JP4204973B2 - 可溶性ケラチン誘導体の製造 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

発明の技術分野
本発明は、経済的でかつ環境保護の見地から許容可能な方法によって羊毛、毛、角、ひずめ、羽根及びうろこなどの動物源からケラチンの誘導体を製造する方法及びその方法で製造されたケラチン誘導体製品に関する。そのケラチン誘導体のいくつかは可溶性なので一群の生体高分子材料を製造するのに使用することができる。

発明の背景
ケラチン類は生物構造、特に高等脊椎動物の上皮組織に広く存在する１クラスの構造タンパク質である。ケラチン類は、２種の主要クラスに区分することができ、すなわち軟質ケラチン（皮膚と少数の他の組織に存在する）と硬質ケラチン（爪、かぎ爪、毛、角、羽根及びうろこの物質を形成している）がある。

硬質ケラチンは、その靱性と不溶性によって、多くの生物系で基本的構造の役割を果たすことができかつこれらの特性は現在合成重合体から得られる多くの工業用及び消費者用材料の望ましい特性でもある。ケラチンは、優れた物理的特性をもっていることに加えて、タンパク質として、高度の化学的機能を有する材料であり、したがって、合成材料が達成できない多くの特性を示す。したがってケラチンは、高い価値のあるニッチ市場の用途を有する製品を開発するのに好適である。またケラチンは、適切な資源から製造される環境保護の見地から許容できる重合体でもあるので合成材料を超える環境面での利点がある。環境を破壊せずに継続できる方法で生産される再生可能な資源から材料を開発するという全世界にわたる傾向によって、一領域の材料がケラチンから、最も一般的にケラチンフィルムの形態で製造されている。

生体高分子材料をケラチンから製造する新しい工業の根底には経済的に実用可能でかつ環境上の観点から継続可能でそして安定でかつ多用途の製品を製造する、ケラチンをその資源から抽出する方法をもっていることが不可欠である。個々のタンパク質の完全さを維持する、いままで利用されているケラチンの抽出方法は、タンパク質の分析と特性決定のために設計されているので、経済性と環境上の観点から、工業規模では実用的でない。いままで利用されている、ケラチンの経済的な溶解方法にはそのケラチンをかなり劣化させる作用があるので、溶解されたタンパク質は、靱性材料に再構成しうる性能など生体高分子としてのケラチンの望ましい性能をもたらす物理化学的特性をほとんど保持していない。

本発明の目的は、既知の方法による不利益を克服すること又は少なくとも公衆に有用な選択肢を提供することである。

少なくとも一つの実施態様で、本発明は、溶解工程中ケラチンタンパク質の構造の完全さと化学的機能を維持しかつ生体高分子材料を開発するための安定で多用途のケラチン誘導体の製品をもたらす、経済的でかつ環境保護の観点から許容できるケラチンタンパク質溶解法を提供しようとするものである。

発明の要約
第一の側面によって、本発明は、一群の安定で可溶性の高分子量ケラチン誘導体を製造するための溶解方法であって、その分子量が、ケラチン資源内で元来示されているタンパク質の分子量と類似しているか又はそれより大きくかつ成分タンパク質の構造の完全さに損傷がほとんどないか又は全くない溶解方法を提供する。

好ましい一側面で、本発明は、ケラチン資源を酸化的亜硫酸分解反応によってＳ−スルホン化する第一段階の消化ステップ及びこれに続く水による制御された洗浄法を使用して高度にＳ−スルホン化されたケラチン誘導体を得る第二段階の抽出ステップを含む高分子量のケラチン誘導体の製造方法を提供する。

高度にＳ−スルホン化されたケラチンの固体状態から溶液への変換は、抽出操作由来の残留化学薬剤を洗い出して抽出溶液のイオン強度を変えるため、そのスルホン化ケラチンを水で制御しながら徐々に洗浄することによって、カオトロピック試薬を使うことなく行われる。

上記第一段階は、スルホン化するのに用いる安価な薬剤（例えば亜硫酸ナトリウム）及び酸化するのに使う安価な薬剤（例えば水酸化銅アンモニウム）の産業上許容できる濃度を使用して、タンパク質中に存在しているシスチン基をＳ−スルホシステインに変換する酸化的亜硫酸分解反応を含んでいる。

別の側面によって、本発明は、上記方法で製造されたＳ−スルホン化ケラチンの溶液からゼラチン状ケラチン製品を分離する方法であって、前記Ｓ−スルホン化ケラチン誘導体の溶液をゆるやかな重力送り濾過システム（ｇｅｎｔｌｅ，ｇｒａｖｉｔｙ ｆｅｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を使って処理し次に分離する。その分離法は遠心分離法が好ましい。

本発明の別の一側面によって、ゼラチン状ケラチンを取り出した後残っている液体流を、精練済羊毛を通過させて残留化学剤を溶液から除いて、その羊毛を、次のタンパク質抽出工程用に調整する。

上記シスチン基の変換に続く工程の第二段階は、上記高度にＳ−スルホン化されたケラチン誘導体を、水で大きく希釈して固体状態又はゼラチン状態から溶液にする工程である。溶解の速度と程度は、熱、界面活性剤、ゆるやかな撹拌、及びはげしいチョッピングもしくは均質化を利用することによって制御することができる。溶解速度を制御することによって、反応溶液を分離することができる。例えば銅酸化剤を用いると、銅が豊富な反応溶液が生成するがその溶液にはタンパク質がほとんど溶解していないかもしくは全く溶解していないか、又はタンパク質は豊富だが銅をほとんど含有していないかもしくは全く含有していない。

本発明の別の側面によって、工程の第二段階から生成する液体流は、Ｓ−スルホン化ケラチン誘導体のみならず硫酸銅や亜硫酸銅などの残留化学薬剤を含有しているが、薬剤類を溶液からリサイクルすることができかつ精製された１又は２種以上のＳ−スルホン化ケラチン中間フィラメントタンパク質（Ｓ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｆｉｌａｍｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））（ＳＩＦＰ）と１又は２種以上のＳ−スルホン化ケラチン高硫黄タンパク質（Ｓ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎ Ｈｉｇｈ Ｓｕｌｆｕｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））（ＳＨＳＰ）を別個に分離できる１又は２種以上の方法を使用して処理される。この処理は、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤又は例えばイミノ二酢酸官能基を含有するキレートイオン交換樹脂を使用し次に等電沈澱法を利用してタンパク質のタイプを分離することによって達成される。薬剤の除去又はタンパク質の分離の効率を改善するため、工程のいくつもの段階で限外濾過法を利用することができる。タンパク質生成物中の金属の不純物は、１種又は２種以上のタンパク質誘導体を、沈澱させた後、キサン、水又はキレート化剤で洗浄することによってさらに減らすことができる。タンパク質生成物は、一旦分離したならば、流動床法、スプレー法又は凍結乾燥法などの一群の方法で乾燥することができる。

本発明の別の側面で、前記二段階の亜硫酸分解反応によって溶解されなかった残留ケラチンを、他の薬剤、例えば過酸化水素、硫化ナトリウム又はタンパク質分解酵素類を使用することによりさらに処理してケラチンペプチド類が製造される。

本発明の別の側面で、前記天然のタンパク質源に、１又は２種以上のタンパク質の少なくともいくらかを水溶性にするのに充分な処理を行い次いで１又は２種以上の水溶性タンパク質を分離することを含む、天然資源からタンパク質を大規模に回収する方法が提供される。

本発明の別の側面で、天然資源からタンパク質を大規模に回収する装置、大量の天然タンパク資源を入れて、前記供給源に含まれている１又は２種以上のタンパク質の少なくともいくらかを水溶性にするのに充分な処理を行う処理容器、及び続いて上記水溶性の１又は２種以上のタンパク質を分離する分離装置を提供する。

本発明の別の側面は、タンパク質の混合物を酸化的亜硫酸分解反応に付して可溶性Ｓ−スルホン化タンパク質の画分を製造することを含む、タンパク質の混合物から複数のジスルフィド結合を有するタンパク質を選択して可溶化する方法である。この酸化的亜硫酸分解反応は、好ましくはカオトロピック薬剤なしで、タンパク質の構造の完全さをほとんど損傷しないか又は全く損傷せずに実施される。

本発明の別の側面は、不純のタンパク質源に、１又は２種以上のタンパク質の少なくともいくらかを水溶性にするのに充分な処理を行い、続いてその水溶性の１又は２種以上のタンパク質をカオトロピック薬剤なしで分離することを含む、タンパク質の構造の完全さをほとんど損傷せずに又は全く損傷せずに不純タンパク質源から精製タンパク質を得る方法である。

本発明の好ましい実施例の説明
製造工程を全体としてつくりあげる本発明の諸側面の組合せを添付図１に要約して線図で示してある。

この製造法は高度スルホン化ケラチン誘導体の製造法であり、動物の羊毛、毛、角、ひずめ、羽根又はうろこなどのいずれのケラチン源にも適用できる。この方法を異なるケラチン源に適用すると、異なる構造と特性を有する可溶性ケラチンを提供できるが、シスチンがＳ−スルホシステインに変換される溶解工程の基本ステップは、すべてのケラチン含有原料に対して等しくうまく適合している。

この製造法は２段階で行うと考えることができる。

第一段階は、シスチンをＳ−スルホンシステインに変換するステップを含んでいるが、酸化的亜硫酸分解反応の操作によって行われる。この方法は、シスチンを非対称形に開裂してシステインとＳ−スルホンシステインにする亜硫酸ナトリウム又はメタ重亜硫酸ナトリウムなどのスルホン化剤、及びスルホン化反応で生成したシステインをシスチンに変換する酸化剤を使用して達成することができる。シスチンをさらにスルホン化することによって、すべてのシスチンのＳ−スルホンシステインへの完全な変換が達成される。

利用可能な酸化剤としては、テトラチオン酸ナトリウム、ヨードソ安息香酸及び水酸化銅アンモニウムがある。本発明の好ましい実施態様では、使用されるスルホン化剤は濃度範囲が０．０２Ｍ〜０．２Ｍの亜硫酸ナトリウムであり、使用される酸化剤は濃度範囲が０．０２Ｍ〜０．０８Ｍの水酸化銅アンモニウムであり、これは硫酸銅とアンモニアを結合させて製造される。ケラチンを可溶化する操作の第一段階は、ケラチン源を、２４時間などの滞留時間、シスチンをＳ−スルホシステインに変換する一つの溶液もしくは一連の溶液（液体対羊毛の比率（容積：重量）が５：１〜５０：１の範囲内）でソーキングする操作である。

本発明の別の実施態様で、使用されるスルホン化剤は、酸性ｐＨに維持された濃度範囲が０．１Ｍ〜０．５Ｍのメタ重亜硫酸ナトリウムである。この実施態様では、羊毛を、メタ重亜硫酸ナトリウムを含有する溶液から取り出し、次いで濃度範囲が０．０２Ｍ〜０．０８Ｍの銅アンモニウム錯体を含有する溶液に添加する。

酸化的亜硫酸分解反応の操作を利用する従来の作業は、ケラチン源を膨潤させてケラチンを溶解しやすくするため、高濃度のカオトロピック剤（例えば尿素又は塩酸グアニジウム）を使用する必要があった。この操作は、工業規模では高価でかつ非実用的である。酸化剤として銅を使用する酸化的亜硫酸分解反応を利用する従来の作業は、シスチンからランチオニンへの高い比率の変換を起こすタンパク質の完全さに対して有害な温度とｐＨの条件下で行われてきた。

工程の第二段階は、カオトロピック薬剤を使用せずかつタンパク質の構造の完全さを維持する温度とｐＨの条件下で、抽出操作由来の残留化学薬剤を洗い出して抽出溶液のイオン強度を変えるためスルホン化されたケラチンを制御して水で徐々に洗浄することによって、高度にスルホン化されたケラチンを固体状態から溶液に変換することを含んでいる。これらの作用の組合せによって、前記高度にスルホン化されたケラチンが固体状態から水溶液に変換する。好ましい操作では、反応容積は、バッチ法又は連続ベースであっても１２〜４８ｈｒ毎に取りかえられる。

溶解速度と溶解度は、界面活性剤の使用、熱の作用、攪拌及びスルホン化ケラチンの均質化によって制御することができる。本発明の特徴はこれらの要因を使用して抽出速度を制御することである。したがって、高度にＳ−スルホン化されたケラチンは固体状態で保持されて、スルホン化の工程で使用された大量の化学薬剤を含有する抽出溶液から分離することができる。好ましい操作では、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの非イオン界面活性剤を０．１重量％〜５重量％の濃度範囲で使用し、温度は１５℃〜５０℃の範囲内に維持される。

銅ベースの酸化剤を使用する場合の本発明の利点は、その銅の豊富な抽出溶液を、次の抽出工程に再使用して、その方法のコストと環境に対する影響を有意に減らすことである。活性銅の種を空気酸化である程度、再生させるため、銅が豊富な溶液を再使用することができる。銅豊富溶液を有効に再使用できる一方法は、溶液をして羊毛を通過させる方法である。羊毛は溶液の銅と結合し、そしてこの羊毛をその後の抽出工程に使用すると、その後の抽出工程における銅に対する必要性が低下する。このように、「羊毛フィルター」は、銅豊富抽出溶液を処理する際の必須のステップとして使用して、流出液を処理するその後の必要性及び以後の工程に加えるべき銅に対する需要を減らすことができる。典型的な操作で、第一段階からの液体流は約１８００〜１５００（ｐａｒｔｓ ｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎ）ｐｐｍの銅を含有していたが、羊毛フィルターを通過させた後、銅含有量は約４００〜３００ｐｐｍまで減少した。

工程の第一段階と工程に使用する薬剤の回収を添付図面１に示す。

Ｓ−スルホン化及び均質化を行った後、ケラチン原料は、ゼラチン状で膨潤した繊維性塊になる。

本発明のさらなる利点は、抽出工程で使用した化学薬剤又は溶解しているケラチンタンパク質を含有している溶液から、高度にスルホン化されたケラチン誘導体を固体状態で分離することである。この分離は、微細メッシュのスクリーンによるゆるやかな重力ベースの濾過を利用し、次いで濾液を微粒子から遠心分離することによって、有効に達成される。

高度にＳ−スルホン化されたケラチン誘導体の溶液は、金属イオンについて、具体的に述べると、抽出工程の一部として使用した銅イオンについて、イオン交換媒体、特に２価の金属イオンに対して、高い親和性を持っていることが知られているイミノ二酢酸官能性を有するイオン交換媒体を使用することによって精製することができる。このイオン交換媒体は、タンパク質溶液が通過する充填樹脂カラムの形態であってもよく又は代わりに、電圧を印加しかつ透析膜が入っているシステムを使用して銅がイオン交換媒体から回収される電気化学的電池の一部分を形成していてもよい。

高度にＳ−スルホン化されたケラチン誘導体が一旦溶液になると、特定のタンパク質、例えばＳ−スルホン化ケラチン中間フィラメントタンパク質は、硫酸、塩酸、クエン酸又は酢酸などの酸を使用して（硫酸を使用することが好ましい）ｐＨ４以下で等電沈澱法を利用することによって容易に単離することができる。本発明の利点は、等電沈澱を行う前に、上記のようなイオン交換媒体を使用することによって又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤をタンパク質溶液に添加することによって、銅や他の金属不純物がタンパク質と結合するのを最小限にすることである。好ましい実施例では、ＥＤＴＡ（０．２Ｍ）が２５ｍｌ／ｌの比率又は溶液を分析することによって示された溶液中に存在するすべての銅イオンを封鎖するのに適切な比率で、第二段階からの液体流に添加される。タンパク質を沈澱させて一旦単離したならば、そのタンパク質を希酸溶液又はＥＤＴＡなどのキレート化剤の溶液又は水で洗浄することによって、金属不純物をさらに減らすことができる。

沈澱と洗浄を行った後、分離されたタンパク質は、ほぼ室温の空気流を利用する乾燥法を使用し、例えば流動床乾燥器を使用して、安定した乾燥状態で単離することができる。代わりに、前記生成物は、凍結乾燥器を使用して乾燥することができる。その乾燥タンパク質の生成物はＳ−スルホン酸の形態のシスチン基を含有しているので、このたんぱく質は、水酸化ナトリウム又は水酸化アンモニウムなどの塩基の存在下でのみ可溶性である。これらの工程は、添付図面１に乾燥として示されている。

等電沈澱を行った後、溶液に残っている高度に可溶性のケラチン誘導体は、羊毛の場合、主として、羊毛繊維内からの高硫黄マトリックスタンパク質であるが、残留している銅又はＥＤＴＡなどの非タンパク質性種を除くために限外濾過の工程を行い、続いてスプレー乾燥を行うことによって溶液から安定な形態で単離することができる。

本発明の特徴は、等電沈澱と限外濾過を組合せて利用し次いでスプレー乾燥して、高度にＳ−スルホン化されたケラチン類を、溶液中のそれらケラチン類の特性にしたがって分離することである。羊毛ケラチンの場合、この方法は、低硫黄中間フィラメントタンパク質クラスを、高硫黄マトリックスタンパク質クラスから効率的に分離して、異なる化学特性を有する２種生成物の流れを提供する。
本発明の特徴は、Ｓ−スルホン酸形のケラチンを塩基の存在下で溶解し、次にその得られた溶液をスプレー乾燥することによって、安定な水溶性型の高度にＳ−スルホン化されたケラチン誘導体を製造することである。

本発明の特徴は、連続法、半連続法又はバッチ法で、ケラチンを可溶化し溶液からＳ−スルホン化ケラチンを単離できるように工学的要素を組合せたことである。工学的要素と単位操作の組合せは図１に詳細に記載してある。

本発明の利点は、工程の反応混合物及び流出液流から銅を回収して再使用することである。電気化学的に析出させる前に銅イオンをＥＤＴＡから分離するために選択性透析膜を使うことを含めて電気化学的方法を使用して、銅を回収することができる。代わりに、銅特異的（ｃｏｐｐｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）イオン交換樹脂の形態の固定化結合剤を使用して、流出液流から銅を除くことができる。これらの方法を利用して除いた銅は再使用できるのでこの方法の環境に対する影響を最小限にすることができる。

イオン交換媒体及び／又はキレート化剤を使用することは、添付図面１には精製と記載してある。

本発明の別の利点は、抽出操作を行った後に固体状態で残っている残留ケラチンをさらに処理することである。この官能基化されたケラチンは高度にＳ−スルホン化されているから、ケラチンを化学的攻撃や酵素の攻撃に対して耐性にする天然ケラチン中に存在するジスルフィド結合が開裂されているので、そのケラチンは他の抽出法を用いて容易に消化できる。例えば、ケラチンペプチドが豊富な溶液は、アルカリ性条件下、残留ケラチン１ｋｇ当り５０％過酸化水素１０〜１００ｍｌの濃度範囲の過酸化水素などの強力酸化剤のアルカリ性溶液の上記残留ケラチンに対する作用によって製造できる。上記残留ケラチンは約５％の固形分を含有している。代わりに、濃度範囲が０．５％〜１５％の硫化ナトリウムなどの強力還元剤の溶液を残留ケラチンに添加してケラチンペプチドが豊富な溶液を製造することができる。代わりに、ズブチリシン、パパイン又はトリプシンのグループの酵素などのタンパク質分解酵素を、ケラチン残留物１ｇ当り０．１ｍｇ〜２０ｍｇの酵素の範囲内のレベルにて、その特異的酵素に対して適切な温度とｐＨの条件で使用し、残留ケラチンを容易に消化してケラチンペプチドが豊富な溶液を調製することができる。これらの方法はすべて、イオン交換媒体、ｐＨ調節及び乾燥（図１には精製及び乾燥と記載されている）を使用することによってケラチンペプチドの固体を生成する上記第二段階で得られる液体流に対して行う方法と類似の方法で処理できるケラチンペプチドが豊富な溶液をもたらす。このような残留ケラチンの消化によって工程全体で生成するケラチン廃棄物が最小限になり、かつケラチン源中に存在するケラチンタンパク質の最大の効用が保証される。

上記方法で得られた２種の完全タンパク質（ｉｎｔａｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）生成物はＳ−スルホン化ケラチン中間フィラメントタンパク質とＳ−スルホン化高硫黄タンパク質である。上記方法で典型的に製造されるＳ−スルホン化ケラチン中間フィラメントタンパク質は、還元／アルキル化操作を使用するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析法を利用して分析した。その結果、分子量分布は主に３０〜６０ＫＤの範囲内（中間フィラメントタンパク質）で小成分のマス（ｍａｓｓ）が１０ＫＤのタンパク質（高グリシン高トリプシンのタンパク質）を含んでいることが分かった。この生成物のアミノ酸組成は表１に示してあり、これは羊毛ケラチン中間フィラメントタンパク質に典型的なアミノ酸組成である。上記Ｓ−スルホン化ケラチン高硫黄タンパク質は、還元／アルキル化操作を行った後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を利用して分析した。その結果、分子量分布は主として１５〜２０ＫＤの範囲内にあることが分かった。この生成物のアミノ酸組成は表１に示してあり、これは羊毛ケラチン高硫黄タンパク質に典型的なものである。

表１ Ｓ−スルホン化ケラチン中間フィラメントタンパク質（ＳＩＦＰ）Ｓ−スルホン化ケラチン高硫黄タンパク質（ＳＨＳＰ）、中間フィラメントタンパク質（ＩＦＰ）及び高硫黄タンパク質（ＨＳＰ）のアミノ酸組成（後者の二つのタンパク質はＧｉｌｌｅｓｐｉｅとＭａｒｓｈａｌｌの好意によるもので彼等の論文Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｗｏｏｌ ａｎｄ ｈａｉｒ，Ｐｒｏｃ．Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ．ＷｏｏｌＴｅｘｔ．Ｒｅｓ．Ｃｏｎｆ．，Ｐｒｅｔｏｒｉａ，２巻６７〜７７頁１９８０年に記載されている）。残基はすべてモル％で示してある。Ｓ−スルホシステイン、シスチン及びシステインは、還元とアルキル化を行った後、Ｓ−カルボキシメチルシステインとして測定されている。

本発明の方法の一実施例を添付図面１に線図で示してある。限外濾過は各精製段階で可能な要素と考えられる。主要要素を、タンパク質抽出操作の下記実施例によって例示する。

実施例
実施例１第一段階。消化
本発明の方法の消化段階は、酸化的亜硫酸分解反応を利用して、ケラチン源内のシスチンをＳ−スルホシステインに変換することを含んでいる。

実施例１ａ。第一段階、消化
羊毛１０ｋｇからケラチンを抽出するため、まず硫酸銅５水和物２ｋｇを、高剪断力ミキサーを使用して、濃アンモニア水８ｌと混合した。その混合物を水で２００Ｌまで希釈し次いで羊毛１０ｋｇを添加した。硫酸（２Ｍ）約１５Ｌを、攪拌されている前記混合物にｐＨが９．４になるまで添加した。無水亜硫酸ナトリウム（５．０４ｋｇ）を添加し、次いでその溶液を、すべての薬剤が完全に溶解しｐＨが９．５で安定するまで混合した。銅アンモニア錯体の最終濃度は０．０４Ｍであった。亜硫酸ナトリウムは最終濃度が０．２Ｍであった。消化溶液の温度は２０℃に維持した。２４ｈｒゆるやかに攪拌した後、軟化した羊毛の繊維状でゼラチン様塊を濾別した。得られた濾液を新鮮な羊毛フィルターで濾過したところ、溶液の銅濃度が１７２５ｐｐｍから１３０ｐｐｍまで低下し、次いでＰｕｒｏｌｉｔｅ Ｓ９３０ ＩＤＡイオン交換樹脂を使ってさらに精製したところ、酸性条件下で銅濃度は１２ｐｐｍまで低下した。新鮮な水を、上記軟化した羊毛に加え、その混合物を攪拌した。

実施例１ｂ。第一段階、界面活性剤を使用して行う消化
実施例１ａの変形で、消化溶液を、非界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ１００を１％添加して調製した。この界面活性剤の添加によって、羊毛繊維からの可溶性タンパク質の放出が遅れたが、抽出溶液中の銅塩類などの残留薬剤からタンパク質を一層効率的に分離することができた。

実施例１ｃ。第一段階、消化
実施例１ａの変形で、消化段階が二つの部分で行われる。第一部分では、羊毛がｐＨ４．２で濃度０．２Ｍのメタ重亜硫酸ナトリウムによって前処理される。その羊毛をこの溶液から取り出した後、残留亜硫酸塩を羊毛から除こうとはせずに、その羊毛を、実施例１ａで述べた濃度とｐＨの水酸化銅アンモニウム溶液に、２０℃でさらに２４ｈｒ浸漬した。

実施例２。第二段階、抽出
実施例２ａ。第二段階、バッチ式抽出
実施例１に記載されている第一段階を完了した後、その混合物を１６ｈｒ攪拌し次いで均質化した。さらに４ｈｒ攪拌した後、固形物と溶液を、ウェッジワイヤスクリーン（ｗｅｄｇｅ ｗｉｒｅ ｓｃｒｅｅｎ）とこれに続いて沈降タンク（ｓｅｔｔｌｉｎｇ ｔａｎｋ）とスピニングディスク（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｄｉｓｃ）遠心分離器を有する２段濾過法を利用して分離した。その固体相を反応容器に戻し水を加えて、元の羊毛の固体に基づいて最終の液体対羊毛の比率を２０：１にした。２４ｈｒ攪拌もしくは連続均質化を行った後、その混合物を、上記２段濾過法を繰り返すことによって分離した。その固体相を抽出容器に戻してさらに希釈した。このサイクルを７〜１２回繰り返した。可溶性タンパク質を含有する液体相は、後記実施例３で詳述するようにしてさらに処理した。

実施例２ｂ。第二段階、連続抽出
第一段階を完了した後、二段濾過工程を連続法で行いかつ固体と新鮮な水を、２４ｈｒでタンクの容積が置換されるのと等しい速度で反応タンクに添加したことを除いて実施例２ａに述べたようにして、混合物を処理した。この工程を１２０ｈｒ続けた。

実施例３。タンパク質溶液の処理
溶液を濃縮しかつ乾燥とイオン交換の工程をより効率的にするため、タンパク質溶液を処理中、いくつかのポイントで限外濾過を利用できる。限外濾過は以下の実施例で述べる処理ステップの前で利用できる。

実施例３ａ。ＥＤＴＡを使用して行うタンパク質溶液の処理
実施例２に述べられているように第二段階を行った結果生成した溶液をさらに処理して、精製された可溶性ケラチンを単離した。ＥＤＴＡ（０．２Ｍ）を、液体相に、２５ｍＬ／ｌの比率で又は溶液を分析することによって示されるような溶液中に存在するすべての銅イオンを封鎖するのに適切な比率で添加した。１ｈｒ混合した後、硫酸を使って濾液のｐＨを３．５まで下げた。

タンパク質の沈澱をスクリーンを使用して単離し、次に希硫酸と水を順に使って洗浄した。タンパク質であるＳ−スルホン化ケラチン中間フィラメントタンパク質を、水酸化ナトリウムの希薄溶液で溶解した後、３ルートの乾燥法すなわち凍結乾燥法、流動床乾燥法及びスプレー乾燥法のうちの一つの乾燥法で乾燥した。タンパク質沈澱操作を行った後の濾液を、限外濾過を利用してさらに処理し、タンパク質成分を残留薬剤から分離した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）をスプレー乾燥して別の可溶性タンパク質であるＳ−スルホン化ケラチン高硫黄タンパク質を単離した。得られた透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ）をさらに処理して、イオン交換媒体を使って流出液流から銅とＥＤＴＡを回収した。

実施例３ｂ。イオン交換媒体を使用して行うタンパク質溶液の処理
実施例２で述べたようにして第二段階の結果生成した溶液をさらに処理して、精製可溶性ケラチン類を単離した。溶液から銅イオンを除くため、液体相を、イミノ二酢酸官能基を含有するキレート樹脂のＰｕｒｏｌｉｔｅ Ｓ９３０ ＩＤＡイオン交換樹脂などのイオン交換樹脂を通過させた。イオン交換を行った後、濾液のｐＨを、硫酸を使って３．５まで下げて、実施例３ａで述べたのと同一の方式でさらに処理した。

実施例３ｃ。イオン交換を行う前にｐＨ調節して行うタンパク質溶液の処理
実施例２に記載したように第二段階を行った結果生成した溶液をさらに処理して精製可溶性ケラチン類を単離した。液体相のｐＨを、硫酸を使って３．５まで低下させた。生成したタンパク質の沈澱をスクリーンを使用して単離し、希水酸化ナトリウム溶液を使用して再び溶解し、次いでＥＤＴＡを添加するか又はイオン交換カラムを通過させることによってさらに精製した。このさらなる精製の後、その溶液のｐＨを硫酸を使って３．５まで下げて、タンパク質を、前記諸実施例に記載されているようにして単離した。最初のｐＨを下げたステップで得た濾液は、かなりの量の可溶性タンパク質と他の薬剤をまだ含有しているが、この濾液をしてイオン交換媒体を通過させることによって精製し、次いでスプレー乾燥して、別の可溶性タンパク質であるＳ−スルホン化ケラチン高硫黄タンパク質を単離した。

実施例４。第二段階で得た残留物の溶解
第二段階の結果として単離された固体の流れを一群の方法でさらに処理してケラチンペプチドを製造することができる。上記残留物は、高レベルのスルホン化を行うと、化学的消化や酵素による消化を容易に行えるようになる。というのは化学的攻撃や酵素の攻撃に対して耐性の元のケラチン源に存在するジスルフィド結合がほとんど開裂されてしまうからである。

実施例４ａ。硫化ナトリウムを使って行う残留物の溶解
硫化ナトリウム溶液（５重量％）を、約５％の固形分を含有している工程の第二段階からの液体流の同容積に添加する。得られた混合物を１２ｈｒ攪拌した後、固形分を濾過と遠心分離で除き、次にそのタンパク質溶液に硫酸を添加してｐＨを２〜３．５の範囲まで下げる。沈澱をスクリーン上に集めて水で徹底的に洗浄する。

実施例４ｂ。過酸化水素を使用して行う残留物の溶解
過酸化水素（５０％）を、ケラチン残留物１ｋｇ当り２５〜３０ｍｌのレベルで、第二段階からの液体流に添加する（ケラチン残留物は約５％の固形分を含有している）。これを混合し次に１Ｍ水酸化ナトリウムを添加してｐＨを１０〜１３の範囲にする。その混合物を２４ｈｒゆるやかに混合し、次に実施例２に記載の二段階濾過法によってタンパク質と固形分を分離し、次いで実施例４ａに記載したように酸性にしてタンパク質を単離する。あるいは、タンパク質溶液をしてイオン交換樹脂を通過させ、次に酸性にして、沈澱した固体を集める。次にその酸性にした溶液をしてイオン交換樹脂を通過させた後、凍結乾燥又はスプレー乾燥を行って別のタンパク質豊富生成物を集めることができる。

実施例４ｃ。タンパク質分解酵素を使用して行う残留物の溶解
工業用ズブチリシン酵素製剤（活性酵素を２．５％含有する溶液）を、ケラチン残留物１ｇ当り活性酵素１０ｍｇの量で、第二段階からの固体の流れに添加した。水酸化ナトリウムを添加してｐＨを９．５に維持し、得られた反応混合物を２ｈｒかけて６０℃まで加熱した。生成したタンパク質溶液を、固体から単離して、実施例４ａに記載されているようにして処理するか、又は実施例４ｂに記載されているように酸性にする前及び／又は酸性にした後にイオン交換樹脂を通過させる。

このように、本発明によって、経済的でかつ環境保護の観点から許容できる可溶性ケラチン誘導体の製造方法が提供される。

本発明の詳細な実施例を述べてきたが、本願の請求項の範囲から逸脱することなく改良と変形を実施できると考えられる。

本発明の一実施例のタンパク質抽出法の線図である。

Claims (15)

1. 以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化されたケラチンタンパク質を製造するための方法：
   （ａ）ケラチン源に酸化的亜硫酸分解反応を行なって消化液において反応生成物を含む固体を生成する、
   （ｂ）固体を消化液から分離する、そして
   （ｃ）固体を水または水と界面活性剤からなる組成物で抽出し、固体から、Ｓ−スルホン化されたケラチンタンパク質を含む抽出物を分離する、但し抽出は反復または連続であることができる。
2. ケラチン源が羊毛である請求項１に記載の方法。
3. 工程（ｃ）の抽出後の固体が水不可溶性ゼラチン状組成物を含む請求項１に記載の方法。
4. 消化液が銅含有反応体を含む請求項１に記載の方法。
5. 酸化的亜硫酸分解反応が抽出物中に残る金属イオンを与え、工程（ｄ）の処理がキレート化剤での抽出物中の金属イオンの封鎖を含む請求項４に記載の方法。
6. キレート化剤がＥＤＴＡである請求項５に記載の方法。
7. 工程（ｄ）が濾過によって行なわれる請求項１に記載の方法。
8. 工程（ｃ）における固体からの抽出物の分離が濾過によって行なわれる請求項１に記載の方法。
9. 酸化的亜硫酸分解反応が抽出物中に残る金属イオンを与え、Ｓ−スルホン化されたケラチンタンパク質がＳ−スルホン化された高硫黄ケラチンタンパク質及びＳ−スルホン化された中間フィラメントケラチンタンパク質を含む請求項１に記載の方法。
10. 工程（ａ）がカオトロピック薬剤の使用なしで行なわれる請求項１に記載の方法。
11. 工程（ａ）がタンパク質の完全さを維持するために４．２〜９．５のｐＨの条件下で行なわれる請求項１に記載の方法。
12. 以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化されたケラチンタンパク質からＳ−スルホン化された高硫黄ケラチンタンパク質を製造するための方法：
    （ａ）金属イオンの存在下でケラチン源に酸化的亜硫酸分解反応を行なって消化液において反応生成物を含む固体を生成する、但し前記金属イオンは抽出物中に残る、
    （ｂ）固体を消化液から分離する、
    （ｃ）固体を、反復または連続して、水または水と界面活性剤からなる組成物で抽出し、固体から抽出物を分離する、但し前記固体は水不溶解性ゼラチン状組成物を含む、
    （ｄ）酸及び水を抽出物に添加してＳ−スルホン化されたケラチン中間フィラメントタンパク質を沈殿する、
    （ｅ）沈殿物を濾過してＳ−スルホン化された高硫黄ケラチンタンパク質を含有する濾液を生成する、
    （ｆ）濾液を限外濾過して保持物を回収する、
    （ｇ）保持物を乾燥して精製されたＳ−スルホン化された高硫黄ケラチンタンパク質を生成する。
13. 以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化されたケラチンタンパク質からＳ−スルホン化された中間フィラメントケラチンタンパク質を製造するための方法：
    （ａ）金属イオンの存在下でケラチン源に酸化的亜硫酸分解反応を行なって消化液において反応生成物を含む固体を生成する、但し前記金属イオンは抽出物中に残る、
    （ｂ）固体を消化液から分離する、
    （ｃ）固体を、反復または連続して、水または水と界面活性剤からなる組成物で抽出し、固体から抽出物を分離する、但し前記固体は水不溶解性ゼラチン状組成物を含む、
    （ｄ）酸及び水を抽出物に添加してＳ−スルホン化されたケラチン中間フィラメントケラチンタンパク質を沈殿する、
    （ｅ）Ｓ−スルホン化された中間フィラメントケラチンタンパク質を濾過し、固体を回収する、
    （ｆ）固体を乾燥して精製されたＳ−スルホン化された中間フィラメントケラチンタンパク質を生成する。
14. 以下の工程を含む、Ｓ−スルホン化されたケラチンタンパク質から可溶性ケラチンペプチドを製造するための方法：
    （ａ）ケラチン源に酸化的亜硫酸分解反応を行なって消化液において反応生成物を含む固体を生成する、
    （ｂ）固体を消化液から分離する、
    （ｃ）固体を、反復または連続して、水または水と界面活性剤からなる組成物で抽出し、固体から抽出物を分離する、但し前記固体は水不溶解性ゼラチン状組成物を含む、
    （ｄ）（ｃ）の水不溶解性ゼラチン状組成物を、硫化ナトリウム溶液、過酸化水素溶液からなる群から選択された薬剤と、残留金属イオン及びタンパク質分解酵素の存在下で接触させ、可溶性ケラチンペプチド含有溶液を生成する、そして
    （ｅ）以下の処理方法のいずれか一つに従って（ｄ）の溶液を処理して可溶性ケラチンペプチドを回収する：
    （１）以下のことを含む第一処理方法：
    （ｉ）（ｄ）の溶液を濾過及び／または遠心分離して、（ｄ）の溶液から固体を除く、
    （ｉｉ）（ｉ）の濾過された及び／または遠心分離された溶液に硫酸を添加して、可溶性ケラチンペプチドを沈殿する、そして
    （ｉｉｉ）沈殿した可溶性ケラチンペプチドを集めて、それにより可溶性ケラチンペプチドを回収する；
    （２）以下のことを含む第二処理方法：
    （ｉ）（ｄ）の溶液を濾過して、（ｄ）の溶液から固体を除く、
    （ｉｉ）（ｉ）の濾過された溶液をイオン交換樹脂に通過させる、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の通過した溶液に硫酸を添加して、酸性化された溶液から固体を沈殿する、
    （ｉｖ）沈殿した固体を酸性化された溶液から分離する、
    （ｖ）酸性化された溶液をイオン交換カラムに通過させる、そして
    （ｖｉ）溶液を凍結乾燥またはスプレー乾燥して、それにより可溶性ケラチンペプチドを回収する；
    （３）以下のことを含む第三処理方法：
    （ｉ）（ｄ）の溶液を濾過して、（ｄ）の溶液から固体を除く、
    （ｉｉ）（ｉ）の濾過された溶液をイオン交換樹脂に通過させる、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の通過した溶液に硫酸を添加して、酸性化された溶液から固体を沈殿する、
    （ｉｖ）沈殿した固体を酸性化された溶液から分離する、そして
    （ｖ）酸性化された溶液をイオン交換カラムに通過させて、可溶性ケラチンペプチドの水溶液を回収する。
15. タンパク質分解酵素がズブチリシン、パパインまたはトリプシンの系統からのものである請求項１４に記載の方法。

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