CN116042743A - 粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶制备烟酰胺中的应用及其应用方法 - Google Patents

粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶制备烟酰胺中的应用及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粘着箭菌在生物转化3‑氰基吡啶制备烟酰胺中的应用及其应用方法，本发明使用的粘着箭菌CGMCC 6315菌株易于培养，应用于生物转化3‑氰基吡啶合成烟酰胺中合成方法操作简单，转化率高且无附加产物生成，产物烟酰胺可作为医药合成中间体，用于临床治疗。

Description

粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶制备烟酰胺中的应用及其应用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶为烟酰胺中的应用及转化方法。
背景技术
腈化合物是一类重要的化工合成原料。由腈化合物出发可以获得酰胺、酸等价值更高、应用范围更广的一类化合物。催化腈化合物生成相应的酰胺化合物的酶类为腈水合酶。微生物产生的腈水合酶具有反应条件温和、产率高、副产物少、区域和立体选择性强等优点。目前产生腈水合酶的微生物中，细胞绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis B23，红球菌属Rhodococcus sp.N-774和玫瑰红球菌Rhodococcus rhodochrous J1已成功应用于生物转化丙烯腈生产丙烯酰胺、3-氰基吡啶生产烟酰胺，以及己二腈生产5-氰基戊酰胺。
烟酰胺，又称尼克酰胺，是烟酸的酰胺化合物，为白色的结晶性粉末；无臭或几乎无臭，味苦；略有引湿性。在水或乙醇中易溶，在甘油中溶解。临床上主要用于防治糙皮病、口炎、舌炎，病态窦房结综合征，房室传导阻滞等问题。
目前尚未见有来源于箭菌属(Ensifer)的细菌催化3-氰基吡啶合成烟酰胺的文献报道。在先前的中国专利(专利号201210277930.2)公开了一株粘着箭菌CGMCC No.6315，及该菌作为一种植物根际促生细菌具有固氮能力的应用，但未公开该菌的其他应用。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种利用粘着箭菌产生的腈水合酶将3-氰基吡啶生物转化为烟酰胺的应用及其转化方法。
技术方案：本发明的提供了一种粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶制备烟酰胺中的应用。
进一步地，所述粘着箭菌为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)，保藏编号:CGMCCNo.6315。
本发明还提供了一种粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶制备烟酰胺中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将粘着箭菌接种于液体培养基中进行恒温发酵培养得到菌液；
(2)将菌液离心后收集细胞再进行洗涤，洗涤后将得到的菌体加入到含有3-氰基吡啶底物缓冲液中，转化后即得烟酰胺。
进一步地，所述步骤(1)中的菌液的发酵培养包括：一次发酵培养和二次发酵培养。
进一步地，所述一次发酵培养和二次发酵培养所用液体培养基为LB液体培养基，所述LB液体培养基的营养液浓度为0.05～1。
进一步地，所述LB液体培养基中还含有氯化钴，所述氯化钴的浓度为0.05～0.2mmol/L。
进一步地，所述一次发酵培养的培养时间为12～24h，所述二次发酵培养的菌液接种量为1％～5％，培养时间为12～48h。
进一步地，所述步骤(2)中的菌液洗涤包括将收集到的细胞悬浮于磷酸钠盐缓冲液中洗涤，细胞浓度调节为5.0～10.0。
进一步地，所述3-氰基吡啶底物缓冲液浓度为200～2000mg/L。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明使用的菌株易于培养，应用于生物催化3-氰基吡啶合成烟酰胺工艺简单，转化率高且不产生副产物烟酸。产物烟酰胺可作为医药合成中间体，用于临床治疗。
附图说明
图1为微生物转化3-氰基吡啶合成烟酰胺示意图；
图2为本发明方法转化合成的烟酰胺及烟酰胺标品对照HPLC图；A为烟酰胺标准品，B为本发明方法合成的烟酰胺产物；
图3为3-氰基吡啶底物、菌体和本发明方法转化合成的烟酰胺产物对照的3D瀑布图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
将粘着箭菌CGMCC 6315划线于LB固体琼脂培养基上。
所用LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH调节至7.0。配制固体培养基时加入20g/L琼脂粉。培养基于115℃高压灭菌30min。
待固体平板上长出单菌落后，挑取一个单菌落接种至含0.1mmol/L氯化钴的30mL的LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养24h。之后取3mL按1％接种量转入含0.1mmol/L氯化钴的300mL LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养12h。9000rpm离心6min收集细胞，悬浮于0.05mol/L的pH 7.5磷酸钠盐缓冲液中，细胞浓度(OD600)调节为5.0。加入到装有浓度为200ppm的2mL 3-氰基吡啶溶液的离心管。将离心管于30℃、220rpm的摇床中进行反应，2h后取样，再在12000rpm下离心3min，取上清500μL，加入500μL乙腈终止反应。用0.22μm孔径的水相过滤膜过滤后，采用安捷伦1200型高效液相色谱仪检测反应产物。结果如图2所示，粘着箭菌CGMCC 6315可将3-氰基吡啶(保留时间为8.173min)转化为保留时间为3.521min的产物，该产物的保留时间与标准品烟酰胺一致。
实施例2
将粘着箭菌CGMCC 6315划线于LB固体琼脂培养基上。
所用LB固体琼脂培养基组成同实例一。
待固体平板上长出菌落后，用无菌牙签挑取一环经活化的粘着箭菌接种于至含0.1mmol/L氯化钴的30mL的LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养24h。之后取15mL按5％接种量转入含0.1mmol/L氯化钴的300mL的1/15LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养48h。
所用1/15LB液体培养基(营养液浓度约为0.07)制备过程：取20mL液体LB培养基，加入280mL双蒸水稀释为300mL的1/15LB培养基。
再经过9000rpm离心6min后收集细胞，悬浮于0.05mol/L的pH 7.5磷酸钠盐缓冲液中，细胞浓度(OD600)调节为5.0。加入到装有浓度为2g/L的2mL 3-氰基吡啶溶液的离心管。转化2h后取样采用HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为652.49mg/L，摩尔转化率为56.4％。
实施例3
其他实验条件同实施例2，加入底物浓度为200ppm的3-氰基吡啶溶液2mL，转化时间1h后取样采用HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为229.85mg/L，摩尔转化率为84.25％。
结论表明，底物浓度过高对腈水合酶产生底物抑制作用，不利于转化。
转化时间根据预实验设置，转化1h可完成转化，延长转化时间对转化率没有明显作用，因此后续实验将转化时间定为1h。
实施例4
将粘着箭菌CGMCC 6315划线于LB固体琼脂培养基上。
所用LB固体琼脂培养基组成同实例一。
待固体平板上长出菌落后，挑取一个单菌落接种于至含0.1mmol/L氯化钴的30mL的LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养24h。之后取3mL按1％接种量转入含0.1mmol/L氯化钴的300mL的LB液体培养基中进行二次发酵培养，30℃、220rpm振荡培养12h。再经过9000rpm离心6min后收集细胞，悬浮于0.05mol/L的pH 7.5磷酸钠盐缓冲液中，细胞浓度(OD600)调节为5.0。加入到装有浓度为200ppm的2mL3-氰基吡啶溶液的离心管。转化1h后取样采用HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为24.09mg/L，摩尔转化率为28％
实施例5
其他实验条件同实施例4，二次发酵培养时，取6mL按2％接种量转入含0.1mmol/L氯化钴的300mL的1/5LB液体培养基中培养。
所用1/5LB液体培养(营养液浓度为0.2)基制备过程：取60mL液体LB培养基，加入240mL双蒸水稀释为300mL的1/5LB培养基。
HPLC定量分析测定烟酰胺的含量结果表明，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为43.85mg/L，摩尔转化率为42.46％。
实施例6
其他实验条件同实施例4，二次发酵培养时，取15mL按5％接种量转入含0.1mmol/L氯化钴的300mL的1/10液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养48h。
所用1/10LB液体培养基(营养液浓度为0.1)制备过程：取30mL液体LB培养基，加入270mL双蒸水稀释为300mL的1/10LB培养基。
HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为203.41mg/L，摩尔转化率为81.03％。
实施例7
其他实验条件同实施例4，二次发酵培养时，取15mL按5％接种量转入含0.1mmol/L氯化钴的300mL的1/20液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养48h。
所用1/20LB液体培养基(营养液浓度为0.05)制备过程：15mL液体LB培养基，加入285mL双蒸水稀释为300mL的1/20LB培养基。
HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为222.36mg/L转化率为81.51％。
分析实施例4-7，二次发酵培养时加入菌液体积根据培养基中营养物浓度不同而调整，1LB按1％接种量加入菌液，1/5LB按2％接种量加入菌液，1/10LB和1/20LB按5％接种量加入菌液；二次发酵培养时间根据实验经验设置，当营养物浓度在一定范围内降低，但二次发酵培养时间不相应缩短时，会有菌体死亡的现象，而当营养物浓度进一步降低，则需延长二次发酵培养时间，否则菌体不能充分生长，因此当营养物浓度为1、1/2、1/5LB时，二次发酵培养时间为12h，当营养物浓度为1/10、1/15、1/20LB时，二次发酵培养时间为48h。
实验结果表明，当二次发酵培养时LB培养基的营养成分减少至原先的1/5、1/10、1/20时，转化率明显提高，进一步减少LB中的营养成分后，菌株的生长受到抑制,转化率趋于稳定。
实施例8
其他实验条件同实施例3，细胞浓度(OD600)调节为10.0。HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为173.54mg/L，摩尔转化率为87.9％。
对比实施例3和8，结论表明提高细胞浓度可相应提高转化率。
实施例9
其他实验条件同实施例3，二次发酵培养时，所用1/15LB液体培养基中氯化钴的浓度为0.05mmol/L。
HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为211.98mg/L，摩尔转化率为77.7％。
实施例10
其他实验条件同实施例3，二次发酵培养时，所用1/15LB液体培养基中氯化钴的浓度为0.2mmol/L。
HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为12.82mg/L，摩尔转化率为17.89％。
对比实施例3、9和10，结论表明钴离子浓度对腈水合酶的活性有一定的影响，当钴离子浓度从0.05mmol/L增加到0.1mmol/L时，腈水合酶的活性逐渐增高，且在钴离子浓度为0.1mmol/L时转化率达到最高，当钴离子的浓度达到0.2mmol/L时，腈水合酶的活性明显减少。

Claims (9)

1.一种粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶制备烟酰胺中的应用。
2.根据权利要求1所述的粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶制备烟酰胺中的应用，其特征在于，所述粘着箭菌为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)，保藏编号:CGMCC No.6315。
3.一种权利要求1所述的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将粘着箭菌接种于液体培养基中进行恒温发酵培养得到菌液；
(2)将菌液离心后收集细胞再进行洗涤，洗涤后将得到的菌体加入到含有3-氰基吡啶底物缓冲液中，转化后即得烟酰胺。
4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的菌液的发酵培养包括：一次发酵培养和二次发酵培养。
5.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于：所述一次发酵培养和二次发酵培养所用液体培养基为LB液体培养基，所述LB液体培养基的营养液浓度为0.05～1。
6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于：所述LB液体培养基中还含有氯化钴，所述氯化钴的浓度为0.05～0.2mmol/L。
7.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于：所述一次发酵培养的培养时间为12～24h，所述二次发酵培养的菌液接种量为1％～5％，培养时间为12～48h。
8.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中的菌液洗涤包括将收集到的细胞悬浮于磷酸钠盐缓冲液中洗涤，细胞浓度调节为5.0～10.0。
9.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于：所述3-氰基吡啶底物缓冲液浓度为200～2000mg/L。
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