DE4311981A1

DE4311981A1 - Mikrobielle Mischkultur zum Abbau von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, insbesondere aus Teerölen

Info

Publication number: DE4311981A1
Application number: DE4311981A
Authority: DE
Inventors: Guenter Dr Dreyer; Manfred Prof Dr Ringpfeil; Miklos Dipl Ing Szigetvari
Original assignee: Biopract GmbH
Current assignee: Biopract GmbH
Priority date: 1992-07-23
Filing date: 1993-04-07
Publication date: 1994-02-17

Description

Die Erfindung betrifft eine mikrobielle Mischkultur zum Abbau von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, insbesondere aus Teerölen. Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Selektion einer solchen Mischkultur. Anwendungsgebiet der Erfindung ist der Umweltschutz.

Bei den bekannten Verfahren der biologischen Bodensanierung werden durch den Stoffwechsel von Mikrooranismen zahlreiche, insbesondere biologisch leicht abbaubare Schadstoffe eliminiert. Biologisch schwer abbaubare Bodenverunreinigungen wie polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) aus Steinkohlen- und Braunkohlenteerölen mit mehr als 4 aromatischen Ringen werden, wenn überhaupt, nur in sehr langen Zeiträumen aus den Böden entfernt.

Gegenwärtig sind einige Mikroorganismen bekannt, die zur Degradation polycylischer aromatischer Kohlenwasserstoffe im Molekulargewichtsbereich von Naphthalin (2 Ringe) bis Pyren (4 Ringe) befähigt sind (Cerniglia, C.E.; Heitkamp, M.A. und Varanasi, U. (Ed): Metabolism of PAH in the aquatic environment. CRC Press, Boca Raton, 1989, S. 41-68; Weißenfels, W.D. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 528, 1989); über die Biodegradation auch höher kondensierter PAK wird von Park berichtet (Park, K.S. et al, J. Environ. Eng. 116-3, 632, 1990). Die meisten Untersuchungen zur Biodegradation der PAK wurden in Einkomponentensystemen durchgeführt und hatten das Ergebnis, daß die Geschwindigkeit der Degradation mit wachsender Zahl der aromatischen Ringe im Molekül stark abfällt. Wenig bekannt ist über die Biodegradation komplexer Mischungen von PAK (Cerniglia, C.E.; Intern. Symp.: Soil Decontamination Using Biological Processes, Karlsruhe, 6.-9. Dez. 1992).

Aus diesen Gründen ist es bisher noch nicht gelungen, ein effektives Verfahren zur Sanierung von mit Teeröl oder anderen, PAK enthaltende Gemischen verunreinigten Böden zu entwickeln.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, Mikroorganismen aufzufinden, die in komplexer PAK-Mischung, insbesondere auch mit den schwer abbaubaren mehrkernigen PAK aus Teerölen als einziger Kohlenstoffquelle, vermehrt werden können. Diese Mikroorganismen sollen isoliert, vermehrt und in eine anwendungsbereite Form gebracht werden und danach zur Reinigung teerölkontaminierter Böden, Gewässer, Hölzer und anderer Materialien in der Lage sein.

Die Aufgabe der Erfindung wird mit einer mikrobiellen Mischkultur gelöst, die 2 Bakterienstämme der Gattung Pseudomonas enthält, deren Wachstumsgeschwindigkeit sich mindestens um den Faktor 2 unterscheidet. Bevorzugt ist ein Gemisch von einem Stamm der Art Pseudomonas putidas und einem Stamm der Art Pseudomonas spec. im Verhältnis 70 : 30 bis 30 : 70. Ein spezielle Ausführungsform der Erfindung ist das Gemisch aus Pseudomonas putida Teer A und dem bisher nicht beschriebenen Pseudomonas spec. Teer B, welche bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter den Nummern DSM 7248 und DSM 7249 hinterlegt wurden.

Die erfindungsgemäße mikrobielle Mischkultur wird durch das nachfolgend beschriebene Selektionsverfahren gewonnen. Dieses Verfahren besteht aus 4 Schritten:

- Emulgierung von Teeröl mittels Ultraschall in einer wäßrigen Lösung von Hefeextrakt und Pepton; beide dienen zugleich als Emulgatoren und als Wachstumssubstrate (keine Verwendung weiterer Emulgatoren),
- Zugabe von Belebtschlamm aus Kläranlagen und/oder Bodenproben als Ausgangskultur,
- Kontinuierliche Fermentierung mit einer Verweilzeit der Nährlösung von etwa 10 Stunden und einer Steigerung des Teerölgehaltes von 0,1% in geometrischer Reihe auf über 1%,
- Adaption der vorzugsweise vermehrten Mischkultur an Teeröl als einziger Kohlenstoffquelle.

Danach wird das Restteeröl durch Ausschütteln mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff, bevorzugt Toluen, entfernt und die Kultur durch Zentrifugation konzentriert. Die Kultur ist danach transport- und lagerfähig. Die Lagerung erfolgt bevorzugt nach Aufschwemmung in einer Pufferlösung von pH 5 bis pH 8, bevorzugt pH 7, unter Zugabe von Frostschutzmitteln und Einschweißung in Kapillaren unter flüssigem Stickstoff als Gefrierkonserve.

Zur Anwendung wird die Gefrierkonserve mit einer naphthalinhaltigen Lösung aufgenommen und in einem Schüttelkolben oder einem belüfteten Kleinfermentor in einer teerölhaltigen Lösung angereichert und als Impfmaterial für die weitere Vermehrung in Fermentoren verwendet. Für den Einsatz zur biologischen Reinigung von teerölkontaminierten Böden und Gewässern oder teerölkontaminierten bzw. teerölimprägnierten Hölzern oder anderen Materialien ist es oftmals von Vorteil, die erfindungsgemäße Kultur an geeigneten Trägern zu fixieren.

Die erfindungsgemäße mikrobielle Mischkultur ist in der Lage, komplexe PAK-Mischungen, wie sie im Teeröl vorliegen, im Bereich von Naphthalin (2 aromatische Ringe) bis Benzo(a)pyren (5 aromatische Ringe) unabhängig von der Molekülgröße der PAK mit hoher Geschwindigkeit abzubauen. So werden unter Fermentations bedingungen (pH ∼7; T ∼30°C; Luftsättigung) in etwa 30 Stunden Naphthalin (2 Ringe), Acenaphthen, Fluoren, Phenanthren, Anthracen (3 Ringe), Fluoranthen (4 Ringe) und Benzo(a)pyren (5 Ringe) in einer Nährsalzlösung mit 0,5% Teerölgehalt als einziger Kohlenstoffquelle zu mehr als 90% abgebaut.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1 Selektion der mikrobiellen Mischkultur zum Abbau von PAK aus Teeröl

Die Selektion der Mischkultur erfolgt in 4 Schritten:

1. Emulgierung von Steinkohlenteeröl (TEWE Teerveredlung GmbH Erkner) mit Hefeextrakt und Pepton mittels Ultraschall. Hefeextrakt und Pepton dienen zugleich als Emulgatoren und zusätzliche Wachstumssubstrate. Komplettiert durch eine Salzmischung nach Heinritz, B. et al (J.Chem.Tech.Biotechnol. 49, 285-295, 1990) ergibt sich als Nährlösung:

Steinkohlenteeröl\|0,1%
Hefeextrakt	0,1%
Pepton	0,1%
NH₄Cl	6 g/l
KH₂PO₄	1,4 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,7 g/l
CuSO₄ · 5 H₂O	0,09 g/l
ZnCl₂	0,04 g/l
MnSO₄ · 4 H₂O	0,08 g/l
CoSO₄ · 7 H₂O	0,01 g/l
FeCl₃	0,001 g/l

2. Zugabe von Belebtschlamm aus einer industriellen Entphenolungsanlage als Ausgangskultur.
3. Kontinuierliche Fermentierung bei 30°C mit einer Verweilzeit der Nährlösung von etwa 10 Stunden und einer Steigerung des Teerölgehaltes in geometrischer Reihe von 0,1% bis auf mehr als 1%.
4. Adaption der vorzugsweise vermehrten Mischkultur an Steinkohlenteeröl als einziger Kohlenstoffquelle.

Beispiel 2 Beschreibung der Mischkultur

Die nach Beispiel 1 erhaltene Bakterienkultur wurde mehrfach auf Teeröl-Selektivagar ausgestrichen und bei 30°C inkubiert. Es wuchsen 2 Kolonietypen, die als Teer A und als Teer B bezeichnet wurden. Teer A benötigte etwa 2 Tage zum Wachstum auf Teerölmedium und hatte anfänglich helle, glatte Kolonien mit leichtem bräunlichen Zentrum. Teer B wuchs sehr langsam (ca. 5-6 Tage) und bildete runzelige, schleimige, bräunliche Kolonien. Die Reinkulturen wurden auf Teeröl-Selektivmedium gehalten und jeweils zur Identifizierung auf CASO (Merck) überimpft. Das Wachstum auf CASO erfolgte bei beiden Kulturen über Nacht, die Kolonieformen auf CASO waren wie folgt:
Teer A - dick, gelblich,
Teer B - dünn, glasig.

Der Stamm Teer A kann aufgrund der Hauptchinonkomponente und des Fettsäuremusters der Art Pseudomonas putida zugeordnet werden.

Der Stamm Teer B kann aufgrund der Lipochinone und des Fettsäuremusters den echten Pseudomonaden zugeordnet werden.

Beispiel 3 Abbau der PAK-Hauptkomponenten und des Benzo(a)pyrens aus Teeröl

Für einen 2,5 Liter Fermentoransatz mit 0,5% Teerölgehalt wurden zunächst 12,5 ml Steinkohlenteeröl (TEWE) Teerveredlung GmbH Erkner) in ca. 40 ml Wasser mit jeweils 5 g Hefeextrakt und Pepton mittels Ultraschall emulgiert und mit einer Salzlösung nach Heinritz, B. et al; J. Chem. Tech. Biotechnol. 49, 285, 1990/ auf 2 Liter aufgefüllt. Das Animpfen des Fermentors erfolgte mit der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Mischkultur, die die Pseudomonas putida (DSM 7248) und Pseudomonas spec. (DSM 7249) zu etwa gleichen Anteilen enthält.

Die Ergebnisse der Fermentation sind in den folgenden Abbildungen dargestellt.

Abb. 1: Biodegradation der Hauptkomponenten einer 0,5% Teerölemulsion im 2,5-Liter Fermentor bei 30°C (Die Ordinatenwerte entsprechen den Flächen der Komponenten im HPLC- Chromatogramm und sind den aktuellen Konzentrationen proportional).

Abb. 2: HPLC-Chromatogramm der Hauptkomponenten einer 0,5% Teerölemulsion zu Beginn der Fermentation im 2,5-Liter Fermentor.

Abb. 3: HPLC-Chromatogramm der Hauptkomponenten nach 30,5- stündiger Fermentation bei 30°C:
Abbau von ca. 94% der Hauptkomponenten (Mittlere Abbaugeschwindigkeit: 0,385 g/h).

Abb. 4: HPLC-Chromatogramm des Benzo(a)pyrens in einer 0,5% Teerölemulsion zu Beginn der Fermentation im 2,5-Liter Fermentor.

Abb. 5: HPLC-Chromatogramm des Benzo(a)pyrens nach 30,5- stündiger Fermentation bei 30°C: Abbau von ca. 94% des Benzo(a)pyrens (Mittlere Abbaugeschwindigkeit: 0, 215 10 g/h).

Claims

1. Mikrobielle Mischkultur zum Abbau von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, insbesondere aus Teerölen, gekennzeichnet durch 2 Bakterienstämme der Gattung Pseudomonas mit einer mindestens um den Faktor 2 unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeit.

2. Mikrobielle Mischkultur nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Gemisch eines Stammes der Art Pseudomonas putida und eines Stammes der Art Pseudomonas spec., die im Mengenverhältnis von 70 : 30 bis 30 : 70 vorliegen.

3. Mikrobielle Mischkultur nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch das Gemisch von Pseudomonas putida Teer A (DSM 7248) und Pseudomonas spec. Teer B (DSM 7249).

4. Pseudomonas putida Teer A (DSM 7248).

5. Pseudomonas spec. Teer B (DSM 7249).

6. Verfahren zur Selektion einer teerölabbauenden mikrobiellen Mischkultur, dadurch gekennzeichnet, daß Teeröl mechanisch in einer wäßrigen Lösung von Hefeextrakt und/oder Pepton emulgiert wird und mit Belebtschlämmen aus Kläranlagen und/oder Erdproben als Ausgangskultur bei kontinuierlicher Fermentierung und schrittweiser Steigerung des Teerölgehaltes aerob abgebaut und die vorzugsweise vermehrte Mischkultur an Teeröl als einziger Kohlenstoffquelle adaptiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die selektierte teerölabbauende Mischkultur nach der Entfernung des Restteeröls durch Ausschütteln mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff, bevorzugt Toluen, anschließender Konzentrierung durch Zentrifugation und Aufschwemmung in einer Pufferlösung von pH 5 bis pH 8, bevorzugt pH 7, unter Zugabe von Frostschutzmitteln in Kapillaren eingeschweißt und in flüssigem Stickstoff als Gefrierkonserve gelagert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefrierkonserve mit einer naphthalinhaltigen Lösung aufgenommen und in einem Schüttelkolben oder einem belüfteten Kleinfermentor in einer teerölhaltigen Nährlösung angereichert und als Impfmaterial für die weitere Vermehrung in Fermentoren verwendet wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die selektierte teerölabbauende Mischkultur an geeigneten Trägermaterialien lebend fixiert wird.

10. Verwendung der mikrobiellen Mischkultur nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur biologischen Reinigung von teerölkontaminierten bzw. teerölimprägnierten Hölzern oder anderen Materialien.