CN114231450A - 一种粘着箭菌及其制备方法和在生产维生素b12中的应用 - Google Patents

一种粘着箭菌及其制备方法和在生产维生素b12中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粘着箭菌及其制备方法和在生产维生素B12中的应用，该粘着箭菌命名为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG‑22，保藏编号为CGMCC No.23306，保藏日期为2021年8月27日。本发明提供了一种由出发菌粘着箭菌Nhu 015‑9经紫外诱变和氯化锂诱变处理后获得的诱变菌株，该诱变菌株不仅在发酵至144h左右达到了最大菌浓，比出发菌同时期的菌浓提高16.4％，而且比出发菌的对数期缩短2天，维生素B12的发酵单位达到了251mg/L明显高于出发菌，其糖耗由1.18kg/g降低为1.05kg/g，甜菜碱消耗由0.21kg/g降低为0.16kg/g，大大降低了生产成本。

Description

一种粘着箭菌及其制备方法和在生产维生素B12中的应用
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，尤其涉及一种粘着箭菌及其制备方法和在生产维生素B12中的应用。
背景技术
维生素B12为钴胺类化合物，维生素B12又称钴铵素,它是一系列含有以钴原子为中心的咕啉核和以5,6-二甲苯并咪唑为碱基的核苷酸，并对人和动物具有生物活性的类咕啉同功维生素总称，主要活性品种有氰钴铵、羟钴铵、腺苷钴铵和甲钴铵。临床上，维生素B12主要用于治疗恶性贫血，同时也用于治疗各种神经系统疾病和某些肝脏疾病等。
目前，用于维生素B12的生产菌株，包括脱氮假单胞菌、费氏丙酸杆菌、苜蓿中华根瘤菌等，其中脱氮假单胞菌具有生长速度快、生产合成能力高和代谢生长过程中不产生内毒素和外毒素的优点，而被广泛应用于维生素B12的工业发酵生产中。目前菌种选育的方法主要是自然选育、诱变选育和构建基因工程菌，其中自然选育的诱变效率较低，只能作为分离、纯化、复壮的工具，基因工程菌的构建具有目的性，但是操作过程较繁琐，并且容易退化，诱变育种随机性强，操作简单，因此诱变育种不失为一种不错的获得脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌的方法。
诱变育种的方法包括化学法和物理法。华北制药采用紫外线和5-嗅尿嘧啶复合诱变处理，选育到一株抗5-嗅尿嘧啶突变株5-BU-3-5，该菌株经摇瓶发酵，发酵单位较出发菌株提高了18％。中国专利CN102453690A采用甲磺酸乙酯和低能离子注入复合诱变，获得遗传性状稳定、发酵条件优良的菌株，与原始菌株相比，发酵单位提高8％～12％。中国专利CN109207469A采用紫外和ARTP复合诱变，最终获得遗传性质稳定、发酵水平较高的菌种，该菌株最终发酵单位达到315μg/mL，并且发酵至144h左右达到最大菌浓，比原始菌株同时期菌浓提高了16.5％；与另两种菌株相比，对数期由原先的120h左右，缩短至96h左右，为后期产维生素B12奠定了基础。目前，现有技术中维生素B12生产菌粘着箭菌的发酵水平仍有进一步提升的空间。
发明内容
本发明提供了一种粘着箭菌及其制备方法和在生产维生素B12中的应用，该粘着箭菌由出发菌粘着箭菌Nhu 015-9经紫外诱变和氯化锂诱变处理后获得，获得的突变株不仅发酵菌株浓度大大提高，对数期缩短，而且维生素B12的发酵单位也显著提高。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种粘着箭菌，命名为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22，保藏编号为CGMCC No.23306，保藏日期为2021年8月27日。
进一步地，上述粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22的生理学特性为杆状，革兰氏阴性菌，有鞭毛，运动，兼性需氧，菌落多为白色，粘稠，最适生长温度为28℃。
进一步地，上述粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22的16s RNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种上述粘着箭菌的制备方法，包括：
(1)取出发菌粘着箭菌Nhu 015-9，制成出发菌悬液；
(2)用紫外灯对出发菌悬液进行紫外诱变，得到诱变后的菌体，稀释诱变后的菌体，将菌体涂布于含氯化锂的无菌平皿中，进行恒温培养，得到突变菌体；
(3)对突变菌体依次进行斜面培养、种液培养、发酵培养后，根据发酵单位，确定初筛优势菌；
(4)对初筛优势菌进行多次复筛，挑选出典型诱变菌株，对每个典型诱变菌株进行逐一发酵摇瓶考察，选择发酵单位和菌浓均较高的菌种，得到高产维生素B12的诱变菌株。
进一步地，步骤(2)中，所述紫外灯的波长为365nm，照射时间为50～70s，照射距离为20～30cm；稀释后的菌体浓度为1×10-6～1×10-7cfu/mL；所述无菌平皿中氯化锂的质量百分数为0.5～0.75％；恒温培养的温度为26～30℃，时间为7～8天。
本发明还提供了如上文所述的粘着箭菌在生产维生素B12中的应用。
本发明还提供了一种生产维生素B12的方法，包括：
(A)将粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22接种至种子培养基中进行种子培养，得到种子液；
(B)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液。
进一步地，所述种子培养的温度为28～30℃，转速为150-300rpm，时间为20～25h；
以种子培养基为基准，按质量百分数计，所述种子培养基的各组分为：糖蜜10％-12％，硫酸铵2.0％-2.5％，磷酸氢二铵0.5％-1.0％，一水硫酸锰0.1％-0.2％，七水硫酸镁1.2％-1.5％，七水硫酸锌0.5％-0.8％，其余为水，pH 7.0-7.5。
进一步地，所述发酵培养的温度为28～30℃，转速为150-300rpm；发酵培养至60h后控制溶氧处在20～30％之间，并在发酵培养至40h后开始添加补料培养基进行补料，发酵至菌体自溶严重，单位无明显提高时放罐；
以发酵培养基为基准，按质量百分数计，所述发酵培养基的各组分为：赤砂糖12％-15％，玉米浆2％-4％，磷酸氢二铵0.5％-1％，硫酸铵1％-2％，氯化钴0.03％，5,6-二甲基苯并咪唑0.1％-0.15％，甜菜碱2％-3％，七水硫酸镁2.0％-3.0％，碳酸钙1.0-1.5％，其余为水，pH 7.0-7.5。
进一步地，以葡萄糖作为补料碳源，总糖浓度为100-200g/L。
更进一步地，以补料培养基为基准，按质量百分数计，所述补料培养基各组分如下：葡萄糖20％，甜菜碱6％，氯化钴0.02％，5,6-二甲基苯并咪唑0.02％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种由出发菌粘着箭菌Nhu 015-9经紫外诱变和氯化锂诱变处理后获得的诱变菌株，该诱变菌株不仅在发酵至144h左右达到了最大菌浓，比出发菌同时期的菌浓提高16.4％，而且比出发菌的对数期缩短2天，维生素B12的发酵单位达到了251mg/L明显高于出发菌。
(2)本发明提供的粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22在整个发酵过程中，菌体形态较粗长，长短均一，比较整齐。
(3)本发明提供的粘着箭菌的制备方法操作方法简单，菌株发酵水平较高，遗传稳定，可以用于维生素B12的工业发酵生产。
附图说明
图1为本发明粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22制备方法的流程示意图。
图2为实施例1诱变菌株Nhu HG-22工业发酵生产维生素B12过程中出发原始菌和突变菌菌浓的变化曲线图。
图3为实施例1诱变菌株Nhu HG-22工业发酵生产维生素B12过程中出发菌和突变菌发酵单位的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中涉及的粘着箭菌Nhu 015-9(保藏编号为CGMCC No.21299，保藏日期为2020年12月04日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。)
实施例1
一、突变株粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22的制备工艺
1、诱变处理
(1)出发菌悬液制备：取出发菌株(粘着箭菌Nhu 015-9)的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管中振荡使菌体分散，离心收集菌体，以生理盐水重悬菌体，制得出发菌悬液；
(2)诱变：用新洁尔灭擦拭紫外诱变仪的桌面及内壁，开启紫外灯灭菌30min，灭菌结束后，取出空白无菌培养皿，在无菌条件下，倒出发菌液薄薄一层，波长365nm、诱变距离25cm，照射60s，紫外诱变结束后，收集菌体，取1ml用无菌水进行梯度稀释，稀释至10-7浓度下，涂布至含0.75％氯化锂无菌平板中，涂布棒涂布均匀后，至恒温培养箱中，28℃培养8天。
氯化锂无菌平板培养基配方为：甜菜糖蜜10g/L，磷酸氢二铵1.5g/L，硫酸铵0.2g/L，七水硫酸镁1.0g/L，七水硫酸锌0.1g/L，一水硫酸锰0.1g/L，氯化锂7.5g/L，琼脂20g/L；用20％的NaOH溶液调节pH，消前pH为7.2。以上培养基配制好经灭菌(0.12MPa，121℃，30min)后，分别装于无菌培养皿中制成平板培养基。
2、高通量初筛
(1)孔板斜面培养：用新洁尔灭擦拭紫外诱变仪的桌面及内壁，开启紫外灯灭菌30min，灭菌结束后，取出已培养好的平皿单菌落，随机挑取200个菌形较饱满、偏大的单菌落涂布至无菌的孔板斜面上，标号，放至恒温培养箱中，28℃培养3天，待长出厚厚一层，备用；
斜面培养基配方为：甜菜糖蜜100g/L，玉米浆(干物)2.0g/L，甜菜碱1.0g/L，磷酸氢二铵1.5g/L，硫酸铵0.2g/L，七水硫酸镁1.0g/L，七水硫酸锌0.1g/L，一水硫酸锰0.1g/L，琼脂20g/L；用20％的NaOH溶液调节pH，消前pH为7.2。以上培养基配制好后，分别装于24孔板斜面中，经灭菌(0.12MPa，121℃，30min)后制成斜面使用。用接菌环蘸取少量单菌落，涂布到斜面培养基上，在28℃恒温箱中培养3天，得到斜面。
(2)孔板种液培养：用接菌环刮取一环孔板斜面菌种于含有1ml种子培养基的48孔板中，一一对应，标号，于28℃、250rpm摇床培养24h，剩余孔板斜面置于4℃冰箱中保藏备用。
种子培养基配方为：甜菜糖蜜100g/L，磷酸氢二铵2.0g/L，硫酸铵0.05g/L，七水硫酸镁1.0g/L，七水硫酸锌0.01g/L，一水硫酸锰0.1g/L，5,6-二甲基苯并咪唑0.002g/L；用20％的NaOH溶液调节pH，消前pH为7.3。经灭菌(0.11～0.12MPa，121℃，30min)后制成种子培养基。
(3)孔板发酵培养：将培养好的菌液，分别取0.3ml接种于含2.7ml发酵培养基的24孔板中，每个菌液3个平行，标号，于32℃、250rpm摇床培养120h，HPLC测发酵单位，残糖、残碱、OD、pH；
发酵培养基配方为：蔗糖100g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆20g/L，磷酸氢二铵0.5g/L，硫酸铵1.0g/L，尿素0.5g/L，七水硫酸镁1.0g/L，七水硫酸锌0.1g/L，六水氯化钴0.1g/L，5,6-二甲基苯并咪唑0.05g/L；用20％的NaOH溶液调节pH，消前pH为7.4。经灭菌(0.12MPa，121℃，30min)后制成摇瓶发酵培养基。
(4)酶标仪快速检测孔板发酵单位：在发酵结束后的发酵液中加入0.1ml冰醋酸，摇匀，然后加入8％亚硝酸钠溶液0.1ml，摇匀，盖上乳胶盖，于水浴锅中煮沸30min，3000rpm离心10min，取上清。稀释5倍，采用酶标仪测吸光度，根据吸光度与维生素B12标准浓度曲线，计算出发酵液的发酵单位，确定初筛优势菌。
3、摇瓶复筛
从初筛结果中选出发酵单位高的诱变菌株，经反复多次复筛，选出前10％的诱变菌株再进行复筛，复筛时一株作三个平行，对挑选出的典型诱变菌株，逐一进行发酵摇瓶考察，筛选得到一株发酵单位和菌浓均较高的菌株，命名为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22。
实施例2粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22的形态和生物学鉴定
经诱变、初筛和复筛，获得一株粘着箭菌菌株，生理学特性为杆状，革兰氏阴性菌，有鞭毛，运动，兼性需氧，菌落多为白色，粘稠，最适生长温度为28℃。该菌株命名为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22，保藏编号为CGMCC No.23306，保藏日期为2021.8.27，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例3诱变菌株Nhu HG-22工业发酵生产维生素B12
(1)挑取诱变菌(粘着箭菌Nhu HG-22)和出发菌(粘着箭菌Nhu 015-9)，分别接种至斜面培养基，28℃，培养3天，分别得到粘着箭菌Nhu HG-22和粘着箭菌Nhu 015-9的斜面菌；
(2)母瓶制备：将粘着箭菌Nhu HG-22和粘着箭菌Nhu 015-9的斜面菌用无菌水洗下后分别接入种瓶培养，28℃，200rpm，培养1d，分别得到粘着箭菌Nhu HG-22和粘着箭菌Nhu 015-9的母瓶；
(3)种子罐培养：将粘着箭菌Nhu HG-22和粘着箭菌Nhu 015-9的母瓶分别接种到种子罐中，30℃，300rpm，培养24h；
(4)发酵罐培养：在无菌条件下，按照8％的接种量，将种子罐发酵液压入发酵罐，进行发酵罐培养；30℃，300rpm，发酵至60h后控制溶氧30％，40h开始补料，发酵至菌体自溶严重，单位无明显提高时放罐。发酵过程中每隔8h取样检测，结果见图2和图3。
其中，按质量百分数计，斜面培养基各组成如下：甜菜糖蜜10％，玉米浆(干物)0.2％，甜菜碱0.1％，磷酸氢二铵0.15％，硫酸铵0.02％，七水硫酸镁0.1％，七水硫酸锌0.01％，一水硫酸锰0.01％，琼脂2％；用20％的NaOH溶液调节pH，消前pH为7.2。
按质量百分数计，种子培养基各组成如下：糖蜜10％，硫酸铵2.0％，磷酸氢二铵0.5％，一水硫酸锰0.1％，七水硫酸镁1.2％，七水硫酸锌0.5％，其余为水，pH7.3；
按质量百分数计，发酵培养基各组成如下：赤砂糖12％，玉米浆2％，磷酸氢二铵0.5％，硫酸铵1％，氯化钴0.03％，5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI)0.1％，甜菜碱2％，七水硫酸镁2.0％，碳酸钙1.0％，其余为水，pH7.4；
按质量百分数计，补料培养基各组分如下：葡萄糖20％，甜菜碱6％，氯化钴0.02％，5,6-二甲基苯并咪唑0.02％。
菌浓的检测方法：以纯水为空白对照，将发酵液稀释50倍，利用分光光度计在波长为700nm条件下进行测定吸光度A，即为该发酵液的OD。
发酵单位的检测方法：取5ml发酵液于25ml比色管中，加入0.5ml冰醋酸，摇匀，再加入0.5ml的8％HNO2溶液，摇匀，滴少许消泡剂，放置于沸水中煮沸30min，冷却，定容至25ml，混匀，取2ml处理样品12000rpm离心2min，再取上清液经0.22μm水相膜过滤。采用Eclipse XDB高效液相色谱系统检测，流动相为乙腈-水(1：9，v/v)，温度40℃，流速1.0mL/min，检测波长550nm，进样量20μl。色谱柱为C18柱，4.6mm*150mm。
结果：如图2所示，所制备的菌株发酵至144h左右达到了最大菌浓，比出发菌株同时期的菌浓的生长速度提高了16.4％；与出发菌相比，对数期缩短了2天左右，为后期维生素B12的生产奠定了基础；在整个发酵过程中，菌体形态较粗长，长短均一，比较整齐；如图3所示，该菌株最终发酵单位达到了251mg/L，较出发菌株粘着箭菌Nhu 015-9提高24％，明显高于出发菌株，其糖耗由1.18kg/g降低为1.05kg/g，甜菜碱消耗由0.21kg/g降低为0.16kg/g，大大降低了生产成本。其操作方法简单，菌株发酵水平较高，遗传稳定，可以用于维生素B12的工业发酵生产。
序列表
<110> 黑龙江新和成生物科技有限公司
浙江新和成股份有限公司
<120> 一种粘着箭菌株及其制备方法和在生产维生素B12中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggtgatcca gccgcaggtt cccctacggc taccttgtta cgacttcacc ccagtcgctg 60
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atacggtatt agcacaagtt tccctgcgtt attccgtaga aaagggtaga ttcccacgcg 1380
ttactcaccc gtctgccgct ccccttgcgg ggcgctcgac ttgcatgtgt taagcctgcc 1440
gccagcgttc gttctgagcc aggatcaaac tct 1473

Claims (10)

1.一种粘着箭菌，命名为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22，保藏编号为CGMCCNo.23306，保藏日期为2021年8月27日。
2.如权利要求1所述的粘着箭菌，其特征在于，所述粘着箭菌(Ensifer adhaerens)NhuHG-22的生理学特性为杆状，革兰氏阴性菌，有鞭毛，运动，兼性需氧，菌落多为白色，粘稠，最适生长温度为28℃。
3.如权利要求1所述的粘着箭菌，其特征在于，所述粘着箭菌(Ensifer adhaerens)NhuHG-22的16s RNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的粘着箭菌的制备方法，其特征在于，包括：
(1)取出发菌粘着箭菌Nhu 015-9，制成出发菌悬液；
(2)用紫外灯对出发菌悬液进行紫外诱变，得到诱变后的菌体，稀释诱变后的菌体，将菌体涂布于含氯化锂的无菌平皿中，进行恒温培养，得到突变菌体；
(3)对突变菌体依次进行斜面培养、种液培养、发酵培养后，根据发酵单位，确定初筛优势菌；
(4)对初筛优势菌进行多次复筛，挑选出典型诱变菌株，对每个典型诱变菌株进行逐一发酵摇瓶考察，选择发酵单位和菌浓均较高的菌种，得到高产维生素B12的诱变菌株。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述紫外灯的波长为365nm，照射时间为50～70s，照射距离为20～30cm；稀释后的菌体浓度为1×10-6～1×10-7cfu/mL；所述无菌平皿中氯化锂的质量百分数为0.5～0.75％；恒温培养的温度为26～30℃，时间为7～8天。
6.如权利要求1～3任一项所述的粘着箭菌在生产维生素B12中的应用。
7.一种生产维生素B12的方法，其特征在于，包括：
(A)将如权利要求1所述的粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu HG-22接种至种子培养基中进行种子培养，得到种子液；
(B)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液。
8.如权利要求7所述的生产维生素B12的方法，其特征在于，所述种子培养的温度为28～30℃，转速为150-300rpm，时间为20～25h；
以种子培养基为基准，按质量百分数计，所述种子培养基的各组分为：糖蜜10％-12％，硫酸铵2.0％-2.5％，磷酸氢二铵0.5％-1.0％，一水硫酸锰0.1％-0.2％，七水硫酸镁1.2％-1.5％，七水硫酸锌0.5％-0.8％，其余为水，pH 7.0-7.5。
9.如权利要求7所述的生产维生素B12的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28～30℃，转速为150-300rpm；发酵培养至60h后控制溶氧处在20～30％之间，并在发酵培养至40h后开始添加补料培养基进行补料，发酵至菌体自溶严重，单位无明显提高时放罐；
以发酵培养基为基准，按质量百分数计，所述发酵培养基的各组分为：赤砂糖12％-15％，玉米浆2％-4％，磷酸氢二铵0.5％-1％，硫酸铵1％-2％，氯化钴0.03％，5,6-二甲基苯并咪唑0.1％-0.15％，甜菜碱2％-3％，七水硫酸镁2.0％-3.0％，碳酸钙1.0-1.5％，其余为水，pH 7.0-7.5。
10.如权利要求9所述的生产维生素B12的方法，其特征在于，所述补料培养基以葡萄糖作为补料碳源，总糖浓度为100-200g/L。
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