미생물의 배양시에 유도물질을 첨가하여 접촉시킴으로써 미생물이 분해능력을 발휘하도록 할 수 있다는 것은 이미 알려져 있으나, 유도물질과 접촉시키는 시간에 착안하여 단위균체량당의 분해능력을 높이는 방법을 검토한 종래예는 전혀 없다.
또한, 현재, 특정한 미생물을 환경 중에 방출함으로써 생태계에 큰 영향을미칠 가능성이 있다고 우려되어, 트리클로로에틸렌 등을 분해하기 위하여 토양 중에 트리클로로에틸렌-분해 미생물을 산포하는 것을 포함하는 생물 첨가(Bio augmentation)는 사회적으로 받아들이기 어렵다. 그러나 살균(sterilization) 처리에 의해 증식 활성을 완전히 상실한 미생물을 산포하면, 단순한 유기물의 산포와 같고, 생태계에 미치는 효과가 거의 없다고 생각된다. 일본국 특허공보 평8(1996)-3012에 개시된 발명에서는, 분해균을 파쇄하여 토양에 산포함으로써, 생태계에 미치는 바람직하지 못한 효과를 최소화할 수 있다고 주장한다. 그러나, 미생물의 파쇄 조작은 대규모 장비와 많은 시간 및 노력이 필요하여, 분해균을 대량으로 오염된 토양에 산포하는 것은 사실상 어렵다.
또한, 이 발명에 있어서는 파쇄균체가 비파쇄 균체에 비하여 토양에 용이하게 침투하는 효과를 들고 있으나, 파쇄균체가 어느 정도 분해활성을 지속할 수 있는지는 언급하고 있지 않다. 또한, 공지의 트리클로로에틸렌 산화 효소는 조효소로서 NAD 를 필요로 한다. 그러나, 조효소는 고가이므로, 균체를 파쇄하여 균체로부터 유리시킨 효소에 조효소를 분해반응에 필요한 농도로 공급하는 것은 매우 어렵다.
따라서, 본 발명의 목적은 트리클로로에틸렌과 같은 유기 할로겐 화합물을 종래부터 알려져 있는 미생물보다도 더욱 효율적으로 분해할 수 있는 신규 미생물, 및 상기 미생물을 사용하는 유기 할로겐 화합물의 분해 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 특정한 미생물이 환경 중에 방출된 후 생태계에 미치는영향을 최소화하는 저렴한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위해 각종 검토를 한 결과, 종래 알려져 있는 어떤 미생물보다도 트리클로로에틸렌 분해능이 매우 높은, 공지된 어떤 속에도 속하지 않는 신규 미생물을 단리하는 것에 성공함으로써, 본 발명을 완성시켰다.
따라서, 본 발명은 다음의 분류학적 성질을 가지며, 트리클로로에틸렌을 분해할 수 있는 세균을 제공한다. 이 세균의 대표적인 주는 MO7주(FERM BP-5624)이다.
형 태 간상 구균(coccoid, rod shaped)
그람 염색성 +
포자 형성 -
운 동 성 -
산소와의 관계 호기성
옥시다아제 시험 -
캐탈라아제 시험 +
내 산 성 -
간상 구균 사이클 +
기생균계(Aerial mycelium)의 형성 -
세포벽의 펩티드 글리칸 형 메조-디아미노 피멜산
글리코릴 시험 - (아세틸형)
미콜산 -
DNA의 GC 함량(몰%) 73 (HPLC법에 의함)
본 발명은 또한, 상기 세균이 상기 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물에 작용하게 하는 것을 특징으로 하는, 유기 할로겐화 화합물 및/또는 방향족 화합물의 분해 방법을 제공한다. 이러한 경우, 유기 할로겐 화합물은 트리클로로에틸렌이 중요하며, 방향족 화합물은 페놀이 바람직하다.
본 발명은 또한, 유기 할로겐 화합물을 함유하는 토양, 배수 또는 기타 폐기물에 상기 세균의 배양물을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 상기 토양, 폐수 또는 기타 폐기물 중의 유기 할로겐 화합물의 분해 방법을 제공한다. 실제 사용할 때 중요한 유기 할로겐 화합물은 트리클로로에틸렌이다.
사용하는 세균 배양물로서 바람직한 것은 배양균체이다. 이 배양 균체는 생균체 또는 살균처리한 균체가 가능하다.
본 발명은 또한, 유기 할로겐 화합물을 함유하는 토양, 폐수 또는 기타 폐기물 중의 유기 할로겐 화합물의 분해방법으로서, 상기 방법은 상기 토양, 폐수 또는 기타 폐기물에 본 발명의 미생물을 접종하고, 상기 토양, 폐수 또는 기타 폐기물에 방향족 화합물 또는 분해성(degradable) 탄소원 또는 이의 혼합물을 첨가하고, 이어서 상기 접종된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 방향족 화합물은 페놀성 화합물, 예를 들면 페놀이 바람직하며, 상기 분해성 탄소원은 당류, 예를 들면, 글루코오스가 바람직하다.
본 발명은 또한, 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물의 분해방법에 있어서, 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 분해할 수 있는 미생물의 배양균체의 살균처리물이, 상기 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물에 작용하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 함유하는 토양, 폐수 또는 기타 폐기물 중의 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물의 분해 방법에 있어서, 상기 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 분해할 수 있는 미생물의 배양균체의 살균처리물을, 상기 토양, 폐수 또는 기타 폐기물에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기의 방법에 있어서, 상기 살균처리는 예를 들면 자외선 조사이다.
본 발명은 또한, 상기의 본 발명의 세균의 배양균체를 포함하여 이루어지는 방향족 화합물 및/또는 유기 할로겐 화합물 분해제를 제공한다. 상기 배양균체는 생균체 또는 살균처리한 균체가 가능하다. 살균 처리로서는 예를 들면 자외선 조사를 들 수 있다. 상기 분해제에 함유되어 있는 균체는, 저장 등의 관점에서 건조 또는 냉동 균체인 것이 바람직하다.
도 1은 NJ법(근린접합법)에 의하여 작성한 계통수 중의 본 발명의 MO7주의 위치를 나타낸 도,
도 2는 UPGMA법(평균거리법)에 의하여 작성한 계통수 중의 본 발명의 MO7주의 위치를 나타낸 도,
도 3은 본 발명의 MO7주를 이용하여 트리클로로에틸렌의 초기 농도가 분해율에 미치는 효과를 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명의 MO7주를 이용하여 pH가 트리클로로에틸렌(초기 농도 30ppm)의 분해율에 미치는 효과를 나타낸 그래프,
도 5는 본 발명의 MO7주를 이용하여 온도가 트리클로로에틸렌(초기 농도 30ppm)의 분해율에 미치는 효과를 나타낸 그래프,
도 6은 본 발명의 MO7주의 사균체(자외선 살균)를 이용하여, 트리클로로에틸렌의 초기 농도(초기 농도 30ppm)가 트리클로로에틸렌의 분해율에 미치는 효과를 나타낸 그래프,
도 7은 본 발명의 MO7주의 배양균체를 살균처리한 것(자외선 조사)과 살균처리하지 않은 것을 사용하여 시간 경과에 따른 트리클로로에틸렌의 잔존 분해 활성을 나타낸 그래프,
도 8은 본 발명의 MO7주를 페놀 및 트리클로로에틸렌을 함유하는 배지 중에서 배양한 경우의 성장곡선(OD), 페놀 소비 및 트리클로로에틸렌의 분해율의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸 그래프,
도 9는 본 발명의 MO7주를 페놀 함유 배지에서 배양한 경우의 성장 곡선(OD) 및 페놀 소비의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸 그래프,
도 10은 도 9의 배양경과에 있어서, 여러 다양한 시간까지 배양한 균체(OD=1.0)당 트리클로로에틸렌의 구체적인 분해율을 나타낸 그래프,
도 11은 도 9의 배양경과에 있어서, 여러 다양한 시간까지 배양한 균체의 총 트리클로로에틸렌 분해율을 나타낸 그래프,
도 12는 본 발명의 MO7주를 페놀(500ppm) 함유 배지에 배양하고, 페놀이 완전히 소비되었을 때 다시 페놀을 첨가함으로써 배양한 경우의 성장 곡선(OD) 및 페놀 소비의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸 그래프,
도 13은 도 12의 배양경과에 있어서, 여러 가지의 시간까지 배양한 배양물의 균체(OD=1.0)당의 트리클로로에틸렌 분해율을 나타낸 그래프,
도 14는 도 12의 배양경과에 있어서, 여러 가지의 시간까지 배양한 배양물의 총 균체당 트리클로로에틸렌 분해율을 나타낸 그래프,
도 15는 트리클로로에틸렌을 함유하는 토양에 본 발명의 MO7주의 배양균체를 첨가하여 트리클로로에틸렌을 분해한 경우의 균체량과 트리클로로에틸렌의 분해량의 관계를 나타낸 그래프,
도 16은 본 발명의 MO7주의 배양균체를 1회에 첨가한 경우 및 2회로 나누어 첨가한 경우의 트리클로로에틸렌 분해량을 나타낸 그래프,
도 17은 여러 가지의 초기 농도의 트리클로로에틸렌을 함유하는 토양에 본 발명의 MO7주의 배양균체를 첨가하여 분해를 행한 경우의 접종된 균체량 및 트리클로로에틸렌 분해율의 관계를 나타낸 그래프,
도 18은 트리클로로에틸렌을 함유하는 토양에 본 발명의 MO7주의 배양균체를 첨가하여 트리클로로에틸렌의 분해를 행하는 경우의 토양중 잔존 트리클로로에틸렌의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸 그래프,
도 19는 비닐 클로라이드, 1,1-디클로로에틸렌, 시스-1,2-디클로로에틸렌 및 트랜스-1,2-디클로로에틸렌의 분석법의 흐름도,
도 20은 디클로로아세테이트 및 트리클로로아세테이트의 분석법의 흐름도,
도 21은 트리클로로에탄올 분석법의 흐름도,
도 22는 수화클로랄 분석법의 흐름도,
도 23은 트리클로로에틸렌을 함유하는 토양에 본 발명의 MO7주의 배양균체 또는 그 살균처리물을 첨가하여 트리클로로에틸렌의 분해를 행한 경우의 결과를 나타낸 그래프,
도 24는 트리클로로에틸렌을 함유하는 토양에 본 발명의 MO7주의 배양균체를 첨가하여 트리클로로에틸렌의 분해를 행하는 경우의 트리클로로에틸렌의 분해물에 대한 온도(20℃, 30℃)의 영향을 나타낸 그래프,
도 25는 트리클로로에틸렌을 함유하는 토양에 본 발명의 소량의 MO7주의 배양균체와 유도제(페놀)를 첨가하여 트리클로로에틸렌의 분해를 행한 경우의 결과를 나타낸 그래프,
도 26은 트리클로로에틸렌을 함유하는 토양에 본 발명의 MO7주 또는 글루탐산에서 배양한 MO715주 배양균체를 첨가하여 트리클로로에틸렌의 분해를 행한 경우의 결과를 나타낸 그래프이다.
(상세한 설명)
본 발명의 대표적인 균주인 MO7주는 다음과 같이 하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 토양, 활성 오니와 같은 분리원을 페놀을 함유하는 배지에서 배양하여, 증식한 미생물을 단리한다. 이어서, 단리체를 트리클로로에틸렌을 함유하는 배지 중에서 인큐베이트하여 트리클로로에틸렌 분해능을 가지는 미생물을 선택한다. 미생물의 분리방법은 실시예 1에 상세하게 기재한다.
상기와 같이 하여 분리한 MO7주는 다음과 같은 분류학적 성질을 가진다.
형 태 간상 구균
그람 염색성 +
포 자 형 성 -
운 동 성 -
산소에 대한 태도 호기성
옥시다아제 시험 -
캐탈라아제 시험 +
내 산 성 -
간상 구균 사이클 +
기생균계(Aerial mycelium) -
세포벽의 펩티드 글리칸 형 meso-디아미노 피멜산
글리코릴 시험 - (아세틸형)
미콜산 -
세포 DNA의 GC함량(몰%) 73 (HPLC법에 의함)
추가로, MO7 종은 다음 특성을 갖는다.
콜로니 색조 특징적인 콜로니 색조가 형성되지 않는다.
콜로니 주변 세포의 신장 -
세포벽의 아라비노갈락탄 중합체 -(#1)
#l : 전 균체의 산가수 분해물을 이용하여 추정하였다.
본 MO7주의 형태학적 및 생리학적인 성질을 조사한 바 상기 표 2에 나타낸 바와 같은 결과를 얻을 수 있었다. 상기 결과에 의거하여 문헌(N.R.Krieg and J.G. Holt, 'Bergy's Manual of Systematic Bacteriology' Vol. 1 (1984), Williams and Wilkins ; J.G.Holt, N.R.Krieg, P.H.A.Senath, J.T.Staley and S.T.Williams, 'Bergy's Manual of Systematic Bacteriology' Ninth edition (1994), Williams and Wilkins)을 참고로 동정(同定)을 행한 결과, 단리된 MO7주는 어느 속·종의 균에도 합치하지 않았다. 또, 16S rRNA 유전자를 클론을 만들어 그 서열을 공지의 균의 서열과 비교한 바, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 가장 근연인 균은 테라박터 튜메스(Terrabacter tumesces)였다. 그러나, 이 균에 있어서도 유전자의 상동성은 95%에 그쳐 동속이 아니라고 판단되었다. 따라서, 본 균주는 어느 공지의 균과도 다른 신규 속의 균임이 확인되었다.
본 발명의 방법에 있어서는, 본 발명의 세균을 유기 할로겐 화합물 및/또는방향족 화합물에 작용하게 함으로써, 이 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 분해한다. 본 발명의 세균에 의해 분해될 수 있는 유기 할로겐 화합물로서는 트리클로로에틸렌, 디클로로에틸렌, 비닐 클로라이드를 들 수 있으나, 실용상의 견지에서 트리클로로에틸렌이 가장 중요하다. 또, 방향족 화합물로서는 페놀성 화합물 예를 들면 페놀을 들 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서는, 토양, 폐수 또는 기타 폐기물 중의 유기 할로겐 화합물의 분해방법으로서, 이 토양, 폐수 또는 기타 폐기물에 본 발명의 세균의 배양물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 세균의 배양물로서는 본 발명의 세균을 배양하여 얻어지는 배양액 그 자체, 또는 상기 배양액으로부터 분리한 배양균체 또는 상기 배양액 중의 사멸된 세균 또는 사멸된 분리 배양균체가 이용된다.
본 발명의 세균을 배양하기 위해서는, 이 세균이 증식할 수 있는 모든 배지를 이용할 수 있다. 배지는 탄소원으로서 예를 들면 글로코오스, 수크로오스 등을 함유하고, 유기질소원으로서 효모 추출물, 펩톤, 육(肉) 추출물 등, 또는 무기질소원으로서 암모늄염, 질산염 등을 함유한다. 또한, 칼륨이온, 나트륨이온, 칼슘이온, 마그네슘이온 등의 양이온 및 염소이온, 황산염 이온, 인산염 이온 등의 음이온으로 이루어지는 무기염류를 함유할 수 있다. 탄소원의 농도는 그 종류에 따라 다르나 약 0.1 내지 약 1%이고, 질소원의 농도는 그 종류에 따라 다르나 약 0.01 내지 약 1% 정도이다. 또한, 무기염류의 농도는 종류에 따라 다르나 약 0.001 내지 약 0.1% 정도이다.
배양은 호기성 액체 배양에 의한 것이 바람직하고, 호기성 조건은 통기, 교반, 통기와 교반, 쉐이크 등의 통상적인 수단으로 확보된다. 트리클로로에틸렌 등의 유기 할로겐 화합물 분해능이나 페놀 등의 방향족 화합물 분해능을 유도하기 위해서는 배지 중에 페놀 등의 방향족 화합물 등을 첨가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 다른 탄소원에 추가하여 페놀 등의 방향족 화합물을 첨가할 수 있으며, 유일한 탄소원으로서 페놀 등의 방향족 화합물을 첨가할 수 있다. 배지 중에 페놀 등의 방향족 화합물의 첨가량은 약 1OOppm 내지 약 1OOOppm 정도가 바람직하다.
본 발명의 미생물을 균체의 형태로 이용하는 경우, 배양액으로부터 세균세포를 분리하기 위해 상용수단, 예를 들면 원심 분리에 의해 균체를 분리하면 된다. 균체를 일단 보존한 후에 사용하기 위해서는, 동결 또는 건조균체 형태로 만들 수 있다. 이러한 경우, 균체를 건조하기 위한 상용수단, 예를 들면 동결 건조, 분무 건조 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서는 환경(미생물상)에 영향을 최소화하기 위해, 살균한 배양물 또는 살균한 균체를 이용할 수 있다. 이를 위한 살균방법으로서는 생균체에 자외선 조사하는 방법 등을 이용할 수 있다. 이와 같은 살균된 세포나 배양물도 본 발명에 있어서의 '배양물'에 포함된다.
처리대상물에 본 발명의 배양물을 첨가하는 경우, 처리대상물에 대하여 1O6내지 lO9세포/g의 생균체 또는 그것에 상당하는 유기 할로겐 화합물 분해능을 가지는 살균된 균체를 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 미생물을 트리클로로에틸렌 등의 유기 할로겐 화합물에 작용하게하는 방법으로는, 토양 등의 고체 또는 폐수 등의 액체(처리대상물이라 칭함)에 함유되는 유기 할로겐 화합물을 분해하기 위해서 처리 대상물에 본 발명의 배양물을 첨가·혼합한다.
본 발명의 다른 실시 형태에 의하면, 토양, 폐수, 기타 폐기물 등의 처리대상물에 본 발명의 미생물을 접종하여 거기에서 증식하게 함으로써, 처리대상물 중의 트리클로로에틸렌 등의 유기 할로겐 화합물을 분해할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 유기 할로겐 화합물을 함유하는 토양, 폐수 또는 기타 폐기물 중의 유기 할로겐 화합물의 분해방법에 있어서, 상기 토양, 폐수 또는 기타 폐기물에 본 발명의 세균을 접종하고, 상기 토양, 폐수 또는 기타 폐기물에 방향족 화합물 또는 분해성 탄소원 또는 이의 혼합물을 첨가하고, 이어서 상기 접종된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
이 경우, 분해성 탄소원으로서는 당류, 예를 들면 글루코오스 등이 바람직하다. 이 경우의 탄소원의 양은 처리대상물에 대하여 약 0.1 내지 약 1% 정도이다. 또, 처리대상물에 방향족 화합물을 첨가하는 경우에는 방향족 화합물을 첨가할 필요가 있고, 방향족 화합물로서는 페놀, 크레졸 등을 사용할 수 있다. 이 경우, 첨가한 방향족 화합물이 유기 할로겐 화합물의 분해 후에 여전히 잔존하고 있으면, 새로운 환경오염의 원인이 되므로 과량의 방향족 화합물을 첨가하는 것은 바람직하지 못하다. 방향족 화합물의 첨가량은 처리대상물에 대하여 약 100 내지 약 500ppm 정도인 것이 바람직하다.
본 발명자들이 상기와 같이 하여 제조한 본 발명의 미생물의 배양균체는, 생균체 뿐만 아니라 살균처리한 경우에 있어서도, 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물 분해능을 유지하는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명은, 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 함유하는 토양, 폐수 또 기타 폐기물 중의 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물의 분해방법에 있어서, 상기 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 분해할 수 있는 미생물의 배양균체의 살균처리물을 상기 토양, 폐수 또 기타 폐기물에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
살균처리로서는 자외선 조사, 에틸렌 옥사이드 처리, 방사선 조사 등의 방법이 이용된다. 이 살균처리물은 유기 할로겐 화합물 분해능에 관하여 높은 저장안정성을 갖는 예상외의 성질이 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 세균 배양물을 포함하여 이루어지는 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물 분해제를 제공한다. 이 배양물은 바람직하게는 배양균체로서, 이것은 생균체 또는 살균처리한 균체가 가능하다. 살균처리는 상기와 같이 자외선 조사, 에틸렌 옥사이드 처리, 방사선 조사 등에 의해 행해진다. 본 발명의 분해제는 저장 등의 관점에서 동결 또는 건조한 형태가 바람직하고 건조물은 상기와 같은 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있다.
트리클로로에틸렌 분해 활성을 유도하기 위하여 방향족 화합물(예를 들면 페놀 등)을 필요로 하지 않는 본 발명의 대표적인 변이주(이후, 구성변이주라고 칭함)인 MO715주는 다음과 같이 하여 분리할 수 있다. 예를 들면 MO7주에 변이작용을 가지는 자외선·방사선 또는 화학물질 예를 들면 니트로소구아니딘 등을 작용시켜 생긴 변이주 중에서 구성변이주를 선택한다. 미생물의 분리방법은 실시예 18에상세하게 설명한다.
본 발명의 구성변이주의 배양은 트리클로로에틸렌 분해활성을 유도하기 위하여 방향족 화합물을 필요로 하지 않는 것 이외에는 친주인 MO7주와 동일하게 실시할 수 있다. 배양시에 가하는 분해성 탄소원으로서는 당류, 예를 들면 글루코오스 또는, 아미노산, 예를 들면 글루탐산이 바람직하다. 또한, 사용방법에 있어서도 트리클로로에틸렌 분해활성을 유도하기 위하여 방향족 화합물을 필요로 하지 않는 것 이외에는 친주와 동일하다. 유기 할로겐 화합물의 분해능에 관해서는, 생균체 또는 살균처리한 균체가 MO7주와 동일한 효과를 가진다는 것을 주목해야 한다.
또한, 상기한 미생물주 MO7주는 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 1996년 8월 12일에 FERM BP-5624로서 부다페스트조약에 의거하여 국제기탁되어 있고, 또한 상기 미생물주 MO715주는 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 l997년 4월 24일에 FERM BP-5928로서 부다페스트조약에 의거하여 국제기탁되어 있다.
(실시예)
다음의 실시예를 통하여 본 발명은 더욱 쉽게 이해될 것이다. 그러나, 다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이며, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. MO7주의 단리 및 이의 16S rDNA의 클로닝과 시퀀싱
본 발명에 사용되는 미생물은 일본국 아이치현 내의 폐수처리장에서 채취한 활성 오니로부터 이하의 방법으로 단리하였다. 채취한 활성오니 0.1ml를, 30ml 바이알에 넣은 1%(v/v) 비타민용액(조성은 표 4에 기재)을 포함하는 6ml의 NMS 배지(조성은 표 3에 기재)에 접종하고, 이에 500ppm의 페놀을 첨가하였다.
바이알은 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉한 후, 30℃·160r.p.m으로 수일에서 수십일간 쉐이크 배양하였다. 조금이라도 탁함이 관찰된 배양액은 동일한 배지에 옮긴 후 쉐이크 배양하였다. 총 4회 반복하여 옮겨 넣었다. 4회째옮겨 놓은 후, 배양액을 적절히 희석하여 500ml의 페놀을 함유하는 NYG 배지(조성은 표 5에 기재)에 1.5%의 한천을 가한 평판 배지(agar plate) 위에 도말(塗沫)하였다. 출현한 콜로니의 배양을 수회 반복하여 미생물을 단리하였다. 또한, 미생물을 배양하기 위한 최적 조건을 선택하여, 상기의 NYG 배지 외에 영양 배지와 같은 다른 배지를 사용할 수 있다.
NMS 배지
황산마그네슘 7수화물 1.0g
황산칼슘 2수화물 0.2g
질산칼륨 0.23g
황산암모늄 0.65g
인산이수소칼륨 0.272g
인산수소 이나트륨 12수화물 0.727g
미량 원소 용액* 0.5ml
증 류 수 1L
미량 원소 용액
EDTA 이나트륨 2수화물 500mg
황산철(Ⅱ) 7수화물 200mg
황산아연 7수화물 10mg
염화망간(Ⅱ) 4수화물 3mg
붕산 30mg
염화코발트(Ⅱ) 6수화물 20mg
염화니켈(Ⅱ) 6수화물 2mg
나트륨 몰리브덴 2수화물 3mg
증 류 수 1L
* 미량 원소 용액은 별도로 멸균하여, 다른 성분의 멸균 종료 후에 첨가한다.
비타민 용액
티아민 염산염 3mg
p-아미노벤조산 13mg
아데닌 1000mg
NAD 250mg
비타민 B12 10mg
티아민 이인산염 100mg
증 류 수 1L
NYG 배지
효모 추출물 0.5g
글루코오스 0.18g
NMS 배지 1L
단리 조작시 한천배지로부터 콜로니를 백금 귀부(loop)로 조균하여, 단리한 미생물을 18cm의 시험관에 넣은 0.05%의 효모추출물과 500ppm의 페놀을 함유하는 10ml의 NMS 배지에 접종하였다. 30℃·130r.p.m으로 5일간 쉐이크 배양한 후, 균체를 5000r.p.m·10분간의 원심분리로 회수하고, 4ml의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액은 20ml 바이알에 넣고, 모든 성분이 동시에 액상 중에 용해된 후 30 ppm이 되는 양만큼 트리클로로에틸렌을 첨가하였다. 바이알은 테플론 코팅 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 30℃에서 밤새 배양한 후, 바이알 중의 기체상을 FID 또는 ECD 검출기가 부착된 가스크로마트그래프로 분석하였다.
얻어진 결과로부터 트리클로로에틸렌의 분해능력이 우수한 균주를 선별하여 형태학적 및 생리학적인 성질을 조사하여, 표 2에 나타낸 바와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
그 결과에 의거하여, 문헌(N.R.Krieg and J.G. Holt, 'Bergy's Manual of Systematic Bacteriology' Vol. 1 (1984) Williams and Wilkins 및 J.G.Holt, N.R.Krieg, P.H.A.Senath, J.T.Stanley and S.T.Williams, 'Bergy's Manual ofDeterminative Bacteriology' Ninth edition (1984) Williams ans Wilkins)를 참고로 동정을 행한 결과, 이 균주는 어느 속·종의 미생물에도 속하지 않았다. 이 균주는 MO7주라고 명명되고, 1996년 8월 12일에 부다페스트조약에 기인하는 국제기탁으로서 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM BP-5624로서 기탁되었다.
또, 본 발명의 미생물에 관하여 16S rDNA의 서열을 결정하여 공지의 미생물의 서열과 비교하였다. 이하에 그 개요를 나타낸다.
본 발명의 미생물의 16S rDNA는 히라이시의 방법(일본미생물생태학회지, vol.10 (1): 31-42, 1995)에 따라 PCR로 증폭하였다. PCR에는 5'-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3' (서열번호 : 1) 및 5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CGG CAG GTT-3' (서열번호 : 2)의 염기 서열을 가지는 프라이머를 사용하였다. 이하의 프로그램에 따라 서멀사이클러(파킨 엘머사)로 PCR을 하였다. 즉, 90℃로 30초동안 미리 가열하고, 96℃ 60초/55℃ 120초/72℃ 180초의 사이클을 30회 반복한 후, 72℃로 300초 가열처리하였다.
증폭한 PCR 단편은 QIAquick(키아겐사)로 정제하고, 히라이시의 방법(일본미생물생태학회지, vol.10 (2): 81-l02, 1995)에 따라 PCR 산물을 직접주형으로 하는 방법으로 시퀀스를 행하였다. 시퀀스 반응에는 5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3' (서열번호 : 1), 5′-GGC CGG ACG GGT GAG T-3' (서열번호 : 3), 5' -TAC GGG AGG CAG CAG-3' (서열번호 : 4), 5' -CTG CCA GCA GCC GCG CG-3' (서열번호 : 5), 5' -G ATT AGA TAC CCT GGT AG-3' (서열번호 : 6), 5' -ACT CAA AGG AAT TGA CGG-3' (서열번호 : 7), 5'-GCA ACG AGC GCA ACC C-3' (서열번호 : 8) 또는 5' -TGT ACACAC CGC CCG T-3' (서열번호 : 9)의 염기 서열을 가지는 프라이머를 각각 사용하였다. 다이 종결제 사이클 시퀀싱 키트(Dye terminator cycle sequencing kit, 파킨엘마사)를 이용하여, 본 키트 지정의 프로그램에 따라 PCR을 하였다. 시퀀스 반응을 한 샘플은 ABI373A 시퀀서(파킨엘마사)에 의해 전기 영동 및 서열 분석을 하였다. 이러한 조작에 의해 결정된 본 발명의 미생물의 16SrDNA의 염기 서열을 표 6(서열 번호 10)에 나타낸다.
또한, 얻어진 염기 서열은 일본국 국립유전학연구소의 데이터 베이스(blast)의 DNA(DDBJ+DDBJ NEW) 중의 데이터와 비교하였다. 유사균주의 검색은 '블라스트(blast)' 프로그램을 사용하여 디폴트치로 행하고, 먼저 유사성이 높은 50종을 선택하였다. 생리적 분류시험의 결과로부터 명확하게 다른 균주(미콜산 생성능을 가지는 Mycobacterium 속)를 제외시켰다. 이어서, 나머지 균종 및 근연이라고 생각되는 속의 타입인 종으로 다중 상동성 (multiple alignment)분석을 하였다.
그 결과로부터 NJ(근린접합)법(도 1) 또는 UPGMA(평균거리)법(도 2)으로 계통수를 작성(5' 말단쪽의 서열을 배열하고 나서 정렬하였다)하였다. 가장 근연의 균은Terrabacter tumescens(계통수에는 참고를 위해Mycobacterium sedimenta1is를 포함하고 있음)였다. 근연인 균주(동일 클러스터에 속하는 미생물)을 다시 Genetryx-Mac 8.0을 사용하여 상동성(homology) 검색을 행하였다. 그러나, 가장 근연의Terrabacter tumescens에 있어서도 유전자의 상동성은 95%에 그쳐 동속이 아니라고 판단되었다. 따라서 본 발명의 미생물은 공지의 어느 균과도 다른 신규 미생물임이 확인되었다.
이 미생물은 배양배지에 혼입한 약 1OOppm 정도의 고농도의 트리클로로에틸렌을 50% 정도 분해하고, 30ppm 정도의 트리클로로에틸렌을 24시간에 완전히 분해한다. 이 미생물의 증식에 따라 트리클로로에틸렌을 분해하기 위하여, 트리클로로에틸렌을 함유하는 배양배지(배지, 토양, 물 등) 중에 페놀 등의 방향족 화합물을 적어도 1종 첨가할 필요가 있다.
이하에 본 발명에 따른 미생물을 하기의 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 2
500ml 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 넣은 0.05%의 효모추출물과 500ppm의 페놀을 함유하는 100ml의 NMS 배지에, 500ppm의 페놀을 함유하는 NYG 배지에 1.5%의 한천을 가한 평판 배지에 옮겨 저장한 본 발명의 미생물의 콜로니를 백금귀부로 조균하여 접종하거나, 500ppm의 페놀을 함유하는 NYG 배지에서 30℃로 본 발명의 미생물을 밤새 쉐이크 배양하여 얻은 전(前)배양액 1.0ml를 접종하였다. 30 ℃, 130r.p.m에서 3일간 쉐이크 배양 후, 균체를 5000r.p.m으로 10분간의 원심분리로써 회수하여 배양배지와 같은 양의 NMS 배지에 재현탁하였다.
이 때 현탁액의 OD600은 0.5(균체수로 1×109c.f.u/m1)였다. 균체현탁액 4ml를 20ml 바이알에 넣고, 모든 성분을 액상 중에 용해하여 10, 50 또는 30ppm이 되게하는 양만큼 트리클로로에틸렌을 첨가하였다. 바이알은 테플론 코팅 부틸 고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 30℃에서 밤새 쉐이크 배양하고, 정기적으로 바이알 중의 기체상을 ECD검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다.
이 결과를 도 3에 나타낸다. 본 미생물은 30ppm의 트리클로로에틸렌을 24시간에 완전히 분해하였다. 50ppm 및 100ppm이라는 고농도의 트리클로로에틸렌에 대해서도 24시간에 각각 70% 및 50% 분해하였다. 또한, 트리클로로에틸렌의 초기농도가 50 및 100ppm와 같이 높은 경우에도, 본 미생물로 분해되는 트리클로로에틸렌의 양은, 초기농도 30ppm의 경우에 비하여 저하되지 않아, 본 미생물은 고농도의 트리클로로에틸렌 존재하에서도 분해 저해를 받지 않는 것을 알 수 있었다. 지금까지, 1OOppm의 고농도 트리클로로에틸렌을 분해한 미생물에 관한 보고는 없는 점에서, 본 미생물의 분해능력은 매우 높다고 생각된다.
실시예 3
실시예 2와 같은 방법으로 배양한 균체를 5000r.p.m으로 10분간 원심분리하여 회수한 후, 배양액과 동일한 양으로 여러 pH로 조제한 M9 배지(Na2HPO4·7H2O 12.8g/l, KH2PO43g/l, NaC1 0.5g/l, NH4Cl 1.0g/1)에 각각 재현탁하였다. 균체현탁액 4ml는 20ml 바이알에 넣고, 모든 성분이 액상 중에 용해한 경우에 30ppm이 되게하는 양의 트리클로로에틸렌을 첨가하였다. 바이알은 테플론 코팅 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 30℃에서 밤새 쉐이크 배양하고, 정기적으로 바이알 중의 기체상을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다. 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이, pH5 이하에서는 활성이 매우 저하하나 pH6 내지 9 사이에서는 분해율 100%의 높은 값이며, pH10에서도 활성이 매우 약간 감소하여 90% 정도였다.
따라서, MO7주는 휴지균체반응에 있어서 트리클로로에틸렌 분해의 적정 pH가 6 내지 9 사이이고, 높은 pH 조건하에서 분해활성이 높은 것을 알 수 있었다. 트리클로로에틸렌의 호기분해에 의하여 생성되는 트리클로로에틸렌 산화물은 알칼리환경하에서는 자발적으로 분해하여 무해한 글리옥실산 등을 생성한다. 한편으로, 트리클로로에틸렌 산화물은 산성 조건하에서 자발적으로 분해되어 할로산을 생성한다. 따라서, 미생물에 의한 트리클로로에틸렌의 호기분해는 알칼리환경하에서 행하는 것이 바람직하다. 본 미생물은 높은 pH조건하에서 높은 분해활성을 발휘하기 때문에, 알칼리환경하에서의 트리클로로에틸렌의 분해에 매우 유용하다.
실시예 4
실시예 2와 같은 방법으로 배양한 균체를 500Or.p.m으로 10분간의 원심분리로써 회수하여 배양액과 같은 양의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액 4ml를 20ml 바이알에 넣고, 모든 성분을 액상 중에 용해한 경우에 30ppm이 되게하는 양의 트리클로로에틸렌을 첨가하였다. 바이알은 테플론 코팅 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 각각 다른 온도로 설정한 배양기 중에서 쉐이크하여 배양하였다. 트리클로로에틸렌의 잔존 농도는 정기적으로 바이알 중의 기체상을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하여 모니터하였다.
결과는 도 5에 나타낸 대로, TCE의 분해는 4℃에서는 7일에 걸쳐 천천히 진행하였다. 37℃에서는 하루만에 분해가 정지하고, 분해율은 낮았다. 한편, 20℃와 30℃에서는 하루에 80 내지 90%가 분해되었으나, 30℃보다도 오히려 20℃쪽에서 분해활성이 약 10% 높았다. 트리클로로에틸렌 등의 오염이 문제로 되고 있는 지하의 토양온도는 15 내지 20℃로 안정되어 있다고 한다. 그러나, 트리클로로에틸렌 분해균에 관한 보고에서는 대부분, 분해활성을 토양온도보다도 높은 30℃에서 평가하였고, 토양환경과 동일한 온도에서의 분해활성이 평가실험시와 유사한 수준으로유지되고 있는 것을 증명한 예는 매우 적었다.
일반적으로, 미생물 분해의 기본적인 반응인 효소반응은 온도가 1O℃ 저하하면 반응속도도 1/2정도로 저하하는 점에서, 평가시보다도 낮은 온도의 토양 중에서는 미생물의 트리클로로에틸렌 분해속도가 저하한다고 예측된다. 그러나, 본 미생물에 있어서는, 메카니즘은 분명하지 않으나 토양환경과 같은 온도에서는 분해활성은 저하하지 않아 높은 실용특성을 가진다고 증명되었다.
실시예 5
실시예 2와 같은 방법으로 배양한 균체를 5000r.p.m으로 10분간의 원심분리로써 회수하여, 배양액과 같은 양의 NMS 배지에 현탁하였다. 그 균체현탁액을 샬레에 넣어 두께가 1 mm 정도로 되도록 산포하고, 광원으로부터 40cm의 위치에 두어 60초 이상, 파장 260nm·15W의 자외선 램프를 조사하여 살균하였다. 살균처리후의 균체현탁액 4ml를 20ml 바이알에 넣고, 모두 액상 중에 용해한 경우에 30ppm이 되게하는 양의 트리클로로에틸렌을 첨가하였다. 바이알은 테플론 코팅 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉하여, 30℃에서 쉐이크 배양하고, 정기적으로 바이알 중의 기체상을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다.
결과는 도 6에 나타낸 대로, 살균처리후의 균체라도 생균에 대하여 80% 이상의 트리클로로에틸렌의 분해활성이 있었다. 또, 살균처리한 균체현탁액을 NYG 배지에 1/100의 양으로 접종하거나 또는 현탁액을 NYG 한천배지에 그대로 도말하여 30℃에서 배양을 하였으나, 배양액 탁도가 증가하거나 콜로니 형성은 전혀 관찰되지 않아 완전히 살균된 것으로 확인되었다.
또한, 살균처리한 균체현탁액을 4℃에서 보존하였을 때의 잔존활성은 보존 3일후에 생균체와 거의 동일하고, 7일후에는 생균체를 7일간 보존한 경우에 비하여 더 높은 활성을 가졌다. 이상의 결과에서 사균체에서는 초기 활성은 생균체에 비하여 80%로 저하하나, 보존시의 활성저하율이 낮기 때문에, 생균체보다도 높은 트리클로로에틸렌 분해활성을 유지할 수 있는 것이 판명되었다.
미생물을 균체의 세포벽 등의 외계와의 경계구조를 파괴하지 않고 살균함으로써, 트리클로로에틸렌 분해반응에 필요한 조효소를 효소활성의 발현에 필요한 농도대로 유지하는 것이 가능하다. 따라서, 트리클로로에틸렌 분해활성을 유지하기 위하여 조효소 등을 공급할 필요가 없이 배양균체만을 산포하면 된다. 그러므로, 저렴한 비용으로 생태계에 미치는 영향을 최소화하여 트리클로로에틸렌 등의 정화를 실시할 수 있다.
실시예 6
20ml 바이알에 넣은, 0.05%의 효모추출물과 500ppm의 페놀을 함유하는 PH 배지(조성은 표 7에 기재) 4ml에, 500ppm의 페놀을 함유하는 NYG 배지에 1.5%의 한천을 가한 평판 배지 상의 본 미생물의 콜로니를 백금귀부로 조균하여 접종하거나, 500ppm의 페놀을 함유하는 NYG 배지에서 30℃에서 본 미생물을 밤새 쉐이크 배양한 전배양액 0.04ml(균체수로 하여 약 106cells/ml)를 접종하였다.
PH 배지
황산마그네슘7수화물 0.2g
황산칼슘 0.1g
염화제2철6수화물 0.02g
인산수소이칼륨 1.0g
황산암모늄 1.0g
염화나트륨 0.1g
증 류 수 1L
접종과 동시에 모든 성분이 액상 중에 용해된 후 30ppm이 되게하는 양의 트리클로로에틸렌과 500ppm의 페놀을 첨가하였다. 바이알은 테플론 코팅 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉하여, 30℃에서 쉐이크 배양하였다. 트리클로로에틸렌 농도는 정기적으로 바이알 중의 기체상을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하여 측정하였다. 페놀 농도는 배양액을 0.45μ의 필터로 여과하고, 얻어진 여과액 1ml에 0.1ml의 K3Fe(CN)6/0.1M 글리신 수용액과 1ml의 4-아미노안티피린 수용액을 차례로 가한 후 혼합하고, 505nm의 흡광도를 측정하여 정량하였다.
이 결과는 도 8에 나타낸 바와 같이, 균체의 증식과 함께 페놀과 트리클로로에틸렌이 감소하여 배양 31시간째에 양자 모두 완전히 분해되었다. 따라서, 본 미생물은 트리클로로에틸렌 분해활성 유도능을 갖는 페놀 등의 방향족 화합물 존재하에 증식시키는 경우, 고도의 트리클로로에틸렌 분해 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 공지의 미생물과 비교하면,슈도모너스 세파시아KK01이 30ppm의 트리클로로에틸렌을 2일에 15ppm 정도까지 분해한다는 보고 및알칼리네스·에우트로프스KS01(일본국 특개 평7(1995)-123976)은 50 및 25ppm의 트리클로로에틸렌을 4일에 완전히 분해한다는 보고 이외에는 모두 1Oppm 이하의 저농도의 트리클로로에틸렌에 대한 분해밖에 보고되어 있지 않다.
알칼리제네스·에우트로프스KS01(일본국 특개 평7(1995)-l23976)의 트리클로로에틸렌 분해에서는, 배양액에 접종되는 미생물의 양은 1O8cells/ml로, 실시예 6에 기재한 본 미생물의 약 100배량이 필요하다. 따라서, 본 발명의 미생물은알칼리제네스·에우트로프스KS01에 비하여, 트리클로로에틸렌을 분해하기위해 필요한 균체량이 훨씬 적다. 따라서, 균체의 배양비용을 줄일 수 있는 등의 이점이 있다. 또한, 혼합첨가한 페놀도 검출 수준 이하까지 분해되므로, 환경오염물인 페놀에 의한 환경오염의 위험이 거의 없다.
또한, 본 발명자등은 토양 중에서 트리클로로에틸렌을 분해능을 갖는 미생물의 분해활성을 높임으로써 고농도의 오염에 대응할 수 있는 분해활성을 가진 미생물을 조제하기 위하여, 접종 전에 배양방법에 착안하여 검토하였다. 그 결과, 접종 전 미생물의 배양시간에 최적치가 있다는 것과, 유도제를 차례로 배양액에 첨가함으로써 트리클로로에틸렌의 분해활성을 개선할 수 있다는 것을 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다. 하기 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다.
실시예 7
500ml 삼각플라스크(Erlenmeyer flask)에 넣은, 0.05%의 효모추출물과 500ppm의 페놀을 함유하는 100ml의 PH 배지에, 500ppm의 페놀을 함유하는 NYG 배지에 1.5%의 한천을 가한 평판 배지에 옮겨 저장한 본 발명의 미생물의 콜로니를 백금귀부로 조균하여 접종하거나, 500ppm의 페놀을 함유하는 NYG 배지에서 30℃로 본 발명의 미생물을 밤새 쉐이크 배양한 전배양액 1.0ml를 접종하였다. 30℃로130r.p.m에서 배양하면서 배양액의 탁도와 페놀 농도를 실시예 6과 같은 방법으로 측정하였다. 배양중인 균체를 5000r.p.m. 10분간 원심분리하여 회수한 후, 배양액과 같은 양의 NMS 배지에 재현탁하였다. 현탁액의 OD600은 0.2(균체수로 1×1O8c.f.u/ml)였다.
균체 현탁액을 20ml 바이알에 넣고, 성분이 모두 액상 중에 용해되어 30ppm이 되게하는 양만큼 트리클로로에틸렌을 첨가하였다. 바이알은 테플론 코팅 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 30℃로 24시간 쉐이크 배양한 후, 바이알 중의 기체상을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다. 이 결과를 도 9 내지 도 11에 나타낸다. 도 9 의 꺾은선그래프는 배양액 탁도 및 페놀 농도를 나타낸다. 도 10의 막대 그래프는 배양 시간 각각에 집균한 본 발명의 미생물의 단위균체량당의 분해활성(비활성, specific activity)을 나타낸다. 도 11의 막대그래프는 배양시간 각각에 집균한 본 발명의 미생물의 배양액 단위량당 분해활성(총활성)을 나타낸다.
트리클로로에틸렌 분해활성에 관한 상기 결과로부터, 비활성은 유도기로부터 대수증식기까지 현저하게 높아진 후, 거의 일정한 레벨을 유지하였다. 그러나, 잔존 페놀이 0이 된 후 점차로 감소하였다. 그러나, 총활성은 잔존페놀의 농도가 0이 되는 정상기 부근에서 최고치를 유지하였다. 따라서, 토양에 접종하기 전의 단계에서 배양액 탁도와 페놀의 농도를 모니터하면서 배양하여, 탁도의 상승이 정지하여 배양이 정상기가 되고 페놀의 농도가 0이 되는 부근에서 배양을 종료하면 트리클로로에틸렌 분해능력이 우수한 균체가 얻어지는 것으로 판명되었다.
실시예 8
실시예 7과 같은 방법으로 본 발명의 미생물을 배양하여 배양액의 탁도와 페놀의 농도를 실시예 6과 같은 방법으로 측정하였다. 또한, 배양 도중에 페놀의 농도가 0이 되었을 때에 다시 500ppm의 페놀을 추가하여 배양을 계속하였다. 배양중인 균체를 5000r.p.m.으로 10분간 원심분리함으로써 회수한 후, 배양배지와 같은 양의 NMS 배지에 재현탁하였다.
현탁액의 OD600은 0.2(균체수로 2.5×108c.f.u./ml)였다. 균체현탁액은 20ml 바이알에 넣고, 모든 성분이 액상 중에 용해되는 경우에 30ppm이 되게하는 양의 트리클로로에틸렌을 첨가하였다. 바이알은 테플론 코팅 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 30℃로 24시간 쉐이크 배양한 후, 바이알 중의 기체상을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다.
이 결과를 도 12 내지 도 14에 나타낸다. 도 12 의 꺾은선그래프는 집균전의 배양단계에서의 배양액 탁도와 페놀의 농도를 나타낸다. 도 13의 막대그래프는 배양 시간 각각에 집균한 본 발명의 미생물의 비활성을 나타낸다. 도 14의 막대그래프는 배양시간 각각에 집균한 본 미생물의 총활성을 나타낸다. 배양 45시간 후 잔존페놀이 거의 0이 된 배양액에 500ppm의 페놀을 첨가한 경우, 페놀 농도는 다시 감소하여 배양액 탁도는 증가하였다. 따라서, 69시간 후에 다시 페놀을 첨가하였으나, 배양액 탁도의 상승과 페놀 농도의 감소는 보이지 않았다.
트리클로로에틸렌 분해활성에 대해서는, 도 13의 41시간 내지 60시간에서와 같이 증식이 정상기에 달하는 부근에서 페놀이 충분히 남아 있을 경우에는 높은 비활성을 얻을 수 있었으나, 그 후 페놀 농도가 감소하면 비활성은 저하되었다. 93시간에도 페놀을 첨가하였으나, 이 때는 균체량 및 비활성이 저하하였다. 그러나, 페놀이 잔존하고 있는 93시간 내지 114시간에는, 페놀이 거의 분해된 45시간 내지 69시간에 비하여 높은 비활성을 유지하고 있었다. 한편, 총활성은 균체량·비활성이 모두 높은 60시간에서 최대이고, 배양 개시시에만 페놀을 첨가하는 경우에 비하여 총활성이 2.5배 높았다.
이어서 토양 중 트리클로로에틸렌의 분해에 관하여 실시예를 들어 설명한다.
실시예 9
1OOml 바이알에, 인공적으로 트리클로로에틸렌으로 오염시킨 사질토(공기-건조)를 30g 넣었다. 본 발명의 미생물을 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 1.5ml, 4.5ml, 7.5ml, 15 ml 또는 30ml의 NMS 배지에서 30℃로 3일간 쉐이크배양한 후, 원심분리로써 집균하여 균체현탁액 첨가후의 토양의 함수율이 25%가 되는 적량의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액(페놀은 함유하지 않음)을 토양에 첨가후, 바이알을 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐하고 알루미늄 캡으로 밀봉하여 30℃에서 일정기간 정치하였다.
그 후, 30g의 토양을 넣은 바이알에, 활성탄을 통과시킨 공기로 폭기(aerate)한 50 ml의 탈이온수, 10ml의 n-헥산을 첨가하여 밀봉하였다. 그것을 초음파 세정기 중에서 10분간 초음파 처리하고 나서 쉐이크기로 10분간 쉐이크하였다. 분리한 n-헥산을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다. 결과는 도 15에 나타낸 바와 같이 균체밀도가 약 2.5×108cfu/g 습한 토양(배양액 15ml)까지는 트리클로로에틸렌 분해와 균체량은 비례적이나, 약 5×108cfu/g 습한 토양(배양액 30ml) 이상에서는 포화되었다. 따라서, 본 발명의 미생물을 트리클로로에틸렌의 분해에 이용하는 경우, 약 2.5×108cfu/g 습한 토양의 균체밀도가 최적이고, 본 발명의 미생물은 토양 중 주어진 오염물 농도에 대하여 정화에 필요한 균체의 최소량을 예측할 수 있는 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 10
10Oml의 바이알에, 인공적으로 트리클로로에틸렌으로 오염시킨 사질토(공기-건조)를 30g 넣었다. 본 발명의 미생물을 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 7.5ml의 NMS 배지에서 30℃로 3일간 쉐이크 배양한 후, 원심분리로써 집균하여 균체현탁액 첨가후의 토양의 함수율이 25%가 되는 적량의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액(페놀은 포함하지 않음)을 토양에 첨가후, 바이알을 테플론코팅된 고무마개로 밀폐하고 알루미늄 캡으로 밀봉하여 30℃에서 일정기간 정치하였다.
그 후, 30g의 토양을 넣은 바이알에, 활성탄을 통과시킨 공기로 폭기한 50ml의 탈이온수, 10ml의 n-헥산을 가하여 밀봉하였다. 이 바이알을 초음파 세정기 중에서 10분간 초음파 처리하고 나서 쉐이크기로 10분간 쉐이크하였다. 분리한 n-헥산을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다. 결과는 도 16에 나타낸 바와 같이 7.5ml의 배양액 상당의 균체를 2회에 걸쳐 토양에 첨가한 경우, 15ml의 배양액 상당의 균체를 1회에 첨가한 경우와 동등한 분해율이었다.
오염 토양에 함유되어 있는 트리클로로에틸렌 분해에 필요한 배양액 양을 한번에 가하여 공급하는 것은 어려우므로(실제의 오염토양은 수십m3이상), 단계적으로 분해 미생물을 배양하여 토양에 첨가해야 한다. 본 발명의 미생물을 단계적으로 첨가할지라도, 필요한 균체를 1회에 주입하는 경우와 동일한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 1회에 균체를 배양·주입할 수 없는 광범위한 오염현장에도 소량의 배양액을 반복하여 첨가함으로써 본 발명의 미생물을 사용할 수 있다.
실시예 11
1OOml의 바이알에 바람직한 농도의 트리클로로에틸렌으로 인공적으로 오염시킨 사립토(sand grain soil, 공기-건조) 30g을 넣었다. 토양의 오염농도는 15, 30, 45, 100 및 150mg/kg으로 설정하였다. 본 발명의 미생물을 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 15, 30 및 45ml의 NMS 배지에서 30℃로 3일간 쉐이크배양한 후, 원심분리로써 집균하여 균체현탁액 첨가후의 토양의 함수율이 25%가 되는 적량의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액(페놀은 함유하지 않음)을 토양에 첨가후, 바이알을 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐하여 알루미늄 캡으로 밀봉하고 30℃에서 일정기간 정치하였다. 토양 중의 균체밀도는 15, 30 및 45ml의 배양액에 대하여 각각 9.4×108, 1.9×109및 2.8×109cfu/g 습한 토양이었다.
그 후, 30g의 토양이 들어간 바이알에, 활성탄을 통과시킨 공기로 폭기한50ml의 탈이온수, 10ml의 n-헥산을 첨가하여 마개를 막았다. 이 바이알을 초음파 세정기 중에서 10분간 초음파 처리하고 나서 쉐이크기로 10분간 쉐이크하였다. 분리한 n-헥산을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다. 결과는 도 17에 나타낸 바와 같이, 토양 중에서 약 150mg/kg의 매우 높은 농도의 트리클로로에틸렌이 분해되었다. 상기 결과에 따르면, 토양에 첨가하는 균체량에 비례하여 트리클로로에틸렌의 분해량이 증가하므로, 오염농도가 높은 경우(l50mg/kg 정도)에도 첨가하는 균체량을 늘리거나 또는 계속 첨가하면 효과적으로 정화할 수 있었다.
실시예 12
테플론 코팅된 고무마개로 밀폐할 수 있는 1OOml의 바이알에 인공적으로 트리클로로에틸렌으로 오염시킨 사질토(공기-건조)를 30g 넣었다. 본 발명에 따른 균주를 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 NMS 배지에서 30℃로 3일간 쉐이크 배양한 후, 원심분리로써 집균하여 균체현탁액 첨가후의 토양의 함수율이 25%, 접종균체량이 108내지 109cells/g 습한 토양 이 되는 적량의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액(페놀은 함유하지 않음)을 토양에 첨가후, 바이알을 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐하여 30℃에서 일정기간 정치하였다.
그 후, 30g의 토양을 넣은 바이알에, 활성탄을 통과시킨 공기로 폭기한 50ml의 탈이온수, 10ml의 n-헥산을 첨가하여 마개를 막았다. 이 바이알을 초음파 세정기 중에서 10분간 초음파 처리하고 나서 쉐이크기로 10분간 쉐이크하였다. 분리한 n-헥산을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다. 토양 중의 트리클로로에틸렌 농도의 시간 경과에 따른 변화는 동시에 다수 샘플을 준비하여 일정 시간 경과마다 일부 샘플의 전량에 대하여 추출조작을 행하여 측정하였다. 추출까지는 4℃에서 보관하였다.
또한, 토양 중의 트리클로로에틸렌 농도의 측정은, 토양의 오염에 관한 환경기준(토양환경기준)에 나타난 방법으로 하였다. 즉, 토양시료와 용매(순수한 물에 염산을 첨가하여 pH가 5.8 내지 6.3이 되도록 조절하였다)를 중량체적비 10%의 비율로 미리 교반 막대를 넣은 나사소켓 부착 삼각 플라스크에 첨가하고, 신속하게 마개를 막았다. 이 때, 혼합액 체적이 500ml 이상 되도록 하고, 혼합액 체적에 대한 나사 소켓 부착 삼각플라스크의 헤드 스페이스를 최소화하였다. 그 조제한 시료액을 상온·상압으로 유지하여 자석 막대로 4시간 연속교반하였다.
이 시료액을 30분 정도 정치후, 유리 주사기에 빨아들였다. 공동 크기 0.45μ인 멤브레인 필터를 장착한 여과지 홀더를 주사기에 접속하여, 플런저를 눌러 공기 및 처음 수ml의 액체를 배출한 후, 마개 부착 시험관에 여과액을 분취하고, 정량에 필요한 양을 달아 가스크로마토그래피로 분석하였다. 결과는 도 18에 나타낸 바와 같이, 토양 중의 트리클로로에틸렌은 균체 첨가후 1일에 전량의 90% 정도가 분해되었다.
따라서, 본 미생물을 토양에 첨가하여 트리클로로에틸렌을 정화하는 방법은 토양중 18mg/kg 정도의 트리클로로에틸렌을 1일에 거의 분해할 정도의 높은 정화능력을 가지는 기술인 것이 판명되었다. 또한, 정치 7일 후 토양 시료를 국가가 정한 분석방법(토양의 오염에 관한 환경기준, 토양환경기준)에 따라서 측정한 결과,트리클로로에틸렌의 농도는 기준치(0.03ppm) 이하였다. 그 결과, 본 발명의 미생물을 이용하여 오염토양을 정화함으로써, 트리클로로에틸렌을 환경기준을 만족시키는 수준까지 정화할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 진공 추출법 등의 물리적인 처리법에서는 일반적으로 저농도로부터 정화할 수 없다고 알려져 있으나, 본 발명의 미생물을 이용함으로써 기준치 이하까지 정화할 수 있다.
실시예 13
1OOml의 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐할 수 있는 바이알에 인공적으로 트리클로로에틸렌으로 오염시킨 사질토(공기-건조)를 30g 넣었다. 본 발명의 미생물을 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 NMS 배지에서 30℃로 3일간 쉐이크 배양한 후, 원심분리로써 집균하여 균체 현탁액 첨가후 토양의 함수율이 25%, 접종균체량이 108내지 109cells/g 습한 토양 이 되는 적량의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액(페놀은 함유하지 않음)을 토양에 첨가후, 바이알을 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐하여 30℃에서 일정기간 정치하였다. 그 후, 토양 중 트리클로로에틸렌의 분해에 따라 생성된다고 알려진 부산물을 분석하였다.
토양 중의 부산물의 분석은 다음과 같이 실시하였다. 비닐 클로라이드, 1,1-디클로로에틸렌, 시스-1,2-디클로로에틸렌 및 트랜스-1,2-디클로로에틸렌은 도 19의 방법으로 분석하였다. 디클로로아세테이트와 트리클로로아세테이트, 트리클로로에탄올, 및 수화클로럴은 각각 도 20, 21 및 22에 기재된 방법으로 분석하였다. 결과는 표 8에 나타낸 바와 같이 모든 부산물이 검출한계 이하였다.
혐기적 조건 하에서의 트리클로로에틸렌의 탈염소반응에서는 독성이 더 높은 디클로로에틸렌류가 축적된다. 또한, 호기적 조건 하에서의 트리클로로에틸렌 산화물의 생성을 시발로 하는 분해과정에서는 디클로로 아세테이트 등이 중간 생성물로 생성되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 미생물이 토양 중 트리클로로에틸렌을 분해할 때 유해한 물질은 축적되지 않았다. 측정한 물질 이외의 존재는 불명확하나, 이 기술의 안전성은 높다고 시준되었다.
분 석 시 험 항 목 결 과 검 출 한 계
비닐 클로라이드 검출되지 않음 0.01ppm
1,1-디클로로에틸렌 검출되지 않음 0.01ppm
시스-1,2-디클로로에틸렌 검출되지 않음 0.01ppm
트랜스-1,2-디클로로에틸렌 검출되지 않음 0.01ppm
디클로로아세테이트 검출되지 않음 0.05ppm
트리클로로에탄올 검출되지 않음 0.01ppm
트리클로로아세테이트 검출되지 않음 0.05ppm
수화클로럴 검출되지 않음 0.05ppm
실시예 14
1OOml의 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐할 수 있는 바이알에 인공적으로 트리클로로에틸렌으로 오염한 사질토(공기-건조)를 30g 넣었다. 본 발명의 미생물을 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 NMS 배지에서 30℃로 3일간 쉐이크 배양한 후, 원심분리로써 집균하여 균체현탁액 첨가후의 토양의 함수율이 25%, 접종균체량이 108내지 109cells/g 습한 토양이 되는 적량의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액은 샬레에 넣어 두께가 1mm 정도로 되도록 산포한 후, 광원으로부터 40cm의 위치에 두고 60초 이상, 파장 260nm·15W의 자외선 램프를 조사하여 살균하였다. 본 발명의 미생물 현탁액(페놀은 함유하지 않음)을 토양에 첨가한 후,바이알을 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐하고 30℃에서 일정기간 정치하였다.
그 후, 30g의 토양을 넣은 바이알에, 활성탄을 통과시킨 공기로 폭기한 50ml의 탈이온수, 10ml의 n-헥산을 첨가하여 마개를 막았다. 상기 바이알을 초음파 세정기 중에서 10분간 초음파 처리하고 나서 쉐이크기로 10분간 쉐이크하였다. 분리한 n-헥산을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다. 또, 살균처리한 균체현탁액을 NYG 배지에 1/100량 접종 또는 NYG 한천배지에 원액대로 도말하여 30℃로 배양을 행하였으나, 배양액 탁도의 상승 또는 콜로니의 형성은 전혀 관찰되지 않아, 완전히 살균된 것이 확인되었다. 결과는 도 23에 나타낸 바와 같이 사균과 생균에서 동등한 트리클로로에틸렌 분해가 나타났다.
미생물에 의한 오염토양의 정화에 있어서는, 생균을 토양에 첨가하고 있는 예가 대부분이나, 균체를 토양에 첨가하는 것은 현 시점에서 대중의 용인 면에서 곤란하다. 또한, 특정한 미생물을 환경 중에 방출함으로써 생태계에 큰 영향을 미칠 가능성이 있다고 우려되고 있다. 그러나, 살균처리에 의해 완전히 증식능력을 상실한 미생물의 산포는 단순한 유기물의 산포와 같아, 생태계에 미치는 영향이 거의 없을 것으로 생각된다. 따라서, UV를 조사함으로써 분해균을 사멸시켜 토양에 첨가한 경우에 대하여 검토하였다. 그 결과, 사균체 첨가는 매우 유용한 방법으로 판명되었다.
또한, 일본국 특개 평8(1996)-3012에 개시된 발명에는, 분해균을 파쇄하여 토양에 산포함으로써 생태계에 미치는 영향을 최소화할 수 있다고 하였다. 그러나, 미생물의 파쇄조작은 대규모 장치, 시간 및 수고를 요하므로, 오염토양에 대하여 대량으로 분해균을 산포하는 것은 실질적으로 어렵다는 것을 쉽게 예상할 수 있다. 또한, 공지의 트리클로로에틸렌 산화효소는 조효소로서 NAD를 필요로 한다. 그러나, 조효소의 가격이 매우 비싸므로, 조효소를 균체 파쇄에 의하여 균체로부터 유리한 효소의 분해반응에 필요한 농도로 공급하는 것은 극히 어렵다. 한편, 본 발명의 미생물을 이용한 방법에서는 그러한 문제가 없고, 저렴한 비용으로 생태계에 미치는 영향을 최소화하여 트리클로로에틸렌 등의 정화할 수 있다.
실시예 15
1OOml의 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐할 수 있는 바이알에 인공적으로 트리클로로에틸렌으로 오염한 사립토(공기-건조)를 30g 넣었다. 본 균주를 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 NMS 배지에서 30℃로 3일간 쉐이크 배양한 후, 원심분리로써 집균하여 균체현탁액 첨가후의 토양의 함수율이 25%, 접종균체량이 108내지 109cells/g 습한 토양이 되는 적량의 NMS 배지에 재현탁하였다. 균체 현탁액은 샬레에 넣어 두께가 1mm 정도로 되도록 산포한 후, 광원으로부터 40cm의 거리에서 60초 이상, 파장 260nm·15W의 자외선 램프로 조사하여 살균하였다.
본 발명의 살균된 균체현탁액(페놀은 함유하지 않음)을 토양에 첨가 후, 바이알을 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐하여 30℃에서 일정기간 정치하였다. 그후, 토양 중의 트리클로로에틸렌을 분해시킨 후, 트리클로로에틸렌 분해에 따라 생성된 것으로 생각되는 부산물을 실시예 13과 유사한 방법으로 분석하였다. 또한, 살균처리한 균체현탁액을 NYG 배지에 1/100량 접종 또는 NYG 한천배지에 원액대로 도말하여 30℃로 배양한 실험에서, 배양액 탁도의 상승 또는 콜로니의 형성이 관찰되지 않아, 완전히 살균된 것으로 확인되었다.
결과는 표 9에 나타낸 바와 같이 어느 부산물이나 검출한계 이하였다. 혐기적 조건 하에서의 트리클로로에틸렌의 탈염소 반응에서는 보다 독성이 높은 디클로로에틸렌류가 축적된다. 또, 호기적 조건 하에서 트리클로로에틸렌 옥사이드의 생성을 시발로 하는 분해과정에서는 디클로로아세테이트 등이 중간생성물로서 형성되는 것이 알려져 있다. 본 미생물이 토양 중의 트리클로로에틸렌을 분해할 때 유해한 물질의 축적은 보이지 않았다. 측정한 물질 이외의 존재는 불명확하나, 사균체를 이용한 경우도 이 기술의 안전성은 높다고 시준되었다.
분 석 시 험 항 목 결 과 검 출 한 계
비닐 클로라이드 검출되지 않음 0.01ppm
1,1-디클로로에틸렌 검출되지 않음 0.01ppm
시스-1,2-디클로로에틸렌 검출되지 않음 0.01ppm
트랜스-1,2-디클로로에틸렌 검출되지 않음 0.01ppm
디클로로아세테이트 검출되지 않음 0.05ppm
트리클로로에탄올 검출되지 않음 0.01ppm
트리클로로아세테이트 검출되지 않음 0.05ppm
포수클로럴 검출되지 않음 0.05ppm
실시예 16
1OOml의 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐할 수 있는 바이알에 인공적으로 트리클로로에틸렌으로 오염한 사질토(공기-건조)를 30g 넣었다. 본 발명의 미생물을 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 NMS 배지에서 30℃로 3일간 쉐이크 배양한 후, 원심분리로써 집균하여 균체현탁액 첨가후의 토양의 함수율이 25%, 접종균체량이 108내지 109cells/g 습한 토양이 되는 적량의 NMS 배지에 재현탁하였다. 본 발명의 균체현탁액(페놀은 함유하지 않음)을 토양에 첨가후, 바이알을 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐하여 20℃에서 일정기간 정치하였다.
그 후, 30g의 토양을 넣은 바이알에, 활성탄을 통과시킨 공기로 폭기한 50ml의 탈이온수, 10ml의 n-헥산을 첨가하여 마개를 막았다. 그것을 초음파 세정기 중에서 10분간 초음파 처리하고 나서 쉐이크기로 10분간 쉐이크하였다. 분리한 n-헥산을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다.
결과는 도 24에 나타낸 바와 같이, 20℃의 경우에서도 30℃의 경우와 마찬가지로 트리클로로에틸렌이 분해되었다. 트리클로로에틸렌은 실제의 토양온도에서도 충분히 분해되는 것으로 제시되었으므로, 본 발명의 미생물이 다른 것에 비하여 실용성이 높은 것으로 판명되었다.
실시예 17
100ml의 바이알에 인공적으로 트리클로로에틸렌으로 오염한 사립토(공기-건조)를 30g 넣었다. 본 발명의 미생물을 500ppm의 페놀과 0.05%의 효모추출물을 첨가한 NMS 배지에서 30℃로 1일간 쉐이크 배양하였다. 토양 중에 각각 500ppm·0.02%·1mM 페놀, 효모추출물 및 글루코오스를 함유한 NMS 배지(또는 PH 배지)에 배양액 1/100 체적량을 첨가한 후, 토양에 첨가하였다. 배양액 첨가시 균체밀도는 106cells/g 습한 토양, 함수율은 25%로 하였다.
바이알은 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐후, 30℃에서 소정 기간 정치하였다. 그 후, 30g의 토양을 넣은 바이알에, 활성탄을 통과시킨 공기로 폭기한 50ml의 탈이온수, 10ml의 n-헥산을 첨가하여 마개를 닫았다. 그것을 초음파 세정기 중에서 10분간 초음파 처리하고 나서, 쉐이크기로 10분간 쉐이크한 후, 분리한 n-헥산을 ECD 검출기가 부착된 가스크로마토그래피로 분석하였다.
결과는 도 25에 나타낸 바와 같이, 토양 중 트리클로로에틸렌은 NMS 배지 및 PH 배지에서 약 14mg/kg 에서 약 1mg/kg 까지 유사하게 감소하였다. 토양 중에 페놀을 첨가하였으므로, 토착 미생물에 의해 트리클로로에틸렌이 감소하였으나, 상기 결과에 따르면, MO7주를 첨가하여 더욱 우수한 효과가 나타났다. 따라서, 상기 주는 살균 배양배지 중에서 뿐 아니라 토착 미생물이 살아있는 자연환경에서도 효과를 나타낼 수 있는 것은 명백하다. MO7주는 자연환경 하에서도 약 106cells/g-습한 토양의 페놀을 첨가함으로써 활성이 충분히 유도되는 것을 확인하였다.
실시예 18. 구성변이주의 형성
1.5%의 한천을 첨가한 평판 배지에 옮겨 저장한 본 발명의 미생물의 콜로니를 백금귀부로 조균하여, 2ml의 1/3LB 배지(조성은 표 10에 기재)를 넣은 시험관에 접종하였다. 30℃·130r.p.m.에서 밤새 쉐이크 배양한 후, 배양액의 일부를 적당히 희석하여 1.5%의 한천을 함유하는 1/3LB 배지에 도말하였다. 30℃에서 배양하여 균수를 측정하였다. 나머지 배양액을 샬레에 넣은 후, 광원으로부터 30cm의 위치에서 파장 260nm·15W의 자외선 램프로 3분간 조사하였다.
1/3LB 배지
트립톤 3.0g
효모추출물 1.5g
염화나트륨 3.0g
증 류 수 1.0L
그 후, 그 배양액을 적당히 희석하여 1.5%의 한천을 첨가한 1/3LB 배지의 평판 배지에 도말하였다. 30℃에서 배양하여 균수를 측정하여, 사멸율을 구하였다. 99% 이상의 사멸율이 얻어진 경우에 충분한 변이가 있는 것으로 간주하였다. 이 때의 균체배양액으로부터 바람직한 변이주를 선발하였다.
카테콜 2,3-디옥시게나아제(C23O)는 카테콜에 산소를 도입하여, 카테콜을 메타분열에 의한 2-히드록시무콘산 세미알데히드를 생성한다. 이 물질은 황색이다. 콜로니에 카테콜을 분무하여 이 C23O가 발현하면 콜로니는 신속하게 황변한다. 페놀-분해성 트리클로로에틸렌-분해균의 트리클로로에틸렌 분해효소는 페놀을 카테콜로 변환시키는 페놀 히드록시라아제(PH)로 공지되어 있다(M.Fujita et al., J.Ferment. Bioeng.,79:100, 1995; V.Shingler et al., J.Bacteriol.,174:711, 1992).
C23O 자체는 트리클로로에틸렌의 분해에 직접적으로 관여하고 있지 않으나, C23O 유전자와 PH 유전자가 인접하여 하나의 오페론으로부터 발현되는 예가 알려져 있다(M.Fujita et al., J.Ferment. Bioeng.,79:100, 1995; V.Shingler et al., J.Bacteriol.,174:711, 1992). C23O이 이 PH와 연계하여 발현된다면, 이 C23O의 발현을 지표로 하여 트리클로로에틸렌 분해효소 발현주를 선발할 수 있다. 본 발명의 미생물은 유일한 탄소원으로서 페놀을 사용하여 배양하면, 페놀을 분해하고, 균의 증식에 따라 배양액은 황변되므로, 상기 선별 방법을 미생물에 적용할 수 있다.
따라서, 변이 후 균체현탁액을 적당히 희석하여 1.5%의 한천을 첨가한 1/3LB 배지의 평판 배지 위에 도말하였다. 30℃에서 1일 내지 3일간 배양 후, 카테콜 용액(0.1%(w/v) 에테르 용액)을 분무하였다.
그 결과, 사멸율이 99.99%인 경우, UV 조사후에 출현한 약 10,000 콜로니를 검색하여, 16개의 황색 콜로니를 선발하였다.
그 콜로니를 1/3LB 액체 배지에서 배양후, 1.5%의 한천을 첨가한 1/3LB 배지의 평판 배지 위에 도말하였다. 30℃에서 배양 후, 출현한 콜로니에 카테콜 용액을 분무하고, 황색 콜로니를 다시 분리하여 C23O 구성발현주를 얻었다.
20ml 바이알에 넣은 4ml의 글루탐산 나트륨(0.1%)을 함유한 M 배지(조성은 표 11에 기재)에, 이들 C23O 구성발현주를 백금귀부로 조균하여 접종하였다. 바이알은 부틸고무마개를 하여 알루미늄 캡으로 밀봉한 후, 30℃로 2일간 쉐이크배양하였다. 그 후, 모두가 액상 중에 용해된 경우에 30ppm이 되게하는 양의 트리클로로에틸렌을 첨가하였다. 30℃로 5일간 쉐이크 배양후, 트리클로로에틸렌 농도를 실시예 6과 같이 측정하였다.
M 배지
질산암모늄 3.0g
인산수소이나트륨 2.2g
인산이수소칼륨 0.8g
황산철(Ⅱ)7수화물 10.0mg
황산칼슘2수화물 10.0mg
황산마그네슘7수화물 10.0mg
효모추출물 50.0mg
증 류 수 1.0L, pH7.0
그 결과, 친주인 MO7주는 트리클로로에틸렌을 거의 분해하지 않았으나, C23O 구성발현주 중 몇 개는 30ppm 트리클로로에틸렌을 52 내지 34% 분해하였다. 이들 미생물은 친주 MO7주에서 유래하며 페놀을 필요로 하지 않고 트리클로로에틸렌을 분해할 수 있는 변이주로 밝혀졌다.
이어서, 트리클로로에틸렌의 분해활성이 가장 높은 MO715주를 이용하는 실시예를 참조하여, 토양 중 트리클로로에틸렌의 분해를 설명한다.
실시예 19. 구성변이주에 의한 트리클로로에틸렌의 분해
실시예 9와 같이, 트리클로로에틸렌 인공오염 토양(11mg/kg 토양)을 제작하였다. MO715주를 글루탐산 나트륨(0.1 w/v%)을 함유하는 100ml의 M 배지에서 30℃로 2일간 쉐이크배양한 후, 원심분리에 의해 집균하여 첨가후의 토양의 함수율이 25%가 되는 적량의 M 배지에 재현탁하였다. 균체현탁액(페놀은 함유하지 않음)을 토양에 첨가후, 바이알을 테플론 코팅된 고무마개로 밀폐하고 30℃에서 일정기간 정치하였다. 트리클로로에틸렌을 실시예 9와 유사한 방법으로 분석하였다. 또한, 페놀에서 배양한 배양액 및 MO7주를 유사한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 글루탐산 나트륨에서 배양한 MO715주 균체현탁액을 첨가후, 트리클로로에틸렌은 12시간후 35% 정도, 48시간후 60% 정도로 분해되었다. 이 때, 글루탐산 나트륨에서 배양한 MO7주는 트리클로로에틸렌을 거의 분해하지 않았다. 따라서, 본 미생물은 유도를 위해 페놀을 필요로 하지 않고 토양 중에서도 트리클로로에틸렌을 분해하는 것이 명확해졌다.
전기한 바로부터, 본 발명은 환경 중에 페놀 등의 유해물질을 산포하지 않고트리클로로에틸렌을 분해할 수 있으므로 안전성이 매우 높은 기술이다.
부다페스트 조약하에 미생물의 국제 기탁을 참조
국제 기탁국: 공업기술원 생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-technology Agency of Industrial Science and Technology)
주소: 1-3, 히가시 1-초메, 슈쿠바-시, 이바라키, 305, 일본국
균주 기탁 번호 기탁일
MO7 FERM BP-5624 1996년 8월 12일.
MO715 FERM BP-5928 1997년 4월 24일
서열표
서열번호 : 1
서열의 길이 : 19
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : 합성 DNA
서열 : GAGTTTGATC CTGGCTCAG
서열번호 : 2
서열의 길이 : 27
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : 합성 DNA
서열 : AGAAAGGAGG TGATCCAGCC GCAGGTT
서열번호 : 3
서열의 길이 : 16
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : 합성 DNA
서열 : GGCCGGACGG GTGAGT
서열번호 : 4
서열의 길이 : 15
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : 합성 DNA
서열 : TACGGGAGGC AGCAG
서열번호 : 5
서열의 길이 : 17
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : 합성 DNA
서열 : GTGCCAGCAG CCGCGCG
서열번호 : 6
서열의 길이 : 18
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : 합성 DNA
서열 : GATTAGATAC CCTGGTAG
서열번호 : 7
서열의 길이 : 18
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류: 합성 DNA
서열 : ACTCAAAGGA ATTGACGG
서열번호 : 8
서열의 길이 : 16
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : 합성 DNA
서열 : GCAACGAGCG CAACCC
서열번호 : 9
서열의 길이 : 16
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 1개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : 합성 DNA
서열 : TGTACACACC GCCCGT
서열번호 : 10
서열의 길이 : 1422
서열의 종류 : 핵산
체인의 수 : 2개 체인
형태 : 선형
분자 종류 : cDNA
본 미생물은 24시간에 30ppm의 트리클로로에틸렌을 분해할 수 있고, 100ppm의 트리클로로에틸렌을 50% 분해할 수 있다.

Claims (5)

  1. 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물의 분해 방법에 있어서,
    유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 분해할 수 있는 미생물의 배양균체 살균처리물을 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물에 작용하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 함유하는 토양, 폐수 또는 기타 폐기물 중의 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물의 분해방법에 있어서,
    상기 유기 할로겐 화합물 및/또는 방향족 화합물을 분해할 수 있는 미생물의 배양균체 살균처리물을 상기 토양, 폐수 또는 기타 폐기물에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 살균처리가 자외선 조사인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 방향족 화합물이 페놀성 화합물이며, 상기 유기 할로겐 화합물이 트리클로로에틸렌인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 미생물이 MO7주(FERM BP-5624) 또는 MO715주(FERM BP-5928)인 것을 특징으로 하는 방법.
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