DE1933301A1 - Verfahren zur Herstellung von hypoallergenischen Penicillinen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von hypoallergenischen PenicillinenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung
von hypoallergenischen Penicillinen. Besonders betrifft sie die Herstellung von hypoallergenischen Penicillinen
durch Herstellung, Reinigung und Isolierung eines Ensympräparates aus Escherichia coil, enzymatischen Abbau eines natürlichen
Penicilline mit Hilfe dieser Penicillinaeylaso und
Acylierung der so gewonnenen 6-Aminopenicillansäure»
Es ist bekannt,, daß viel® Mikroorganismen, sowohl Bakterien
wie SLUOh. Pilze, Enzyme produzierst? die die Amidbindhmg in der
— 2 —
6-Position von Penicillinen hydrolysieren und die allgemein als
Penicillinacylasen oder -amidasen "bezeichnet werden (siehe J.M.
T. Hamilton-Miller, Bacteriological Reviews, 30 (1966), Seite 761). Bei der gegenwärtigen großtechnischen Produktion von
6-Aminopenicillansäure werden vorzugsweise Suspensionen von E. coli-Zellen, die eine Acylase oder Amidase enthalten, verwendet.
Diese Methoden nahen jedoch verschiedene Nachteile. Da das Enzym weitgehend intracellulär ist, muß das Penicillin
notwendigerweise zuerst in die Zellkörper eindringen, um mit dem Enzym zu reagieren, was zu einer langsameren Reaktion führt.
Der Zellstamm kann auch andere Enzyme enthalten, die das Penicillin oder die gebildete 6-Aminopenicillansäure durch Aufspaltung
der ß-Lactambindung inaktivieren oder die die Zellkultur
mit den Organismen, die solche Enzyme bilden, verunreinigen. Da die Acylaseinur einen sehr kleinen Teil des Zellgehaltes
ausmachen, hat das Verfahren unter Verwendung des gesamten Organismus
auch insofern einen praktischen Kachteil* als große Materialmengen, die im Verfahren inaktiv sind, verarbeitet werden
müssen.
Ein weiterer Nachteil infolge der Verwendung der gesamten Organismen
besteht darin, daß eine zusätzliche Stufe an den Verfahrensablauf angehängt werden muß, der zur Herstellung halbsynthetischer
Penicilline führt, nämlich die Abtrennung (wie beispielsweise durch Filtration)»der Organismen von der Reaktionsflüssigkeit;,
in der die ursprünglich vorhandene Seitenkette von bioayntnetischen
Penicillinen abgespalten wurde. Ein weiterer Nachteil ist der Verlust an Penicillansäure, teils durch Adsorption
an den Zellen vjid teils durch Abbau, der durch während des
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Zellstoffwechsels gebildete Materialien eingeleitet wird. Noch
ein anderer Paktor, der zu Problemen führt, ist mit der Verwendung der gesamten Zellen für die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure
aus biosynthetischen Penicillinen verbunden und besteht darin, daß die Abtrennung der Säure von anderen Produkten
der Abspaltungsreaktion ziemlich schwierig ist. So berichteten Batchelor et al (Lancet I (1968), Seite 1175), daß unter Verwendung
ganzer Zellen erhaltene 6-Aminopenicillansäure proteinhaltige Verunreinigungen enthalten kann, die in der Lage sind,
gefährliche Allergie herbeiführende Reaktionen bei Menschen und Tieren hervorzurufen. Wenn Penicilline aus derart verunreinig-,
ter 6-Aminopenicillansäure hergestellt werden, können die Verunreinigungen
in den Produkten zurückgehalten werden und verantwortlich für viele der allergischen Reaktionen sein, die bei
diesen Penicillinen beobachtet werden (Cf0So Stewart, Amer.
Heart. J. (1968), Seite 429). Um- diese Verunreinigungen zu entfernen,
müssen die daraus hergestellten Penicilline oder 6-Aminopenicillansäure
zusätzlichen Trennverfahren, wie Dialyse oder
GeIfiltration, unterzogen werden (Kanadisches Patent 771 662).
Dabei werden große Mengen der 6-Aminopenicillansäure oder des Penicillins verloren, wie sich aus einer Gewinnung von nur 12$
Benzylpenicillin (Britische Patentschrift 1 078 847) oder von nur 56$ Phenoxymethy!penicillin (Britische Patentschrift
1 114 311) ergibt.
Alle diese Nachteile werden vermieden, wenn man ein zellfreies
oder gereinigtes Enzympräparat nach der vorliegenden Erfindung verwendet. So erhält man die 6-Aminopenicillansäure unter Verwendung eines zollfreien oder gereinigten Enzympräparates nach
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• — tj. «—
der vorliegenden Erfindung zur Aufspaltung der Amidbindung in
der 6-Position des Penicillins "in guten Ausbeuten und im wesentlichen
frei von proteinhaltigen Verunreinigungen. Wenn die auf diese Weise hergestellte 6-Aminopenicillansäure acyliert wird,
erhält man hypoallergenische Penicilline in guten Ausbeuten ohne irgendwelche zusätzliche Reinigung. In der Literatur finden
sich verschiedene Versuche, gereinigte Enzympräparate aus E. coli-Stämmen herzustellen. Borkar et al(Hindustan Antibiotics
Bull. 4 (1961), Seiten 48, 152) behandelten in einem Phosphatpuffer suspendierte Zellen mit Ultraschallwellen und erreichten
eine 25-fache Reinigung durch fraktionierte Ausfällung und mit einer Chromatographiersäule. Holt und Stewart (Naure 201
(1964), Seite 824)- erhielten ein Enzympräparat geringer Reinheit durch Gefriertrocknung und Dialyse der filtrierten Kulturbrühe.
Szentirmai (Acta Microb. Acad. Scient. Hung. 12 (1966), Seite
395) erhielt eine 40-fache Reinigung eines E. coli-Enzyms durch Ammoniumsulfatausfällung und nachfolgende Calciumphosphatgeladsorption
und DEAE-Cellulose- Chromatographie eines Phosphatpuiferextraktes
von E. coli-Zellens die mit Ultraschallwellen behandelt
waren.
Sakaguchi und Marao (Japanische Patentschrift 26 050/64) erhielten
eine mäßige Ausbeute an gereinigtem Enzympräparat von E. coli durch Extrahieren der Zellen mit Boratpuffer über
längere Zeitdauer oder über kürzere Zeit in Kombination mit Ultraschallwellenbehandlung. Aus dem Extrakt konnte das Enzym
in fester Form nach Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse
und Gefriertrocknung erhalten werden. Johneon und Hardcastle
(USA Patentschrift 3 297 546) erhielten eine Lösung eines Enzyms
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BAD ORtGlNAL
aus E. coli durch Behandlung der Zellkultur mit einer Verbindung MX2, üblicherweise Ca(NO, )«* und quaternären Ammoniumverbindung,
Abfiltrieren der Zellen und Suspendieren derselben in Wasser während einiger Stunden sowie anschließende Entfernung
der Zellen durch Filtration mit nachfolgender Behandlung des Filtrats mit Aktivkohle.
Es ist außerdem bekannt, daß in Bakterienzellen enthaltene Enzyme beim Extrudieren von Zellsuspensionen unter hohem Druck
durch ein enges Mundstück freigegeben werden. Duerre und Hibi (Appl. Microbiol. 11 (1964), Seite 467)» die andere Enzymtypen
als Penicillinamidasen untersuchten, fanden bei dem untersuchten E. coli, daß Hochdruck über 1.000 Atmosphären (15.000 psi)
angewendet werden muß, um eine maximale Freigabe des Enzyms zu erreichen. Bei solchen Drücken jedoch wurden auch die Zellwände
zerstört, und große Mengen des Zellmaterials wurdest in Lösung
gebracht. Frazer (Nature 167 (1951), Seite 33) fand, daß E. coli-Zellen in kleinem Maßstab zersprengt werden konnten, wenn
sie aus einer Bombe durch einen Gasdruck von 34-61 Atmosphären
(500 - 900 psi) ausgetrieben wurden.
Es wurde nun gefunden, daß die intracelluläre Penioillinacylase
in E. coli aus dem Organismus in groß-technischem Maßstab in Wasser extrahiert werden kann, nachdem die Zellen oder deren
Suspensionen in Wasser oder einem Gemisch von Wasser und organischen Lösungsmitteln schnell von einem aufgebrachten Druck
von wenigstens 34 Atmosphären (§00 psi)p der jedoch nicht grosser
ist als der Druck, bei dem die Zellen ü"b©i»aäiig g!©rreiSen,
befreit werdene
ΘΘ9826/1419
Sp liefert die vorliegende. Erfindung in einer H insieht ein Verfahren
zur Herstellung von Penicillinacylase-Präparaten aus E. coli durch Fermentierung eines solch ein Enzym produzierenden
E. coli-Stammes in an sich bekannter Weise, Entfernung der Kulturflüssigkeit
und schnelles Ausstoßen des Zellmaterials durch eine enge öffnung oder einen engen Schlitz unter Aufbringung
eines Druckes von wenigstens 34 Atmosphären, der jedoch unter dem Druck liegt, wo übermäßiges Zerreißen der Zellen auftritt.
Noch bei 204 Atmosphären (3.000 psi) werden die Zellen nicht übermäßig zerstört. Das ausgestoßene Material wird dann mit
Wasser, gegebenenfalls unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels und/oder einer Base, wie Natriumhydroxid oder Triäthylamin,
gerührt, um das Enzym in Lösung zu bringen. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Entfernung der Kulturflüssigkeit und das Ausstoßen des Zellmaterials
gleichzeitig in einer selbstreinigenden Zentrifugen-Trennvorrichtung,
die bei einer Temperatur zwischen 0 - 50° C, vorzugsweise bei 15 - 40° G, arbeitet, wo das abgetrennte Zellmaterial
intermittierend innerhalb von 0,05 - 1,0 Sekunden, vorzugsweise innerhalb von 0,1 - 0,5 Sekunden, durch einen ringsum laufenden
Schlitz mit einer Breite von 0,1 -1,5 im, vorzugsweise 0,3 "bis
0,7 mm, durch Aufbringung eines Druckes von 34 - 136 Atmosphären
(500 - 2.000 psi), vorzugsweise 61 - 75 Atmosphären (900
bis 1.100 psi), ausgestoßen wird. Wenn erwünscht, wird die Brühe mit einem organischen Lösungsmittel mit geringer Löslich-.keit
in Wasser gesättigt, wie beispielsweise mit Butylacetat, iBobutylaoetat und Amylaoeisat, um den Organismus abzutöten und
den Abtrennprozeß zu unterstützen. In gleicher Weise ist es
möglich, wenn erwünscht, das Zellmaterial in der Abtrennvorrichtung
mit Wasser zu waschen. Das ausgestoßene Zellmaterial wird bei 10 - 50° C, vorzugsweise bei 20 - 40° C, während 0,10
bis. 5,0 Stunden, zweckmäßigerweise während 0,25 bis 3,0 Stunden
und vorzugsweise während 0,25 - 1,0 Stunden, mit einem wirksamen Rührer gerührt, um das Enzym zu lösen, wobei gegebenenfalls in
einer Konzentration von 1,0 - 5,0$ ein mit Wasser unmischbares
organisches Lösungsmittel, wie Methylisobuty!keton, Butylacetat,
Isobutylacetat, Amylacetat, Benzol, Toluol oder Chloroform, zugesetzt
wird. Um die Extraktion des Enzyms aus dem ausgestoßenen Zellmaterial su erleichtern, kann zu dem G-emisoh eine anorganische
Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniak, oder eine tertiäre organische Base, wie Triäthylamin oder ΝΑ'
thyl piperidin, zugesetzt werden, um den pH-Wert zwischen 6,5
und 9,0, vorzugsweise zwischen 7*0 und 895, einzustellen und zu
halten.
Die so erhaltene Enzymlösung kann, gegebenenfalls nach Verdünnung
mit Wasser, von irgendwelchem zurückgebliebenen Zellmaterial und anderen festen Verunreinigungen nach üblichen Verfahren,
wie Filtration oder Zentrifugieren oder gegebenenfalls durch eine Kombination beider Methoden und möglicherweise unter Zusatz
von entfärbenden Mitteln, klärenden Mitteln und FiIterhilfsmitteln,
wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Cellulosepulver, Diatomeenerde oder anderen festen, schwach adsorbierenden Mitteln, befreit
werden. Eine bevorzugte Methode ist die, das meiste Zellmaterial durch Zentrifugieren zu entfernen und die darüberste·^
hende Flüssigkeit zu filtrieren.
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Zusätzliche Reinigung des Enzyms kann man durch Ansäuern der
wässrigen Lösung auf pH 3»O - 6,0, vorzugsweise auf 4,0 - 5»0, Entfernung des ausgefällten inaktiven Materials durch Filtration
und erneute Einstellung auf den ursprünglichen pH-Wert erreichen.
Die Penicillinacylase, die in den oben beschriebenen zellfreien,
und gegebenenfalls teilweise gereinigten wässrigen Lösungen enthalten ist, kann durch Behandlung der Lösungen mit Mitteln, wie
Tanninen, die schlecht lösliche Komplexe mit Proteinen bilden, ausgefällt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses
Verfahrens wird die Enzymlösung bei einem pH 4 - 6, zweckmäßigerweise· bei pH 4,5 - 5»5» mit Tannin bis zu einer Endkonzentration
von 500 - 900 ppm in Gegenwart eines chelatbildenden Mittels, wie Äthylendiamintetraessigsäure, das mit Eisenionen Komplexe
bildet, behandelt. Der gebildete Enzym-Tanninkomplex kann in üblicher Weise, wie beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren,
isoliert werden. Er kann gewaschen und getrocknet und von Wasser befreit werden, wie beispielsweise durch Trocknen,
besonders durch Gefriertrocknung, oder durch Behandlung mit organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, wie
Aceton. Der Tannin-Komplex ist eine geeignete Form für die Lagerung und den Transport des Enzyms. Er kann auch direkt
für die Entfernung der Seitenkette von Penicillinen, wie Benzylpenicillin, verwendet werden, wie in der britischen Patentanmeldung
33 734/67 beschrieben ist.
Die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Penicillinacylase kann durch Auflösen des Komplexes in Wasser bei pH 7 - 9, vor-
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zugsweise 7,5 - 8,5, in wässrige Lösung gebracht werden. Wechselweise
kann der Komplex auch mit einem Gemisch von Wasser und einem mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel, wie n-Butanol, bei
pH 4 - 7, vorzugsweise 4,5 - 5,5, behandelt werden. Eine dritte Methode zur Entfernung des Tannins besteht in der Behandlung des
in Wasser suspendierten Enzym-Tannin-Komplexes mit einem anionischen Ionenaustauscher, wie DEAE-Oellulose, welcher das Tannin
bindet und das Enzym an das Wässer abgibt. Die für diese Methoden notwendigen Wassermengen sind wesentlich kleiner als jene in
den ursprünglichen Enzymlösungen, und auf diese Weise erreicht
man eine beachtliche Konzentrierung der enzymatischen Aktivität.
Nach einem anderen Aspekt dieser Erfindung kann die in irgendeiner
oben beschriebenen Lösung enthaltene Penicillinacylase mit Hilfe eines Ionenaustauschers konzentriert und gereinigt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Enzym auf einem kationischen Ionenaustauscher mit einer offenen Struktur, wie
SE-Sephadex^ , CM-Cellulose oder CM-Sephadex^ durch Überleiten
der auf pH 3,5 - 6, vorzugsweise 4,0 - 5»0t eingestellten Lösung
des Enzyms durch eine lonenaustauschersaule adsorbiert werden. Wechselweise kann auch der Austauscher zu der gerührten Enzymlösung
zugegeben werden. Die Acylase kann aus dem Ionenaustauscher durch Eluieren bei pH 6,0 - 8,0 mit schwachen Pufferlösungen, wie 0,2 m Ammoniumacetat oder Trishydroxymethylammoniumacetat,
freigesetzt werden.
Um reinere Präparate des Enzyms zu erhalten, können anorganische Ionen und niedermolekular® Verunreinigungen aus den Enzymlösungen
duroh Dialysieren gegen Wasaer entfernt werden. Wechselweise
I419
werden die Lösungen, wenn nötig nach Konzentrierung durch Verdampfen
"bei einer Temperatur unterhalb 50° G auf eine geeignete
Konzentration von 25 - 100 mg Trockengewicht je ml, der Gelfiltration
unterzogen.
Die so in irgendeiner der obigen Stufen erhaltenen wässrigen Enzymlösungen sind sehr zweckmäßig, direkt für die Entfernung
der Seitenketten von natürlichen Penicillinen, besonders für die Entfernung der Seitenkette von Benzylpenicillin, verwendet
zu werden.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Ai
das wie bisher hergestellte Enzym aus wässriger lösung in festem Zustand durch Gefriertrocknung, Plätationstrocknung, Sprühtrocknung
oder Konzentrierung im Vakuum oder durch Ausfällung gemäß bekannten Verfahren isoliert. Das Isolierungsverfahren führt
zu einem festen Enzym, das eine hohe spezifische Aktivität besitzt und das in einer für die Lagerung und den Transport sehr
geeigneten form vorliegt. Die Verwendung solcher festen, wasserlöslichen Enzympräparate hat auch verschiedene technische Vorteile,
da es möglich ist, mit konzentrierteren Lösungen als jenen zu arbeiten, die bei bekannten Verfahren "unter Verwendung
von Zellsuspensionen benutzt werden.
Die bevorzugte Methode zur Isolierung des Enzyms besteht entweder in einer Gefriertrocknung einer Enzymlösung bei einer
Temperatur zwischen -10° und +50° 0, vorzugsweise zwischen 0° und 30° 0, oder durch Flutationstrocknung in einem luftstrom
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bei 10° - 55° C, vorzugsweise bei 35° - 45° C
Die nach der Erfindung erhaltenen gereinigten Enzyme und Enzymlösungen
sind sehr geeignet und vorteilhaft für die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch Entfernung der Seitenkette von
Penicillinen, speziell von Benzylpenicillin. Die Ausbeuten und Reinheiten der Produkte sind wesentlich besser als jene, die man
mit bekannten Verfahren bei Benutzung von Suspensionen von E. coli-ZeIlen erreicht»
Es wurde auch gefunden, daß nach dieser Erfindung hergestellte 6-Aminopenicillansäure sehr wenig, wenn überhaupt, proteinhaltige
Verunreinigungen mit Allergie erzeugenden Eigenschaften enthält gegenüber jener, die man unter Verwendung von Suspensionen
von E. coli-Zellen herstellt. Dies ist von großer technischer
Wichtigkeit, da es so möglich ist, Penicilline mit hypo-allergenischen Eigenschaften direkt aus der nach der Erfindung
hergestellten 6-Aminopenicillansäure ohne zusätzliche Reinigungsverfahren zu gewinnen. Beispiele von Penicillinen
mit hypo-allergenischen Eigenschaften, die auf diese Weise hergestellt werden können, sind« ©C-Phenoxyäthy!penicillin,
C?C -Phenoxypropylpenicillin, 2,6-Dimethoxyphenylpenicillin,
3-(o-Chlorphenyl)-5-methyl-4--isoxazolylpenicillin, C<-Carbonylbenzylpenicillin,
(TC-Azidobenzylpenicillin und <*-Aminobenzylpenicillin.
Die Penicillinacylase von E. coil kann auch zur Entfernung der
Seitenkette von Penicillinestern, besonders von Estern von
Benzylpenicillin verwendet werden, wie in der britischen Patent-
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$AO ORIGINAL
anmeldung 33 734/67 beschrieben ist. Es wurde nun gefunden, daß die nach der Erfindung erhaltenen Enzympräparate sehr geeignet
für dieses Verfahren und wirksamer als die bisher verwendeten Suspensionen von E. coli-Zellen sind. Außerdem wurde
gefunden, daß die Enzympräparate nach der Erfindung besser als die bisher benutzten Zellsuspensionen bei der enzymatischen Synthese
von Penicillinen aus 6-Aminopenicillansäure und Vorläufern mit Seitenketten sind (W.K. Kaufmann et al., Antimicrobial
Agents Ann. 1960, Seite 1).
Die nach der Erfindung erhaltenen gereinigten Enzympräparate sind geeignete Ausgangsmaterialien für eine chemische Modifizierung
des Enzyms und führen zu Präparaten mit besseren Eigenschaften hinsichtlich der Aktivität und/oder der technischen
Leistung. So kann das Enzym mit aktivierten Polymermaterialien,
wie beispielsweise mit Bromcyan behandelten Polysachariden reagieren,
um Produkte zu ergeben, in denen das Enzym an einem polymeren Trägermaterial fixiert ist. Die enzymatische Aktivität
wird in solchen Produkten erhalten, die für die Verwendung zur Spaltung von Penicillinen von Vorteil sind, da sie aus der
Reaktionslösung mit einfachen Mitteln, wie beispielsweise durch Filtration, gewonnen werden können. Die Präparate aus Polymermaterial und Enzym können auch in Säulen für die kontinuierliche
Herstellung von 6-Aminopenicillansäure benutzt werden, indem man Penicillinlösungen durch diese Säulen leitet.
Die Herstellung und Renigung eines zellfreien Enzymproduktes, die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus natürlichen
Penicillinen (wie beispielsweise Benzylpenicillin) und die Her-
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stellung von synthetischen Penicillinen aus 6-Aminopenicillansäure
werden durch die folgenden Beispiele erläutert.
Herstellung von E. coli-Bakterienzellen
Maiseinweichflüssigkeit (3 kg), Sojabohnenöl (135 ml), Paraffin
(12 ml) und Cetanol (3 ml) in Wasser (150 l) wurden auf pH 6,0 mit 45$iger Natronlauge (165 ml) eingestellt und dann bei 124°
G 30 Minuten in einem Fermentationsbehälter sterilisiert. Die Lösung wurde mit 100 ml einer 20 - 24 Stunden^Kultur von E. coli
(Astra 1339) geimpft und bei 25° C unter Belüftung und Rühren 18 Stunden inkubiert.
Maiseinweichflüssigkeit (300 kg), Sojabohnenöl (13,8 kg), Paraffin
(1,22 kg), Cetanol (0,3 kg), Phenylessigsäure (21 kg) und Natriumchlorid (112 kg) in Wasser (14,0004) wurden mit 45#iger
Natronlauge'(40 kg) auf pH 6,6 eingestellt, und die Lösung
wurde in einem Fermentationsbehälter bei 124° 0 30 Minuten
sterilisiert. Die Lösung wurde gekühlt und mit der oben erwähnten Impfkultur geimpft und anschließend bei 25° C unter
Rühren und Belüftung inkubiert. 24 Stunden nach der Impfung und, wenn der pH-Wert, auf 8,2 angestiegen war, wurden die Bakterienzellen
durch Zugabe von Butylacetat (180 1) abgetötet, und das Gemisch wurde ans chi ie B end. gekühlt.
Isolierung und Reinigung der Acylaee . 000626/U1.9
a) .Zur Isolierung der Bakterienmasse wurde das Gemisch in
einer selbstreinigenden Zentrifugentrennvorrichtung (De Laval, Typ BRPX 213-35S) getrennt. Die Bakterienzellenpaste
wurde in 100 - 120 kg-Anteilen gesammelt. Zu jedem
Anteil wurden 3,0$ Methylisob.utylketon zugesetzt, und das
Gemisch wurde dann mit Hilfe eines TJltra-Turrax-Rühreis
(Typ T 110/2M) 25 Minuten lang homogenisiert. Die Gesamtausbeute
an Bakterienmasse betrug 325 kg.
Analyse des Enzyms in den verschiedenen Produktionsstufen
ergab die folgenden Werte in Acylase-Einheiten, die entscheidend für die während der betreffenden Stufe zurückbleibende
Enzymmenge sind (eine Acylase-Einheit entspricht der Enzymmenge, die in der Lage ist, in 1,5 Stunden bei pH
8,5 und 37° C eine Menge an Benzylpenicillin aufzuspalten,
die einem mg 6-Aminopenicillansäure äquivalent ist):
Fermentationskultur 5 E/ml
Überstehende Flüssigkeit 0,33 E/ml
Flüssiger Auslauf der Zentrifugen- 0 2a E/ml
trennvorrichtung * '
Bakterienzellenpaste 212 E/g
Überstehende. Flüssigkeit in der 7,- E /
Paste vor der Homogenisierung /ö
Überstehende Flüssigkeit in der
Paste nach der Homogenisierung 123 E/g
b) Die in Beispiel 2a) erhaltene Bakterienzellenpaste wurde
bei Untersuchungen der Enzymlöslichkeit verwendet. Zu 100 g Zellpaste wurden 100 ml entionisiertes Wasser züge-
0098-26/1419
Die erhaltene Suspension besaß einen pH-Wert von 5»9 und
wurde zu einer Reihe von folgenden Behandlungen benutzt»
I. Die Suspension wurde 20 Minuten bei 5.000 G (Zentrifugalkraft,
gemessen in Vielfachen der Erdschwere) zentrifugiert, und die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit
wurde bestimmt.
II. Die Suspension wurde einer Homogenisierung mit Hilfe eines
Ultra-Turrax-Rührers während 5 Minuten zugeführt. Während
dieser Behandlung wurde die Probe in einem Eisbad gekühlt, um Temperaturen oberhalb 35° C in der Probeözu vermeiden.
Die Probe wurde dann wie unter I. zentrifugiert, und die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde bestimmt.
III. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 8,5 mit Natronlauge
unter Rühren eingestellt, worauf die Probe wie oben homogenisiert und zentrifugiert und die Aktivität in der überstehenden
Phase bestimmt wurde.
IV» yfo Methylisobutylketon wurden zu der Suspension zugesetzt,
deren pH-Wert wie in Versuch III. eingestellt wurde. Diese Probe wurde dann wie oben homogenisiert und zentrifugiert,
und die Enzymaktivität in der überstehenden Phase wurde bestimmt.
Das Verfahren eines Löslichmachens kann durch folgende
Tabelle demonstriert werden.
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Enzymlöslichkeit
B/g | io der Gesamtmenge |
106 | 100 |
29 | 28 |
62 | 59 |
73 | 69 |
83 | 78 |
Bakteriensuspension
Überstehende Flüssigkeit aus I. Überstehende Flüssigkeit aus II. Überstehende Flüssigkeit aus III. Überstehende Flüssigkeit aus IV.
Überstehende Flüssigkeit aus I. Überstehende Flüssigkeit aus II. Überstehende Flüssigkeit aus III. Überstehende Flüssigkeit aus IV.
c) Homogenisierte Bakterienpaste (175 kg, Aktivität 190 E/g) wurde mit Wasser (175 kg) verdünnt, und unter Rühren des
Gemisches wurde Hyflo (22,7 kg), Celite 505 (22,7 kg) und Fibraflo (10,2 kg) zugesetzt. Die Wasserphase wurde durch
Filtration auf einem Funda*—'-Filter abgetrennt, und der
Filterkuchen wurde mit Wasser (50,1) gewaschen. Die vereinigten
Lösungen (290 kg) besaß^en eine Aktivität von 48 E/g.
d) Homogenisierte Bakterienpaste (1 kg , Aktivität 212 E/g)
wurde mit Wasser (2,0 1) verdünnt, mit Hilfe von 0,5 η Natronlauge (220 ml) auf pH·-8,5 eingestellt und dann 30
Minuten bei 20° C gerührt. Das Gemisch wurde mit 13.200 G (Serwall, Typ RC-2, Automatic Superspeed Refrigerated Centrifuge)
30 Minuten bei 0° C zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit wurde abgegossen, durch Filtration geklärt und ergab 2,7 kg Lösung mit einer Aktivität von
50 E/g. Erneutes zweimaliges Suspendieren des Sedimentes in Wasser (1 1) während 5 Minuten bei pH 8,5 und nachfolgen-
009Ö26/U19
ORIGINAL INSPECTED
des Zentrifugieren ergab eine zusätzliche Enzymlösung (2 kg, Aktivität 11 E/g). Dies entspricht einer gesamten
Aktivitätsausbeute von 74$ wasserlöslicher Acylase.
e) Klare Acylaselösung (2 kg, Aktivität 50 E/g), wie in Beispiel 2d) erhalten, wurde lyophilisiert und ergab 98,5 g
feste Acylase mit einer Aktivität von 950 E/g.
f) Klare Acylaselösung (2 kg, Aktivität 50 E/g), erhalten wie in Beispiel 2d), wurde sprühgetrocknet und ergab 92 g feste
Acylase mit einer Aktivität von 920 E/g.
g) Klare Acylaselösung (1 kg, Aktivität 52 E/ml), wie in Beispiel 2d) erhalten, wurde 8 Stunden gegen strömendes Leitungswasser
dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde lyophilisiert und ergab 20,5 g feste Acylase mit einer
Aktivität von 2.400 E/g.
h) Klare Acylaselösung (245 kg, Aktivität 48 E/g), gemäß Beispiel 2c) erhalten, wurde gerührt und mit Hilfe von 9-m
Essigsäure (2,2 kg) auf pH 4,5 eingestellt. . Das Rühren wurde 1 Stunde fortgesetzt, und danach wurde das Gemisch
filtriert und die klare Lösung mit 7-m Ammoniak (4,5 kg) unter Bewegen auf pH 8,0 eingestellt. Naoh einer Stunde
wurde das Gemisch filtriert und die Lösung mit Hilfe von 9-m Essigsäure (2,0 kg) auf pH 5 eingestellt. Die Aktivität
der Lösung (220 kg) betrug 47,5 E/g.
-OOÖ826/U10
i) Gemäß Beispiel 2d) erhaltene überstehende Flüssigkeit ■ (500 g, Aktivität 52 E/g) wurde auf pH 4 eingestellt und
15 Minuten bei O0 C gerührt, um Proteinverunreinigungen
auszufällen. Nach dem Zentrifugieren" und Einstellen auf pH 7,5 wurde die erhaltene klare Lösung (500 g, Aktivität
40 E/g), gegen Leitungswasser über Nacht dialysiert und sodann gefriergetrocknet und ergab 4 g mit einer Aktivität
von 4.900 E/g.
j) Homogenisierte Bakterienpaste (1 kg mit einer Aktivität von
128 E/g) wurde mit 13.200 G (Serwall» Typ RC-2, Automatic
Super speed Refrigerated Centrifuge) 30 Minuten bei 0° C zentrifugiert.
Bie überstehende Flüssigkeit ( 500 g, Aktivität 80 E/g) wurde abgegossen, durch Filtration geklärt und
als solche für enzymatische Penicillinspaltung zur Bildung von 6-Aminopenicillansäure verwendet.
Beispiel 3
λ
Herstellung von Acyläse mit Tannin
Gemäß Beispiel 2h) gewonnene Acylaselösung (185 kg» Aktivität 47,5 E/g) wurde gerührt und mit Ä'thylendiamintetraessigsäure
(50 g) und anschließend mit einer Tanninlösung (166 g) und Natriumsulfit (55 g) in Wasser (5,5 1) behandelt. Nach einstündigem
Rühren wurde Gelite 505 (1,5 kg) und Natriumsulfit (700 g) zugesetzt und die Suspension filtriert» wobei man
3.950 g feuchten festen Tanninacylase-Niedersofclag mit einer
Aktivität von 1.930 E/g erhielt.
009826/U19
Gewinnung von Acylase aus dem Tannin-Niederschlag
a) Gemäß Beispiel 3 erhaltener feuchter Tanninacylase-Niederschlag
(30,4 g, Aktivität 1.930 E/g) wurde mit kaltem Aceton (30 ml, -10 bis -30p C) behandelt, welches langsam unter
Rühren zugesetzt wurde. Nachdem der Niederschlag teilweise gelöst war, wurde eine zusätzliche Menge kaltes Aceton
(200 ml) auf einmal zugesetzt und das Gemisch filtriert. Der Feststoff wurde mit kaltem Aceton gewaschen und an Luft
bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. Ausbeute 15,4 g, Aktivität 3.650 E/g.
b) Feuchter Tanninacylase-Niederschlag (3.750 g, Aktivität
1.930 E/g) gemäß Beispiel!.3 wurde in 0,1 molarem Ammoniumacetat mit pH 5,0 (5,0 1) und Butanol (2,5- 1) suspendiert.
Natriumsulfit (50 g) wurde zugesetzt, und der pH-Wert wurde mit Hilfe von Essigsäure auf 5,0 eingestellt. Das Rühren
wurde 20 Minuten fortgesetzt und das Gemisch filtriert. Die Wasserphase (6.650 ml, Aktivität 800 E/ml) wurde abgetrennt.
c) Acylaselösung (1.000 ml, Aktivität 48 E/ml) wurde nach einer
wie
pH-Praktionierung in Beispiel 2h) mit Tannin gemäß Beispiel 3 behandelt. Der Tanninacylase-Niederschlag wurde filtriert und unter Rühren in 0,1-m Ammoniumacetatpuffer mit pH 8,0 (100 ml) suspendiert. Das Rühren wurde eine Stunde fortgesetzt, und der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt und kon-' trolliert. Das Gemisch wurde filtriert und ergab 100 ml
pH-Praktionierung in Beispiel 2h) mit Tannin gemäß Beispiel 3 behandelt. Der Tanninacylase-Niederschlag wurde filtriert und unter Rühren in 0,1-m Ammoniumacetatpuffer mit pH 8,0 (100 ml) suspendiert. Das Rühren wurde eine Stunde fortgesetzt, und der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt und kon-' trolliert. Das Gemisch wurde filtriert und ergab 100 ml
Acylaselösung mit 220 E/ml.
'0 09826/1419
d) In Pufferlösung mit pH 8 (100 ml) suspendierter feuchter
Tanninacylase-Niederschlag wie in Beispiel 4c) wurde mit DEAE-Cellulose (2 g, Kapazität 1,0 m-Äquivalent/g) behandelt.
Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und filtriert und ergab eine Acylaselösung (90 ml) mit 494 E/ml,.
e) Wie in Beispiel 3 erhaltener feuchter Tanninacylase-Niederschlag
(36,6 g, Aktivität 1.250 E/g) wurde in 0,2-m Ammoniumacetatpuffer
mit pH 8 (150 ml) suspendiert und auf pH 8,0 eingestellt. Nach 10-minütigem Rühren wurde Butanol (60 ml)
und anschließend 9-m Essigsäure bis pH 5,0 zugesetzt. Das
Rühren wurde 10 Minuten fortgesetzt und das Gemisch dann filtriert. Die Wasserschicht (166 ml, Aktivität 140 E/ml)
wurde abgetrennt.
Lyophilisierung von Tanninacylase-Niederschlag
Wie in Beispiel 3 erhaltener Tanninacylase-Niederschlag (86,1 g,
Aktivität 1.600 E/g) wurde auf -30° 0 gekühlt und im Vakuum bei 25° G und 0,1 - 0,2 Torr getrocknet. Die Ausbeute betrug 28,5 g
eines trockenen Produktes mit einer Aktivität von 2.340 E/g.
Isolierung des Enzyms durch Trocknung
ä) Sprühtrocknung
Wie in Beispiel 2h) erhaltene Acylaselösung (5 1, Aktivität
. ■ 0.Q98.26/U18 '
47,5 E/ml) wurde "bei einer Lufttemperatur von 110 - 115° C
am Einlaß und von 70 - 75° C am Auslaß während einer Zeit von einer Stunde sprühgetrocknet.
Ausbeute 85 g, Aktivität 380 E/g
b) Flotationstrocknung
Gellulosepulver (100 g) wurde mit gemäß Beispiel 4b) erhaltener Acylaselösung (200 g, Aktivität 162 E/g) vermischt.
Das resultierende Gemisch wurde in einem Luftstrom bei 40° C während 90 Minuten flo.tationsgetrocknet. Es wurden 93»2 g
trockenes Pulver mit einer Aktivität von 284 E/g erhalten.
Reinigung der Acylaseaktivität durch Ionenaustauscher-Chromatographie
a) Die in Beispiel 2c) erhaltene Acylaselösung (5.000 ml,
Aktivität 48 E/ml) wurde mit Hilfe von 9-m Essigsäure auf pH 4,6 eingestellt. Nach Stehen über Nacht in der Kälte
wurde das Gemisch filtriert und die klare Lösung durch eine Ionenaustauschersäule geschickt (Sulphoethyl Sephadex^—'
C 50, Durchmesser 8 cm, Länge 15 cm in 0,1-m Ammoniumacetat,
pH 4,6). Die Säule wurde mit dem Ammoniumacetatpuffer von einem pH 4,6 (650 ml) gewaschen. Die Acylase wurde mit
0,2-m Ammoniumacetatpuffer von pH 8,0 Bluiert. Die erhaltenen
640 ml besaßen eine Aktivität von 326 E/ml.
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b) .Eine gemäß Beispiel 4 b).erhaltene gereinigte Acylaselö-
' sung (5.550 ml, Aktivität 800 E/ml) wurde auf pH 4,6 eingestellt
und in gleicher Weise wie in Beispiel 7a) "behandelt. Man erhielt 2.350 ml mit einer Aktivität von 1.610
E/ml.
c) Auf SE-Sephadex wie in Beispiel 7b) gereinigte Acylaselösung (250 ml, Aktivität 1.610 E/ml) wurde auf -40° C gekühlt
und im Vakuum bei 0,1 - 0,2 Torr und einer Temperatur von 25° 0 getrocknet. Die Ausbeute betrug 2,11 g gereinigte
Acylaae mit einer Aktivität von 190.000 E/g.
d) Die in Beispiel 7b) gereinigte Acylaselösung (230 ml, Aktivität
1.610 E/ml) wurde durch Eindampfen im Vakuum auf ein Volumen von 24 ml konzentriert. 15 ml des Konzentrats mit
einer Aktivität von 15*000 E/ml wurden durch eine Sephadex
G- 75-Säule, (Durchmesser 2,5 cm, Länge 100 cm) geschickt.
Die Acylase wurde mit entionisiertem Wasser eluiert« Man erhielt die Acylase in 108 ml, Aktivität 1.710 E/ml. Gefriertrocknung
dieser lösung ergab 1,8 g mit einer Aktivität von 92.5OO E/g.
e) Aus einer Sulphoethyl Sephadex G:50-Säule gemäß Beispiel 7a) gewonnene und gefriergetrocknete Acylaaezubereitung (72 mg)
wurde in 0,005-m Natriumphosphatpuffer mit pH 6,30 (2,7 ml) gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert und sodann
durch eine Säule geschickt, die Carboxymethylcellulose enthielt (Whatman CM-32, klein in der Kapazität: 1 Milliäquivalent/gj
Säulenlänge 13»5 cm, Durchmesser 0,9 cm), nachdem
009826/1419
die Carboxymethylcellulose -vorher mit dem Puffer ins Gleichgewicht
gebracht worden war. Die Säule wurde mit den folgenden Puffern eluiert;
0,005 m Natriumphosphatpuffer, pH 6,30 (etwa 17 ml)
0,02 m Matriumphosphatpuffer, pH 6,35 (etwa 17 ml) unl
0,1 m Natriumphoephatpuffer, pH 6,35
Fraktionen von 1,3 ml wurden gesammelt, und die Extinktion bei 280 m/U wurde gemessen. Die gesamte Enzymaktivität wurde
mit dem 0,1 m-Puffer eluiert und enthielt nur 10$ des ursprünglichen
1-roteir.gehaltes. Etwa 90$ der Gesamtextinktion
fand man als inaktives Protein in Fraktionen, die 0,005 ι Puffer enthielten.
f) Eine gemäß Beispiel 2h) erhaltene Lösung (100 ml) wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und sodann während
24,5 Stunden gegen 0,005 m-Phosphatpuffer nit einem pH von
6,0. Diäthylaminoäthylcellulose (Whatman DE-32, klein in
der Kapazität, 1,0 MiHiäquivalent je g) (12,5 mg/ml), die
mit dem oben erwähnten Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden waren, wurde zugesetzt. Die Ionenaustauschcellulose
wurde nach 30 Kinuten abgetrennt. Es wurde keine Verminderung
der Acy läse-Aktivität beobachtet, doch die Extinction
bei 280 m/U betrug nur noch 10$ des Ursprungswertes. Die
Enz.vnr-ktivität wurdo dann durch Carboxymethylcellulose
(V/hatr-jan 01.1-32) adsorbiert, mit HGl behandelt und gewaschen
r.'l<-r nit G. 005 Ju-l;auriuir.iicetR.t mit pH 5,5 äquilibriert. In
iji.' ο·■:):. i'-l'"' ϊ·'τ, wurden :-r<ve:i. verschiedene lohc-.n^ustauschermerre-i
Ο 0 9 8 2 β / U 1 9
benutzt, nämlich 12,5 mg und 3>2 mg je ml. Each Abtrennung
des Ionenaustauschers wurde die Enzymaktivität nach Dispergieren des Ionenaustauschers in Wasser eluiert, indem man
den pH-Wert auf 6-7 und die lonenstärke durch Zugabe von 0,1 m Phosphatpuffer erhöhte. Die Ausbeute betrug etwa 80$.
g) Eine gemäß Beispiel 2h) erhaltene Lösung (100 ml) wurde gegen destilliertes Wasser und dann 22 Stunden gegen 0,005 m
Phosphatpuffer -von pH 6,0 dialysiert. Die Lösung wurde zweimal mit Diäthylaminoäthylcellulose (Whatman DE-32) (12,4 rug'
je ml) behandelt, die mit dem oben erwähnten Puffer äquilibriert
worden war. Die Lösung wurde dann mit dem gleichen Ionenaustauscher (13 mg je ml) in der 0H-Form ohne Verlust
an Acylase-Aktivität behandelt. Der Ionenaustauscher wurde 30 Minuten nach seiner Zixgabe abgetrennt.: Nach dem letzten
Zusatz war der pH-Wert auf 8,31 gestiegen. Das Enzym wurde
dann -vollständig nach Zugabe des Ionenaustauschers in der OH-, Form. (50 mg je ml) adsorbiert. Der pH betrug 9» 11'· Nach
Abtrennung des Ionenaustauschers und seinem Dispergieren in Wasser wurde das Enzym durch Einstellung des pH-Wertes auf
etwa 6 eluiert. Die Ausbeute betrug etwa 60$, und die Reinheit
des Enzyms, gemessen als das Verhältnis von Aktivität
zu Extinktion bei 280 m/u, wurde auf das Zwanzigfache erhöht.
h) Eine gemäß Beispiel 2c) erhaltene Lösung (100 ml) wurde.
durch Dialyse gegen destilliertes Wasser während einer Stunde teilweise entsalzt und sodann mit Carboxymethyl-
.<vv£u :,'-;■ 909828/1419
cellulose in der H^-Form (Whatman CH-32, kleine Ionenkapazität,
1 Milliäquivalent je g) (etwa 40 mg je ml) behandelt. Der pH-Wert wurde auf 4,0 - 4,5 eingestellt. Der Ionenaustauscher
wurde/ abgetrennt und die adsorbierte Acylase durch Erhöhung des pH-Wertes auf etwa 6 und Erhöhung der Ionenstärke
durch Zugabe von Phosphatpuffer eluiert.
i) Das Verfairen gemäß Beispiel 7h) wurde wiederholt, doch
wurde als Ausgangsmaterial eine gemäß Beispiel 2h) erhaltene Lösung verwendet.
j) Eine gemäß Beispiel 2c) erhaltene Lösung (100 ml) wurde durch Behandlung mit etwa 25 mg je ml Carboxymethylcellulose
(Whatman CM-32) in der H+-]?orm und dann mit der gleichen
Menge an Diäthylaminoäthylcellulose (Whatman DE-32) in der 0H~-Form entsalzt und von Proteinen befreit. Der pH-Wert
wurde so kontrolliert, daß er innerhalb des Bereiches von 5-7 abfiel. (Die Behandlung kann wiederholt werden,
sollte aber beendet werden, bevor wesentliche Mengen an Acylase adsorbiert v/erden). Das Enzym wurde dann mit Hilfe'
von Carboxymethylcellulose adsorbiert und wie in Beispiel 7a) eluiert.
k) Eine gemäß Beispiel 2c) oder 2h) erhaltene Lösung (100 ml) wurde wie in Beispiel 7j) mit der Ausnahme behandelt, daß
keine Diäthylaminoäthylcellulose verwendet wurde.
BAD
00082671418 BA
" - 26 - ■ 19333Q1
Beispiel 8 . .-■■-. ' : , .
Konzentration und Reinigung der Acylase-Aktivität durch
Ultrafiltration
Eine gemäß Beispiel 2c) erhaltene Lösung (10 ml), die durch Behandlung
mit Ionenaustauscher gemäß Beispiel 7j), jedoch unter
.Weglassung der letzten Stufe eines Adsorbierens mit Carboxymethylcellulose
teilweise entsalzt und von Proteinen befreit worden war, wurde mit destilliertem W&3ser (40 ml) verdünnt
und unter Druck durch eine Membran filtriert, die Moleküle mit einem Molekül arg ewicht von mehr als 50.000 vollständig zurückhielt
(Diaflo^^-Liembran der Amicon Corporation, Cambridge,
Mass. USA). Das Konzentrat ( 2 ml), das den Hauptteil der
Acylase enthielt, wurde gefriergetrocknet.
Ausfällung der Acy läse-Aktiv!tat mit Hilfe von Ammonium-
sul-fat
a) Zu einer gemäß Beispiel 4b) erhaltenen gereinigten Acylaselösung
(1.000 ml, Aktivität 358 E/ml) wurde Ammoniumsulfat (570 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde gerührt, bis sich das
Salz gelöst hatte. Nach swei-stündigem Stehen bei 5° C
wurder der gebildete Niederschlag abfiltriert. Die Ausbeute betrug 52,5 g feuchte Verbindung mit einer Aktivität
von 5.160 E/g. . ■
b) Die gemäß Beispiel 9a) erhaltene f^euchte Verbindung :
(47,0 g, Aktivität 5.160 E/g) wurde an der luft über
009828/1411
BADORJGfNAt.
Nacht "bei 25° C getrocknet. Ausbeute 19,63 g,: Aktivität
7.580 E/g. - . -
B_e J1SJ)1 i e I_ 10 '· ■ ■
Reinigung der Aeylase-Aktivität durch Dialyse
Gemäß Beispiel 2c) erhaltene Acylase-Lösung (11 ml , Aktivität
48 E/ml) wurde ü"ber Nacht gegen entionisiertes Wasser dialysiert,
Die dialysierte Lösung wurde wie in Beispiel 5 lyophilisiert. Ausbeute 0,06 g mit einer Aktivität von 8,000 E/g.
Beis-oiel 11. ■■'"■.'
Reinigung der Acylase-Aktivität durch Gelfiltration
Gemäß Beispiel 4-b) erhaltene Acylaselösung (150 g, Aktivität
166 E/g) wurde durch Eindampfen im Vakuum auf- ein Volumen von
9 mm.konzentriert, einer Gelfiltration auf Sephadex -—"'& 75 in
einer Säule von 3 x 80 cm zugeführt und mit entionisiertem Wasser
eluiert. Die Aktivität (21.200 E) wurde in 80 ml erhalten, die 15)2$ des zugeführten Materials enthielten, wie auf der.
Grundlage der Adsorption hei 280 m/u "bestimmt vmrde.
Beispiel 12 .
Bindung von E. coli-Acylase an Polymere
a) Eine Agar ο selb sung (Sepharose 4B ''^ ,- .4^ig, 2 f5 ml) wurde
filtriert, und der isolierte feuchte Feststoff wurde 8·: ■
Minuten bei pH 11,5 - 12,0 in einer eiskalten wässrigen.
Bromcyar.lösung (5/öig. 2 ml) gerührt. Dss feste Gel wurde
~<5θ9β2β/ 1Λ 19
isöi^vi LiPM
■durch Filtration gewonnen und.auf dem Filter gut mit Eiswasser
und eiskalter 1,0 molarer Boraxlösung gewaschen.
Das Gel wurde dann in 0,1 m-Borax (4 ml) suspendiert mid
mit E. coli-Acyläse (Aktivität 1-59.000 E/g; 0,106 g), erhalten
nach Beispiel 7d), .24 Stunden bei +4° C gerührt..
Das .ü-.emisch wurde filtriert und "das gewonnene feste Mate-,
rial sorgfältig auf dem Filter mit -Wasser gewaschen, um
1,2 g festes Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 679 S/g zu ergeben.
b) Sephadex^G 25 (0,100 g) wurde 8 Minuten bei pH 11,5.-.12
mit einer eiskalten wässrigen lösung von Bromcyan .(5$ig,/
~2 ml) gerührt und filtriert. Das gewonnene -G-el wurde gut
mit Eiswasser und eiskalter 0,1 m- Boraxlösung (4 ml) ge-Y^aschun-,
Gemäß Beispiel 7d) erhaltene E. coli-Acylase
..(Aktivität 159.000 E/g, 0,106 g) wurde zügeGeta ts und das
Gemisch wurde 24 Stunden bei +4 ö gerührt. ■ D&mi wurde
das .fremisch auf pH 7,5 eingestellt und .filtriert. Das
feste.. Material--vmrde auf dem Filter mit ',Tasser gut gewaschen
Λ und ergab 0,5 g"Polymer mit einer spezifischen Aktivität von
212 E/g. ..·■.;.; ._. ■■■_-■ V-: - :■ V V
c)-.= Das Exüeriment b) ..wurde mit DSAE-Sephaöex -^ A 50 (0-, 1 g):
; ■■■ ■■* -v : ß\ :■ V: ■■" - : "
anstelle von. Sephadex-^ Qr 25 wiederholt". Ώΐε Ausbeute .be-■ -.-.
trug 1,25 g feuchtes. Polymer mit einer speaiflachen Aktivität von 435 E/g. . V-'. . ' . . ' =--.--. ; ■"■ . ..;
19 /
d) De,s Experiment. b) wurde mit Cellulosepulver (Machery, .
Magel. & Co, M-300; 0,1 g) ' anstelle von Sephadex^ G 25
wiederholt. Die Ausbeute betrug 0,35 S Polymer rait einer
spezifischen Aktivität von 261 E/g. -
Herstellung von 6-Aminopenicillansäure
Zu einer Enzymlösuiig (283 g, Aktivität 42 E/g) wurde eine Lösung
von Benzylpenicillin (20 g). als .Kaliumsalζ in Wasser
(317 ml) zugestzt. · .
Das Gemisch wurde bei; 37 C inkubiert, κη& der pH-Wert v;urde
durch periodische Zugabe von 2,5 n-Natrlunihydr.Q-xid auf 7>8 gehalten.
Nach 6 Stunden enthielt das Keaktxonsgeiaisch 10,7 g
6-A:ninopsnicillansäure (^2'-}o) und wurde filtrier b. Der pH-Wertder
Lösung wurde mit 5 ü Salzsäure auf' 3 eingestellt, und es
wurde mit einem halben Volumenteil Methylisobuty!keton extrahiert, um restliches Benzylpenicillin und die Phenylessigsäure
aus der Seitenkette, die. während der Bildung der 6-Aminopenicillansäure
abgespaltet Wurde., zu entfernen." Hach der Extraktion
wurde die Wasserlösung vom Methylisobuty!keton abgetrennt.
Der pH-Yfert der VfasVerlosung'wurde auf 7,5 eingestellt und das
Volumen im Vakuum auf 120 ml vermindert.-- Die konzentrierte
Lösung wurde, auf 5° C abgekühlt und filtriert. Wenn die filtrierte
.Lösung.mit 5 «..Salzsäure auf pH 4,3 angesäuert wurde,
fiel die kristalline ö-Aminopenicillanriäure au'ü.
■ ' * 00Ö82S/1419
SAD ORIGINAL
Bach der .filtration wurden die Kristalle mit etwas kaltem Wasser
uiid. danach mit trockenem Aceton gewaschen .und. im Vakuum- getrocknet, um eine Aus/beute von 8,84 g 6-Aminopenicillansäure zu ergeben.
Me Reinheit des Produktes betrug .95$ und die Gesaintausbeute,
"berechnet auf das Benzylpenicillin, betrug 72$. . ' '.-
. Herstellung von ö-Aminope'iieillansäure
a) Zu einer Enzymlosung ( 375 g, Alct-ivilät 33,8 E/g), die'wie.
in Beispiel 2c) erhalten worden war, vrarde""Benzylpenicillin
als Kaliumsalz" (21 g) , gelöst in Wasser (325 ml)", zugesetzt.
Die Lösung wurde bei 37° G inkubiert, und der; pH-V/er, t wurde
durch periodische Zugabe von 2,5 η Natriumhydroxid auf 7?8 . \
gehalten. Nach 6 Stunden wurde die Lösung auf 10°' C gekühlt
und mit Me thylisobuty. !keton (200 ml) bei pH 2 extrahiert, via
das restliche Benzylpenicillin und die Phenylessigsäure tiuß
der Seitenkette au entfernen, die während -dor Bildung dor
6-Aminopenicillansäure abgespaltet worden war. Nach der Extraktion vrarde die Wasserlöaung von demMetlr/llsobutyl- .
keton abgetrennt.
Der pH-Wert der V/asserlösung wurde auf 7,5 ein^ei
das Volumen auf 1 10 jnX im Vakuum-vermindert. .Die konzentrierte.
Loüüng· wurde auf 5° G abgekühlt und filtriort. Wenn
die filtrierta Lösung mit 5 -n Öaii:.3:.ture auf r-H 4,;3 angesäuert wurde, fiel die kristalline 6-Amla:>cenLoillatu;äure
aus.
mm^m 008826/1419
BAD ORIGINAL
Hach der Filtration wurden.die Kristalle zweimal mit.-kaltes
V/asser (5 ml)"- und anschließend mit trockenem Aceton (zweimal,
mit 5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um eine Ausbeute von 8,51 g 6-Ajaiiiopeiiicillänsäure zu ergeben. . Die
Reinheit des Produktes "betrug 99/^j und die G-esamtausbeute,
"berechnet auf das Benzylpenicillin, betrug "69$-·"
In analoger Weise wurde 6-Aminopenicillansäure hergestellt,
wobei man gemäß den vorausgehenden Beispielen hergestellte
Enzympräparate verwendete. Ausbeute und Reinheil;- der erhaltenen
Saure sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.
826/TA 19
Hb) I | Benzylpenicillin- j kaliumsalz . ..'■ : g '... .'■:;' ., ; |
,Enzym | 1 6.3 | . ■■■■';:■■<:■■:■.·} | 6 | -Aminopenicillans.äure - | 1 | Reinheit | Ausbeute* .',, \:<f>..;■■■ -"■■ |
|
Hc) | 21 | hergestellt, wie» !"enge in Beisüiel,'.('. ; g, , ■'■■ . ■"■"■λ·"-·'! ■■■ . : |
J 4,2- | Aktivität - | Ausbeute, | 8 | 98.2 | 82 | ||
Beispiel | Hd) | 21 i . |
'; , ■■: ?,: , | J450 | ; 1.600/ .. - |
10. | 3 | 96.0, | 78 ■ |
|
Ue) | 500 | ■, .'.ν .", 4a) |
f 5.4
1 t |
2.920 . | 9. | ,55; ■: | ■ 98.5: | ■ ,■ ■ ■■■ ■ | ||
Hf) | 21 | 4b) | ■|Η5· | 300 | 261. | 9 | 97.0. | ■■.: ■ 60,- | ||
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au±: reines Produkt, korrigiert
OJ €3.
Beispiel 15
Herstellung von p~Nitrobenzylester der 6—Aniinopeni-'
cillansäure . -
Eine wie in Beispiel 7B) erhaltene Ensyrnlösung "(18,6 g, Aktivität 1.61Q E/g) v/urde mit Wasser (700 ml) und Methanol (i20
ml) verdünnt und durch Zugabe von 0,1 m-Natronlauge auf pH 7,8
eingestellt. Eine Lösung von p-Fitrobenzyl-benzylpenicillinat
(3,1 g, 6,6 Mol) in Methanol (60 ml) wurde zugesetzt. Das. Gemisch wurde bei '37 G gerülirt und durch Zugabe von 0,1 m-]tfatronlauge
auf pH 7S8 gehalten. Nach 2,5 Stunden wurde das-Gemisch
gekühlt und mit Äthylacetat (500 ml) extrahiert. Die saure
Schicht wurde abgetrennt und mit einer weiteren Menge Xth-yl-a.eetat
(250 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt
und mit wasserfreiem Natriumsulfat eine. Stunde getrocknet.
Kach der Filtration wurde die organische Lösung in zwei gleiche
Teile geteilt. Ein Teil vmrdeim Vakuum bei Raumtemperatur konzentriert und ergab den freien p-Bitrobensylester von 6-Aminopenicillansäure
als öligen Rückstand (1,1 g). Das Produkt ergab
im IR-Spektrum Banden bei "3..2-50, 1.756 und 1.720 era"1, die
die Any/Osenheit einer KHg-Gruppe, eines ß-Lactamringes und eine?.:
Estergruppe anzeigten. . -.:,.'.
In Aceton (20 ml) gelöste Bensolsulphonsäure (0,58 g) wurde su
dem anderen Teil der Ithylacetatlösung zugesetzt, die dann im Vakuum auf ein Volumen von- etwa 30 ml konzentriert wurde. Bei
Zugabe von Äther (10 ml) und Stehen über Kacht in Eisschrank
fiel dar? BerjzQlsuiphonsitar.etsalz von p-IfitrObensyl-ö
009026/1419
, BAD
cillinat (0,8 g) als weiße Kristalle aus, S. 14-8 ~ 151° C.
Dieses Produkt war mit dem in der" britischen Patentschrift
33 734-/67., Beispiel 4, beschriebenen Produkt identisch.
Bei spleiß J τ6 .".-"■
Herstellung von 6-(d-o(-A2idoTjIienylaceta]iiido)-penicillansäure
Zu einer Enzynilösimg (283 g, Aktivität 42 E/g) wurde· eine Lösung
von Benzylpenicillin (20 g) als Kalium-Salz in Wasser (317 ml)
zugesetzt»
Das Gemisch wurde 37° 0 inkubiert, und der pH~Y.rert wurde durch
periodische Zugabe von 2,5 η natronlauge auf 7,S gehalten. Nach
δ Stunden enthielt das Reakticnsgemiscli 10,7 g 6-Äminopeiiicillaiisälire
(92'^) und wurde filtriert. . ·
Die Lösung wurde auf 5° C abgekühlt und mit 10 η Schwefelsäure
auf pH 3,0 angesäuert. Unter Rühren wurde Meth,ylinobutylfceton
(300 ml), das d-^-ABidüpiienvlacetylchlorid" (62 aiM) .enthielt,"
zugesetzt. Das Rühren wurde 30 Minuten.fortgesetzt, und der
rll-V/ert wurde durch periodische Zugabe von 2,5 η Natronlauge -"
auf 3,0 gehalten. Das.Reaktionsgeinisch wurde durch Gelite 505
(TO g) filtriert, und das Methylisoh-u-tylketon v.airde von der Wasserphaae
abgetrennt. ■. .
Die !.iOthyliuob-utylketon-losung wurde mit wasserfreiem Jia1.i-iur.\-
sulfat (25 e) getrocknet. ' ..' . _: " . ' . ■ -
009826/ UI9 bad
Nach der filtration .wurde die 6-(d-ui~Azidophenylacetamido)- ■";.
penicillarisäure als. Natriumsalz: durch Zugabe "von 4-1 ml, einer
2 η-Lösung des Natraumsalsies.' von 2-Äthylcapronsäure .in-..Methylisobuty!keton
ausgefällt. V .--'·■"■"
Das Natriums als Ton · 6- (d-.&C-Asidophenylace tamido) -penieillansäure
wurde filtriert.. Die Kristalle wurden mit 50 ml Methy1-isobutylketon
(50 ml) gewaschen und im Vakuum bei; 50 "Ö'.-getrocknet, Um eine Austeilte --von- 16,5 g zu ergeben. Die Reinheit des
Produktes betrug .9-6$ "und die Gesamtausbeute, berechnet auf das.
Benzylpenicillin, ^
In analoger Weise wurde 6-(d-c7\-Azidophenylacetamido)-penicillansäure-Uatriumsalz
unter Verwendirrig anderer Ensympräpäräte "-ge-*"
wonnen, die nach den-obigen Beispielen hergestellt vrarden waren,
Ausbeute und Reinheit des Penicillins sind in der nachfolgendenr
Tabelle II zusammengestellt. :
(D | •H | * | fcj} | |
M | O- | 0.) | ||
ρ; | •H | •p | ||
■ | rf | ω | ||
- I -P |
CQ | (U | CQ | |
O) | rf | P1 | 0 | |
O | CO | I | ||
cd | Λ H | Q | W) | |
H | O | ^d | ||
id | •H | -P | ||
Pj | •rl. | S | •H | :—ί |
ω | ts) | ca | :03 | © |
<f | -s | H | ||
I | ■r-i | P, | ||
% | 0) | CO | ||
I | "Xj | H | ||
O | O | |||
ν , | β | -Q | ||
I | rf | Q) | ||
VD | rf | |||
Φ | H | |||
-Q | ||||
Ό | ||||
+J. | ||||
- - - | ||||
G) | ||||
■j | ||||
H. | ||||
—|. | ||||
G) | ||||
^ | ||||
0) | ||||
■U) | ||||
-1- | ||||
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BAD ORIGINAL
Beispiel 17
Enzym a ti solle Synthese 'von Benzylpenicillin
6-Aminopenicillansäure (175 ßig). und Phenylessigsäure (111 mg). wurden
in Kaliuiaphosphatpuff er (10 ml) "bei pH 7,0 gelöst. Die
in Beispiel 7c) hergestellte-Acylase ^3,6 mg, Aktivität '
128.OCO E/g) wurde in V/asser (S ml) gelöst und au der oben bereiteten
Lösung augesetzt. .
Der pH-Wert wurde mit 1 m Η-^ΡΟ, auf 5,0 eingestellt» und die
Lösung wurde bei 37° Q inkubiert-.." Der pH-Wert wurde auf 5»0
gehalten, und nach 4 Stunden wurde die Lösung abgekühlt und.
papierchromatographisch analysiert. 30$ der 6-Arainopenicillaii-säure
waren in .Benzylpenicillin überführt.
Beispiel 18 '
An tigen-b-ildungover suche
Methode: Pa^aiTe Hautanaphylaxi-e bei Mehrschvyeinchen, im wesent
lichon gemäß de Weck et al., Int. Arch. Allergy, >3 '(196B),-Seiten-535.
- 567. ■ . . - '
Kaninchcn-ö-aininopenicillaniväureantiserurri wurde durch wiederhol to subcutane Injoiction ί-οπ roher 6-Aminapon:Lcilln.!ioG.ure und
durch iawei Injektionen einer. aurückgehaltenen Probe aus eixier
dialj/üierten 6-Aminonenic:LllanBäarö-Gharge; produziert. Bei Verbuchen
über die pa&srve Z/Uüaim.ienballuiig der BlutkorportriVfHi.
zeigte dic.-Jöü-Anbi.BGrün) eineii -'ili"-ter-von 1/4096. Ein ml cü.oüog '
009826/1419 badoriginal
ö-AiEinopenicillansäure'antiseruiiiß wnrue intravenös eines weissea.
Meerschweinchen injiziert. 24 Stunden später wurden .0. 1 ml
einer 5foigen Lösung in Salzlösung von Svana-Blau intravenös ver™
abreicht,."und eine Stunde danach wurden C,_1 nl mit 4 mg 6-Aminopenieillansäure,
hergestellt nach den Beispielen Hd), Hg·) 'und Hi), intradermal verabreicht. An. einer 4. .Stelle des Rückens
/des Tieres wurde eine Probe von 6-Aminopenicillansäure verab- .
reicht, die in herkömmlicher Weise unter Verwendung ganzer Zellen
von E.-coli hergestellt worden war. Die Probon der 6-Araino-penicillansäure
wurden unmittelbar nach dem Auflösen injiziert. Als Kontrolle wurden 0,1 ml normale Salzlösung inbradermal injiziert.
Bei einem zweiten" Meerschweinchen wurde·das gleiche Verfahren
wiederholt, jedoch mit der Ausnahme,, daß anstelle des ö-Aminopenicillansäureantiserums ein ml normale Salzlösung intravenös
verabreicht wurde. '
Zwei S [runden nach den intradermalen lnjok"üonen wurde der Umfang
des Blauwerdenij an den Injeküionsstellen bestimmt- und als das
Produkt säw-eier sankrechter JJurchmesser aui'jgedriickt--
Ergebnisse . " .
Bei beiden Tieren., dem nicht-;3enBi'bi".!.isie.ri;i-n und dein par,«.Lvsensibilioierteji,
verurGachten alle b-Aminopanicillansäuro-proben
Ausbreitung des. Porbatoff es, : die aua^eprli^ter ala- an
der Stelle der üalalösungsinjektion war. Wie jedoch ?'"b·.?"!. 1«
III soigt, verursachte die herköimnliche ό-^^ΐηΰ].^ιιίο111;·π..ίαηΛ-1^-
probe eine üfciirkero Reaktion bei dorn scciölbLtinieiM.en ^ier. 'Diο
-gleiche. Reaktion, doch in viel ,■■;eruiere;;] A.imiLtß, orhitJ1. b n;:x;t
'^ν- 00982Θ/ΤΑ19
.39 -
bei b-iiminopeniciliaiisätire nach eier Erfindung.
. Tabelle IXl . ' " .-
Das Produkt zweier .aufeinander senkrechter Durchmesser (mm )
blauex· Flecken, die durch Injektion von 4 mg der angegebenen
Verbindungen intraderrßb.1 verursacht wurden. .
ö-Aminopeiiicillan- j Sensibilisiertes j >iicht~serisibili~
säure gemäß Bei- Tier siertes Tier
Et.
Hergsiitolit imxcr
duiig E. coil-14d)
»Salzlösung
12
Unterschied
Die Ergebnisse z-sif-en, daß eine Probe von S-Amiriop.enicillanoäure,
die nach herkömmlichen Methoden hergestellt wurde, „sich
von den anderen Proben dor 6-isi:;inopenicillansäure hinsichtlich
der Fähigkeit, die passive ]ia.uta"aaiüiylaxie hervorsxirufen, -unterscheidet.
Dies ist ein Ausdruck verminderter Antigen'bildung
bei 6-AninopenieilleaisMure gemäß der vorliegenden Erfindung
gegenüber der G-A^inopenicillansäure, die nach herköraaliehsn
Methoden unter Yervv.enüUi'ig ganzer Zellen von E. coli bereitet
wurde. " . " . - "
. BAD ORIGINAL
009826/1419
Claims (1)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung: von hypoallergenischen Penicillinen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein natürliches Penicillin enzymatisch mit Hilfe einer wäßrigen Lösung einer ssellfreien Penieiliin&cylgL©e9 die durch Fermentieren eines Stammes -von Escheriehla coil unter Bildung eines Enzyms, Abtrennendes intraeellulär®n Enzyms von der Kulturflüssigkeit des Mikroorganismus unter kontrollierten Temperaturen im Bereich von O- 50° C durch schnelles Ausstoßen des Zellffiäteriale durch einen Schlitz oder eine Öffnung unter einem aufgebrachten Druck von wenigetens jh Atmosphären, der jedoch den Druck nicht überschreitet, wo übermäßiges Zerplatzen der Zellen erfolgt, Rühren des ausgestoßenen Zellmaterials unter Lösen des Enzyms während O,10 - 5,O Stunden in Wasser von 10-50° C, anschließendes Extrahieren des Enzyms aus dem inaktiven Zellmaterial in wäßriger Lösung, Isolierung aus der wäßrigen Lösung, gegebenenfalls nach einer Reinigung, und erneutes Auflösen in Vaseer erhalten wurde« zu 6-Aminopenicillansäure abbaut und diese enzymatisch oder chemisch, acyliert.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, man eine wäßrige Lösung #in«r sellfreien verwendet, die durch Ausstoßen d«« ZellmateriÄl» bei ·ΐ.ηβιο Druck von 3h - 136AtaoSphären «rhalten wurde.0 98 2 6/1 41 93· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein® wäßrige Löstang einer zellfreien Penleillinacylase verwendet, die unter Auestoßen des Zellmaterials innerhalb von O7O5 - 1»Q Sekunden erhalten wurde.k. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer seilfreien Penicillinacylase verwendet, die durch Ausstoßen des Zellmaterials durch einen ringsum laufenden Schlitz oder eine öffnung mit einer Breite von 0,1 - 1,5 mm erhalten wurde.5« Verfahren nach Anspruch 1 - k, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penleillinacylase verwendet, bei deren Herstellung die Kulturflüssigkeit und das Zellmaterial voneinander getrennt wurden, ln-dem man den Mikroorganismus durch ausreichende Sättigung des Kulturmediums mit einem organischen Lösungsmittel abtötete, welches niedrig® Löslichkeit in Wasser besitzt und aus Butylaeetat, Icefautyl&oeiai oder Amylacetat besteht«6. Verfahren imoh Anasprueh 1 - 5» dadureh gekeiansoiohnet, daß man eine wäßrige Lösung einer if®i!fr®£©a Fenicillinaoylaee verwendet, - bei deren Her©t®ll«an^ d&m Ez&xjm d^reh Rühre» des ausgoistoßesäen 2?allraat@ri®.l® ±n Wasser, v®rsugeweii8· 1 - 5.^9 M®tfeyiisobiatylk®ton, B^tylaeei&t; Isobutylstoetat, Aeylftoetat, Benzol, Toita©! ©der Chi©rof©na ±n LSgusig g*-BAD OBIGINAL"'■■■■. 193330Ί7·' Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penidllinacylase verwendet, bei deren Herstellung man beim Extrahieren des Enzyms Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid, Ammoniak, Triäthylamin oder N-Äthylpiperidin zusetzte.8. Verfahren nach Anspruch 1 -7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Peniclllinacylase verwendet, die in der Weise gereinigt wurde, daß man die wäßrige Lösung von Enzym und inaktivem Zellmaterial auf pH 3,0 - 6,0 ansäuerte und das ausgefällte inaktive Zellmaterial durch Filtration entfernte und anschließend denein*· pH-Wert wieder auf seine ursprüngliche Höhe stellte.9· Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penicillinacylase verwendet, bei deren Herstellung das extrahierte Enzym aus der zellfreien wäßrigen Lösung bei pH k - 6 mit Tannin in Gegenwart eines chelatbildenden, mit Eisenionen Komplexe bildenden Mittels ausgefällt und der gebildete Enzym-Tannin-Komplex durch Filtration oder Zentrifugieren isoliert wurde.10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penioillinateylase verwendet) bei deren Herstellung die in dem Tannin-Nieder-", schlag enthaltene Fenlcillixmeylaee durch Auflösen des isoliert®» Komplexes in Wasser bei pH 7 - 9 && die wäßrigetr®±gmsmtmt_ wurde« - - - - V11; Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zollfreien Penicillinacylase verwendet, bei deren Herstellung die in dem Tarmin-Niederschiag enthaltene Penicillinacylase durch"Auflösen des isolierten Komplexes in ©inem'Gemisch, von. Wasser und n-Butanol bei pH h - 7 in die wäßrig© Lösung freigesetzt wurde·12. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekensizeicSmet, daß man eine wäßrige Lösung einer sellfreien Penicillinacylase verwendet, bei deren Herstellung die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Penieilllnaeylase durch Behandlung des in Wasser suspendierten isolierten Komplexes mit DEAS-Cellulose, die das Tannin bindet, freigesetzt wurde·13· Verfahren nach Anspruch 1 — 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penicillinacylase verwendet, bei deren Herstellung das extrahierte Enzym konzentriert und gereinigt wurde, indem man eine auf pH 3»5 bis 6 eingestellt® Lösung des Enzyme durch eine Säule eines kationisch«». Ionenaustauschers mit einer offenen Struktur schickte oder den Ionenaustauscher zu der gerührten Enzymlösung zusetzt© und danach die Acylase aus dem Ionenaustauscher dtsfch Eluierta bei pH 6,0 - 8,0 mit schwachen Pufferlösungen,, die aus O12 m-Amiaonium&cetat oder Triehydr©xy!ii©thylaaisaoniu!Ba©etat be'stehen, freisetzt«.Ik, Yerfahrön naeh Anepruch 1 - 13, dadurch gekennzeichnet, daß008 82 671410 ^ ^ \. - SAD ORIGINAL.- kh -man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penicillinacylase verwendet, bei deren Herstellung man anorganische Ionen und niedermolekulare Verunreinigungen aus der Enzymlösung durch Dialysieren gegen Wasser entfernte.,15· Verfahren nach Anspruch 1 - 13» dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penicillinacylase verwendet, bei deren Herstellung anorganische Ionen und niedermolekulare Verunreinigungen aus der Enzym- " lösung durch Eindampfen der Lösung bei einer Temperatur unterhalb 50 C bis zu einer Konzentration von 25 - 100 mg Trockengewicht je ml und anschließende Gelfiltration entfernt wurden.16. Verfahren nach Anspruch 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penicillinacylase verwendet, bei deren Herstellung das gereinigte Enzym durch Umsetzung mit einem aktivierten Polymermaterial, vorzugsweise mit einem mit Bromzyan behandelten Polysaccharid, chemisch modifiziert wurde.17» Verfahren nach Anspruch 1 - 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung einer zellfreien Penicillinacylase verwendet, bei deren Herstellung das gereinigte Enzym durch Gefriertrocknung der Enzymlösung bei einer Temperatur ewisehen -10 und +50° C öder durch Flotationstrocknung der Enzymlösung in einem Luftstrom bei 10 - 55° -.--■ C isoliert wurde.009826/U19 rΐ8. Verfahren nach Anspruch 1 - 17» dadurch gekennzeichnet, daß man als natürliches Penicillin Benzylpenicillin verwendet.19· Verfahren nach Anspruch 1. - 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die 6-Aminopenicillansäure mit einem Seitenketten-Vorläufer in der wäßrigen Lösung der zellfreien Penicillinacylase umsetzt.20. Verfahren nach Anspruch 1 - 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als hypoaHergenisches Penicillin O^-Phenoxyäthylpenicillin, CXs-Phenoxypropylpenicillin, 2,6-Dimethoxyphenylpenicillin, 3-(o-ChlorphenylJ-^-methyl-^-isoxazolylpenicillin,OC-Carbony!benzylpenicillin, OC-Azidobenzylpenicillin, 0{-Aminobenzylpenicillin oder Benzylpenicillin herstellt.00 982 6/ 14 19
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