KR20000057662A - 니트릴 및/또는 아미드 화합물의 해독방법 - Google Patents

니트릴 및/또는 아미드 화합물의 해독방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 니트릴 잔기를 아미드 또는 산 잔기로 전환시킬 수 있는 유도된 미생물 균주의 순수 배양균을 이용하여 니트릴 화합물을 상응하는 아미드 또는 산 화합물로 전환시킴에 의한, 니트릴 화합물의 혼합물, 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법을 기재한다. 아미드가 혼합물에 형성되거나 존재하면, 아미드는 본 해독방법을 이용하여 상응하는 산으로 추가 전환시킬 수 있다. 이어서, 산은 필요에 따라 CO2, H2O 및 바이오매스로 추가 분해시킬 수 있다. 유도된 순수 배양균은 전형적으로 니트릴 생산 폐 스트림에 고농도로 존재하는 니트릴 혼합물 또는 니트릴과 아미드의 혼합물을 해독시킬 수 있다. 본 발명은 또한, 니트릴 잔기를 아미드 또는 산 잔기로 전환시킬 수 있는 유도된 미생물 균주의 유도된 순수 배양균을 이용하여, 불필요한 니트릴 화합물을 함유하는 아세트아미드 또는 아크릴아미드 제제와 같은 아미드 제제로부터 니트릴 화합물의 제거방법을 기재한다. 본 발명은 또한 유용한 미생물 균주를 함유하는 해독용 키트 및 바이오필터 및 이들의 사용방법에 대해서도 기재한다.

Description

니트릴 및/또는 아미드 화합물의 해독방법{METHODS FOR THE DETOXIFICATION OF NITRILE AND/OR AMIDE COMPOUNDS}
니트릴은 아민, 아미드, 아미딘, 카복실산, 에스테르, 알데히드, 케톤, 이민, 및 헤테로사이클릭 화합물을 포함한 광범위의 각종 화합물의 합성에 사용될 수 있는 대단히 용도가 넓은 화합물이다. 가장 중요하고 상업적으로 중요한 니트릴 중 하나는 통상적인 용매인 아세토니트릴이다. 기타 니트릴 화합물은 제초제로서 또는 세제나 방부제의 합성에 사용되고 있다. 가장 상업적으로 중요한 니트릴의 다른 하나는 아크릴로니트릴로서 이는 아크릴아미드, 아크릴산, 아크릴 섬유, 공중합체 수지 및 니트릴 고무의 제조에 사용되고 있다.
아크릴로니트릴 생산방법 중 하나는 SOHIO/BP 공정을 사용하는 것인데, 이러한 방법은 촉매 존재하에 공기 중에서 암모니아 증기에 의한 프로펜(a/k/a 프로필렌)의 암목시드화를 수반한다[참조문헌:Acrylonitrile, 1979, Process Economics Program Report, Stanford Research International, Menlo Park, CA; Weissermel and Arpe, 1978, Industrial Organic Chemistry, Verlag Chemie-Weinheim New York, pp. 266-270]. 이러한 공정으로부터의 폐 스트림은 디니트릴, 아미드 및 산을 고농도로 포함하는 니트릴의 복잡한 혼합물을 함유한다. 좀더 구체적으로는, 폐 스트림은 일반적으로, 아세토니트릴, 아크릴로니트릴, 석시노니트릴 및 푸마로니트릴과 같은 니트릴과 아크릴아미드를 함유한다. 또한, 시아나이드가 다양하고/하거나 높은 농도로 종종 존재한다. 폐 스트림은 일반적으로 높고/높거나 다양한 농도의 암모늄 설페이트를 함유한다. 이러한 위험한 폐 유출물은 이의 유독성으로 해서 환경 중으로 방출시킬 수 없으며 미국에서는 통상적으로 심혈(deep well) 주입에 의해 내층면 층으로 폐기되고 있다. 이러한 폐기는 폐스트림의 "처리"로 생각될 수 없으며 오히려 쓰레기 매립과정에 유사하다.
미국 외의 나라에서는, 폐 스트림을 약 250 ppm 이하의 낮은 니트릴 총농도로 희석한 다음, 휘발물질을 제거하고 다수의 유기 성분을 부분 산화시키는 습식/공기 산화 후에 통상적인 통기된 생물학적 폐 스트림 시스템, 즉 활성 하수 슬러지로 처리함으로써 아크릴로니트릴 생산으로부터의 폐 스트림을 "처리하는" 것이 통상적이다. 이러한 "처리" 방법은 다음과 같은 이유로 해서 니트릴 생산시설 폐 스트림의 효율적인 폐기에 적당하지 않다: (1)습식/공기 산화가 휘발성 화합물의 스트리핑을 일으켜, 대기 중으로의 방출 문제가 생김; (2)폐 스트림의 희석에는 적당한 "처리"의 달성에 요하는 유동 및 장기 체류시간을 조작하기 위한 대형 폐수처리 시설이 필요함; 및 (3)활성 슬러지에 의한 생물학적 처리와 습식/공기 산화의 병행으로 고처리 비용 발생. 니트릴 생산업계에서는 니트릴 생산 설비의 유출물의 효율적이고, 비용 효과적이며 환경 친화적인 폐기방법의 필요성을 오랜동안 깊이 느끼고절감하고 있다.
특정 미생물이 니트릴 화합물을 이의 상응하는 아미드나 산 화합물로 생물학적으로 전환시키는 데 유용함이 오랜 동안 알려져왔다. 과학 및 특허 문헌 모두 아크릴로니트릴로부터 특수 화학약품, 예를 들면, 아크릴아미드 및 아크릴산 또는 아크릴레이트의 생산에 니트릴 전환 미생물의 사용을 기술하는 다수의 참조문헌이 실려있다. 일반적으로 문헌[참조:Kobayashi et al., 1992, Trends Biotechnol. 10:402-408] 참조. 니트릴 전환 미생물은 니트릴 화합물을 이의 상응하는 산 화합물로 전환시키는 니트릴라제; 니트릴 화합물을 이의 상응하는 아미드 화합물로 전환시키는 니트릴 히드라타제; 및 아미드 화합물을 이의 상응하는 산 화합물로 전환시키는 아미다제를 포함한 활성을 보유한 것으로 나타났다.
그러나 본 발명자가 아는 바로는, 니트릴 분해 미생물을 이용하는 모든 이러한 특수 화학약품 생산에 있어, 단 하나의 화합물만이 해당 활성의 유도에 사용되어 왔고 단 하나의 니트릴 화합물만이 하나의 목적하는 특수 화합물을 생산하도록 전환시켜왔다.
2.1. 니트릴 화합물을 이용할 수 있는 미생물
문헌에는 니트릴 또는 아미드 화합물을 유일한 탄소 및/또는 질소원으로 이용할 수 있는 다수의 미생물을 기재하는 특정 참조문헌이 실려있다.
예를 들면, 문헌[참조:Asano et al., 1982, Agric, Biol. Chem. 46:1165-1174]에는 아세토니트릴을 유일한 탄소 및 질소원으로 시용하여 성장할 수 있는 아쓰로박터(Arthrobacter)의 분리균주에 대하여 기재하고 있다.
문헌[참조:Nawaz et al., 1989, 43rd Purdue Ind. Waste Conf. Proc., pp. 251-256(Nawaz, 1989)]에는 유일한 탄소 및 에너지원으로 아세토니트릴을 포함하여 각종 니트릴 화합물을 이용할 수 있는 슈도모나스 에어루지노사 균주의 분리에 대하여 기재하고 있다. 그러나, 이러한 균주는 아크릴로니트릴, 아크릴아미드, 벤조니트릴 및 말로니트릴과 같은 기타 니트릴 화합물을 이용할 수 없다.
문헌[참조:Nawaz et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58:27-31 (Nawaz)]에는 벤조니트릴을 사용하여 순응시킨 후, 벤조니트릴과, 부티로니트릴, 아세토니트릴, 글루타로니트릴, 프로피오니트릴, 석시노니트릴 및 메타크릴로니트릴 중에서 선택된 다른 한 니트릴과의 혼합물을 분해할 수 있는 클렙시엘라 뉴모니아 NCTR1 균주에 대해 기술하고 있다. 방향족 니트릴의 존재를 요하지 않는 본 발명의 유도방법과는 완전히 상반되게, Nawaz의 미생물은 벤조니트릴과 다른 하나의 니트릴의 혼합물 분해능 유도에 벤조니트릴을 요구한다. 더욱이 가장 중요한 것은, 니트릴의 임의 혼합물 분해를 성취하기 위해서는, 벤조니트릴이 존재하여야 한다는 사실이다. 니트릴 생산시설의 니트릴 폐 스트림은 벤조니트릴을 함유하지 않으므로, Nawaz에 의해 개시된 이러한 미생물 및 방법은 완전히 비실용적이고, 사실 이러한 폐 스트림 처리에는 효력이 없다.
문헌[참조:Chapatwala et al., 1993, App. Biochem. Biotech. 39/40:655-666]에는 유일한 탄소 및 질소원으로 아세토니트릴을 이용할 수 있는 슈도모나스 푸티다 균주의 분리에 대하여 기재하고 있다. 그러나, 균주에 의한 여타 니트릴-함유 화합물의 이용에 대해서는 어떠한 기재내용도 없다.
문헌[참조:Narayanasamy et al., 1990, Indian J. Exp. Biol. 28:968-971]에는 아쓰로박터 종에 의한 아크릴로니트릴, 아세토니트릴, 아크릴아미드 및 아세트아미드 각각의 이용에 대하여 기재하고 있다. 세균 균주가 디니트릴 또는 니트릴 혼합물을 분해할 수 있다는 어떠한 암시도 없다.
문헌[참조:O'Grady and Pembroke, 1994, Biotech. Letters 16:47-50]에는 애그로박테리움 종의 분리 및 다수의 상이한 니트릴 화합물을 개별적으로 이용하거나 분해하는 분리균주의 능력에 대하여 기재하고 있다. 분리균주가 니트릴 화합물의 혼합물을 이용하거나 분리할 수 있을 것이라는 어떠한 암시도 없다.
문헌[참조:Martinkova et al., 1992, Folia Microbiol. 37:373-376]에는 유일한 탄소 및 질소원으로 아세토니트릴을 이용할 수 있는, 코린박테리움 종 균주 3 B 및 애그로박테리움 라디오박터(A. radiobacter) 균주 8/4/1을 포함한 몇몇 세균 균주의 분리에 대하여 기재하고 있다. 균주가 여타 니트릴 화합물 또는 니트릴 화합물의 혼합물을 이용할 수 있는 지에 대해서는 어떠한 기재내용도 없다.
문헌[참조:Nawaz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:3343-3348]에는 제초제 알라클로르 오염 토양으로부터 로도코커스 종으로 잠정적으로 동정된 세균의 분리에 대하여 기재하고 있다. 이러한 세균은 유일한 탄소 및 질소원으로서 아크릴로니트릴을 사용할 수 있는 것으로 나타났다.
문헌[참조:Nawaz et al., 1993, Can. J. Microbiol. 39:207-212]에는 슈도모나스 종 및 잔토모나스 말로필리아(Xanthomonas maltophilia)의 분리에 대하여 기재하고 있으며, 이들 각각은 유일한 탄소 및 질소원으로 아크릴아미드를 이용할 수 있다.
1997년 2월 20일자로 공개된 국제 특허출원 공개 WO 97/06248는 적당한 미생물을 니트릴과 같은 아미드 또는 아미드 전구체, 또는 이들의 혼합물 존재하, 아미드 또는 아미드 전구체가 탄소의 적어도 20% 몰, 바람직하게는 실질적으로 전부를 구성하는 연속 배양, 탄소-제한 조건하에서 배양함에 의한 아미다제 생산방법에 대하여 기재하고 있다. 적절한 미생물로는 슈도모나스, 로도코커스 등이 포함된다. 이 문헌에는 니트릴 또는 니트릴 전구체, 또는 이들의 혼합물 존재하, 연속 배양 탄소-제한 배양조건하에서의 미생물 배양에 의한 니트릴라제 생산방법도 기재되어 있다. 적절한 미생물로는 노카디아, 로도코커스 ATCC 39484을 포함한 로도코커스 등이 포함된다. 이어서 유도된 효소는 특히 니트릴 또는 아미드의 이의 상응하는 산으로의 전환에 사용된다.
비록 니트릴 화합물을 이용하는 미생물이 혹시라도 니트릴 함유 조성물로부터 단일 니트릴 화합물의 제거에 유용할 수 있을지 몰라도, 니트릴 생산시설의 폐 스트림 폐기 보조에 이러한 미생물을 사용한다는 것은 예상되지 않는데, 그 이유는 니트릴 이용이 이용되는 단일 니트릴 화합물에 특이적인 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제의 발현에 의존하기 때문이다. 특이적 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제의 발현은 미생물이 니트릴 생산시설의 폐 스트림에서 발견되는 고농도로 존재하는 니트릴 화합물 또는 니트릴 화합물의 혼합물과 아미드 화합물의 혼합물의 전환능을 갖게 될 것임을 보장하지는 않는다.
2.2. 니트릴 생산 설비의 폐 스트림을 포함하는 니트릴 폐기물의 처리
다수의 참조문헌은 니트릴 생산 설비의 폐 스트림을 포함한 니트릴 폐기물로부터 니트릴의 미생물학적 제거방법을 제공하려는 시도에 대하여 기재하고 있다.
Kato 등의 미국 특허 제3,940,332호(Kato)는 니트릴 및 무기 시아나이드를 함유하는 폐 스트림 분해에 분리된 세균 균주 노카디아 루브로퍼팅크타(Nocardia rubropertincta) ATCC 기탁번호 21930를 하수 처리 시설로부터의 활성 슬러지와 병용하는 것에 대하여 기술하고 있다. Kato는 또한 세균 균주가 아세토니트릴, 아크릴로니트릴, 프로피오니트릴, 부틸로니트릴, 크로토노니트릴, 푸마로니트릴, 발레로니트릴, 글루타로니트릴, 및 벤조니트릴을 포함한 니트릴을 분해할 수 있음을 시사하고 있지만, 이러한 니트릴 각각의 양 또는 니트릴이 분해되는 조건 또는 니트릴이 함께 분해될 수 있는 지에 대해 전혀 시사하는 바가 없다. Kato에 의해 기재된 균주가 니트릴 화합물의 혼합물을 분해하거나 해독시킬 수 있는지에 대해서도 시사하는 바가 없다. 더욱이, Kato에 의해 처리된 니트릴 폐기물은 저강도 폐기물로서 니트릴 총 농도가 50 내지 250 ppm이다. 아울러, 본 발명자는 Kato에 의해 기재된 균주를 시험하였고 그 결과 균주는 본 발명의 방법을 이용하여 달성될 수 있는 것과 동일한 효율로 니트릴의 혼합물로부터 아세토니트릴을 제거하지 못한다는 점을 발견하였다.
문헌[참조:Sunarko and Meyer, 1989, DECHMA Biotech. Conf. 3:859-862]에는 세포를 2-펜텐니트릴의 존재하에 성장시킴으로써 유도된 마이코박테리움 UBT5, 바실러스 UBT2, 코린박테리움 UBT9, 및 플렉시박터(Flexibacter) UBT4의 동결건조 세포가 실험실 HPLC 칼럼 유출물에서 발견되는 소량의 아세토니트릴도 분해시킬 수 있음을 기술하고 있다.
문헌[참조:Brown et al., 1980, Water Res. 14:775-778]에는 주변환경의 천연수 및 오염수 중으로 0.5 내지 5 ppm의 농도로 첨가된 아크릴아미드가 아크릴아미드의 분해를 일으킴을 기재하고 있다.
문헌[참조:Kincannon et al., 1983, Journal WPCF 55:157-163]에는 도시 활성 슬러지 수처리 설비로부터 분리해 낸 미생물의 혼합물이 1개월의 순응기 후에 아크릴로니트릴을 분해할 수 있음을 기재하고 있다. 더욱이, 저자는 또한 아크롤레인도 미생물의 혼합물에 의해 유사하게 분해될 수 있음을 보여준다.
문헌[참조:Donberg et al., 1992, Environ. Toxicol. Chem. 11:1583-1594]에는 토양에서 발견되는 미생물의 혼합물이 호기성 조건하에서 아크릴로니트릴을 분해시킬 수 있음을 기재하고 있다. 어떤 혼합물은 2일 정도에 10 내지 100 ppm 아크릴로니트릴을 분해할 수 있었다. 그러나, 좀더 높은 아크릴로니트릴 농도에서는(1000 ppm) 분해가 억제되었다. 저자는 이러한 억제현상이 모(parent) 아크릴로니트릴 화합물의 억제효과에 기인하는 것으로 추론하였다.
Knowles와 Wyatt의 유럽 특허 제274 856 B1 및 문헌[참조:Wyatt and Knowles, 1995, Biodegradation 6:93-107]에는 미생물 혼합물에 의한 니트릴 생산 설비(아크릴로니트릴 생산의 BP/SOHIO 공정 사용)의 폐 스트림으로부터 니트릴 및 아미드 화합물의 혼합물의 분해에 대하여 기재하고 있다. 순수 배양균보다는 미생물의 혼합물을 사용한다는 점이 Knowles와 Wyatt 방법의 심각한 결점이다. 반응조건이 변함에 따라, 혼합 배양균내 특정 균주가 성장에 있어 상이한 시기에 촉진되게 되어 분해효율이 감소될 수 있으므로 혼합 배양균을 유지하기가 곤란한다.
상기 참조문헌과 관련하여 다수의 단점이 존재한다. 예를 들면, 전술한 개개의 미생물 균주 다수는 이들이 분해할 수 있는 니트릴 또는 아미드 화합물의 범위가 제한되어 있다. 니트릴 및 아미드 화합물의 분해/이용에 요구되는 시간은 수 일 또는 수 주 정도이다. 추가로, 기존 활성 슬러지 처리에 의한 폐기는 궁극적으로는 폐기시켜야 하는 생성된 다량의 바이오매스와 같이 자체 결점을 안고 있다. 더욱이 가장 중요한 점은, 순수 배양균보다는 미생물 혼합물의 사용은 매우 처리를 어렵게 만드는 데 그 이유는 혼합 배양균을 유지시키기가 어렵기 때문이다. 반응조건이 변함에 따라, 혼합 배양균내 특정 균주는 성장에 있어 상이한 시기에서 촉진되게 되어, 시간 경과에 따라 혼합 배양균의 특성이 변하고 분해효능이 감소될 수 있다. 혼합 배양균은 쉽게 재생되거나 유지되지 않는다.
본 출원의 섹션 2 또는 여타 섹션에서의 참조문헌의 인용과 확인은 이러한 참조문헌이 본 발명에 대한 선행기술로서 이용될 수 있다는 허락으로 해석되어서는 않된다.
3. 발명의 요약
유도된 미생물의 순수 배양균 또는 이의 추출물을 이용한 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법이 본 발명에 의해 제공된다. 미생물을 이용하는 방법은 가스, 에어로졸 또는 액체를 포함한 유체 형태의 화합물의 그러한 혼합물의 해독에 유용하다.
본 발명의 일 양태에 따라, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 해독하는 미생물 균주의 다중 유도방법이 제공된다. 본 양태의 일양식으로, 방법은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 함유하는 영양 완전 배지에서 미생물 균주의 순수 배양균을 배양하는 과정을 수반한다. 본 양태의 다른 양식에서, 방법은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 유일한 탄소 및 에너지원 및/또는 질소원으로 함유하는 최소배지에서 미생물 균주의 순수 배양균을 배양하는 과정을 수반한다.
다중 유도방법은 방향족 니트릴의 존재를 요하지 않지만; 일 양태에 따르면, 방향족 니트릴 해독능은 방향족 니트릴의 사용 없이 유리하게 달성된다.
본 발명의 일 양태에 따라, 아미드 화합물의 혼합물 해독 미생물 균주의 다중 유도방법이 제공된다. 본 양태의 일 양식에서, 방법은 니트릴과 아미드의 혼합물을 함유하는 영양 완전 배지에서 미생물 균주의 순수 배양균을 배양하는 과정을 수반한다. 본 양태의 다른 양식에서, 방법은 니트릴과 아미드의 혼합물을 유일한 탄소 및 에너지원 및/또는 질소원으로 함유하는 최소배지에서 미생물 균주의 순수 배양균을 배양하는 과정을 수반한다.
본 발명의 다른 양태에서, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있는 미생물의 수득방법이 제공된다. 일반적으로, 이러한 방법은 미생물의 순수 배양균(또는 공지의 순수 배양균의 혼합물로 구성된 미생물의 규정된 혼합 배양균)을 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 호기성 조건하에서 배양한 다음, 배양 미생물로부터 니트릴 생산 폐 스트림에서와 같이 니트릴 생산 폐 스트림에서 통상적으로 고농도로 발견되는 것들과 같은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 해독시키는 미생물을 회수하는 단계를 포함한다. 회수된 미생물을 분리하여 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있는 미생물의 순수 배양균을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 아미드 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있는 미생물의 수득방법이 제공된다. 일반적으로, 본 방법은 미생물의 순수 배양균(또는 공지의 순수 배양균의 혼합물로 이루어진 미생물의 규정된 혼합 배양균)을 호기성 조건하에서 니트릴과 아미드의 혼합물과 배양한 다음, 배양 미생물로부터 아미드 화합물의 혼합물을 해독하는 미생물을 회수하는 단계를 포함한다. 회수된 미생물을 분리하여 아미드 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있는 미생물의 순수 배양균을 제공할 수 있다.
미생물의 순수 배양균은 유도 후 연장된 기간 동안, 예를 들면, 정상적인 냉장온도, 즉 약 4℃하에서 적어도 4개월, 정상적인 냉동기 온도, 즉 -20℃ 이하에서 좀더 오래( 수 년) 또는 동결건조나 저온보존이 이용될 때에는 해독활성의 손실 없이 보존될 수 있다. 또한, 미생물은 비교적 고농도의 니트릴 화합물을 신속하고 효율적으로 해독시킬 수 있다. 더욱이, 미생물은 광범위 농도의 니트릴 및/또는 아미드 화합물에 견딜 수 있다. 특정 미생물은 니트릴 화합물 중 적어도 하나를 유일한 탄소 및 에너지원으로 이용할 수 있다. 어떤 미생물은 니트릴 또는 아미드 화합물 중 적어도 하나를 유일한 탄소 및 에너지원 및 질소원으로 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따라, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 해독방법이 제공된다. 바람직한 양태로서, 방법은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 니트릴 및/또는 아미드를 상응하는 아미드 및/또는 산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안 ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 니트릴 및/또는 아미드의 혼합물을 해독시키도록 유도된 미생물 균주의 순수 배양균과 접촉시키는 과정을 수반한다. 유도된 미생물의 순수 배양균은 본 발명의 방법에 사용될 때 활동적으로 분열하거나 심지어는 생존상태여야 할 필요가 없다.
대안의 바람직한 양태로서, 방법은 니트릴 및/또는 아미드를 상응하는 아미드 및/또는 산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안 ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 니트릴 및/또는 아미드의 혼합물을 해독시키도록 유도된 미생물 균주의 순수 배양균의 조 추출물과 접촉시키는 과정을 수반한다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 해독방법은 미생물의 순수 배양균 및/또는 미생물의 순수 배양균 조 추출물에 하나 이상의 니트릴 및/또는 아미드 분해효소, 예를 들면, 니트릴라제, 니트릴 히드라타제, 및 아미다제를 첨가하여 니트릴 및/또는 아미드 화합물의 해독 속도 및/또는 효율을 증가시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 아미드 화합물의 혼합물의 전환방법이 제공된다. 아미드는 상응하는 산 화합물로 전환된다. 바람직한 양태로서, 방법은 아미드의 혼합물을 아미드를 상응하는 산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안, ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 아미드 혼합물의 산으로의 전환능을 보유하도록 유도된 미생물 균주의 순수 배양균 또는 조 추출물과 접촉시키는 과정을 수반한다.
본 발명의 또 다른 양태는 아크릴아미드 또는 아세트아미드와 같은 아미드의 하이브리드 화학/생물학적 생산방법을 제공한다. 이러한 양태는 아세트아미드 또는 아크릴아미드와 같은 아미드의 개선된 생산방법을 포함하며, 개선점은 용액이 약 30 내지 50% 아미드 및 약 100 이상, 10,000 ppm 이하의 니트릴을 포함하는, 아미드의 화학적 합성 생산공정 중에 형성된 중간체 용액을 니트릴의 농도를 100 ppm 이하로 감소시키기에 충분한 시간 동안, 여타 아미다제 활성을 불활성화하도록 처리한 다중 유도된 미생물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 니트릴은 아크릴아미드로 전환된다.
본 발명의 또 다른 양태는 유도된 미생물 또는 이의 추출물을 포함하는 바이오필터 및 이의 사용방법을 제공한다. 바이오필터는 공기, 증기, 에어로졸 및 물 또는 수용액과 같은 유출물 중 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 해독에 사용된다.
본 발명의 또다른 양태에 따라, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물 해독능을 보유하도록 다중 유도된 미생물의 순수 배양균을 함유하는 키트가 제공된다.
본 발명의 방법, 바이오필터 및 키트는 각종 니트릴 화합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 고농도로 포함하는 혼합물의 신속한 해독에 유용하다. 니트릴 화합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물은 일반적으로 수성 환경에 있다. 본 발명의 방법, 바이오필터 및 키트는 또한, 불필요한 니트릴 화합물을 함유하는 아미드 제제로부터 니트릴 화합물의 제거에도 유용하며, 이에 따라 실질적으로 순수한 아미드 제제가 제공된다. 예시적인 양태로서, 아미드 제제는 아세트아미드 또는 아크릴아미드 제제이다. 추가로, 본 발명의 방법, 바이오필터 및 키트는 또한 불필요한 아미드 단량체 또는 비공중합 아미드 화합물을 함유하는 폴리아미드 또는 중합된 아미드 제제 중의 불필요한 아미드 단량체 화합물을 제제로부터 용이하게 제거시켜, 실질적으로 순수한 폴리아미드 또는 중합된 아미드 제제를 제공할 수 있는 상응하는 산 화합물로 전환시키는 데 유용하다. 바람직하게는, 폴리아미드 또는 중합된 아미드는 방법에 의해 영향을 받지 않으며, 즉, 실질적으로 폴리아미드 또는 중합된 아미드의 어떠한 손실도 없다.
일면으로서, 본 발명의 방법, 바이오필터 및 키트는 니트릴 생산시설의 폐 스트림내 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물의 해독에 사용하기에 특히 적합하다. 이러한 면에서 볼 때, 본 발명의 방법 및 조성물은 고농도의 니트릴이 유도된 미생물의 순수 배양균에 의해 해독된다는 점에서 특히 유리하다. 본 발명의 다른 일면으로, 방법은 불필요한 니트릴 화합물을 함유하는 아미드 제제로부터 니트릴 화합물의 제거에 사용하기에 특히 적합하다. 이러한 점에서 볼 때, 유도된 미생물의 순수 배양균 또는 이의 추출물이 아미다제 활성을 함유하면, 순수 배양균 또는 추출물은 아미드의 산으로의 전환능을 불활성화시키지만 방법에 사용하기에 앞서 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 전환시키는 미생물 또는 추출물의 능력에는 영향을 미치지 않는 온도에서 배양하여야 한다.
본 발명에 따라, 일단 유도되면, 순수 미생물 배양균은 해독이 일어나기 위해 활동적으로 분열하여야 하거나 심지어는 생존상태여야 할 필요도 없다. 성장과 해독의 이러한 분리는 성장 억제 조건; 예를 들면, 니트릴 화합물의 매우 높은 농도, 고 알칼리성 또는 산성 pH, 고온, 예를 들면, 55℃ 등 하에서 니트릴 화합물의 신속한 해독을 허용한다. 또한, 분리란 다음을 의미한다:(1)세포가 해독하기 위해 성장하여야 할 필요가 없으므로, 세포(바이오매스)는 생성되지 않거나 이의 생성은 최소화되며, 세포가 성장하는 경우, 생성되는 폐 바이오매스를 다루는 것이 필수가 된다; (2)세포가 성장하지 않기 때문에, 성장 기질로서 작용할 수 없는 화합물도 우연히 해독될 수 있으며; (3)공정에 의해 자연에서 손쉽게 분해될 수 있는 독성이 덜하거나 무독한 중간체가 생성된다(취급의 어려움과 독성 감소).
추가로, 일부 니트릴 또는 아미드 화합물은 특히 생분해가 어렵기 때문에, 본 발명은 니트릴의 상응하는 아미드 및/또는 산 화합물로의 해독 또는 아미드의 생분해에 덜 저항성인 산 화합물로의 전환을 허용하여, 저항성 화합물의 성공적인 생분해가 허용된다.
본 발명의 방법과 조성물에 의해 제공된 속도와 효율은 니트릴 화합물의 해독에 대해 이전에는 결코 달성되지 않았었다.
3.1. 정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 니트릴 화합물과 관련하여, "해독"이란 용어는 니트릴 화합물의 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로의 전환을 포함한다. 예를 들면, 아크릴로니트릴은 아크릴아미드로 또는 아크릴산 또는 이들의 혼합물로의 전환에 의해 해독된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 아미드 화합물과 관련하여, "해독"이란 용어는 아미드 화합물의 상응하는 산 화합물로의 전환을 포함한다. 산은 유리산 또는 염 형태(산이 염의 존재하에 있는 경우)로서 존재할 수 있다. "해독"이란 용어는 니트릴 또는 아미드 화합물이 전환되는 화합물이 니트릴 또는 아미드 화합물보다 덜 유독 (즉 생존 유기체에 유해)하다는 것을 의미하지는 않지만, 이러한 화합물은 충분히 그럴 수 있다. 추가로, "해독"이란 용어는 니트릴 또는 아미드 화합물이 최종산물인 CO2, H2O 및 바이오매스로 분해됨을 의미하지는 않는다.
바람직한 양태로, 해독은 니트릴 및/또는 아미드 화합물의, 환경보호국에 의해 덜 위험, 바람직하게는 위험하지 않은 것으로 공인될 수 있는 화합물로의 전환을 수반한다.
본 출원에서 사용되는 "니트릴" 화합물이란 용어는 하나 이상의 니트릴 잔기, 즉 CN, 및 CN 잔기 외에 적어도 하나의 탄소원자를 함유하는 유기 화합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 "니트릴"이란 용어는 아크롤레인 시아노히드린같은 화합물을 포함한다. 반응성 시아나이드 존재하에서 아크롤레인은 아크롤레인 시아노히드린 형태로 존재함이 주목된다. 니트릴 해독 미생물은 시아노히드린인 니트릴을 상응하는 산으로 전환시킬 수 있다. 예를 들면, 아크롤레인 시아노히드린은 아크릴산으로 전환된다. 본원에서 사용되는 "니트릴"이란 용어는 아세토니트릴, 아크릴로니트릴, 푸마로니트릴, 석시노니트릴, 크로토노니트릴, 아디포니트릴, 벤조니트릴, 부티로니트릴, β-프로프리오설포노니트릴, 이소발레로니트릴, 발레로니트릴, 페닐니트릴, 아크롤레인 시아노히드린 등을 포함하며 이에 국한되지 않는다.
3.2. 발명의 목적
본 발명의 목적은 니트릴 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 화합물의 혼합물을 필수적으로 분해(사용)함이 없이 이들의 상응하는 아미드 또는 산 화합물로 해독시킬 수 있는 단일 미생물의 유도된 순수 배양균을 제공하는 것이다. 또한, 이러한 전환은 니트릴, 예를 들면, 아크릴로니트릴 생산 설비의 폐수 스트림에서 발견되는 농도와 같이 혼합물에 존재하는 화합물이 고농도로 존재할 때 일어날 수 있다. 또한, 유도된 순수 배양균은 광범위의 니트릴(디니트릴 포함) 및 아미드 화합물을 딱 하나 또는 두 니트릴 화합물을 개별적으로가 아니라 동시에 전환시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 니트릴 생산설비의 폐수 스트림에서 발견되는 화합물의 혼합물을 자연에서 더욱 용이하게 분해될 수 있는 화합물로 전환시키기 위한 이러한 순수 배양균의 사용방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 장점 중 하나는 화합물의 혼합물의 전환이 성장과 항상 결부되어 있는 것은 아니기 때문에, 좀더 적은 바이오매스가 후속 폐기에 대해 생성될 수 있다는 점이다. 본 발명의 다른 장점은 고농도 화합물의 전환에 요구되는 시간이 수 분 및 수 시간 정도라는 점이다.
본 발명의 다른 목적은 아미드 생산설비에서 제조되는 아미드 제제와 같이, 아미드 제제로부터 불필요한 니트릴 화합물의 제거를 위한 순수 배양균의 사용방법을 제공하는 것이다. 순수 배양균은 니트릴을 산 잔기로 전환시킴에 의한 불필요한 니트릴 화합물을 함유하는, 아세트아미드 또는 아크릴아미드와 같은 상업용 아미드 제제의 정제에 유리하게 사용된다. 이는 생산되는 아미드의 순도와 산물의 수율을 향상시킨다.
본 발명의 또 다른 목적은 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키기 위한 순수 배양균의 사용방법을 제공한다.
본 발명의 기타 목적 및/또는 장점은 당업자에게 명백하다.
본 발명은 1996년 12월 18일자로 출원되고 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허출원 제08/769,080호의 부분 연속 출원이다.
본 발명은 니트릴 잔기를 아미드 또는 산 잔기로 전환시킬 수 있는 유도된 미생물 균주의 순수 배양균을 사용한 니트릴 화합물의 상응하는 아미드 또는 산 화합물로의 전환에 의한, 니트릴 화합물의 혼합물, 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법에 관한 것이다. 아미드가 혼합물에 형성되거나 존재하면, 아미드는 본 해독방법을 이용하여 상응하는 산으로 추가 전환시킬 수 있다. 이어서, 산은 필요에 따라 CO2, H2O 및 바이오매스로 추가 분해시킬 수 있다. 유도된 순수 배양균은 전형적으로 니트릴 생산 폐 스트림에 고농도로 존재하는 니트릴의 혼합물 또는 니트릴과 아미드의 혼합물을 해독시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 니트릴 잔기를 아미드 또는 산 잔기로 전환시킬 수 있는 유도된 미생물 균주의 순수 배양균을 사용한, 불필요한 니트릴 화합물을 함유하는 아세트아미드 또는 아크릴아미드 제제와 같은 아미드 제제로부터 니트릴 화합물의 제거방법에 관한 것이다. 유도된 순수 배양균은 아미드 제제의 독성을 제거하거나 감소시킬 수 있어 아미드 제제로부터의 아미드 산물의 순도와 수율이 향상된다.
본 발명은 또한, 아미드 잔기를 산 잔기로 전환시킬 수 있는 유도된 미생물 균주의 순수 배양균을 이용하는, 아미드 화합물의 혼합물의 상응하는 산 화합물로의 전환방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 니트릴의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 해독을 위한 바이오필터 및 이의 사용방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 유용한 다중 유도된 미생물 균주를 함유하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 하기 본 발명의 상세한 설명, 본 발명의 특정 양태의 실시예 및 첨부 도면을 참조로 더욱 완전하게 이해될 수 있다.
도 1은 25 내지 80℃의 온도범위에서 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) 균주 DAP 96622에 의한 니트릴 해독율에 미치는 온도효과를 보여주는 그래프.
도 2a-2c는 본원에서 교시된 바와 같이 유도된 로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 상이한 pH 값에서의 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴을 해독능을 보여주는 그래프. 도 2a, pH=6; 도 2b, pH=7; 도 2c, pH=8. 세부사항은 섹션 8.2 참조.
도 3은 본원에서 교시된 바와 같이 유도된 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 해독능을 보여주는 그래프.
도 4a 및 4b는 본원에서 교시된 바와 같이 유도된 로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 1:5로 희석하거나(도 4a) 최대농도(도 4b)의 폐수 칼럼 바닥물질 해독능을 보여주는 그래프. 세부사항은 섹션 10 참조.
도 5는 본원에서 교시된 바와 같이 유도되고 더 이상 활동적으로 분열하지 않는 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 네트 스트리퍼 바닥물질(net stripper bottom) 해독능을 보여주는 그래프. 세부사항은 섹션 11 참조.
본 발명은 니트릴 잔기를 아미드 및/또는 산 잔기로 및/또는 아미드 잔기를 산 잔기로 전환시킬 수 있도록 유도된 단일 미생물 균주의 순수 배양균을 이용하여 니트릴 화합물을 상응하는 아미드 및/또는 산 화합물로 전환시키거나 아미드 화합물을 상응하는 산 화합물로 전환시킴에 의한 높은 전체 농도의 니트릴 화합물의 혼합물, 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법을 포함한다. 최초 혼합물이 니트릴 화합물의 혼합물이고 아미드가 형성되면, 아미드는 본 방법을 이용하여 상응하는 산으로 추가 전환시킬 수 있다. 유도된 순수 배양균은 니트릴 생산 폐 스트림에 전형적으로 고농도로 존재하는 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있다. 유도된 순수 배양균은 아미드 생산설비에 의해 생성되는 불필요한 니트릴 화합물을 함유하는 아미드 제제로부터 이를 제거할 수 있다. 유도된 순수 배양균은 아미드 혼합물을 상응하는 산 화합물로 전환시킬 수 있다.
비록 특정 전환 메커니즘에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 니트릴을 상응하는 아미드로 전한시킬 수 있는 미생물은 니트릴 히드라타제 효소 활성을 함유하고; 니트릴을 상응하는 산으로 전환시킬 수 있는 것들은 니트릴 히드라타제 효소 활성과 아미다제 효소 활성 또는 니트릴라제 효소 활성을 겸비하는 것으로 추정된다.
니트릴의 상응하는 아미드로의 해독은 당업자에 공지된 임의 방법에 의해, 예를 들면, 화염 이온화 검출기와 함께 가스 액체 크로마토그래피를 이용하여(GLC-FID) 아미드를 검출하고 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 산 화합물을 검출하여 니트릴 화합물의 소멸 및/또는 아미드 화합물의 동시 출현을 평가함으로써 모니터 할 수 있다. 상응하는 산으로의 해독은 최초에 존재하는 각각의 니트릴 또는 아미드 그룹에 대해 암모니아의 화학량론적 생성으로 귀결된다. 니트릴 화합물 또는 아미드 화합물의 해독정도는 문헌[참조:Fawcett and Scott, 1960, J. Clin. Pathol. 13:156-159]의 기술을 사용하여 암모니아 방출을 측정함으로써 모니터 될 수 있다. 암모니아 방출이 암모니아 또는 암모늄 염의 존재로 해서 측정될 수 없는 경우, 니트릴 및 아미드의 농도는 GLC-FID 등을 포함하여(이에 국한되지 않음) 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 모니터 될 수 있다. 이와 달리, 니트릴 화합물의 소멸은 산 화합물을 유도체화하고 GLC-FID를 이용하여 유도체화된 산물을 검출함으로써 모니터 될 수 있는 상응하는 산 화합물의 생성을 평가함으로써 측정될 수 있다. 아미드 및 산은 먼저 알킬화, 에스테르화 또는 실릴화되면 GLC-FID 분석을 위해 유도체화시킬 수 있다(일반적으로, Supelco Chromatography Products catalog, 1997, page 653-656 (Supelco Inc., Bellefonte PA) 참조).
이어서, 산 및 기타 비-니트릴 화합물은 필요에 따라 CO2, H2O 및 바이오매스로 추가 분해시킬 수 있다.
제한의 의미를 두지 않고 설명의 명확을 기하기 위하여, 본 발명의 상세한 설명을 다음과 같은 하부 섹션으로 세분한다:
(1)니트릴 및/또는 아미드 해독능을 지닌 미생물 균주의 유도 및 동정방법;
(2)분리된 미생물 균주의 성상확인;
(3)해독용 유도된 미생물 균주의 사용방법 또는 적용;
(4)유용한 유도된 미생물 균주를 함유하는 키트.
5.1. 니트릴 및/또는 아미드 해독능을 지닌 미생물 균주의 유도 및 동정방법.
본 발명은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 존재하에서 균주를 성장시킴에 의한 유용한 미생물 균주의 분리 및 동정방법을 제공한다. 놀랍게도, 광범위의 니트릴 또는 아미드 해독능, 즉, 각종 니트릴 또는 아미드, 예를 들면, 아세토니트릴 또는 아크릴로니트릴과 같이 단일 CN 잔기를 갖는 니트릴 및 푸마로니트릴 및 석시노니트릴과 같이 두 개의 CN 잔기를 갖는 디니트릴의 해독능을 유도하기 위하여, 배양 배지를 단 하나 이상의 니트릴 화합물로 보충시켜야 함이 발견되었다. 좀더 구체적으로 말하면, 광범위 스펙트럼의 니트릴 및/또는 아미드 해독능이 제한된 수의 니트릴 화합물의 혼합물 및 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 사용하여 유도될 수 있음이 발견되었다. 이러한 방식으로, 균주는 "다중 유도"된다. 다중 유도 후, 순수 배양균내의 균주는 단일 CN 잔기를 갖는 니트릴, 디니트릴, 및 아크롤레인 시아노히드린같은 화합물 을 포함하여 광범위의 니트릴 화합물의 혼합물 및 소정 범위의 아미드 화합물을 해독시킬 수 있다. 유도과정을 겪도록 선택된 미생물 균주는 공지의 공급원 중에서 선택되거나 새로 분리된 미생물일 수 있으며, 호열성균 또는 기타 극호열성균, 예를 들면, 호염균 또는 호산균일 수 있다. 유리하게는, 다중 유도법은 벤조니트릴과 같은 방향족 니트릴을 요하지 않지만, 일 양태에 따르면, 유도된 미생물은 방향족 니트릴을 함유하는 혼합물 해독능을 보유한다.
니트릴 및/또는 아미드 해독활성을 지니도록 다중 유도될 수 있는 미생물은 탄수화물 등과 같은 용이하게 이용할 수 있는 탄소원을 함유하는 배지에서의 성장에 비해, 니트릴 또는 아미드를 유일한 탄소원 또는 유일한 탄소 및 질소원으로 함유하는 배지에서 좀더 느리게 성장하는 듯한 것으로 주목되었다. 바람직한 양태에서, 니트릴 및/또는 아미드 해독활성을 지니도록 다중 유도될 수 있는 미생물 균주를 용이하게 이용할 수 있는 탄소원(예를 들면, 글루코스, 말토스, 슈크로스, 아세테이트, 벤조에이트 등)을 함유하는 배지에서 배양시킨다. 탄소 및 질소원을 반응기 중의 탄소 및 질소 수준이 1% 이하가 되도록 점진적으로 또는 연속적으로 첨가한다. 이러한 식으로 다량의 세포가 신속하고 저렴하게 생산된다. 일단, 원하는 세포 매스가 성취되면, 이어서 미생물을 하기 섹션 5.1.1 또는 5.1.2에 기술된 방법에 따라 예를 들면, 생산 사이클의 마지막 20 시간 동안 다중 유도시킨다.
5.1.1. 니트릴 및 아미드 화합물과 영양 완전 배지를 사용한 유도
본 발명의 일 양태에 따라, 니트릴 및/또는 아미드 해독활성의 유도방법은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충한 영양 완전 배양배지를 사용하여 제공된다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 양태의 방법은 미생물을 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충한 영양 완전배지에서 배양한 다음 배양 미생물을 수집하는 단계를 포함한다. 아가 플레이트에서 배양할 경우, 미생물은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 존재하에 약 24 내지 48 시간 배양한다. 발효조에서 배양시, 미생물은 영양 완전배지에서 1 내지 48+ 시간, 바람직하게는 1 내지 20 시간, 더욱 바람직하게는 16 내지 20 시간 동안, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물의 첨가에 앞서 배양시킨 다음; 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 첨가 4 내지 5 시간 후 수거한다. 다량의 바이오매스를 소망하는 경우, 미생물을 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 첨가에 앞서 좀더 긴 기간 동안 발효조에서 배양시킬 수 있다. 당업자에 공지되어 있는 바와 같이, 성장을 유지하기 위해 필요에 따라 부수적인 영양분이 첨가될 수 있다.
본 양태의 일 양식에서, 미생물은 니트릴 화합물의 혼합물로 보충된 영양 완전 배지에서 유도된다. 니트릴 화합물의 유용한 혼합물은 다음을 포함한다: 아세토니트릴 약 50 내지 약 500 ppm; 아크릴로니트릴 약 50 내지 약 500 ppm; 및 석시노니트릴 약 25 내지 약 100 ppm. 임의로, 약 1 내지 10 ppm KCN 또는 NaCN이 혼합물에 첨가될 수 있다. 비록 특정 메커니즘에 국한되기를 바라지는 않지만, 본 발명자는 유도 중에 KCN 또는 NaCN의 존재가 미생물을 무기 시아나이드에 순응시키는 것으로 믿고 있다. 또한 아울러, 약 1 내지 25 ppm 농도의 코발트를 혼합물에 가할 수 있다. 비록 특정 메커니즘에 국한되기를 바라지는 않지만, 본 발명자는 코발트가 철 함유 니트릴히드라타제 효소에서 철 원자를 치환시키고 니트릴히드라타제를 시아나이드 내성으로 만드는 것으로 추측한다. 이러한 점은 해독시키고자 하는 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물이 무기 시아나이드가 많은 니트릴 생산 폐 스트림일 경우 유익하다. 또한 임의로, 약 1 내지 10 g/l 농도의 우레아도 혼합물에 첨가될 수 있다. KCN, NaCN, 코발트 또는 우레아의 첨가는 해독활성 유도에 필수는 아니다.
바람직하게는, 영양 완전배지는 각각 약 150 ppm 농도의 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 및 각각 약 50 ppm 농도의 석시노니트릴과 푸마로니트릴 중 적어도 하나의 혼합물을 함유하는 니트릴 화합물의 혼합물로 보충된다. 더욱 바람직하게는, 니트릴 혼합물은 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴 각각 약 150 ppm 및 석시노니트릴 약 50 ppm 농도를 포함한다. 임의로, 각각 약 10 ppm 농도의 KCN과 코발트 및 약 7 g/l 농도의 우레아가 배양배지에 첨가된다. 더욱 바람직하게는, BACTOTMR2A 배지(Difco, 미국 미시건 디트로이트) 또는 YEMEA 배지인 영양 완전배지 또는 아가 없이 일정비의 YEMEA 성분을 함유하는 배지를 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 각각 약 150 ppm 및 석시노니트릴 약 50 ppm 농도, KCN과 코발트 각각 약 10 ppm, 및 우레아 약 7 g/l로 보충한다. 바람직한 양식에서, 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴은 함께 아세토니트릴, 아크릴로니트릴, 석시노니트릴 및 푸마로니트릴 해독활성을 유도한다. 배양배지내 석시노니트릴의 포함은 석시노니트릴 및/또는 푸마로니트릴이 존재하는 혼합물내 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴 해독율을 향상시키는 것으로 보인다. 그러나, 석시노니트릴의 첨가는 석시노니트릴의 해독을 향상시키는 듯 하지만 푸마로니트릴의 해독에는 영향을 미치지 않는다.
본 양태의 대안적인 양식에서, 미생물은 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충된 영양 완전배지에서 유도시킨다. 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 유용한 혼합물은 다음을 포함한다:(1)석시노니트릴 약 25 내지 100 ppm, 아세토니트릴 약 50 내지 150 ppm 및 아크릴로니트릴 약 50 내지 150 ppm 중 적어도 하나; 및 (2)아세트아미드 약 50 내지 500 ppm 및 아크릴아미드 약 50 내지 500 ppm. 임의로, KCN 또는 NaCN은 약 1 내지 10 ppm으로 첨가될 수 있다. 또한 임의로, 코발트는 약 1 내지 25 ppm으로 첨가될 수 있고 우레아는 약 1 내지 10 g/l으로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 영양 완전배지는 50 ppm 석시노니트릴 및 아세트아미드 및 아크릴아미드 각각 150 ppm으로 보충된다.
영양 완전배지는 성장에 요구되는 모든 필수 영양소, 예를 들면, 탄소, 및/또는 질소를 미생물에 공급하는 성장배지이다. 예를 들면, 글루코스, 펩톤, KH2PO4, MgSO4, 카사미노산, 효모 추출물, 가용성 전분 및 나트륨 피루베이트를 함유하는 BACTOTMR2A 배지(Difco, 미국 미시건 디트로이트)가 적당한 영양 완전배지이며 이에 국한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 영양 완전배지는 글루코스, 말트 추출물 및 효소 추출물을 아가 없이 함유하는 YEMEA 배지이다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 영양 완전배지는 글루코스, 펩톤, KH2PO4, MgSO4, 가용성 전분 및 나트륨 피루베이트를 함유하는 영양 완전배지이다. 본 발명은 당업자에게 공지된 여타의 영양 완전배지의 사용을 포함한다.
미생물은 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 8.0 범위의 pH; 및 4 내지 55℃, 바람직하게는 약 15 내지 37℃의 온도를 포함한 조건하에서 배양된다. 추가로, 용존산소 텐션은 0.1 내지 100%, 바람직하게는 약 4 내지 80%, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 30%이어야 한다. 용존산소 텐션은 모니터하여 공기, 순수한 산소, 퍼옥사이드, 및/또는 산소를 방출하는 기타 퍼옥시 조성물 형태로 산소를 공급함으로써 목적하는 범위로 조정될 수 있다.
배양기 말미에, 배양 미생물을 예를 들면, 스크래핑, 원심분리, 여과 등에 의해, 또는 당업자에 공지된 여타 방법에 의해 수집하고 농축한다.
하나의 예시적인 양태로, 세포를 4℃에서 수집하여 세포 농축물로서 제조한 다음 고속 동결시켜(드라이 아이스 및 아세톤) -20℃ 이하에서 보존한다. 동결세포 농축물이 사용될 수 있거나 고정될 수 있다.
수집된 미생물의 니트릴 및/또는 아미드 해독활성은, 일단 전술한 방법에 따라 다중 유도되면, 하나 이상의 기질을 배양 미생물에 첨가함으로써 안정화시킬 수 있다. 비록 특정 메커니즘에 국한되기를 바라지는 않지만, 본 발명자는 니트릴히드라타제 및 아미다제 효소가 기질의 존재하에 있을 때 일반적으로 가장 안정함이 당업자에게 익히 공지되어 있음에 주목한다. 따라서, 예를 들면, 이소부티르아미드와 같은 아미드 화합물, 또는 이소부티르산과 같은 산의 첨가는 활성이 장기간 보유되도록 니트릴히드라타제를 안정화시킬 수 있다.
안정화는 또한, 폴리아크릴아미드 또는 아크릴아미드 큐브에 또는 폴리에틸렌 이미드와 가교결합된 알기네이트에 유도된 미생물을 고정시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 폴리에틸렌 이미드와 가교결합된 알기네이트에 고정시킴으로써 안정화된다.
5.1.2. 니트릴 또는 니트릴 및 아미드 화합물과 최소 배지를 이용한 유도
본 발명의 다른 양태에 따라, 니트릴-해독활성의 유도방법은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충된 최소 배양배지를 사용하여 제공된다. 더욱 구체적으로는, 방법은 미생물을 니트릴의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충한 최소배지에서 배양한 다음 배양 미생물을 수집하는 단계를 포함한다. 아가 플레이트에서 배양하는 경우, 미생물은 약 24 내지 48 시간 배양된다. 발효조에서 배양하는 경우, 미생물을 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충한 최소배지에서 1 내지 48+ 시간, 바람직하게는 1 내지 20 시간, 더욱 바람직하게는 16 내지 23 시간 배양한 다음; 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 첨가 4 내지 5 시간 후 수거한다. 다량의 바이오매스를 소망하는 경우, 미생물을 좀더 긴 기간 동안 발효조에서 배양시킬 수 있다.
니트릴 화합물의 유용한 혼합물은 다음을 포함한다: 아세토니트릴 약 50 내지 약 500 ppm; 아크릴로니트릴 약 50 내지 약 500 ppm; 및 석시노니트릴 약 25 내지 약 100 ppm. 임의로, 약 1 내지 10 ppm KCN 또는 NaCN이 혼합물에 첨가될 수 있다. 비록 특정 메커니즘에 국한되기를 바라지 않지만, 본 발명자는 유도 중에 KCN 또는 NaCN의 존재가 미생물을 무기 시아나이드에 순응시키는 것으로 믿고 있다. 또한 임의로, 약 1 내지 25 ppm 농도의 코발트를 혼합물에 가할 수 있다. 비록 특정 메커니즘에 국한되기를 바라지는 않지만, 본 발명자는 코발트가 철 함유 니트릴히드라타제 효소에서 철 원자를 치환시키고 니트릴히드라타제를 시아나이드 내성으로 만드는 것으로 추측한다. 이러한 점은 해독시키고자 하는 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물이 무기 시아나이드가 많은 니트릴 생산 폐 스트림일 경우 유익하다. 또한 임의로, 약 1 내지 10 g/l 농도의 우레아도 혼합물에 첨가될 수 있다. KCN, NaCN, 코발트 또는 우레아의 첨가는 해독활성 유도에 필수가 아니다.
바람직하게는, 최소배지는 각각 약 150 ppm 농도의 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴 및 각각 약 50 ppm 농도의 석시노니트릴과 푸마로니트릴 중 적어도 하나를 함유하는 니트릴 화합물의 혼합물로 보충된다. 더욱 바람직하게는, 니트릴 혼합물은 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴 각각 약 150 ppm 및 석시노니트릴 약 50 ppm 농도를 포함한다. 임의로, 각각 약 10 ppm 농도의 KCN과 코발트 및 약 7 g/l 농도의 우레아가 배양배지에 첨가된다. 이러한 바람직한 양식에서, 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴은 함께 아세토니트릴, 아크릴로니트릴, 석시노니트릴 및 푸마로니트릴 해독활성을 유도한다. 배지내 석시노니트릴의 포함은 석시노니트릴이 존재하는 혼합물내 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴 해독율을 향상시키는 것으로 보인다. 그러나, 석시노니트릴의 첨가는 석시노니트릴의 해독을 향상시키는 듯 하지만 푸마로니트릴의 해독에는 영향을 미치지 않는다.
본 양태의 대안 양식에서, 미생물은 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충된 최소배지에서 유도시킨다. 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 유용한 혼합물은 다음을 포함한다:(1)석시노니트릴 약 25 내지 100 ppm, 아세토니트릴 약 50 내지 150 ppm 및 아크릴로니트릴 약 50 내지 150 ppm 중 적어도 하나; 및 (2)아세트아미드 약 50 내지 500 ppm 및 아크릴아미드 약 50 내지 500 ppm. 임의로, KCN 또는 NaCN은 약 1 내지 10 ppm으로 첨가될 수 있다. 또한 임의로, 코발트는 약 1 내지 25 ppm으로 첨가될 수 있고 우레아는 약 1 내지 10 g/l으로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 최소배지는 50 ppm 석시노니트릴 및 아세트아미드 및 아크릴아미드 각각 150 ppm으로 보충된다.
최소배지는 성장을 위한 유기탄소를 미생물에 공급하지 않는 영양 불완전배지이다. 오히려, 최소배지는 미생물이 탄소 및/또는 에너지원으로 사용할 수 있는 화합물로 보충되어야 한다. 예를 들면, 스태니어 최소배지[참조문헌:Stanier et al., 1966, J. Gen. Microbiol. 43:159-271] 및 포스페이트 완충 식염수(PBS)가 본 발명에서의 사용에 허용되는 최소배지이며 이에 국한되지는 않는다.
미생물은 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 8.0 범위의 pH; 및 4 내지 55℃, 바람직하게는 약 15 내지 37℃의 온도를 포함하는 조건하에서 배양된다. 추가로, 용존산소 텐션은 0.1 내지 100%, 바람직하게는 약 4 내지 80%, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 30%이어야 한다. 용존산소 텐션은 모니터하여 공기, 순수한 산소, 퍼옥사이드, 및/또는 산소를 방출하는 기타 퍼옥시 조성물 형태로 산소를 공급함으로써 목적하는 범위로 조정될 수 있다.
배양기 말미에, 배양 미생물을 예를 들면, 스크래핑, 원심분리, 여과 등에 의해, 또는 당업자에 공지된 여타 방법에 의해 수집하고 농축한다.
수거 미생물의 니트릴 및/또는 아미드 해독활성은, 일단 전술한 방법에 따라 다중 유도되면, 하나 이상의 기질을 배양 미생물에 첨가함으로써 안정화시킬 수 있다. 비록 특정 메커니즘에 국한되기를 바라지는 않지만, 본 발명자는 니트릴히드라타제 및 아미다제 효소가 기질의 존재하에 있을 때 일반적으로 가장 안정함이 당업자에게 익히 공지되어 있음에 주목한다. 따라서, 예를 들면, 이소부티르아미드와 같은 아미드 화합물, 또는 이소부티르산과 같은 산의 첨가는 활성이 장기간 보유되도록 니트릴히드라타제를 안정화시킬 수 있다.
안정화는 또한, 폴리아크릴아미드 또는 아크릴아미드 큐브에 또는 폴리에틸렌 이미드와 가교결합된 알기네이트에 유도된 미생물을 고정시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 폴리에틸렌 이미드와 가교결합된 알기네이트에 고정시킴으로써 안정화된다.
5.1.3. 유용한 미생물의 동정
다른 양태에 따라, 본 발명은 니트릴 화합물의 혼합물, 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물, 또는 아미드 화합물의 혼합물 해독에 유용한 미생물의 동정 및 분리를 위한 미생물 스크리닝 방법을 제공한다. 방법은 일반적으로, 니트릴 및/또는 아미드 해독능의 다중 유도에 사용되는, 섹션 5.1.1 및 5.1.2에서 전술한 조건에 처리하고자 하는 미생물을 노출시킨 다음, 잠정 "유도된" 시험 미생물의 니트릴 화합물의 혼합물, 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물, 또는 아미드 화합물의 혼합물 해독능을 평가하는 단계를 수반한다.
니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 해독에 유용한 미생물의 스크리닝 방법은 시험 미생물을 니트릴 화합물의 제 1 혼합물(섹션 5.1.1 및 5.1.2 참조)로 보충한 영양 완전배지 또는 최소배지에서 약 24 내지 48 시간 동안 아가 플레이트 상에서 잠정 유도된 미생물을 수득하기 위한 성장 호조건하에서 배양한 다음; 아크릴로니트릴 약 1 내지 약 20,000 ppm 농도, 아세토니트릴 약 1 내지 약 20,000 ppm 농도, 푸마로니트릴 약 1 내지 약 30,000 ppm 농도, 및 석시노니트릴 약 1 내지 약 40,000 ppm 농도를 포함하는 니트릴의 제 2 혼합물과 미생물을 접촉시킨 다음, 혼합물내 니트릴 각각의 소멸을 모니터함으로써(여기에서, 혼합물내 하나 이상의 니트릴 화합물의 소멸은 시험 미생물이 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 해독능을 가짐을 시사한다) 잠정 유도된 미생물의 니트릴 혼합물 해독능을 평가하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 니트릴의 제 2 혼합물은 아크릴로니트릴, 아세토니트릴, 푸마로니트릴 및 석시노니트릴 각각 약 50 내지 250 ppm 농도를 포함하며 약 30 분후 제 2 혼합물의 니트릴 화합물 전부의 소멸은 시험 미생물이 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 해독능을 가짐을 시사한다. 가장 바람직하게는, 약 10분 후 제 2 혼합물의 니트릴 화합물 전부의 소멸은 미생물이 목적하는 능력을 보유하고 있음을 시사한다. 미생물이 암모늄 설페이트 존재하에 니트릴의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 해독능을 보유하기를 소망하는 경우, 암모늄 설페이트는 약 1 내지 8% 암모늄 설페이트로 제 2 혼합물에 포함된다.
본 양태의 바람직한 양식에 따라, 영양 완전배지 또는 최소배지는 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 각각 약 150 ppm 및 석시노니트릴과 푸마로니트릴 각각 약 50 ppm 중 적어도 하나를 함유하는 니트릴 화합물의 제 1 혼합물로 보충된다. 더욱 바람직하게는, 니트릴의 제 1 혼합물은 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 각각 약 150 ppm 및 석시노니트릴 약 50 ppm 농도를 포함한다. 임의로, KCN을 약 10 ppm 농도로 배양배지에 첨가한다.
본 양태의 다른 바람직한 양식에 따라, 영양 완전배지 또는 최소배지를 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 제 1 혼합물로 보충한다(섹션 5.1.1 및 5.1.2 참조).
유용한 영양 완전배지 및 최소배지는 섹션 5.1.1 및 5.1.2에 전술하였다. 시험 미생물은 약 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0의 pH; 및 약 4 내지 55℃, 바람직하게는 15 내지 37℃의 온도를 포함한 조건하에서 배양한다.
니트릴 화합물의 해독정도는 문헌[참조:Fawcett and Scott, 1960, J. Clin. Pathol. 13:156-159]의 기술을 사용하여 암모니아 방출을 측정함으로써 모니터 할 수 있다. 암모니아 방출이 암모니아 또는 암모늄 염의 존재로 해서 측정될 수 없는 경우, 제 2 혼합물에 존재하는 니트릴의 농도는 GLC-FID 등을 포함하여(이에 국한되지 않음) 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 모니터 될 수 있으며, 존재하는 산 화합물의 농도는 산 화합물을 유도체화하고 GCL-FID를 이용하여 유도체화된 산물을 검출함으로써 모니터 될 수 있다. 산은 먼저 알킬화, 에스테르화 또는 실릴화되면 GLC-FID 분석을 위해 유도체화시킬 수 있다(일반적으로, Supelco Chromatography Products catalog, 1997, page 653-656 (Supelco Inc., Bellefonte A) 참조).
아미드 화합물의 혼합물 해독에 유용한 미생물 미생물 스크리닝 방법은 아가 플레이트에서 약 24 내지 48 시간 동안, 시험 미생물을 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 제 1 혼합물로 보충한 영양 완전배지 또는 최소배지 중 잠정 유도된 미생물의 수득을 위한 성장 호조건하에서 배양한 다음; 미생물을 아세트아미드 약 1 내지 20,000 ppm 농도 및 아크릴아미드 약 1 내지 20,000 ppm 농도를 포함하는 제 2 혼합물과 접촉시켜, 혼합물내 아미드 각각의 소멸을 모니터함으로써(여기에서, 제 2 혼합물내 아미드의 소멸은 시험 미생물이 아미드 화합물의 혼합물 해독능을 보유하고 있음을 시사한다) 잠정 유도된 미생물의 아미드 혼합물 해독능을 평가하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 제 2 혼합물은 아세트아미드와 아크릴아미드 각각 50 내지 150 ppm을 포함하며 약 30분 후 아미드 전체의 소멸은 잠정 유도된 미생물이 아미드의 혼합물을 해독하도록 유도되었고 따라서 본 발명에 따른 해독방법에 유용한 미생물임을 시사한다. 가장 바람직하게는, 약 10분 후 제 2 혼합물의 아미드 전체의 소멸은 미생물이 목적하는 능력을 보유함을 시사한다. 미생물이 암모늄 설페이트 존재하에 아미드 화합물의 해독능을 보유하기를 소망하는 경우, 암모늄 설페이트는 약 1 내지 8% 암모늄 설페이트로 제 2 혼합물에 포함된다. 임의로, KCN이 제 2 혼합물에 약 10 ppm으로 첨가될 수 있다.
본 양태의 바람직한 양식에 따라, 영양 완전배지 또는 최소배지는 석시노니트릴 약 50 ppm과 아세트아미드 및 아크릴아미드 각각 약 150 ppm의 혼합물을 함유하는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 제 1 혼합물로 보충된다. 임의로, KCN을 약 10 ppm 농도로 배양배지에 첨가한다.
유용한 영양 완전배지 및 최소배지는 섹션 5.1.1 및 5.1.2에 전술하였다. 시험 미생물은 약 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0의 pH; 및 약 4 내지 55℃, 바람직하게는 15 내지 37℃의 온도를 포함한 조건하에서 배양한다.
아미드 화합물의 해독정도는 문헌[참조:Fawcett and Scott, 1960, J. Clin. Pathol. 13:156-159]의 기술을 사용하여 암모니아 방출을 측정함으로써 모니터 할 수 있다. 암모니아 방출이 암모니아 또는 암모늄 염의 존재로 해서 측정될 수 없는 경우, 존재하는 아미드의 농도는 GLC-FID 등을 포함하여(이에 국한되지 않음) 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 모니터 될 수 있으며, 존재하는 산 화합물의 농도는 산 화합물을 유도체화하고 GLC-FID를 이용하여 유도체화된 산물을 검출함으로써 모니터 될 수 있다. 산은 먼저 알킬화, 에스테르화 또는 실릴화되면 GLC-FID에 의한 분석을 위해 유도체화시킬 수 있다(일반적으로, Supelco Chromatography Products catalog, 1997, page 653-656 (Supelco Inc., Bellefonte PA) 참조).
5.2. 미생물 균주의 성상확인
공지의 공급원으로부터 분리되거나 수득된 후술되는 미생물 균주가 섹션 5.1에서 전술한 바와 같이 본 발명에 따른 다중 유도 후 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 아미드 및/또는 산 화합물로 해독시키는 능력을 지닌 것으로 발견되었다.
하기 표 1과 2는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(미국 메릴랜드 로크빌)으로부터 입수된 두 균주 각각 ATCC 기탁번호 33278 및 ATCC 기탁번호 39484로부터 유도되고, 본 발명에 따른 다중 유도 후 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 상응하는 아미드 및/또는 산 화합물로의 해독능을 보유하는 것으로 발견된 로도코커스 균주 DAP 96622 및 DAP 96253의 특정 균주의 특징을 제시한다. 하나의 설명적인 예로서, 두 로도코커스 균주는 아크릴로니틀, 아세토니트릴 각각 150 ppm, 및 석시노니트릴 50 ppm을 50 ppm KCN과 함께 또는 없이 다중 유도된다.
문헌[참조:Manual of Methods for General Bacteriology, 1981, Philip Gerhardt, ed., Am. Soc. Microbiol., Washington, D.C.]에 기술된 프로토콜에 따라 탄수화물 이용 시험을 수행하였다. 니트릴 이용 시험은 미생물을 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 각각 150 ppm 및 석시노니트릴 50 ppm으로 보충한 영양 완전배지에서 배양함으로써 유도된다. 실질적인 이용 시험은 유일한 탄소 및/또는 에너지원으로서 특정 시험 화합물로 보충한 최소 배지에서 수행된다.
표 1
로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622:
식별 특징 결과
카탈라제/옥시다제 (+)/(-)
시트레이트 이용 (+)
트리플 슈가 아이언 아가 불변
성장온도: 5℃ (-)
25℃ (+)
35℃ (+)
45℃ (+)
당의 이용:글루코스 (+)
슈크로스 (+)
프럭토스 (+)
락토스 (+)
만니톨 (+)
만노스 (+)
아라비노스 (-)
이노시놀 (+), 가스 없음
람노스 (+), 가스 없음
우레아제 (+)
나이트레이트 환원 (-)
젤라틴 가수분해 (-)
항생물질 내성:
젠타마이신 S
에리트로마이신 S
스트렙토마이신 S
토브라마이신 S
리팜핀 S
페니실린 S
테트라사이클린 S
탄소 및 질소의 이용:
유일한 탄소 및 질소원으로서 니트릴을 함유한 스태니어 최소배지
아크릴로니트릴 (150 ppm/300 ppm) (+)/(+)
아세토니트릴 (150 ppm/300 ppm) (+)/(+)
석시노니트릴 (150 ppm/300 ppm) (+)/(+)
푸마로니트릴 (150 ppm/300 ppm) (+)/(+)
아크릴로니트릴/아세토니트릴/석시노니트릴 (150/300 ppm ea) (+)/(+)
아크릴로니트릴/아세토니트릴/푸마로니트릴 (150/300 ppm ea) (+)/(-)
아크릴로니트릴/아세토니트릴/석시노니트릴/푸마로니트릴 (150/300 ppm ea) (-)/(-)
탄소원의 이용
1 g/l 암모늄 설페이트를 함유하는 스태니어 최소배지
P-크레졸 (150/300 ppm) (+)/(+)
톨루엔 (150/300 ppm) (NT)/(NT)
스티렌 (150/300 ppm) (NT)/(NT)
톨루엔/스티렌 (150/300 ppm ea.) (NT)/(NT)
아세테이트 (150/300 ppm) (+)/(+)
아크릴레이트 (150/300 ppm) (+)/(+)
석시네이트 (150/300 ppm) (+)/(+)
푸마레이트 (150/300 ppm) (+)/(+)
탄소원의 이용
1 g/l 암모늄 설페이트를 함유하되 10 ppm KCN도 함유하는 스태니어 최소배지
푸마로니트릴 (150/300 ppm) (+)/(+)
석시노니트릴 (150/300 ppm) (+)/(+)
암모늄 설페이트는 함유하지 않고 10 ppm KCN만을 함유하는 스태니어 최소배지
푸마로니트릴 (150/300 ppm) (+)/(+)
석시노니트릴 (150/300 ppm) (+)/(+)
표 2
로도코커스 종 균주 DAP 96253:
식별 특징 결과
카탈라제/옥시다제 (+)/(-)
시트레이트 이용 (+)
트리플 슈가 아이언 아가 불변
성장온도: 5℃ (-)
25℃ (+)
35℃ (+)
45℃ (+)
당의 이용:글루코스 (+)
슈크로스 (+)
프럭토스 (+)
락토스 (+)
만니톨 (+)
만노스 (+)
아라비노스 (-)
이노시놀 (+), 가스 없음
람노스 (+), 가스 없음
우레아제 (-)
나이트레이트 환원 (-)
젤라틴 가수분해 (-)
항생물질 내성:
젠타마이신 I*
에리트로마이신 S
스트렙토마이신 S
토브라마이신 S
리팜핀 S
페니실린 S
테트라사이클린 S
*I는 감수성과 내성의 "중간"을 의미함.
탄소 및 질소의 이용:
유일한 탄소 및 질소원으로서 니트릴을 함유한 스태니어 최소배지
아크릴로니트릴 (150 ppm/300 ppm) (+)/(+)
아세토니트릴 (150 ppm/300 ppm) (+)/(+)
석시노니트릴 (150 ppm/300 ppm) (+)/(-)
푸마로니트릴 (150 ppm/300 ppm) (+)/(-)
아크릴로니트릴/아세토니트릴/석시노니트릴 (150 ppm/300 ppm ea) (+)/(+)
아크릴로니트릴/아세토니트릴/푸마로니트릴 (150/300 ppm ea) (-)/(-)
아크릴로니트릴/아세토니트릴/석시노니트릴/푸마로니트릴 (150/300 ppm ea) (-)/(-)
탄소원의 이용:
1 g/l 암모늄 설페이트를 함유하는 스태니어 최소배지
P-크레졸 (150/300 ppm) (+)/(+)
톨루엔 (150/300 ppm) (+)/(+)
스티렌 (150/300 ppm) (+)/(+)
톨루엔/스티렌 (150/300 ppm ea) (+)/(+)
아세테이트 (150/300 ppm) (+)/(+)
아크릴레이트 (150/300 ppm) (+)/(+)
석시네이트 (150/300 ppm) (+)/(+)
푸마레이트 (150/300 ppm) (+)/(+)
탄소원의 이용
1 g/l 암모늄 설페이트를 함유하되 10 ppm KCN도 함유하는 스태니어 최소배지
푸마로니트릴 (150/300 ppm) (+)/(+)
석시노니트릴 (150/300 ppm) (+)/(+)
탄소원의 이용
암모늄 설페이트는 함유하지 않고 10 ppm KCN만 함유하는 스태니어 최소배지
푸마로니트릴 (150/300 ppm) (+)/(+)
석시노니트릴 (150/300 ppm) (+)/(+)
하기 표에서와 같이 성상확인된 하기 미생물 균주는 본 발명에 따른 다중 유도 후 니트릴 화합물의 혼합물, 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물, 및/또는 아미드의 혼합물의 상응하는 아미드 및/또는 산 화합물로의 해독능을 보유하는 것으로 발견되었다. 이들 미생물의 분리에 관해서는 WO96/18724에 기재되어 있다. 간략히 말하면, 200 개체 이상의 분리된 순수한 미생물 분리체가 동일 공업용 부지에서의 오염토로부터 배양된다. 이들 순수 분리체 모두를 합하여 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물의 혼합물을 함유하는 슬러지/폐기물과 배양한다. 미생물의 혼합 배양균을 배양물질로부터 회수하고 BACTOTMR2A 배지(Difco, 미국 미시건 디트로이트)에서 유지시킨다.
아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁되어 있고 ATCC 기탁번호 55644를 배정 받은 DAP-2로 명명된 혼합 배양균은 적어도 하기 화합물 또는 이들의 혼합물을 호기성 분해한다: 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 2-, 3- 또는 4-클로로톨루엔, 2-, 3- 또는 4-클로로벤조에이트, 1,3-디클로로벤조에이트, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-디니트로벤젠, 1-클로로-3-니트로벤젠, 1-클로로-4-니트로벤젠, 1- 또는 2-메틸나프탈렌, 피렌, 아세나프틸렌, 플루오란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조푸란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 시나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-시남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 멜라민, 시아누르산, δ-(-)-리모넨, 헥사데칸, 메탄올, 포름알데히드, 및 클로로포름.
니트로벤젠, 나프탈렌, 및 톨루엔 각각 150 ppm으로 보충한 BACTOTMR2A 배지상에 단일 콜로니를 분리함으로써 DAP 2로 명명된 혼합 배양균으로부터 하기 순수 배양균이 분리되고 성상확인된다.
미생물 DAP 623:
DAP 623은 그램 음성 운동성 간상균으로, 일반적으로 소형의 단일 간상균이지만, 간혹 쌍으로도 관찰된다. 염색은 비균일할 수 있고 약간의 플록(floc) 형성이 존재한다. 콜로니는 BACTOTMR2A 배지상에서 흰색 내지 크림색으로 나타난다. 추가로, 이러한 유기체는: 메시틸렌, 락테이트, 석시네이트, 리모넨, m-톨루산, 클로로벤젠, 살리실레이트, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 및 4-클로로벤조산, 및 1,3-디클로로벤젠을 유일한 탄소 및 에너지원으로 이용할 수 있다. DAP 623은 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁되어 있고 ATCC 기탁번호 55722를 배정 받았으며 표 3에서와 같이 추가로 성상확인된다.
표 3
DAP 623
식별 특징 결과
카탈라제/옥시다제 (+)/(-)
시트레이트 이용 (+)
트리플 슈가 아이언 아가 글루코스로부터 산
성장온도: 15℃ (+)
25℃ (+)
35℃ (+)
41℃ (+)
당의 이용:글루코스 (+)
프럭토스 (+)
락토스 (-)
만니톨 (+)
만노스 (+)
2-메틸나프탈렌 (-)
α-케토글루타레이트 (+)
글루타메이트 (+)
에탄올 (-)
헥사데칸 (-)
NO3→NO2(+)
아르기닌 데카복실라제 (+)
라이신 데카복실라제 (+)
오르니틴 데카복실라제 (+)
젤라틴 가수분해 (+)
우레아제 (+)
항생물질 내성:
HgCl2(-)
앰피실린 R
카나마이신 (-)
테트라사이클린 R
스펙티노마이신 R
스트렙토마이신 (-)
미생물 DAP 626:
DAP 626은 크기가 다양하고 단독으로 또는 쌍으로 출현하는 그램 가변성 간상균이다. 편모판에서의 성장이 관찰되며 이는 편모 운동성을 시사한다. 또한, 이러한 유기체는 유일한 탄소 및 에너지원으로 메시틸렌, 락테이트, 석시네이트, 리모넨, 시나밀 아세테이트, 카테콜, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2- 3-, 및 4-클로로벤조산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 626은 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁되어 있고 ATCC 기탁번호 55723를 배정 받았으며 표 4에서와 같이 추가로 성상확인된다.
표 4
DAP 626
식별 특징 결과
카탈라제/옥시다제 (+)/(+)
시트레이트 이용 (-)
트리플 슈가 아이언 아가 H2S 생성
성장온도: 15℃ (+)
25℃ (+)
35℃ (+)
41℃ (+)
당의 이용:글루코스 (-)
프럭토스 (+)
락토스 (-)
만니톨 (+)
만노스 (-)
2-메틸나프탈렌 (-)
α-케토글루타레이트 (+)
글루타메이트 (+)
에탄올 (+)
헥사데칸 (+)
NO3→NO2(-)
아르기닌 데카복실라제 (-)
라이신 데카복실라제 (-)
오르니틴 데카복실라제 (-)
젤라틴 가수분해 (-)
우레아제 (+)
항생물질 내성:
HgCl2(-)
앰피실린 R
카나마이신 (-)
스펙티노마이신 (-)
스트렙토마이신 R
미생물 DAP 629:
DAP 629는 거의 구균-간균성인 그램 음성의 소형 운동성 간상균이다. 콜로니는 BACTOTMR2A 아가 상에서 성장될 때 약간의 형광성을 띠면서 흰색으로 출현한다. 또한, 이러한 유기체는 유일한 탄소 및 에너지원으로 플루오란트렌, 메시틸렌, 락테이트, 석시네이트, 리모넨, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2- 3-, 및 4-클로로벤조산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 629는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁되어 있고 ATCC 기탁번호 55726를 배정 받았으며 표 5에서와 같이 추가로 성상확인된다.
표 5
DAP 629
식별 특징 결과
카탈라제/옥시다제 (+)/(+)
시트레이트 이용 (-)
트리플 슈가 아이언 아가 발효 없음
성장온도: 15℃ (+)
25℃ (+)
35℃ (+)
41℃ (-)
당의 이용:글루코스 (+)
프럭토스 (-)
락토스 (-)
만니톨 (-)
만노스 (-)
2-메틸나프탈렌 (-)
α-케토글루타레이트 (+)
글루타메이트 (+)
에탄올 (-)
헥사데칸 (-)
NO3→NO2(+)
아르기닌 데카복실라제 (-)
라이신 데카복실라제 (+)
오르니틴 데카복실라제 (-)
젤라틴 가수분해 (+)
우레아제 (-)
항생물질 내성:
HgCl2(-)
앰피실린 R
카나마이신 (-)
테트라사이클린 (-)
스펙티노마이신 (-)
스트렙토마이신 (-)
미생물 DAP 632:
DAP 632는 그램 가변성의 운동성이 있는 가는 간상균으로, 단독으로 및 쌍으로 모두 관찰된다. 콜로니는 BACTOTMR2A 아가 상에서 성장될 때 크림색 내지 황색으로 출현한다. 또한, 이러한 유기체는 유일한 탄소 및 에너지원으로 플루오란트렌, 아세나프탈렌, 메시틸렌, 락테이트, 리모넨, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2- 3-, 및 4-클로로벤조산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 632는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁되어 있고 ATCC 기탁번호 55727를 배정 받았으며 표 6에서와 같이 추가로 성상확인된다.
표 6
DAP 632
식별 특징 결과
카탈라제/옥시다제 (+)/(-)
시트레이트 이용 (+)
트리플 슈가 아이언 아가 발효 없음
성장온도: 15℃ (+)
25℃ (+)
35℃ (+)
41℃ (+)
당의 이용:글루코스 (-)
프럭토스 (-)
락토스 (-)
만니톨 (-)
만노스 (-)
2-메틸나프탈렌 (-)
α-케토글루타레이트 (-)
글루타메이트 (+)
에탄올 (-)
헥사데칸 (-)
NO3→NO2(-)
아르기닌 데카복실라제 (-)
라이신 데카복실라제 (-)
오르니틴 데카복실라제 (-)
젤라틴 가수분해 (+)
우레아제 (+)
항생물질 내성:
HgCl2R
앰피실린 R
카나마이신 R
테트라사이클린 R
스펙티노마이신 R
스트렙토마이신 R
미생물 DAP 115:
DAP 115는 그램 음성의 운동성 간상균이다. 편모판에서 성장이 관찰되며 이는 편모 운동성임을 시사한다. 콜로니는 BACTOTMR2A 아가 상에서 성장될 때 흰색으로 나타나지만 영양 육즙에서는 황색을 띤다. 또한, 이러한 유기체는 유일한 탄소 및 에너지원으로 벤조-(b)-플루오란트렌, 플루오란트렌, 디벤조푸란, 아세나프탈렌, 살리실레이트, 락테이트, 석시네이트, 글리옥실레이트, 메시틸렌, 바닐린, 리모넨, 시나밀 아세테이트, 카테콜, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2- 3-, 및 4-클로로벤조산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 115는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁되어 있고 ATCC 기탁번호 55724를 배정 받았으며 표 7에서와 같이 추가로 성상확인된다.
표 7
DAP 115
식별 특징 결과
카탈라제/옥시다제 (+)/(+)
시트레이트 이용 (+)
트리플 슈가 아이언 아가 H2S 생성
글루코스로부터 산 및 가스
성장온도: 15℃ (+/-)
25℃ (+)
35℃ (+)
41℃ (+)
당의 이용:글루코스 (+)
프럭토스 (+)
락토스 (-)
만니톨 (+)
만노스 (+)
2-메틸나프탈렌 (+)
α-케토글루타레이트 (+)
글루타메이트 (+)
에탄올 (-)
헥사데칸 (+)
NO3→NO2(+)
아르기닌 데카복실라제 (-)
라이신 데카복실라제 (-)
오르니틴 데카복실라제 (+)
젤라틴 가수분해 (+)
우레아제 (+)
항생물질 내성:
HgCl2R
앰피실린 R
카나마이신 R
테트라사이클린 R
스펙티노마이 R
스트렙토마이신 R
미생물 DAP 120:
DAP 120은 그램 음성의 운동성 간상균이다. 편모판에서 성장이 관찰되며 이는 편모 운동성임을 시사한다. 또한, 이러한 유기체는 유일한 탄소 및 에너지원으로 크리센, 피렌, 락테이트, 석시네이트, 글리옥실레이트, 살리실레이트,메시틸렌, 바닐린, 리모넨, 시나밀 아세테이트, 카테콜, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 및 4-클로로벤조산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 120은 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁되어 있고 ATCC 기탁번호 55725를 배정 받았으며 표 8에서와 같이 추가로 성상확인된다.
표 8
DAP 120
식별 특징 결과
카탈라제/옥시다제 (+)/(+)
시트레이트 이용 (+)
트리플 슈가 아이언 아가 H2S 생성
성장온도: 15℃ (+)
25℃ (+)
35℃ (+)
41℃ (+)
당의 이용:글루코스 (+)
프럭토스 (+)
락토스 (-)
만니톨 (+)
만노스 (-)
2-메틸나프탈렌 (+)
α-케토글루타레이트 (+)
글루타메이트 (+)
에탄올 (-)
헥사데칸 (+)
NO3→NO2(+)
아르기닌 데카복실라제 (-)
라이신 데카복실라제 (-)
오르니틴 데카복실라제 (-)
젤라틴 가수분해 (+)
우레아제 (+)
항생물질 내성:
HgCl2R
앰피실린 R
카나마이신 R
테트라사이클린 R
스펙티노마이신 (-)
스트렙토마이신 (-)
하기의 표 9는 DAP 2로 명명된 혼합 배양균에서 분리해 낸 상기 성상확인된 순수 배양균이 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴 각각 150 ppm 단독으로 보충한 스태니어 최소배지상에서 성장할 수 있음을 보여준다. 배양균을 25 내지 27℃에서 성장시키고 14일 후에 콜로니의 크기를 측정한다. 값은 각 측정에 대해 5개의 동일(replicate) 콜로니의 평균을 나타낸다.
표 9
아세토니트릴 및 아크릴로니트릴의 이용
배양균 성장*콜로니 크기
DAP 626 +++ 5.3 mm
DAP 115 +++ 6.3 mm
DAP 632 +++ 6.2 mm
DAP 623 +++ 5.0 mm
DAP 120 +/++a a
DAP 629 +++ 5.3 mm
*++++ 창성, +++ 우수, ++ 양호, + 보통, +/- 빈약, - 비성장으로 점수를 매긴 성장
a균주 DAP 120의 성장이 매우 빈약하지만 신속히 퍼짐, 따라서 정확한 정량이 불가능하였음.
표 9에서 증명되는 바와 같이, 균주는 유일한 탄소 및 질소원으로 아세토니트릴과 아크릴로니트릴을 이용할 수 있다.
5.3. 니트릴 및/또는 아미드 해독을 위한 미생물의 적용 및 이용방법
본 발명의 일 양태에 따라, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법은 본 발명에 따라 다중 유도된 유용한 미생물 균주의 순수 배양균을, 니트릴을 상응하는 아미드로 전환시키기에 충분한 시간 동안 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이와 달리, 방법은 다중 유도된 미생물의 순수 배양균을, 니트릴 및 아미드를 상응하는 산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따라, 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법은 본 발명에 따라 다중 유도된 유용한 미생물 균주의 순수 배양균을, 아미드 화합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키기에 충분한 시간 동안 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
미생물 균주는 성장, 즉 활동적으로 분열할 수 있거나 휴지상태, 즉 활동적으로 분열하지 않거나 생존상태가 아닐 수도 있다. 방법이 미생물의 활동적으로 성장하는 배양균의 이용을 수반하는 경우, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물과의 접촉조건은 세균 증식이 지지되도록 하여야 한다. 이러한 조건에는 예를 들면, 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 8.0의 pH; 4 내지 55℃, 바람직하게는 약 15 내지 37℃의 온도; 포화도 0.1 내지 100%, 바람직하게는 약 4 내지 80%, 더욱 바람직하게는 4 내지 40%의 용존산소 텐션(여기에서, 산소는 산소 함유 또는 산소 방출 조성물을 사용하여 공급될 수 있다)이 포함된다. 산소 함유 또는 산소 방출 조성물은 공기, 순수한 산소, 퍼옥사이드, 또는 산소를 방출하는 기타 퍼옥시 화학약품 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 추가로, 양성 용존산소 텐션이 제공되어 있든 없든 간에 배양배지는 교반되거나 교반되지 않을 수 있다.
방법이 활동적으로 분열하지 않는 미생물 배양균의 사용을 수반하는 경우, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물과의 접촉조건은 니트릴 및/또는 아미드 해독 (효소) 활성이 지지되도록 하여야 한다. 예를 들면, 온도는 약 0 내지 65℃, 바람직하게는 약 4 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 55℃에서 유지된다. pH는 알칼리성 또는 산성일 수 있고 약 pH 6 내지 8의 범위에서 최적으로 유지된다. 이러한 특정 양태는 해독이 성장 의존성이 아니기 때문에 가능하며, 즉, 일단 니트릴 및/또는 아미드 해독활성이 유도되면, 미생물은 해독을 위해 더 이상 성장할 필요가 없다. 이러한 특정 양식은 혐기성 조건하에서 수행될 수 있다.
미생물 균주의 순수 배양균은 해독작용 후 수거와 재사용을 허용하도록 자유 유영보다는 캡슐화 또는 고정시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 미생물 균주는 고정된다. 순수 배양균은 흡착, 정전기 결합, 공유결합 등에 의해, 해독반응 혼합물로부터 미생물의 회수에 조력하는 고체 지지체상에 고정시킬 수 있다. 적절한 고체 지지체에는 입상 활성탄, 퇴비, 나무 찌꺼기, (예를 들면, 나무 토막, 너깃 nugget, 조각난 짚 또는 수목), 알루미나, 루테늄, 철 옥사이드, 이온 교환 수지, (예를 들면, AmberliteTMIRA-93 또는 IRA-96(Rohm & Haas), DOWEXTM(Dow Chemical Co., Inc.), DEAE 셀룰로스, DEAE-SEPHADEXTM(Pharmacia, Inc.), 세라믹 비드, 폴리아크릴아미드 비드 또는 큐브, 알기네이트 비드, κ-카라기난 큐브 및 고유 자기력에 기인하여 수용액으로부터 회수될 수 있는 고체 입자가 포함되며 이에 국한되지는 않는다. 알기네이트 비드는 Ca++알기네이트 비드 또는 경화 알기네이트 비드일 수 있다. κ-카라기난 큐브는 경화 κ-카라기난 큐브일 수 있다. 설명적인 예로서, 유도된 미생물의 순수 배양균을 나트륨 알기네이트 용액 및 칼슘 클로라이드와 혼합시켜 미생물을 알기네이트 비드에 고정시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 유도된 미생물은 폴리에틸렌 이미드와 가교결합된 알기네이트 비드에 고정되거나 폴리아크릴아미드계 중합체에 고정된다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법은 본 발명에 따라 다중 유도된 유용한 미생물 균주의 순수 배양균 추출물을, 니트릴을 상응하는 산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이와 달리, 방법은 다중 유도된 미생물의 순수 배양균 추출물을, 니트릴 및 아미드 화합물을 상응하는 산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 추출물은 개별 미생물의 조 추출물이다. 미생물 추출물은 하기의 방법을 포함하여(이에 국한되지는 않음) 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 제조된다: 유도된 미생물의 순수 배양균 샘플의 세포를 예를 들면, 음파처리에 의해 , 프렌치 프레스를 이용한 분쇄 등에 의해 붕괴시켜 세포 용해물을 생성시킨다. 용해물을 여과하거나 원심분리하여 세포 파편 및 비용해 세포를 제거시켜 조 추출물을 수득한다. 용해물은 또한 완전 세포에 대해 전술한 바와 같이 고정시킬 수 있거나 효소 고정에 사용하기 위한 공지 기술을 이용하여 고정시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법은 본 발명에 따라 다중 유도된 유용한 미생물 균주의 순수 배양균 추출물을, 아미드를 상응하는 산으로 전환시키기에 충분한 시간 동안 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 추출물은 개개 미생물의 조 추출물이다. 미생물의 추출물은 하기 방법을 포함하여(이에 국한되지는 않음) 당업자에 공지된 방법에 의해 제조된다: 유도된 미생물의 순수 배양균 샘플의 세포를 예를 들면, 음파처리에 의해, 프렌치 프레스를 이용한 분쇄 등에 의해 붕괴시켜 세포 용해물을 생성시킨다. 용해물을 여과하거나 원심분리하여 세포 파편과 비용해 세포를 제거하여 조 추출물을 수득한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 유도된 섹션 5.2에서 상세하기 기술한 미생물의 순수 배양균 또는 추출물을 본 발명의 방법에 사용한다. 이와 달리, 섹션 5.1.3에 전술한 스크리닝 방법을 이용하여 동정된, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있는 미생물의 순수 배양균 또는 추출물이 본 발명의 방법에 사용된다.
본 발명의 방법은 당업자에 공지된 임의 방법, 예를 들면, 아미드 검출을 위한 GLC-FID 및 산 화합물 검출을 위한 HPLC에 의해 니트릴 화합물의 전환 및/또는 아미드 화합물의 동시 출현의 모니터링 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상응하는 산으로의 해독작용으로 최초에 존재하는 각각의 니트릴 또는 아미드 그룹에 대한 암모니아의 화학량론적 생성이 일어난다. 니트릴 화합물 또는 아미드 화합물의 해독정도는 문헌[참조:Fawcett and Scott, 1960, J. Clin. Pathol. 13:156-159]의 기술을 이용하여 암모니아 방출을 측정함으로써 모니터될 수 있다. 암모니아 방출이 암모니아 또는 암모늄 염의 존재로 해서 측정될 수 없는 경우, 존재하는 니트릴과 아미드의 농도는 GLC-FID 등을 포함하여(이에 국한되지 않음) 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 모니터 될 수 있다. 이와 달리, 니트릴 화합물의 소멸은 산 화합물을 유도체화하고 GLC-FID를 이용하여 유도체화된 산물을 검출함으로써 모니터 될 수 있는 상응하는 산 화합물의 생성을 평가함으로서 측정될 수 있다. 아미드 및 산은 먼저 알킬화, 에스테르화 또는 실릴화되면 GLC-FID 분석을 위해 유도체화시킬 수 있다(일반적으로, Supelco Chromatography Products catalog, 1997, page 653-656 (Supelco Inc., Bellefonte PA) 참조).
해독시키고자 하는 니트릴 화합물 및/또는 니트릴 및 아미드 화합물 및/또는 아미드 화합물은 고체, 액체, 및/또는 가스 형태일 수 있다. 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물이 가스 및/또는 액체 형태일 경우, 고체와 같은 물질에 흡착시킬 수 있다. 필요하다면, 니트릴을 함유하는 조성물의 pH는 미생물 또는 추출물과 접촉시키기에 앞서 중성, 즉 pH 약 6 내지 약 8로 조정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 적용에서, 해독방법은 니트릴 생산설비로부터의 수성 폐 스트림내 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물의 해독에 사용된다. 이러한 적용의 일 양식에서, 설비는 아크릴로니트릴을 생산한다. 아크릴로니트릴은 프로펜 (a/k/a 프로필렌) 또는 프로판의 직접 암목시드화에 의해 상업적으로 생산될 수 있다. 프로펜의 직접 암목시드화의 일례는 SOHIO/BP 공정에 의해 구현된다[참조문헌:Acrylonitrile, Process Economics Report, Stanford Research International, Menlo Park, CA, 1979; Weissermel and Arpe, 1978, Industrial Organic Chemistry, Verlag Chemie-Weinheim New York, pp. 266-270].
전형적으로, 니트릴 생산설비의 폐수 스트림은 디니트릴을 포함하여 니트릴과 아미드의 혼합물 고농도, 및 아크롤레인 시아노히드린 및 암모늄 설페이트를 함유한다. 예를 들면, 전형적인 폐수 스트림, 예를 들면, SOHIO 공정을 이용하는 아크릴로니트릴 생산설비로부터의 폐수 칼럼 바닥물질(WWCB)은 대략 1230 mg/l의 아크릴로니트릴, 4500 mg/l의 아세토니트릴, 1490 mg/l의 아크릴아미드, 1070 mg/l의 아크롤레인(아크롤레인 시아노히드린 형태), 547 mg/l의 석시노니트릴, 1446 mg/l의 푸마로니트릴 및 335 mg/l의 전 시아나이드 및 5 내지 8%의 암모늄 설페이트를 함유한다.
표 10은 SOHIO/BP 아크릴로니트릴 생산설비로부터의 전형적인 폐수 스트림(AN 폐수)내 니트릴 및 아미드 화합물의 농도 범위를 예시한다.
표 10
폐수 샘플내 대표적인 화합물의 범위
NSB†ppm WWCB†ppm
아크롤레인 10-100 50-1200
아크릴아미드 10-130 1100-1500
프로피오니트릴 ≤20 10-150
아세토니트릴 0-3000 20-4500
아크릴로니트릴 5-180 10-1250
석시노니트릴 300-40,000 50-5000
푸마로니트릴 ≤100 20-1500
†NSB = 네트 스트리퍼 바닥물질; WWCB = 폐수 칼럼 바닥물질.
본 발명의 방법에 의해 해독시킬 수 있는 공업용 니트릴 생산 폐기물의 다른 일례는 아크릴로니트릴 50 내지 300 ppm; 아크릴아미드 0 내지 400 ppm; 아세토니트릴 200 내지 5500 ppm; 아크롤레인 0 내지 300 ppm; 프로피오니트릴 0 내지 100 ppm; 석시노니트릴 100 내지 1500 ppm; 푸마로니트릴 0 내지 40 ppm 및 적어도 하나의 반응성 CN 잔기를 포함한다.
유도된 균주는 폐 스트림에서 발견되는 고농도의 니트릴 및/또는 아미드 화합물을 해독시킬 수 있다. 암모늄 설페이트의 존재 또는 부재는 본 발명의 해독방법을 방해하지 않는다. 더욱이, 본 해독방법에 사용된 다중 유도된 미생물은 고농도의 니트릴 및/또는 아미드를 큰 속도와 효율로 해독시킬 수 있다. 해독율은 농도가 해독방법 진행 중에 반응 혼합물에서 발견된 350 내지 60,000 ppm 범위, 1,000 내지 60,000 ppm 범위, 또는 30,000 내지 60,000 ppm 총 니트릴 및/또는 아미드인 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물에 존재하는 각각의 개개 니트릴 또는 아미드 화합물 약 30 내지 50 ppm/분이다.
본 발명의 다른 바람직한 적용에서, 해독방법은 불필요하거나 원하지 않는 니트릴 화합물을 함유하는 아세트아미드 또는 아크릴아미드 제제를 포함하여(이에 국한되지는 않음) 아미드 제제로부터 니트릴 제거에 사용된다. 이러한 적용은 아미드 생산설비에서 생산되는 아미드 제제와 같은 아미드 제제의 정제에 특히 유용하다. 아미드 제제의 일례는 아크릴로니트릴 또는 아세토니트릴과 같은 원하지 않는 니트릴 화합물을 함유할 수 있는, 아크릴로니트릴로부터 상업적인 아크릴아미드 생산설비에서 생산된 아크릴아미드 제제이다. 최종 산물인 아크릴아미드는 상당량의 아크릴로니트릴 및 저수준의 아세토니트릴을 함유할 수 있다. 예를 들면, 상업용 30 내지 50% 아크릴아미드 용액의 경우 아크릴로니트릴은 일반적으로 100 ppm 이상 1,000 ppm 이하이다. 다중 유도된 미생물의 아미드의 상응하는 산으로의 해독능은 미생물이 본 적용에 사용될 수 있기 전에 불활성화시키거나 파괴시켜야 한다. 아미드 해독활성이 약 55 내지 60℃에서 열에 민감하므로, 다중 유도된 미생물은 아미드 제제와 접촉시키기 전이나 이와 동시에 바람직하게는 적어도 약 55 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 약 60 내지 100℃로 가열시킨다. 아미다제 불활성화는 60 내지 100℃에서 다양한 시간 동안 가열한 뒤에 모니터 할 수 있고 니트릴히드라타제 및 아미다제 활성을 측정하여 불활성화를 위한 최적기를 결정한다. 주어진 온도에서의 불활성화기는 세포 또는 추출물의 농도 및 혼합도에 좌우될 것이다. 적기의 결정은 당해분야의 기술내에 잘 들어온다. 바람직한 양식에서, 다중 유도된 미생물을 아미드 제제와의 접촉에 앞서 약 70 내지 100℃로 수 차례, 예를 들면, 100℃에서 10초간 약 3회 가열시킨다.
또한, 해독방법은 바람직하게는 니트릴 화합물의 상응하는 아미드 화합물로의 한층 더 신속한 전환을 일으키는 4 내지 80℃, 바람직하게는 25 내지 70℃의 온도에서 수행된다. 예를 들면, 탄수화물, 우레아 및 코발트와 아크릴로니트릴, 아세토니트릴 및 석시노니트릴을 각각 150, 150 및 50 ppm, 및 임의로 KCN 또는 NaCN을 10 ppm 함유하는 성장배지를 이용하여 유도된 다중 유도된 미생물을 신선하고, 안정화되거나 고정된 세포 또는 추출물로 사용할 수 있다. 고정은 바람직하게는 폴리아크릴아미드 또는 경화 알기네이트에서 수행된다. 원하지 않는 니트릴의 제거공정은 아크릴아미드와 같은 아미드가 생성될 때 또는 포장 후 또는 선적 및/또는 보존 중을 포함하여 생산이 완료된 후 달성될 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 적용에서, 해독방법은 아크릴아미드와 같은 아미드의 화학 합성 생산공정의 일부와 병합된다. 따라서, 본 적용은 아크릴아미드와 같은 아미드의 하이브리드 화학/생물학적 생산방법을 제공한다. 본 적용의 일 양태에 따라, 아크릴아미드 생성을 위해 촉매의 존재하에 공기 중에서 암모니아 증기에 의한 프로펜(a/k/a 프로필렌)의 직접 암목시드화를 수반하는 SOHIO/BP 공정(일반적으로, Acrylonitrile,, 1979; Weissermel and Arpe, 1978, supra 참조)과 같은 화학합성 공정이 아크릴아미드 약 30% 이상 및 아크릴로니트릴 10% 이하를 포함하는 중간체 용액의 생산에 사용된다. 대략 30% 이상의 아크릴아미드 및 약 10% 이하의 아크릴로니트릴의 중간체 용액을, 아크릴로니트릴의 양이 약 100 ppm 이하로 감소되도록 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환시키기에 충분한 시간 동안 다중 유도된 미생물 또는 이의 추출물과 접촉시킨다. 생성 용액은 약 50% 아크릴아미드 및 100 ppm 이하의 아크릴로니트릴을 함유한다. 다중 유도된 미생물의 아크릴아미드를 아크릴산으로 해독시키는 능력을 바람직하게는 미생물이 본 적용에 사용될 수 있기 전에 불활성화시키거나 파괴시킨다. 아미드 해독활성이 약 55 내지 60℃에서 열에 민감하므로, 다중 유도된 미생물은 용액과 접촉시키기 전이나 이와 동시에 바람직하게는 적어도 약 55 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 약 60 내지 100℃로 가열시킨다. 바람직한 양식에서, 다중 유도된 미생물을 용액과의 접촉에 앞서 약 70 내지 100℃로 수 차례, 예를 들면, 100℃에서 10초간 약 3회 가열시킨다. 추가로, 이러한 방법은 바람직하게는, 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 한층 더 신속한 전환을 일으키는 50℃보다 높은 온도에서 수행된다.
이러한 하이브리드 화학/생물학적 합성 적용은 향상된 처리시간, 저비용, 화학 공정 동안 형성된 아크릴로니트릴을 전환시키기 위한 다중 화학 공정에 대한 필요성 제거, 및 10 ppm 이하의 아크릴로니트릴을 함유하도록 아크릴아미드 용액을 정화시킬 필요성의 제거면에서 아크릴아미드의 완전 화학적 생산방법에 비해 상당히 향상된다. 이러한 적용은 바람직하게는 합성의 뱃치 공정 또는 다단계 뱃치 또는 반-연속식에 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 적용에서, 해독방법은 아세토니트릴 부타디엔 스티렌 공중합체(ABS 공중합체)의 제제로부터 아세토니트릴의 제거에 사용된다. 이러한 적용은 ABS 공중합체의 정제에 특히 유용하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 적용에서, 해독방법은 불필요하거나 원하지 않는 아미드 단량체를 함유하는 폴리아미드 또는 중합된 아미드 제제내의 아미드 단량체를, 예를 들면, 당업자에게 공지된 화학적 분리방법에 의해 제제로부터 용이하게 제거시킬 수 있는 상응하는 단량체 산 화합물로 전환시키는 데 사용된다. 예를 들면, 아크릴아미드는 암모늄 염으로서 용이하게 제거되는 아크릴산으로 전환시킬 수 있다. 이러한 적용은 폴리아크릴아미드 제제 또는 아크릴아미드를 함유하는 공중합체와 같은 폴리아미드 또는 중합된 아미드 제제의 정제에 특히 유용하다.
유도된 미생물 균주와 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물의 접촉방법은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 접촉방법은 폐쇄 용기 또는 컨테이너에서의 접촉 또는 유도 균주를 함유하는 장치와의 접촉 등을 포함하며 이에 국한되지는 않는다.
에너지는 예를 들면, 혼합에 의한 기계 에너지 부여; 음향 에너지 부여; 예를 들면, 유체에 정상 음파를 셋업시켜; 또는 전기장 또는 정전기장 부여에 의해 부여될 수 있다.
니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴과 이미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물과 미생물의 다중 유도된 순수 배양균을 전술한 바와 같이 세균 성장 및 목적 화합물의 해독을 촉진하는 조건하에서 유지시킬 수 있다.
이와 달리, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물과 미생물의 다중 유도된 순수 배양균은 반드시 세균 성장을 촉진하지는 않지만 다중 유도된 미생물의 (효소적) 니트릴 히드라타제, 아미다제, 및/또는 니트릴라제 활성을 지지하는 조건하에서 유지시킬 수 있다. 예를 들면, 온도는 약 0 내지 65℃, 바람직하게는 약 4 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 55℃로 유지시킬 수 있다. pH는 약 pH 6 내지 8 범위에서 최적으로 유지된다. 이러한 조건은 해독작용이 성장 의존성이 아니기 때문에 가능하며, 즉 일단 니트릴 및/또는 아미드 해독활성이 유도되면 미생물은 해독을 위해 더 이상 성장해야 할 필요가 없다. 아울러, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물과 미생물의 다중 유도된 순수 배양균을 혐기성 조건하에 유지시킬 수도 있다.
상이한 시점에서 샘플을 채취하여 당업자에 공지된 방법, 예를 들면, GLC-FID 등에 의해 선택된 니트릴 및/또는 아미드 화합물의 농도를 측정할 수 있다.
5.3.1. 작동방식
본 발명의 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 해독방법은 뱃치식, 순차적 뱃치식, 연속 또는 반-연속식 및 바이오필터를 이용한 통류를 포함하여 다양한 방식으로 작동될 수 있다.
모든 작동방식에 있어서, 내용물의 샘플은 해당 화합물의 해독작용을 모니터하기 위해 주기적으로 채취될 수 있다. 또한, 반응기 내용물의 교반 및/또는 혼합은 발포를 유도할 수도 있다. 이러한 경우에 발포 방지를 위해 소포제를 첨가할 수 있다. 적당한 소포제로는 예를 들면, 실리콘 함유 소포제 에멀션(예를 들면, Dow ANTIFOAM-AR; 실리콘계 소포제)가 포함된다.
5.3.1.1. 뱃치식 작동
뱃치식 작동은 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물, 예를 들면, 아세토니트릴, 아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 푸마로니트릴, 석시노니트릴, 시아나이드, 벤조니트릴, 부티로니트릴, 아크롤레인 (혼합물 중에 아크롤레인 시아노히드린 형태로 존재) 및 크로토노니트릴로 이루어진 그룹 중에서 선택된 둘 이상의 니트릴을 함유하는 유체를 바이오 반응기와 같은 용기에 넣고, 섹션 5.1에서 기술한 바와 같이 유도된 미생물로 접종한 다음 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물이 해독되도록 혼합물을 배양하여 미생물을 배양시키는 단계를 수반한다. 일정기간 경과 후, 배양을 중단하고 내용물을 제거하며 고체가 존재하면 여과에 의해 액체로부터 분리해낸다. 이어서, 니트릴 및/또는 아미드 화합물의 수준을 평가하고 니트릴 및/또는 아미드 화합물이 해독되었는지를 확인하기 위하여, 고체 및 액체상 모두로부터 샘플을 취하여 예를 들면, GLC-FID에 의해 시험할 수 있다. 뒤이어 반응기 고체를 탈수시켜 예를 들면, 쓰레기 매립 처리로 추가 처리시키거나 후속 뱃치식을 위한 세균 접종물로 사용할 수 있다. 뱃치식에서, 탈수 고체 잔류물은 약 2 내지 40 중량% 또는 용량%, 바람직하게는 약 5 내지 20%로 재첨가된다. 공기 또는 산소를 반응기 및 바이오 반응기내 기계적으로 교반된 내용물 중으로 펌프질 할 수 있다.
5.3.1.2. 순차적 뱃치식 작동
순차적 뱃치식은 배양기간 종료 후 반응기를 일정시간, 보통 약 15분간 침강시키고, 반응기 내용물의 상부 60 내지 95%를 제거하여, 존재할 경우 침강 고체를 중화된 유체의 후속 뱃치를 위한 접종액으로서 바닥에 남기는 것을 제외하고는 뱃치식과 동일하게 작동된다. 바람직하게는 내용물의 70 내지 90%가 배출된다. 순차적 뱃치식은 지연기 또는 순응기가 감소되고, 고수준의 바이오매스가 반응기에 보유되며, 폐 공급물 조성의 다양성이 더 잘 받아들여지며, 생물학적 처리 후에 잔류하는 잔류 고체가 잠재적으로 감소되기 때문에 유체 해독을 위한 바람직한 양태이다.
5.3.1.3. 반-연속/연속식
반-연속/연속식은 두 뱃치식 및 순차적 뱃치식과 유사하다. 그러나, 일정기간 경과 후 배양을 중단하기보다는, 바이오 반응기에서 처리 유체가 배출됨에 따라 소정 기간에 걸쳐 일정량으로 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 함유하는 신선한 유체를 바이오 반응기 중으로 펌프질한다. 이러한 작업은 해독과정을 중단함이 없이 유체의 연속처리를 제공한다.
5.3.2. 바이오필터
본 발명의 다른 양태는 바이오필터를 제공한다. 바이오필터는 공기, 증기, 에어로졸, 및 물 또는 수용액과 같은 유출물 중의 니트릴 화합물의 혼합물, 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 및 아미드 화합물의 혼합물의 해독에 사용된다. 예를 들면, 휘발성 니트릴 화합물이 존재하면, 휘발물질은 이들이 발견되는 고체나 수용액으로부터 스트리핑시킬 수 있으며 휘발물질이 바이오필터에 포획되는 방식으로 소정의 단계를 수행하여야 한다. 일단 포획되면, 휘발물질은 후술하는 바와 같이 미생물 균주의 순수 배양균으로 해독시킬 수 있다. 이러한 양태의 일 양식에서, 고전형 바이오필터가 사용될 수 있으며, 여기에서 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 함유하는 공기는 바이오필터 장치를 통해 통과된다. 이러한 양태의 다른 양식에서는, 세류층(細流層) 바이오필터가 사용될 수 있는데, 여기에서 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 함유하는 공기 및 수용액은 바이오필터 장치를 통해 통과된다.
본 발명의 바이오필터는 본 발명의 방법에 따라 유도된 미생물의 순수 배양균, 또는 이의 추출물이 고체 지지체 상에 고정된 장치를 포함한다. 미생물은 활동적으로 분열되거나 활동적으로 분열되지 않을 수 있다. 미생물은 또한 바이오필터 장치와 조합하기에 앞서 동결건조시킬 수 있다. 적절한 고체 지지체에는 입상 활성탄, 퇴비, 나무 찌꺼기, (예를 들면, 나무 토막, 너깃, 조각난 짚 또는 수목), 알루미나, 루테늄, 철 옥사이드, 이온 교환 수지, (예를 들면, AmberliteTMIRA-93 또는 IRA-96 (Rohm & Haas), DOWEXTM(Dow Chemical Co., Inc.), DEAE 셀룰로스, DEAE-SEPHADEXTM(Pharmacia, Inc.), 세라믹 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 알기네이트 비드, κ-카라기난 큐브 및 고유 자기력에 기인하여 수용액으로부터 회수될 수 있는 고체 입자가 포함되며 이에 국한되지는 않는다. 바람직하게는 고체 지지체는 폴리에틸렌 이미드와 가교결합된 알기네이트 비드이다. 바이오필터 장치는 처리될 물질이 장치를 통해 흐를 수 있도록 유입 및 배출구를 구비할 수 있다. 바람직한 양태로서, 고체 지지체에 부착된 미생물은 본 발명에 따라 유도되는, ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
바이오필터는 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 함유하는 유출물을, 본 발명에 따라 유도된 미생물의 순수 배양균 또는 이의 추출물이 고체 지지체 상에 고정되어 있는 장치를 포함하는 바이오필터를 통해 유동시키는 단계를 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 방법은 니트릴 및/또는 아미드 화합물이 실제로 해독되었는지를 결정하기 위한 유출물 모니터 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 고체 지지체에 부착되는 미생물은 본 발명에 따라 유도되는, ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
5.4. 키트
본 발명은 다중 유도되고 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있는 미생물 균주의 순수 배양균을 포함하는 키트를 제공한다. 미생물 균주는 활동적으로 분열하거나 동결건조되거나 동결될 수 있고 니트릴 및/또는 아미드 화합물을 함유하는 수용액에 직접 첨가될 수 있다. 바람직한 양태에서, 키트는 유도된 동결건조 균주를 포함한다. 균주는 또한 입상 활성탄, 나무 토막, 알루미나, 루테늄, 철 옥사이드, 세라믹 또는 알기네이트 비드 및 고유 자기력에 기인하여 수용액으로부터 회수될 수 있는 고체 지지체를 포함한 고체 지지체에 고정시킬 수 있다. 기타 키트 성분으로는 예를 들면, 미생물의 유도를 위한 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 및 당업자에게 익히 공지되어 있는 바이알, 포장성분 등과 같은 키트 성분이 포함될 수 있다.
하기 실시예는 단지 설명을 위해 제시될 뿐이며 어떠한 식으로도 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
6. 실시예: 해독능에 미치는 상이한 유도 혼합물의 영향
본 실시예는 예로 든 미생물, 즉 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 해독능에 미치는 상이한 유도 혼합물의 효과를 설명한다.
미생물 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 순수 배양균은 이 균주를 표 11에 요약한 상이한 유도 혼합물 중 하나로 보충한 영양 완전 YEMEA 배지(효모 추출물 4.0 g; 말트 추출물 10 g; 덱스트로스 4.0 g; 아가 20 g 및 증류수 1.0 리터) 아가 플레이트에서 성장시킴으로써 상기 섹션 5.1에 기술된 바와 같이 다중 유도시킨다. 세포를 플레이트로부터 수거하여 원심분리하고 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척한다.
미생물 균주는 상이하게 유도된 세포를 소형 뱃치 반응에서 25℃에서 반응성 CN 잔기의 존재하에 164 ppm 아크릴로니트릴, 160 ppm 아세토니트릴, 51 ppm 아크릴아미드, 54 ppm 아크롤레인, 51 ppm 푸마로니트릴, 및 102 ppm 석시노니트릴을 함유하는 시험 혼합물 해독능에 대해 시험함으로써 평가된다.
다중 유도된 세포를 25℃에서 시험 혼합물과 접촉시키고 시험 혼합물에 존재하는 6 종의 초기의 상이한 니트릴 및 아미드 화합물의 소멸을 GLC-FID로 모니터한다.
결과를 표 12에 나타내었다.
유도 혼합물
첨가된 유도제 화합물(ppm) B,K A C D E F G H I J
아세토니트릴 150 150 100 50 200 500 150 150
아크릴로니트릴 150 150 100 50 200 500 150 150
아세트아미드 150
아크릴아미드 150
석시노니트릴 50 50 50 50 50 50 50 50 100 25
푸마로니트릴
해독활성에 미치는 유도 혼합물의 효과
화합물 B,K A C D E F G H I J
아크롤레인 ++++ +++ +++ +++ ++++ +++/++++ +++ +++/++++ ++++ ++++
아세토니트릴 ++++ ++/+++ ++++ +++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++
아크릴로니트릴 ++++ ++/+++ ++++ +++ +++ ++/+++ ++++ ++++ ++++ ++++
아세트아미드* ++++ +++ +++ +++ +++ +++ +++/++++ +++ +++ ++++
아크릴아미드 ++++ +++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ ++++ +++ ++++
석시노니트릴 ++++ +++/++++ ++++ +++ +++ +++ +++ ++++ ++++ ++++
푸마로니트릴 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
활성키: + = 경미한 활성, ++ = 보통 활성, +++ = 양호한 활성, ++++ = 우수한 활성.*아세트아미드는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 시험 혼합물에 초기에는 존재하지 않았지만 아세토니트릴의 전환에 의해 형성되었음.
아세토니트릴(150 ppm), 아크릴로니트릴(150 ppm) 및 석시노니트릴(50 ppm)의 유도 혼합물은 시험된 조건하에서 최상의 해독활성을 부여하였다. 아크릴로니트릴 또는 아세토니트릴 중 하나의 제거는 그 특정 니트릴 화합물에 대한 해독활성을 제거하지 않았다. 그러나, 모노-니트릴 화합물 중 하나가 유도 혼합물로부터 생략된 경우, 전체 활성은 두 모노-니트릴 모두 존재하였을 때 만큼 크지는 않았다. 유도 혼합물내 아크릴로니트릴 또는 아세토니트릴 수준의 감소는 전환된 니트릴 또는 아미드 화합물의 스펙트럼에 영향을 미치지는 않았지만, 해독활성의 수준을 저하시켰다. 한편, 유도 혼합물내 아크릴로니트릴 또는 아세토니트릴 수준의 증가는 해독활성 수준을 비례적으로 증가시키지는 않았다. 석시노니트릴 농도의 변화는 석시노니트릴에 대한 해독활성에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 좀더 높은 석시노니트릴 농도에서(100 ppm), 아세트아미드 및 아크릴아미드에 대한 활성수준이 다소 감소하였다.
아세토니트릴 및 아크릴로니트릴을 유도 화합물로서 아세트아미드 및 아크릴아미드로 치환시킴은 해독된 니트릴 및/또는 아미드 화합물의 스펙트럼을 감소시키지 않았다. 그러나, 해독활성 수준의 약간의 저하를 가져왔다.
7. 실시예:로도코커스 종 균주 DAP 96253의 니트릴 해독능
본 실시예는 다중 유도된 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 광범위한 해독능을 설명한다. 균주를 150 ppm 아크릴로니트릴, 150 ppm 아세토니트릴 및 50 ppm 석시노니트릴로 보충한 영양 완전 YEMEA 배지 상에서 섹션 5.1에서 기술한 바와 같이 다중 유도시킨다. 세포를 수거하여 세척한 다음 포스페이트 완충 식염수에 재현탁시킨다. 이어서, 세포를 벤조니트릴, 크로토노니트릴, 부티로니트릴 및 아디포니트릴과 개별적으로, 각각 약 100 내지 150 ppm의 농도로 30℃ 및 초기 pH 약 7에서 접촉시킨다. 해독반응을 Fawcett 및 Scott의 방법(전술)에 따라 암모니아 방출에 의해 모니터한다.
10분 안에 벤조니트릴의 니트릴 잔기의 해독이 근본적으로 완료되었다. 크로토노니트릴 및 부티로니트릴의 경우, 니트릴 그룹의 해독이 일어났지만, 덜 신속하고, 즉 10분에 두 화합물의 10 내지 20%만이 해독되었다. 아디포니트릴로는 10분에 어떠한 해독활성도 나타나지 않았다.
이러한 결과는 아세토니트릴, 아크릴로니트릴 및 석시노니트릴을 이용한 다중 유도가 미생물 균주로 하여금 광범위의 니트릴 화합물을 해독하도록 유도함을 보여준다. 더욱이, 결과는 방향족 니트릴 해독활성이 지방족 니트릴을 이용한 다중 유도에 의해 유도될 수 있음을 보여준다.
8. 실시예: 해독에 미치는 반응조건의 효과
본 실시예는 해독반응이 수행될 수 있는 상이한 조건, 예를 들면, 상이한 온도, pH, 암모늄 설페이트 농도, 및 산소의 존재 또는 부재를 설명한다. 본 섹션 실험의 경우, 로도코커스 종 균주 DAP 96253 또는 로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 순수 배양균을 먼저 150 ppm 아세토니트릴, 150 ppm 아크릴로니트릴 및 50 ppm 석시노니트릴로 보충한 영양 완전 YEMEA 배지를 이용하여 섹션 5.1에 기술된 바와 같이 다중 유도시킨 다음 하기 방법에 따라 니트릴 해독활성에 대해 시험한다.
8.1. 온도
상이한 온도에서의 로도코커스 종 균주 DAP 96253에 의한 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴의 해독이 조사된다. 유도된 미생물 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 순수 배양균을 37℃, 40℃ 및 55℃에서 아크릴로니트릴 또는 아세토니트릴을 함유하는 수성 혼합물에 첨가하고 니트릴 화합물의 소멸을 GLC-FID로 모니터한다.
결과(나타내지 않았음)는 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 아세토니트릴 해독능이 시험된 3 가지 온도에서 본질적으로 동일함을 입증한다. 이와 유사하게, 아크릴로니트릴 해독능도 시험된 3 가지 온도에서 동일하다.
다른 실험 세트에서, 니트릴 해독율에 대한 온도 효과를 시험하였다. 다중 유도된 미생물 로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 순수 배양균을 각각 150 ppm 농도의 아세토니트릴 또는 아크릴로니트릴을 함유하는 상이한 샘플에 가한다. 상이한 샘플을 유도된 미생물과 25℃, 35℃, 45℃, 55℃, 60℃, 70℃ 및 80℃의 온도에서 배양하고 니트릴 화합물의 소멸을 GLC-FID로 모니터한다. 해독율(μM/분)을 계산해낸다. 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 니트릴 해독율이 25 내지 55℃ 사이에서 온도 증가에 따라 일정하거나 약간 향상됨을 보여준다. 그러나, 55℃ 이상의 온도에서, 해독율은 감소한다.
8.2. pH
로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 유도된 세포를 니트릴 화합물과 아미드 화합물, 구체적으로는, 164.3 ppm 아크릴로니트릴, 159.9 ppm 아세토니트릴, 51.4 ppm 아크릴아미드, 53.5 ppm 아크롤레인, 51 ppm 푸마로니트릴, 및 101.9 ppm 석시노니트릴의 혼합물 해독능에 대하여 3 가지의 상이한 pH 값, 즉 pH 6, pH 7 및 pH 8에서 시험한다. 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴의 소멸을 GCL-FID로 모니터한다. 상이한 시점에서, 반응 내용물을 원심분리하고, 상등액을 경사시킨 다음 신선한 혼합물인 니트릴 및 아미드 화합물을 첨가하고, 필요에 따라 반응 혼합물의 pH를 적당한 시험 pH로 조정한다. 결과를 도 2a 내지 2c에 나타내었다.
도 2a 내지 2c에 나타낸 결과는 각각 6, 7 및 8의 pH 값에서 아세토니트릴과 아크릴로니트릴의 해독활성이 전 범위에 걸쳐 초기에 일정하게 머무름을 보여준다. 그러나, 반복된 재공급으로, pH 6에서의 해독활성은 3 번째 재공급 후 감소하기 시작하며, pH 8에서의 해독활성은 5 회 이상의 재공급 후에 감소하기 시작한다.
8.3. 암모늄 설페이트
암모늄 설페이트는 SOHIO/BP 생산공정을 이용하는 아크릴로니트릴 생산 설비의 폐 스트림에서 8%(wt/wt) 정도의 고농도로 발견된다. 존재할 경우 암모늄 설페이트의 니트릴 해독에 미치는 효과를 측정하기 위해, 해독반응을 0 내지 8%(wt/wt)의 암모늄 설페이트 농도 범위로 수행한다.
로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 유도된 세포를 0 내지 8%(wt/wt) 범위의 상이한 암모늄 설페이트 농도에서 니트릴 화합물과 아미드 화합물, 구체적으로 164.3 ppm 아크릴로니트릴, 159.9 ppm 아세토니트릴, 51.4 ppm 아크릴아미드, 53.5 ppm 아크롤레인, 51 ppm 푸마로니트릴, 및 101.9 ppm 석시노니트릴의 혼합물 해독능에 대해 시험한다. 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 소멸을 GLC-FID로 모니터한다.
시험된 암모늄 설페이트의 모든 상이한 온도에서, 유도된 미생물 균주의 해독능에 대한 효과는 관찰되지 않았다(결과는 나타내지 않았음).
8.4. 산소
로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 유도된 세포 또는 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 유도된 세포를 산소의 존재 또는 부재하에 니트릴 화합물과 아미드 화합물, 구체적으로 164.3 ppm 아크릴로니트릴, 159,9 ppm 아세토니트릴, 51.4 ppm 아크릴아미드, 53.5 ppm 아크롤레인, 51 ppm 푸마로니트릴, 및 101.9 ppm 석시노니트릴의 시험 혼합물 해독능에 대해 시험한다. 두 균주의 세포를 섹션 5.1에서 기술한 바와 같이 유도시켜 수거하고 농축시킨다. 농축 세포를 두 동등한 펠릿으로 나눈다. 혐기성 시험의 경우, 펠릿을 질소-퍼징된 스태니어 배지로 재현탁시키고 재 원심분리한다. 계속해서, 펠릿을 질소로 퍼징한 다음 튜브에 넣고 마개로 막는다. 혐기성 시험에 사용되는 시약 플라스크를 헤드-가스 공간을 최소화하여 오토클레이빙한다. 오토클레이빙 후, 플라스크를 고온상태일 때 비우고 마개로 막는다.
탈기된 펠릿을 시험 혼합물을 함유하는 탈기되고 질소 퍼징된 배지와 혼합하고 탈기된 펠릿을 시험 혼합물과 혼합시킨다. 통기된 펠릿을 탈기시키지 않은 시험 혼합물과 혼합시킨다. 반응물을 교반 없이 배양한다. 니트릴 및 아미드 화합물의 소멸을 GLC-FID로 모니터한다.
해독반응에서 산소의 존재 또는 부재시 유의할 만한 어떠한 차이점도 관찰되지 않았다. 산소가 미생물의 생장에 필요하지만, 산소는 해독에는 요구되지 않는다.
본 섹션에서 기술되는 실험 결과는 해독반응이 각종 상이한 조건하에서 진행될 수 있음을 명백히 보여준다.
9. 실시예: 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물의 해독
본 실시예는 유도된 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 해독능을 설명한다. 로도코커스 종 균주 DAP 96253은 150 ppm 아세토니트릴, 150 ppm 아크릴로니트릴 및 50 ppm 석시노니트릴로 보충된 영양 완전 YEMEA 배지에서 균주를 성장시킴으로써 다중 유도된다. 유도된 세포를 수거하여 건량 100 mg의 세포를 니트릴 화합물, 구체적으로 164.3 ppm 아크릴로니트릴, 159.9 ppm 아세토니트릴, 51.4 ppm 아크릴아미드, 53.5 ppm 아크롤레인, 51 ppm 푸마로니트릴, 및 101.9 ppm 석시노니트릴의 혼합물을 함유하는 수용액 300 ml와 접촉시킨다. 반응을 25℃ 및 초기 pH 7에서 수행한다. 아크롤레인, 아세트아미드, 아크릴로니트릴, 아세토니트릴, 석시노니트릴, 및 푸마로니트릴의 소멸을 GLC-FID로 모니터한다. 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 전술한 바와 같이 유도된 다중 유도된 미생물 균주가 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 360분 안에 거의 비-검출수준으로 해독시킬 수 있었음을 보여준다. 나타낸 푸마로니트릴 분석은 니트릴과 아미드의 혼합물내 푸마로니트릴의 분리가 특정의 사용된 검출방법으로는 50 ppm 이하 수준에서는 곤란하기 때문에 정확하지 않다.
10. 폐수 칼럼 바닥물질의 해독
본 실시예는 다중 유도된 로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 두 상이한 농도에서의 폐수 칼럼 바닥물질로부터의 니트릴 화합물의 혼합물 해독능을 설명한다. 전 강도 또는 물로 1:5로 희석한 아크릴로니트릴 및 아세토니트릴로 보충한, 아크릴로니트릴 생산의 SOHIO/BP법을 이용하여 아크릴로니트릴 생산설비로부터 수득된 폐수 칼럼 바닥물질(WWCB)을 미생물 로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 유도된 세포를 사용하여 해독시킨다. 미생물 로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622의 순수 배양균은, 150 ppm 아세토니트릴, 150 ppm 아크릴로니트릴 및 50 ppm 석시노니트릴로 보충된 영양 완전 YEMEA 배지 상에 미생물을 배양함으로써 상기 섹션 5.1에서 기술한 바와 같이 다중 유도시킨다. 유도된 세포를 수거하여 각각 아세토니트릴과 아크릴로니트릴로 보충한 두 상이한 농도의 WWCB를 함유하는 해독시킬 니트릴의 시험 혼합물(혼합물 A 및 B로 명명)에 첨가한다. 혼합물 A는 각각 아크릴로니트릴 및 아세토니트릴 200 ppm으로 보충한 전 강도의 WWCB 물질이다. 혼합물 B는 각각 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴 150 ppm으로 보충한 WWCB의 희석액(물로 1:5 희석)이다. 각 혼합물로부터 아세토니트릴, 아크릴로니트릴, 석시노니트릴 및 푸마로니트릴의 소멸은 GLC-FID로 모니터한다. 결과를 혼합물 A의 경우는 도 4a에, 혼합물 B의 경우에는 도 4b에 나타내었다.
도 4a와 도 4b에 제시된 결과는 유도된 로도코커스 로도크로우스 균주 DAP 96622가 수 분 내지 수 시간 정도에서, 각각 희석 및 전 강도 WWCB 모두에서 발견되는 니트릴 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있음을 명백히 입증한다.
11. 실시예: 네트 스트리퍼 바닥물질의 해독
본 실시예는 다중 유도된 로도코커스 균주 DAP 96253의 네트 스트리퍼 바닥물질로부터의 니트릴 화합물의 혼합물 해독능을 설명한다. 아크릴로니트릴 생산의 SOHIO/BP법을 사용하여 아크릴로니트릴 생산설비로부터 수득된 네트 스트리퍼 바닥물질(NSB)(아크릴로니트릴 및 아세토니트릴로 보충)은 미생물 로도코커스 종 균주 DAP 96253의 휴지기 유도된 세포를 이용하여 해독시킨다. 미생물을 150 ppm 아세토니트릴, 150 ppm 아크릴로니트릴 및 50 ppm 석시노니트릴로 보충한 영양 완전 YEMEA 배지 상에 배양함으로써 로도코커스 종 균주 DAP 96253을 다중 유도시킨다. 유도 후, 세포를 4℃에서 6일 또는 60일간 보관하고 휴지 세포로 언급한다. 해독시킬 NSB 반응 혼합물은 제로시(time zero)에 15 ppm 아크릴로니트릴, 15 ppm 아세토니트릴 및 17,500 ppm 석시노니트릴을 함유한다. 휴지 세포를 25℃ 및 초기 pH 7의 조건하에서 NSB에 첨가한다. 140 분 시점에서, 각각 아세토니트릴 및 아크릴로니트릴 100 ppm을 반응 혼합물에 가한다. 이 시점에서, NSB 반응 혼합물은 100 ppm 아크릴로니트릴, 100 ppm 아세토니트릴, 및 0 ppm 석시노니트릴을 함유한다. 아세토니트릴, 아크릴로니트릴 및 석시노니트릴의 소멸은 GLC-FID로 모니터한다. 결과를 60일간 보관한 세포에 대해 도 5에 나타내었다.
도 5에 제시된 결과는 더 이상 활동적으로 분열하지 않는 미생물의 다중 유도된 균주가 수 시간 정도면 니트릴 화합물의 혼합물을 해독시킬 수 있음을 입증한다. 6일간 보관된 세포도 유사한 해독활성을 나타내었다. 이러한 결과는 또한 해독활성이 성장과는 분리되어 있음을 설명한다. 이러한 점은 해독활성이 산소를 요구하지 않는다는 사실과 일치한다.
12. 실시예: 완전 세포의 폴리아크릴아미드내 고정
로도코커스 균주 DAP 96253의 완전 세포를 폴리아크릴아미드에 고정시켜 안정한 매트릭스에 세포를 고정시킨다. 또한, 폴리아크릴아미드는 반응기 용기내 세포의 더욱 효과적인 보유를 유도하고 세포내 니트릴라제 및 아미다제 활성을 안정화시키는 역할을 하는 기계적 보전성 및 강도를 제공한다.
DAP 96253 다중 유도된 세포의 습윤 중량 10 g을 증류수 40 ml에 현탁시킨다. 세포 40 ml를 아크릴아미드 4.5 g 및 N-, N-메틸렌 비스아크릴아미드 0.5 g을 함유하는 증류수 40 ml에 가한다. 용액 80 ml에, α-디메틸아미노프로프리오니트릴 5 ml 및 2.5% 칼륨 퍼설페이트 용액 10 ml를 첨가하고 생성 혼합물을 격렬하게 교반한 다음 얼음 위에 놓는다. 용액을 중합시킨 후, 중합 용액을 소형의 큐브로 절단하여 증류수로 세척하고 비중합 단량체를 제거한다.
13. 실시예: 다중 유도된 미생물의 시험설비 규모 생산
본 실시예는 DAP 균주 96253의 다중 유도된 배양균의 시험 설비 규모 생산을 설명한다.
미생물 생산 개시 때 사용된 초기 배지는 다음과 같은 성분을 함유한다:
(그램/리터)
효모 추출물 0.5
프로테오스 펩톤 #3 0.5
카사미노산 0.5
덱스트로스 0.5
가용성 전분 0.5
나트륨 피루베이트 0.3
K2HPO4 0.3
MgSO4 0.05
CoCl2 10 mg
우레아 7.5
하기의 표 13은 46 시간 생산 실행 과정에 걸쳐 제조된 기본 배지에의 첨가를 보여준다. 미생물에 의해 분해되지 않고 이에 유독하지 않은 실리콘계 소포제가 첨가된다.
시간(시) 탄소 보충물*(ml/l) 유도제 혼합물**(ml/l) 소포제 A(0.03% 용액)***(ml/l)
0 20 6.67 1
6 20 6.67 1
12 20 6.67 1
17 10 1 1
17.5 10 -- --
18 10 1 --
18.5 10 -- --
19 10 1 --
19.5 10 -- --
*탄소 보충물: 효모 추출물 = 16 g말트 추출물 = 63.9 g덱스트로스 = 26.6 g증류수 = 1.0 리터**유도제 혼합물: 아세토니트릴 = 3.82 ml아크릴로니트릴 = 3.72 ml석시노니트릴 = 1.015 gKCN 또는 NaCN = 0.02 g증류수 = 100 ml***소포제 ATM(실리콘계 소포제, Dow Chem. Corp.)
시간(시) 탄소 보충물*(ml/l) 유도제 혼합물**(ml/l) 소포제 A(0.03% 용액)***(ml/l)
20 20 6.67 1
20.5 20 -- --
23 -- -- -- 반응기의 1/3 내지 1/2 수거. 초기 배지로 최초 용적으로 만든다.
29 20 6.67 1
35 20 6.67 1
40 10 1 1
40.5 10 -- --
41 10 1 1
41.5 10 -- --
42 10 1 1
42.5 10 -- --
43 20 6.67 1
43.5 20 -- --
46 -- -- -- 실행의 전부 또는 실행의 1/3 내지 1/2을 수거하고 상기에서와 같이 23 시간 지속
*탄소 보충물: 효모 추출물 = 16 g말트 추출물 = 63.9 g덱스트로스 = 26.6 g증류수 = 1.0 리터**유도제 혼합물: 아세토니트릴 = 3.82 ml아크릴로니트릴 = 3.72 ml석시노니트릴 = 1.015 gKCN 또는 NaCN = 0.02 g증류수 = 100 ml***소포제 ATM(실리콘계 소포제, Dow Chem. Corp.)
14. 실시예: 아크릴아미드 용액으로부터 오염성 아크릴로니트릴의 제거
상기 섹션 13에서 기술한 바와 같이 수득한 다중 유도된 세포 DAP 96253을 폴리아크릴아미드 또는 경화 알기네이트에 고정시킨다. 이어서, 세포를 약 150 ppm 아크릴로니트릴을 함유하는 50% 아크릴아미드 용액과 25℃에서 반응시킨다. 15분 후 아크릴로니트릴의 농도는 폴리아크릴아미드에 고정시킨 세포의 경우 50 ppm 미만이고 경화 알기네이트에 고정시킨 세포의 경우 1 ppm 미만이다.
15. 미생물 기탁
하기 미생물이 1996년 12월 10일자로 미국 메릴랜드 로크빌 소재의 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(ATCC)에 기탁되었고 표시된 기탁번호를 배정 받았다:
미생물 ATCC 기탁번호
로도코커스 종 DAP 96253 55899
로도코커스 로도크로우스 DAP 96622 55898
본원에서 기술하고 청구된 발명은 본원에 기재된 특정 양태가 본 발명의 몇몇 일면을 설명하기 위한 것이므로 이들 양태로 범위가 제한되지는 않는다. 여타의 동등한 양태도 본 발명의 범위 내에 포함시키고자 한다. 실제로, 본원에서 예시되고 설명된 것들 외에 본 발명의 다양한 변형도 전술한 기술내용으로부터 당업자에게 자명해진다. 이러한 변형 또한 첨부된 청구의 범위 내에 포함시키고자 한다.
다수의 참조문헌이 본원에서 인용되는 데, 이들의 전 내용이 본원에서 참조로 인용된다.
국제출원번호:PCT/ /
미생물상세한 설명의 73쪽 10-35줄에 인용된 미생물과 관련한 선택지
A. 기탁물의 동정추가 기탁물을 별지에 동정하였다.
기탁 기관명아메리칸 타입 컬춰 컬렉션
기탁기관의 주소(우편번호 및 국명 포함)미국 메틸랜드 20852 로크빌 파크론 드라이브 12301
기탁일:1996년 12월 11일 기탁번호 55898
B.추가 표시(해당되지 않을 경우 공란). 본 정보는 별지에 계속
C.표시된 지정국(모든 지정국이 표시되지 않은 경우)
D.표시의 별도 제공(해당되지 않을 경우 공란)
하기 수록된 표시는 추후 국제사무국에 제출된다 (표시사항의 일반적 성질, 예를 들면, "기탁물의 기탁번호" 명기)
E.본지는 출원 당시 국제출원과 함께 접수되었다(수리관청 체크)(공인 사무관)국제사무국에 의한 (출원인으로부터) 접수일은 이다.(공인 사무관)
국제 출원번호:PCT/ /
서식 PCT/RO/134(계속)
아메리칸 타입 컬춰 컬렉션
미국 메릴랜드 20852 로크빌 파크론 드라이브 12301
기탁번호 기탁일
55899 1996년 12월 11일

Claims (54)

  1. 다중 유도된 미생물의 순수 배양균을, 니트릴 화합물을 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들이 혼합물로 전환시키기에 충분한 시간 동안 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로 전환시키는 방법.
  2. 다중 유도된 미생물의 순수 배양균을, 니트릴 화합물 또는 니트릴 및 아미드 화합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키기에 충분한 시간 동안 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키는 방법.
  3. 다중 유도된 미생물의 순수 배양균을, 아미드 화합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키기에 충분한 시간 동안 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키는 방법.
  4. 제 1 항, 2 항 또는 3 항에 있어서, 순수 배양균이 ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 다중 유도되는 다중 유도된 미생물의 배양균인 방법.
  5. 제 1 항, 2 항 또는 3 항에 있어서, 순수 배양균이 캡슐화되거나 고정되는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 순수 배양균이 입상 활성탄, 나무 토막, 알루미나, 루테늄, 철 옥사이드, 세라믹 비드, 알기네이트 비드, 및 κ-카라기난 큐브로 이루어진 그룹 중에서 선택된 고체 지지체에 고정되는 방법.
  7. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 다중 유도된 미생물이 미생물의 순수 배양균을 각각 약 150 ppm 농도의 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 및 각각 약 50 ppm 농도의 석시노니트릴과 푸마로니트릴 중 적어도 하나를 함유하는 니트릴 화합물의 혼합물로 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 방법.
  8. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 배양배지가 각각 약 150 ppm의 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 및 약 50 ppm의 석시노니트릴을 함유하는 니트릴 화합물의 혼합물로 보충되는 방법.
  9. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 배양배지가 약 1 내지 10 ppm KCN 또는 NaCN으로 추가 보충되는 방법.
  10. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 배양배지가 최소배지인 방법.
  11. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 배양배지가 영양 완전배지인 방법.
  12. 제 3 항에 있어서, 다중 유도된 미생물이 미생물의 순수 배양균을 (a)약 50 ppm의 석시노니트릴, 약 150 ppm의 아세토니트릴 및 약 150 ppm의 아크릴로니트릴 중 적어도 하나 및 (b)각각 약 150 ppm의 아세트아미드 및 아크릴아미드를 함유하는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 방법.
  13. 제 3 항에 있어서, 배양배지가 약 50 ppm의 석시노니트릴 및 약 150 ppm의 아세트아미드와 약 150 ppm의 아크릴아미드를 함유하는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충되는 방법.
  14. 제 12 항 또는 13 항에 있어서, 배양배지가 약 1 내지 10 ppm KCN 또는 NaCN으로 추가 보충되는 방법.
  15. 제 12 항 또는 13 항에 있어서, 배양배지가 최소배지인 방법.
  16. 제 12 항 또는 13 항에 있어서, 배양배지가 영양 완전배지인 방법.
  17. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물이 약 10 내지 1500 ppm의 아크릴아미드 , 약 0 내지 4500 ppm의 아세토니트릴, 약 5 내지 1250 ppm의 아크릴로니트릴, 약 50 내지 40,000 ppm의 석시노니트릴, 약 20 내지 1500 ppm의 푸마로니트릴, 및 약 10 내지 1200 ppm의 아크롤레인을 함유하는 니트릴 생산 설비로부터의 폐 스트림을 포함하는 방법.
  18. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물이 불필요한 니트릴 화합물을 함유하는 아미드 제제를 포함하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 다중 유도된 미생물을 아미드 제제와 접촉시키기에 앞서 또는 이와 동시에 약 55 내지 약 60℃로 가열하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 아미드 제제가 아크릴로니트릴인 니트릴 화합물을 함유하는 아크릴아미드 제제인 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 아미드 제제가 아세토니트릴인 니트릴 화합물을 함유하는 아세트아미드 제제인 방법.
  22. 다중 유도된 미생물의 추출물을, 니트릴 화합물을 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로 전환시키기에 충분한 시간 동안 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로 전환시키는 방법.
  23. 다중 유도된 미생물의 추출물을, 니트릴 및 아미드 화합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키기에 충분한 시간 동안 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키는 방법.
  24. 다중 유도된 미생물의 추출물을, 아미드 화합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키기에 충분한 시간 동안 아미드 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 산 화합물로 전환시키는 방법.
  25. 제 22 항, 23 항 또는 24 항에 있어서, 추출물이 ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 다중 유도되는 다중 유도된 미생물의 추출물인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 추출물이 캡슐화되거나 고정되는 방법.
  27. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 추출물이 미생물의 순수 배양균을 각각 약 150 ppm 농도의 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 및 각각 약 50 ppm 농도의 석시노니트릴과 푸마로니트릴 중 적어도 하나를 함유하는 니트릴 화합물의 혼합물로 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 다중 유도된 미생물의 순수 배양균의 조 추출물인 방법.
  28. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 배양배지가 각각 약 150 ppm의 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 및 약 50 ppm의 석시노니트릴을 함유하는 니트릴 화합물의 혼합물로 보충되는 방법.
  29. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 배양배지가 약 1 내지 10 ppm KCN 또는 NaCN으로 추가 보충되는 방법.
  30. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 배양배지가 최소배지인 방법.
  31. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 배양배지가 영양 완전배지인 방법.
  32. 제 24 항에 있어서, 추출물이 미생물의 순수 배양균을 (a)약 50 ppm의 석시노니트릴, 약 150 ppm의 아세토니트릴 및 약 150 ppm의 아크릴로니트릴 중 적어도 하나 및 (b)각각 약 150 ppm의 아세트아미드과 아크릴아미드를 함유하는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 다중 유도된 미생물의 순수 배양균의 조 추출물인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 배양배지가 약 50 ppm의 석시노니트릴 및 약 150 ppm의 아세트아미드와 약 150 ppm의 아크릴아미드를 함유하는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충되는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 배양배지가 약 1 내지 10 ppm KCN 또는 NaCN으로 추가 보충되는 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, 배양배지가 최소배지인 방법.
  36. 제 32 항에 있어서, 배양배지가 영양 완전배지인 방법.
  37. 제 22 항에 있어서, 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물이 약 10 내지 1500 ppm의 아크릴아미드, 약 0 내지 4500 ppm의 아세토니트릴, 약 5 내지 1250 ppm의 아크릴로니트릴, 약 50 내지 40,000 ppm의 석시노니트릴, 약 100 내지 1500 ppm의 푸마로니트릴, 및 약 10 내지 1200 ppm의 아크롤레인을 함유하는 니트릴 생산 설비로부터의 폐 스트림을 포함하는 방법.
  38. 미생물 샘플을 각각 약 150 ppm 농도의 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 및 각각 약 50 ppm 농도의 석시노니트릴과 푸마로니트릴 중 적어도 하나를 함유하는 니트릴 화합물의 혼합물로 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로의 전환능을 지니도록 미생물을 유도하는 방법.
  39. 미생물 샘플을 각각 약 150 ppm의 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 및 약 50 ppm의 석시노니트릴을 함유하는 니트릴 화합물의 혼합물로 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로의 전환능을 지니도록 미생물을 유도하는 방법.
  40. 미생물 샘플을 (a)약 50 ppm 농도의 석시노니트릴, 약 150 ppm 농도의 아세토니트릴 및 약 150 ppm 농도의 아크릴로니트릴 중 적어도 하나 및 (b)각각 약 150 ppm 농도의 아세트아미드과 아크릴아미드를 함유하는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물의 혼합물의 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로의 전환능을 지니도록 미생물을 유도하는 방법.
  41. 제 38 항, 39 항 또는 40 항에 있어서, 배양배지가 최소배지인 방법.
  42. 제 38 항, 39 항 또는 40 항에 있어서, 배양배지가 영양 완전배지인 방법.
  43. 제 38 항, 39 항 또는 40 항의 방법에 의해 수득된 다중 유도된 미생물.
  44. (a)시험 미생물을 각각 약 150 ppm 농도의 아세토니트릴과 아크릴로니트릴 및 약 50 ppm 농도의 석시노니트릴 중 적어도 하나를 함유하는 니트릴 화합물의 제 1 혼합물로 보충된 배양 배지 중, 잠정 유도된 미생물을 수득하기 위한 성장 호조건하에서 배양한 다음;
    (b)(i)잠정 유도된 미생물을 약 1 내지 약 40,000 ppm 농도의 아크릴로니트릴, 약 1 내지 약 40,000 ppm 농도의 아세토니트릴, 약 1 내지 약 40,000 ppm 농도의 푸마로니트릴, 및 약 1 내지 약 40,000 ppm 농도의 석시노니트릴을 포함하는 니트릴 화합물의 제 2 혼합물과 접촉시켜;
    (ii)제 2 혼합물내 니트릴 화합물 각각의 소멸을 모니터함으로써(여기에서, 혼합물내 적어도 두 니트릴 화합물의 소멸은 시험 미생물이 니트릴 화합물의 혼합물의 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로의 전환능을 지님을 시사한다) 잠정 유도된 미생물의 니트릴 화합물의 혼합물 전환능을 평가하는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 아미드 또는 산 화합물 또는 이들의 혼합물로 전환시킬 수 있는 미생물의 동정 및 분리를 위한 미생물 스크리닝 방법.
  45. (a)시험 미생물을 (a)약 50 ppm 농도의 석시노니트릴, 약 150 ppm 농도의 아세토니트릴 및 약 150 ppm 농도의 아크릴로니트릴 중 적어도 하나 및 (b)각각 약 150 ppm 농도의 아세트아미드와 아크릴아미드를 함유하는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 제 1 혼합물로 보충된 배양 배지에서 배양한 다음;
    (b)(i)잠정 유도된 미생물을 약 1 내지 약 20,000 ppm 농도의 아세트아미드, 및 약 1 내지 약 20,000 ppm 농도의 아크릴아미드를 포함하는 아미드 화합물의 제 2 혼합물과 접촉시켜;
    (ii) 제 2 혼합물내 아미드 화합물 각각의 소멸을 모니터함으로써(여기에서, 아미드 화합물의 소멸은 시험 미생물이 아미드 화합물의 혼합물의 상응하는 산 화합물 또는 이의 혼합물로의 전환능을 지님을 시사한다) 잠정 유도된 미생물의 아미드 화합물의 혼합물 전환능을 평가하는 단계를 포함하는, 아미드 화합물의 혼합물을 상응하는 산 화합물로 전환시킬 수 있는 미생물의 동정 및 분리를 위한 미생물 스크리닝 방법.
  46. 다중 유도되고 니트릴 화합물의 혼합물 또는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물 또는 아미드 화합물을 해독시킬 수 있는 미생물 균주의 순수 배양균을 포함하는 키트.
  47. 제 46 항에 있어서, 다중 유도된 미생물이 ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 다중 유도되는 미생물인 키트.
  48. 다중 유도된 미생물의 순수 배양균 또는 이의 추출물이 고체 지지체 상에 고정된 장치를 포함하는 바이오필터.
  49. 제 48 항에 있어서, 다중 유도된 미생물이 ATCC 기탁번호 55899, 55898, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 다중 유도되는 미생물인 바이오필터.
  50. 아크릴아미드 약 30% 및 아크릴로니트릴 약 10%를 포함하는 용액을, 아크릴로니트릴의 농도를 100 ppm 이하로 감소시키기에 충분한 시간 동안, 임의로 아미다제 활성을 불활성화시키도록 처리한 다중 유도된 미생물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 아크릴로니트릴로부터 아크릴아미드의 하이브리드 화학/생물학적 생산방법.
  51. 아세트아미드 또는 아크릴아미드와 같은 아미드의 개량 생산방법에 있어서, 아미드의 화학 합성 생산방법 동안 형성된, 아미드 약 50% 및 니트릴 약 10% 이하를 포함하는 중간체 용액을, 니트릴 농도를 100 ppm 이하로 감소시키기에 충분한 시간 동안, 임의로 아미다제 활성을 불활성화시키도록 처리한 다중 유도된 미생물과 접촉시키는 단계를 포함하는 개량 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 다중 유도된 미생물이 미생물의 순수 배양균을 (a)약 50 ppm의 석시노니트릴, 약 150 ppm의 아세토니트릴 및 약 150 ppm의 아크릴로니트릴 중 적어도 하나 및 (b)각각 약 150 ppm의 아세트아미드와 아크릴아미드를 함유하는 니트릴 화합물과 아미드 화합물의 혼합물로 보충된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 아미드가 아크릴아미드이고 니트릴이 아크릴로니트릴인 방법.
  54. 제 51 항에 있어서, 아미드가 아세트아미드이고 니트릴이 아세토니트릴인 방법.
KR19997005484A 1996-12-18 1997-12-18 니트릴 및/또는 아미드 화합물의 해독방법 KR100574770B1 (ko)

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