DE69517062T2

DE69517062T2 - Verfahren zur Herstellung von Amid-Verbindungen mit Mikroorganismen

Info

Publication number: DE69517062T2
Application number: DE69517062T
Authority: DE
Inventors: Satoshi Mitsuda; Fujio Mukumoto; Yoshiki Takashima
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1994-02-01
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 2001-03-08
Anticipated expiration: 2015-02-01
Also published as: EP0666321A2; HUT70458A; US5563053A; MY113838A; HU9500298D0; CN1072262C; EP0666321B1; SG44513A1; DE69517062D1; TW422882B; CN1111677A; EP0666321A3; KR950032629A; HU216652B; DK0666321T3; KR100339723B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Amidverbindungen mit einem Mikroorganismus, welcher Hydratisierungsaktivität besitzt, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln.
In den vergangenen Jahren wurden biologische Katalysatoren wie Mikroorganismen häufig für chemische Reaktionen verwendet. Es ist zum Beispiel gut bekannt, dass Nitrilverbindüngen durch Hydratisierung unter Verwendung von bestimmten Stämmen der Gattung Bacillus, Bacteridium, Micrococcus oder Brevibacterium (USP 4.001.081); Corynebacterium oder Nocardia (USP 4.248.968); Pseudomonas (USP 4.555.487); Rhodococcus oder Microbacterium (EP-188.316); oder Fusarium (JP-A 64-86889/1989) in Amidverbindungen umgewandelt werden können. Verfahren zur Herstellung von Amiden sind auch in EP-A0.486.289 und GB-A 2.054.563 beschrieben.
Alle diese Mikroorganismen gehören jedoch zur Kategorie mesophiler Bakterien, welche nicht bei Temperaturen von 55ºC oder höher wachsen können.
Zusätzlich ist die Hydratisierungsaktivität mesophiler Bakterien für die Umwandlung einer Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung im Bereich von Temperaturen, die höher als Raumtemperatur sind, nicht stabil. Aus diesem Grund wird die Herstellung von Amidverbindungen mit mesophilen Bakterien gewöhnlich bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt. In diesem Fall sind Kühlvorrichtungen erforderlich, um den Reaktor bei niedrigen Temperaturen zu halten und für das Kühlen werden große Mengen an Energie verbraucht, was zu einem merklichen Anstieg der Herstellungskosten führt. Aufgrund dieser Umstände haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung intensiv nach Mikroorganismen gesucht, welche auch im Bereich von Temperaturen höher als Raumtemperatur Hydratisierungsaktivität besitzen, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln. Als Ergebnis fanden sie heraus, dass ein Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, bei Temperaturen von höher als 550C zu wachsen, welcher vom Grund einer bestimmten heißen Quelle in Okayama-ken isoliert wurde, diese Erfordernisse erfüllt, womit die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
Damit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Amidverbindung bereit, welches das Umwandeln einer Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung durch Hydratisieren der Nitrilverbindung in Gegenwart einer Kulturbrühe aus Bakterienzellen, unversehrten Bakterienzellen, aufgebrochenen Bakterienzellen oder darin enthaltenen Enzymen, oder immobilisierten Zubereitungen, die durch Immobilisieren unversehrter Bakterienzellen, aufgebrochener Bakterienzellen oder darin enthaltender Enzyme erhältlich sind, umfasst, wobei die Bakterienzellen Zellen einer biologischen reinen Kultur von Mikroorganismen sind, die die Fähigkeit haben, bei Temperaturen von höher als 55ºC zu wachsen, und welche Hydratisierungsaktivität haben, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine biologisch reine Kultur eines neuen Mikroorganismus bereit, der die Fähigkeit besitzt, bei Temperaturen von höher als 55ºC zu wachsen, und der Hydratisierungsaktivität hat, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln, welcher als Bacillus smithit SC-J05-1 (FERM BP-4935) bezeichnet wird.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können verschiedene Nitrilverbindungen in ihre entsprechenden Amidverbindungen umgewandelt werden. Beispiele für Nitrilverbindungen sind aliphatische Nitrile wie n-Butyronitril, n-Valeronitril, Isobutyronitril, Acetonitril und Pivalonitril; Halogen enthaltende Nitrilverbindungen wie 2- Chlorpropionitril; ungesättigte aliphatische Nitrilverbindungen wie Acrylnitril, Crotonnitril und Methacrylnitril; Hydroxynitrilverbindungen wie Lactonitril und Mandelonitril; Aminonitrilverbindungen wie 2-Phenylglycinnitril; aromatische Nitrilverbindungen wie Benzonitril und Cyanopyridine; und Dinitrilverbindungen wie Malononitril, Succinonitril und Adiponitril. Bevorzugt sind n-Butyronitril, n-Valeronitril, Isobutyronitril, Acetonitril, Pivalonitril, 2-Chloropropionitril, Acrylnitril, Crotonnitril, Methacrylnitrih Benzonitril, 2- Cyanopyridin, 3-Cyanopyridin, 4-Cyanopyridin, Malononitril, Succinonitril und Adiponitril. Die Umwandlung einer Nitrilverbindung in eine Amidverbindung wird durch Hydratisieren der Nitrilverbindung in Gegenwart einer Kulturbrühe aus Bakterienzellen, unversehrten Bakterienzellen, aufgebrochenen Bakterienzellen oder immobilisierten Zubereitungen, die durch Immobilisieren unversehrter Bakterienzellen, aufgebrochener Bakterienzellen oder darin enthaltener Enzyme erhältlich sind, ermöglicht. Die Bakterienzellen sind diejenigen einer biologisch reinen Kultur eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, bei Temperaturen von höher als 55ºC zu wachsen, und welcher Hydratisierungsaktivität hat, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln.
Der Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist, solange er zu der Kategorie thermophiler Mikroorganismen gehört, welche Hydratisierungsaktivität haben, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln, nicht besonders eingeschränkt. Der Begriff "thermophiler Mikroorganismus", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, bei einer Inkubationstemperatur von 55ºC oder höher zu wachsen.
Der gewünschte Mikroorganismus kann zum Beispiel durch nachfolgende Verfahren erhalten werden. Zuerst wird Erde in der Natur gesammelt und die gesammelte Erde oder ein Überstand, der erhalten wurde, nachdem die Erde gründlich in Wasser resuspendiert wurde, wird zu einer geeigneten Menge eines gut bekannten Kulturmediums zum Wachstum von Mikroorganismen, zum Beispiel ein flüssiges Medium oder Agarmedium, welches Glycerin, Polypepton, Hefeextrakt und Malzextrakt als hauptsächliche Nährstoffe enthält, zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei einer Temperatur von 55ºC oder höher für einen Zeitraum von etwa 24 Stunden bis etwa 3 Monaten. Die Kulturbrühe, die auf diese Weise erhalten wird, oder ein Teil der isolierten Bakterienzellen werden auf einem Agarplattenmedium, welches die gleichen Nährstoffe wie vorstehend beschrieben enthält, ausplattiert, gefolgt von einer weiteren Inkubation zur Ausbildung einzelner Kolonien, aus welchen ein thermophiler Mikroorganismus isoliert werden kann.
Die auf diese Art aus der Natur erhaltenen oder in verschiedenen Mikroorganismus- Hinterlegungsstellen hinterlegten Mikroorganismen werden durch Inkubation in einem Teströhrchen oder einem Kolben, welches (welcher) ein flüssiges Medium beinhaltet, das die vorstehenden Medium-Nährstoffe und eine Nitrilverbindung oder eine Amidverbindung wie Isovaleronitril, Crotonnitril oder Crotonamid enthält, bei einer Temperatur von 55ºC oder höher für einen geeigneten Zeitraum, zum Beispiel von etwa 12 Stunden bis etwa 7 Tagen, gezüchtet. Die Kulturbrühe wird zu einer wässrigen Lösung einer Nitrilverbindung, wie Propionitril oder Acrylnitril, zugegeben und in die Umsetzung wird zum Beispiel bei einer Temperatur von 30ºC für einen Zeitraum von etwa 10 bis etwa 60 Minuten durchgeführt. Dann wird das Reaktionsgemisch darauf getestet, ob eine Amidverbindung produziert wurde oder nicht, was es ermöglicht, leicht einen thermophilen Mikroorganismus mit Hydratisierungsaktivität für die Umwandlung einer Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung zu identifizieren. Für den Nachweis von Amidverbindungen kann zum Beispiel ein Nachweisverfahren mit Gaschromatographie wie nachfolgend beschrieben angewendet werden.
Als ein typisches Beispiel kann Bacillus smithii SC-J05-lin dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Bei diesem Bakterienstamm handelt es sich um einen Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, bei Temperaturen von höher als 55ºC zu wachsen, von der Gattung Bacillus, von welchem durch die vorliegenden Erfinder gezeigt wurde, dass er eine höhere Hydratisierungsaktivität der Nitrilgruppen von Nitrilverbindungen besitzt, und der im National Institute of Bioscience and Human Technology in the Agency of Industrial Science and Technology, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM P-14037 am 24.
Dezember 1993 hinterlegt wurde, und welcher am 14. Dezember 1994 in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4935 umgewandelt wurde.
Die bakteriologischen Merkmale von Bacillus smithii SC-JOS-1 sind wie folgt: (a) Morphologie:
1. Aussehen und Größe der Zellen:
Gestalt: Stäbchen
Größe: 0,5-0,8 um · 0,8-2 um
2. Polymorphismus: keiner
3. Motilität: aktiv, peritriche Geißeln
4. Sporulation: nachgewiesen
5. Gramfärbung: variabel
6. Säurebeständigkeit: keine
(b) Wachstumseigenschaften:
1. Nähragar-Plattenkultur: rund, konvex, nicht-glänzend, blassbraun
2. Nähragar-Schrägkultur: nicht-glänzend, blassbraun
3. Nährbrühe-Flüssigkultur: einheitlich trübes Wachstum
4. Nährbrühe-Gelatine-Stichkultur: nicht verflüssigt
5. Lackmus-Milch: unverändert
(c) Physiologische Eigenschaften:
1. Nitratreduktion: -
2. Denitrifikation: -
3. MR-Test: +
4. VP-Test: -
5. Indolbildung: -
6. Schwefelwasserstoffbildung: +
7. Stärke-Hydrolyse: -
8. Citratverwendung
Koser-Medium: +
9. Verwendung anorganischer Stickstoffquellen
NaNO&sub3;: -
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;: +
10. Pigmentbildung
Kings A-Medium: -
King s B-Medium: -
11. Urease: -
12. Oxydase: +
13. Katalase: - bis +
14. Wachstumsbedingungen
pH: 4,1-7,5
Temp.: 30-60ºC
15. Verhalten gegenüber Sauerstoff: geringfügig aerob
16. O-F-Test: F
17. Säure- und Gasbildung aus Zucker
Säure Gas
L-Arabinose: - -
D-Xylose: + -
D-Glucose: + -
D-Mannose: + -
D-Fructose: + -
D-Galactose: + -
Maltose: + -
Saccharose: + -
Lactose: - -
Trehalose: + -
D-Sorbitol: - -
D-Mannitol: + -
Inositol: + -
Glycerin: + -
Stärke:
(d) Andere Eigenschaften:
1. Mol% G + C von DNA: 40,6%
Eine intensive Literatursuche nach einem Mikroorganismus, welcher die vorstehenden Merkmale hat, wurde durchgeführt und es wurde von L. K. Nakamura et aL, International Journal of Systematic Bacteriology, 38, 63-73 (1988) berichtet, dass Bacillus smithii die gleichen Merkmale wie vorstehend beschrieben aufweist. Anhand dieser Ergebnisse wurde der Bakterienstamm SC-JOS-1, der von den vorliegenden Erfindern gefunden wurde, als Stamm identifiziert, der zu der Art Bacillus smithii gehört.
Es lag keine Kenntnis darüber vor, dass Mikroorganismen der Art Bacillus smithii Hydratisierungsaktivität haben, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln. Es wird erwogen, dass Bacillus smithü SC-JOS-1 (FERM BP-4935) in dieser Hinsicht ein neuer Bakterienstamm ist. Desweiteren können Varianten des Bakterienstammes, z. B. Mutanten, Zellfusionsstämme oder rekombinante Stämme, welche von Bacillus smithii SC-JOS-1 (FERM BP-4935) erhalten werden, ebenfalls in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Eine Kultur des Mikroorganismus zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann in verschiedenen Arten von Medien hergestellt werden, welche Kohlenstoff und Stickstoffquellen enthalten, organische und/oder anorganische Salze und ähnliches, und welche alle zur Herstellung von Kulturen herkömmlicher Bakterien weit verbreitet eingesetzt werden.
Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Glucose, Glycerin, Dextrin, Saccharose, organische Säuren, tierische und pflanzliche Öle und Melasse.
Beispiele für Stickstoffquellen sind organische und anorganische Stickstoffquellen wie Brühe, Pepton, Hefeextrakt, Malzextrakt, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Baumwollsamenpulver, Trockenhefe, Casaminosäure, Natriumnitrat und Harnstoff. Beispiele für organische und anorganische Salze sind Chloride, Sulfate, Acetate. Carbonate und Phosphate von Elementen, wie Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Mangan, Kobalt und Zink. Spezifische Beispiele davon sind Kaliumchlorid, Natriumchlorid. Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat, Kobaltchlorid, Zinksulfat, Kupfersulfat, Natriumacetat, Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Natriummonohydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, dass eine Nitrilverbindung, wie Isovaleronitril und Crotonnitril, oder eine Amidverbindung wie Crotonamid zu dem Kulturmedium zugegeben wird, um die Nitril-Hydratisierungsaktivität des hierin verwendeten Mikroorganismus zu verstärken. Diese Verbindungen können zum Beispiel in einer Menge von etwa 10 mg bis etwa 1 g pro 100 ml Kulturmedium verwendet werden. Eine Mikroorganismenkultur wie sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wird nach üblichen Verfahren, welche für gewöhnliche Bakterien verwendet werden, entweder in Form einer Festphasenkultur oder einer Flüssigkultur, wie eine Schüttelkultur unter Verwendung von Teströhrchen, Reziprokschütflern oder Rotationsschüttlern, und anderen Kulturen unter Verwendung von Fermentationsgefäßen oder Fermentationstanks, hergestellt.
Eine Kultur des Mikroorganismus wird gewöhnlich unter aeroben Bedingungen inkubiert. Insbesondere wenn Fermentationsgefäße verwendet werden, ist es notwendig, aseptische Luft einzuführen, gewöhnlich in einer Menge von etwa dem 0.1- bis etwa 2- fachen des Kulturvolumens pro Minute.
Die Inkubationstemperatur kann innerhalb eines Bereiches variieren, in welchem der verwendete Mikroorganismus in Kultur lebensfähig ist. Die Kultur wird zum Beispiel bei einer Temperatur von etwa 30ºC bis etwa 100ºC inkubiert. Der ph-Wert des Mediums wird kontrolliert, zum Beispiel auf einen Bereich von etwa 2 bis etwa 11.
Insbesondere wenn ein Mikroorganismus der Art Bacillus smithü gezüchtet wird, liegt die Inkubationstemperatur im Bereich von etwa 30ºC bis etwa 100ºC, vorzugsweise von etwa 40ºC bis etwa 55ºC, und der ph-Wert des Mediums liegt im Bereich von etwa 5 bis etwa 7.
Die Inkubationszeit kann in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen variieren, und die Kultur wird gewöhnlich über einen Zeitraum von etwa 1 bis etwa 7 Tagen inkubiert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise wie folgt durchgeführt.
Die gezüchtete Brühe aus Bakterienzellen, unversehrten Bakterienzellen, oder die Materialien, welche durch Behandlung der Bakterienzellen eines Mikroorganismus erhältlich sind, der auf die vorstehend beschriebene Art hergestellt wurde, werden in Wasser oder einer wässrigen Lösung wie Phosphatpuffer suspendiert, und diese Suspension wird zur Umsetzung zu einer Nitrilverbindung zugegeben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Materialien, welche durch Behandlung der Bakterienzellen erhältlich sind" auf aufgebrochene Bakterienzellen oder darin enthaltene Enzyme, welche durch ein herkömmliches Verfahren wie Ultraschall- Zertrümmerung, Homogenisation oder Aufbrechen mit einer "French"-Presse, erhalten werden, oder bezieht sich auf immobilisierte Präparationen, welche durch Immobilisierung unversehrter oder aufgebrochener Bakterienzellen oder darin enthaltener Enzyme, in einem leicht entfernbaren Stadium nach ihrer Unlösbarmachung, nach einem Immobilisationsverfahren wie ein Träger-unterstütztes Verfahren, in welchem diese Materialien durch kovalente Bindung, Ionenbindung, Adsorption oder ähnliches, auf einen geeigneten Träger aufgebracht werden, oder ein Einschlußverfahren, in welchem diese Materialien in die Netzwerkstruktur eines Polymers eingeschlossen werden, erhältlich sind.
Die Bakterienzellen oder die Materialien, die durch Behandlung der Bakterienzellen erhältlich sind, werden gewöhnlich in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 20 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 10 Gew.-% verwendet. Im Fall von Enzymen oder immobilisierten Präparationen kann deren Konzentration in Abhängigkeit von ihrer Reinheit oder dem verwendeten Immobilisationsverfahren variieren; es wird zum Beispiel bevorzugt, dass diese Enzyme und immobilisierten Präparationen so hergestellt werden, dass sie ähnliche Nitrilgruppen-Hydratisierungsaktivität haben wie die Bakterienzellen oder das Material, welches durch Behandlung der Bakterienzellen erhältlich ist. Die Bakterienzell-Kulturbrühe kann ohne irgendeine weitere Behandlung vor der Zugabe einer Nitrilverbindung verwendet werden. Es wird bevorzugt, dass die Baktierenzell-Kulturbrühe derart verdünnt oder konzentriert wird, dass sie ähnliche Nitrilgruppen- Hydratisierungsaktivität hat wie die Bakterienzellen oder das Material, welches durch Behandlung der Bakterienzellen erhältlich ist.
Die Umsetzung wird gewöhnlich bei einer Temperatur von etwa 0º bis etwa 70ºC, vorzugsweise von etwa 0º bis etwa 50ºC, bei einem ph-Wert von etwa 5 bis etwa 10, vorzugsweise von etwa 6 bis etwa 9, für einen Zeitraum von etwa 10 Minuten bis etwa 72 Stunden durchgeführt. Wenn der pH-Wert innerhalb des vorstehenden Bereiches kontrolliert wird, können die Bakterienzellen die hergestellte Amidverbindung in hohen Konzentrationen in dem Reaktionsgemisch anreichern.
Die so hergestellte Amidverbindung kann durch jedes übliche, im Stand der Technik bekannte Verfahren, aus dem Reaktionsgemisch wiedergewonnen werden. Zum Beispiel werden die Bakterienzellen oder die Materialien, welche durch Behandlung der Bakterienzellen erhältlich sind, durch Zentrifugation aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt, gefolgt von der Behandlung mit Aktivkohle oder einem Ionenaustauscher zur Entfernung von Ver unreinigungen. Das gereinigte Gemisch wird durch Destillation oder Verdampfen unter reduziertem Druck konzentriert und die ausgefällten Kristalle werden mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol umkristallisiert, wobei die gewünschte Amidverbindung erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche nicht deren Schutzumfang einschränken sollen.

Beispiel 1: Isolierung von Bakterienzellen

Aus einer bestimmten heißen Quelle in Okayama-ken wurde Erde gesammelt, und die gesammelte Erde wurde in ein Kulturmedium (pH 7,2) gegeben, welches 1,0 Gew.-% Glycerin, 0,5 Gew.-% Polypepton, 0,3 Gew.-% Hefeextrakt und 0,3 Gew.-% Malzextrakt enthielt, gefolgt von einer Inkubation für 21 Tage bei 55ºC unter Reziprokschütteln. Ein Teil der Kulturbrühe wurde auf ein Agarmedium ausplattiert, welches die gleichen Nährstoffe wie vorstehend beschrieben enthielt und die Kultur wurde zur Ausbildung einiger Kolonien inkubiert.
Von diesen Kolonien wurden Bakterienzellen isoliert, und eine mit isolierten Bakterien gefüllte Öse wurde in ein flüssiges Medium überimpft, welches 0,1 Gew.-% Isovaleronitril zusätzlich zu den gleichen Nährstoffen wie vorstehend beschrieben enthielt, gefolgt von einer Inkubation bei 55ºC für 24 Stunden, wobei eine Kulturbrühe als Probe erhalten wurde. Dann wurde 1 ml der Kulturbrühe zu 9 ml einer 2,78 gew.%igen Acrylnitrillösung in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7, zugegeben und die Umsetzung wurde bei 10ºC gestartet. Nach 10 Minuten wurde zum Stoppen der Reaktion 1 ml 2 N HCl zugegeben. Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde entnommen und durch Gaschromatographie analysiert, um beim Durchmustern einiger Bakterienstämme nach Nitrilgruppen-Hydratisierungaktivität die Anwesenheit von hergestelltem Acrylamid zu testen. Auf diese Art wurde Bacillus smithii SC-JOS-1 als ein thennophiler Mikroorganismus erhalten, welcher die Hydratisierungsaktivität hat, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln.

Bedingungen für Gaschromatographie

Säule: gepackte Säule
Träger: Porapak Typ Q (Porengröße 80-100)
Länge: 1, 1 m
Säulentemperatur: 210ºC
Durchflussrate des Trägergases: 50 ml/min.
Injektionsvolumen der Probe: 2 ul

Beispiel 2: Züchtung von Bakterienzellen zum Testen thermophiler Eigenschafen

Die Bakterienzellen von Bacillus smithii SC-J05-1, welche in Beispiel 1 erhalten wurden; und die Bakterienzellen von Bacillus sp.-Bakterien (hinterlegt in der Genetics Laboratory Collection, Ecole Nationale Superieure des Agriculture, French, mit der Hinterlegungsnummer R332 und ebenfalls hinterlegt im Nationale Institute of Bioscience and Human Technology in der Agency of Industrial Science and Technology, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM P-2717; hierin nachfolgend als Bacillus sp.-Bakterien R332 bezeichnet), welche wie in JP-B62-21519/1987 beschrieben mesophile Bakterien sind, wurden unabhängig auf Agarplatten mit Nährmedium ausplattiert und bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert, um die Wachstumsfähigkeit zu testen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Kriterien: (-) nicht gewachsen; (+) gewachsen; und (++) sehr gut gewachsen.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, ist Bacillus smithii SC-305-1 der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu Bacillus sp.-Bakterien R332 als Kontrolle ein unterschiedlicher thermophiler Mikroorganismus.

Beispiel 3: Züchtung von Bakterienzellen

In einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml steriles Kulturmedium (pH 7,2) gegeben, welches 1,0 Gew.-% Saccharose, 0,5 Gew.-% Polypepton, 0,3 Gew.-% Hefeextrakt, 0,3 Gew.-% Malzextrakt, 0,001 Gew.-% Eisensulfat, 0,001 Gew.-% Mangansulfat, 0,001 Gew.-% Kobaltchlorid und 0,001 Gew.-% Zinksulfat enthält. In diesen Kolben wurden 0,1 ml der Kulturbrühe aus Bacillus smithii SC-J05-l, welche im gleichen Kulturmedium wie vorstehend beschrieben kultiviert worden waren, überimpft. Dieser Kolben wurde dann unter Reziprokschütteln in einer Rate von 135 Intervallen pro Minute einen Tag lang bei 55ºC inkubiert, wobei eine Bakterienzell-Kulturbrühe von Bacillus smithii SC-JOS-1 erhalten wurde.

Referenzbeispiel 1: Züchtung von Bakterienzellen

In einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml steriles Kulturmedium (pH 7,2) gegeben, welches 1,0 Gew.-% Glycerin, 0,5 Gew.-% Polypepton, 0,3 Gew.-% Hefeextrakt, 0,3 Gew.-% Malzextrakt, 0,001 Gew.-% Eisensulfat, 0,001 Gew.-% Mangansulfat, 0,001 Gew.-% Kobaltchlorid und 0,001 Gew.-% Zinksulfat enthielt. In diesen Kolben wurden 0,1 ml einer Kulturbrühe aus Bacillus sp.-Bakterien R332 überimpft, welche im gleichen Kulturmedium wie vorstehend beschrieben gezüchtet worden waren. Dieser Kolben wurde dann unter Reziprokschütteln mit einer Rate von 135 Intervallen pro Minute zwei Tage lang bei 30ºC inkubiert, wobei eine Bakterienzell-Kulturbrühe von Bacillus sp.-Bakterien R332 erhalten wurde.

Vergleichsbeispiel 1: Hitzestabilität

Aus 400 ml der Bakterienzell-Kulturbrühe von Bacillus smithii SC-JOS-1, welche in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 10 Minuten gesammelt. Nach dem Waschen mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7, wurden diese Zellen in 100 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Die auf diese Art hergestellte Bakterienzell-Suspension wurde auf Hydratisierungsaktivität, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln, getestet. Weiterhin wurde die gleiche Suspension von Bakterienzellen zum Testen der Hitzestabilität der Aktivität für einen konstanten Zeitraum bei einer konstanten Temperatur gehalten.
Die Hydratisierungsaktivität zur Umwandlung einer Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung wurde nach den folgenden Verfahren gemessen. Zu 9 ml einer 2,78%igen Acrylnitrillösung in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7, wurde 1 ml einer getesteten Lösung gegeben und die Umsetzung wurde bei 10ºC gestartet. Nach 10 Minuten wurde zum Stoppen der Reaktion 1 ml einer 2 N HCl-Lösung zugegeben. Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde entnommen und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, zur Bestimmung der Menge an produziertem Acrylamid durch Gaschromatographie analysiert.
Hinsichtlich der Einheit der Enzymaktivität wie sie hierin nachfolgend verwendet wird, ist die Aktivität, die benötigt wird, um 1 umol Acrylnitril in Acrylamid pro Minute umzuwandeln, als eine Einheit (Unit, U) definiert worden.
Dann wurden aus 400 ml der Bakterienzell-Kulturbrühe aus Bacillus sp.-Bakterien R332, welche in Referenzbeispiel 1 erhalten wurden, die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 10 Minuten gesammelt. Nach dem Waschen mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7, wurden diese Bakterienzellen in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Die auf diese Weise hergestellte Suspension von Bakterienzellen wurde auf Hydratisierungsaktivität, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln, auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben, getestet. Weiterhin wurde die gleiche Suspension von Bakterienzellen zur Bestimmung der Hitzestabilität der Aktivität, für einen konstanten Zeitraum bei einer konstanten Temperatur gehalten und dann hinsichtlich dieser Aktivität getestet. Die Aktivität wurde auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben gemessen. Auf der Grundlage der Ergebnisse der Messung wurde die Aktivität nach der Behandlung in Relation zur Aktivität vor der Behandlung (hierin nachfolgend als verbleibende Aktivität bezeichnet) für jeden Bakterienstamm berechnet, und die verbleibende Aktivität von Bach/us smithü SC-JOS-1 wurde auf der Grundlage der verbleibenden Aktivität von Bacillus sp.-Bakterien R332, welche als 100 gesetzt wurde, umgewandelt. Tabelle 2

Vergleichsbeispiel 2: Reaktionsstabilität

Aus der Bakterienzelt-Kulturbrühe von Bach/us smithü SC-JOS-1, welche in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 10 Minuten gesammelt. Nach dem Waschen mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7, wurden diese Bakterienzellen im gleichen Puffer resuspendiert, wobei 20 U/ml Bakterienzell-Suspension erhalten wurden.
Andererseits wurden aus der Bakterienzell-Kulturbrühe von Bacillus sp.-Bakterien R332 die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 10 Minuten gesammelt. Nach dem Waschen mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7, wurden diese Bakterienzellen in 100 ml des gleichen Puffers resuspendiert, wobei 20 U/ml Bakterienzell-Suspension erhalten wurden.
Danach wurde 1 ml jeder der Bakterienzell-Suspensionen und 9 ml einer 2,78 Gew.-%igen Acrylnitrillösung in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7, vermischt und die Umsetzung wurde bei 30ºC, 40ºC, 50ºC oder 60ºC durchgeführt. Nach 10 Minuten wurde zum Stoppen der Reaktion 1 ml 2 N HCl zugegeben. Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben zur Bestimmung der Menge an produziertem Acrylamid durch Gaschromoatographie analysiert. Die Menge an produziertem Acrylamid bei den jeweiligen Temperaturen wurde auf der Grundlage der Werte, die im Falle von Bacillus sp.-Bakterien R332, welche als 100 gesetzt wurden, jeweils umgewandelt. Die umgewandelten Werte sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Beispiel 4: Umsetzung unter Verwendung von Bakterienzell-Kulturbrühe

Zu 100 ml der Bakterienzell-Kulturbrühe von Bacillus smithii 50405-1, welche in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden 2,5 g (47,2 mmol) Acrylnitril zugegeben und die Umsetzung wurde unter Rühren mit einem Magnetrührer bei 20ºC durchgeführt. Nach 3 Stunden wurden 1,0 ml des Reaktionsgemischs entnommen, welchem zum Stoppen der Umsetzung 0,1 ml 2 N HCl zugegeben wurden. Dieses Aliquot des Reaktionsgemisches wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel I beschrieben durch Gaschromatograpahie analysiert. Als Ergebnis wurden alle Portionen Acrylnitril in ihrer Gesamtheit in Acrylamid umgewandelt und die Bildung von Nebenprodukten wie Acrylsäure konnte nicht nachgewiesen werden.

Beispiel 5: Umsetzung unter Verwendung von Bakterienzellen

Aus 150 ml Bakterienzell-Kulturbrühe von Bacillus smithii SC-J05-1. welche in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 10 Minuten gesammelt. Nach Waschen mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7, wurden diese Zellen in 50 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Zu dieser Suspension wurden in drei Portionen 3,0 g (56,6 mmol) Acrylnitril zugegeben und die Umsetzung wurde bei 20ºC unter Rühren mit einem Magnetrührer durchgeführt. Nach 4 Stunden wurden 1,0 ml des Reaktionsgemisches entnommen, zu welchen zum Stoppen der Reaktion 0,1 ml 2 N HCl zugegeben wurde. Dieses Aliquot des Reaktionsgemisches wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben durch Gaschromatographie analysiert. Als Ergebnis wurden alle Portionen Acrylnitril in ihrer Gesamtheit in Acrylamid umgewandelt und die Bildung von Nebenprodukten wie Acrylsäure konnte nicht nachgewiesen werden. Andererseits wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 10 Minuten aus dem verbleibenden Reaktionsgemisch entfernt und der Überstand wurde durch Destillation unterhalb von 50ºC konzentriert, wobei die Ablagerung von Kristallen verursacht wurde, welche dann mit Methanol umkristallisiert wurden, wobei 3,7 g (52,1 mmol, 92% Ausbeute) farblose Kristalle von flacher Form erhalten wurden. Die Messung des Schmelzpunktes, Elementaranalyse, IR-Spektren und NMR-Spektren bestätigten, dass es sich bei diesen Kristallen um Acrylamid handelte.

Beispiel 6: Umsetzung unter Verwendung von Enzymlösung

Aus 8 l der Bakterienzell-Kulturbrühe von Bacillus smithii SC-J05-1, welche in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden die Bakterienzellen durch Zentrifligation bei 10.000 · g für 10 Minuten erhalten. Nach dem Waschen wurden diese Bakterienzellen in 300 ml 0,05 M HEPES-KOH-Puffer, pH 7,2, resuspendiert und zweimal mit einer "French"-Presse bei 20.000 psi. aufgeschlossen. Die aufgeschlossenen Zellen wurden bei 10.000 · g 30 Minuten zentrifugiert, um die verbleibenden Bakterienzellen zu entfernen. Unter Verwendung eines Dialyseschlauches (Wako Pure Chemical Intrustries, Ltd.) wurde der Überstand 24 Stunden bei 4ºC gegen 10 mlvi HEPES-KOH-Puffer, pH 7,2 dialysiert, wobei der Puffer viermal gewechselt wurde. Das Dialysat wurde durch eine Säule (50 mm 0 · 200 mm) mit DEAE- Sepharose FF (Pharmacia) als Anionenaustauscher geschickt, welche zuvor mit 0,05 M HEPES-KOH-Puffer, pH 7,2 equilibriert wurde, wobei die Adsorption von Enzymen daran bewirkt wurde.
Dann wurde zum Waschen 0,05 M HEPES-KOH-Puffer, pH 7,2 durch die Säule geschickt und die Elution wurde durch einen Gradienten von 0,05 M HEPES-KOH-Puffer, pH 7,2 mit 0 M bis 1,0 M Kaliumchlorid durchgeführt. Diejenige Fraktion, welche die Hydratisierungsaktivität zeigt, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln, wurde gewonnen und unter Verwendung eines Dialyseschlauches (Wako Pure Chemical Intrustries, Ltd.) 24 Stunden bei 4ºC gegen 10 mM HEPES-KOH-Puffer, pH 7,2 dialysiert, wobei der Dialysepuffer viermal gewechselt wurde. Das Dialysat wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Elution durch einen Gradienten aus 0,05 mM HEPES-KOH-Puffer, pH 7,2 mit 0,2 M bis 0,8 M Kaliumchlorid durchgeführt wurde, aufgereinigt. Das Eluat wurde auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben dialysiert, wobei eine Enzym-Rohextraktlösung erhalten wurde.
Die Aktivität, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln, wurde wie folgt bestimmt:
Als erstes wurde 1 ml der Enzym-Rohextratklösung zu 9 ml einer 100 mM wässrigen Propionitrillösung, pH 7, 7, zugegeben und die Umsetzung wurde bei 10ºC gestartet. Nach 10 Minuten wurde zum Stoppen der Reaktion 1 ml 2 N HCl zugegeben. Ein Aliquot des Reaktionsgemischs wurde entnommen und zur Bestimmung der Menge an produziertem Propionamid durch Gaschromatographie analysiert. Im Hinblick auf die Einheit an Enzymaktivität, wie sie hierin nachfolgend verwendet wird, wurde die Umwandlung von 1 mmol Propionitril in Propionamid pro Minute als eine Einheit definiert (Unit, U). Die so erhaltende Enzym-Rohextraktlösung wurde mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7 verdünnt. Zu 100 ml dieser Verdünnung wurden 2,5 g (47,2 mmol) Acrylnitril zugegeben und die Umsetzung wurde bei 20ºC unter Rühren mit einem Magnetrührer durchgeführt. Nach 3 Stunden wurden 1,0 ml des Reaktionsgemisches entnommen, zu welchen 0,1 ml 2 N HCl zum Stoppen der Reaktion zugegeben wurden. Dieses Aliquot des Reaktionsgemischs wurde unter den gleichen Bedingungen wie für Beispiel 1 beschrieben durch Gaschromatographie analysiert. Als Ergebnis wurden alle Portionen Acrylnitril in ihrer Gesamtheit in Acrylamid umgewandelt und die Bildung von Nebenprodukten wie Acrylsäure konnte nicht nachgewiesen werden.

Beispiel 7: Umwandlung verschiedener Nitrilverbindungen

In diesem Beispiel wurden Nitril-hydratisierende Enzyme, welche in Bacillus smÜhithü SC-J05-1 enthalten sind, auf die Fähigkeit, verschiedene Nitrilverbindungen in ihre entsprechenden Amidverbindungen umzuwandeln, getestet. Zu 60 U der Enzym-Rohextraktlösung, welche in Beispiel 5 erhalten wurde, wurden 20 ml 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, 7 und 1 mmol jeder der getesteten Nitrilverbindungen wie in Tabelle 4 gezeigt als Substrat zugegeben und die Umsetzung wurde bei 30ºC für 3 Stunden durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Enzym-Rohextrakte, welche aus Bacillus smithii SC- JOS-1 hergestellt wurden, Hydratisierungsaktivität hatten, um alle getesteten Nitrilverbindungen in ihre entsprechenden Amidverbindungen umzuwandeln. Das Reaktionsgemisch wurde durch Gaschromatographie oder Flüssigchromatographie analysiert, um die Menge an produzierter Amidverbindung oder die Menge an verbrauchter Nitrilverbindung zu bestimmen. Tabelle 4
Gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene Nitrilverbindungen sogar im Bereich von Temperaturen, welche höher als Raumtemperatur sind, stabil in ihre entsprechenden Amidverbindungen umgewandelt werden, was ermöglicht, hochreine Amidverbindungen sehr wirkungsvoll über einen größeren Temperaturbereich herzustellen, im Vergleich mit den herkömmlichen Verfahren, welche gewöhnlich bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Amidverbindungen, umfassend das Umwandeln einer Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung durch Hydratisieren der Nitrilverbindung in Gegenwart einer Kulturnährbrühe aus Bakterienzellen, unversehrten Bakterienzellen, aufgebrochenen Bakterienzellen oder darin enthaltenen Enzymen oder immobilisierten Zubereitungen, die durch immobilisieren unversehrter Bakterienzellen, aufgebrochener Bakterienzeilen oder darin enthaltener Enzyme erhältlich sind, wobei die Bakterienzellen Zellen einer biologisch reinen Kultur von Mikroorganismen sind, die die Fähigkeit haben, bei Temperaturen von höher als 55ºC zu wachsen und die Hydratationsaktivität haben, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus ein Bakterienstamm von Bacillus smithii ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus Bacillus smithii SC-J05-1 (FERM BP-4935) ist.

4. Biologisch reine Kultur eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, bei Temperaturen von höher als 55ºC zu wachsen und die Hydratationsaktivität hat, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln.

5. Biologisch reine Kultur von Bacillus smithii SC-J05-1 (FERM BP-4935) oder eine Variante hiervon, die die Hydratationsaktivität hat, um eine Nitrilverbindung in ihre entsprechende Amidverbindung umzuwandeln.