KR20020029859A - 제 1 형 아텔로교원질의 직접 분리추출 방법 - Google Patents
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Abstract
제 1 형 교원질의 분자 말단에 위치하는 텔로펩타이드(telopeptide)는 면역반응을 일으키는 주된 원인으로서 의약품이나 화장품 등의 원료로 사용할 때에는 산용해성 교원질을 다시 펩신(pepsin)으로 처리하여 텔로펩타이드를 제거한 아텔로교원질(atelocollagen)을 사용하고 있다. 그러나 이 방법은 다단계 처리과정을 거쳐야 하므로 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다. 본 발명은 포유류의 조직을 산용액에 넣고 분쇄한 다음 효소를 즉시 반응하도록 하여 고순도의 아텔로교원질을 직접 분리추출하는 간단하고 경제적인 방법을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 제 1 형 아텔로교원질의 직접 분리추출방법에 관한 것이다.
교원질은 포유동물의 구조 단백질로서 각 조직의 특성에 따라 여러 가지 형태로 존재하며, 그 가운데 약 3분의 1은 글라이신-X-Y의 아미노산의 서열이 반복된 분자량 약 120,000인 펩타이드 나선쇄(α 쇄) 3개가 수소결합을 하여 분자를 이루는 제 1 형 교원질이 차지하고 있다. 제 1 형 교원질의 분자량은 약 360,000정도로서, 유전적으로 다른 특성이 있는 각각의 쇄는 X, Y 부위의 아미노산 구성이 다르며, 자연상태에서는 분자 말단에 위치하는 비나선형인 텔로펩타이드(telopeptide) 부위가 서로 결합하여 섬유화를 이룬 상태로 존재하고, 교원섬유분해효소(collagenase)는 쇄의 나선형 단백질 부위만 절단하여 교원질을 분해시킨다.
일반적으로 제 1 형 교원질은 포유류 조직을 트립신(trypsin)으로 처리하여 세포와 분리시키고 세포외기질로부터 무기질과 각종 당단백을 제거하는 방법으로 추출하고 있으며, 이들 교원질은 다시 산 용해성과 불용성으로 분리하여 사용하고 있다. 따라서 다른 단백질과 같이 교원질의 추출은 고유의 극성이나 용해도를 이용한 침전법, 크로마토그래피 방법 등을 이용하고 있다. 즉, 조직의 절편을 황산아모니움(ammonium sulfate)으로 침전 분리한 다음, 2-6M 우레아(urea) 완충용액을 이용한 크로마토그래피를 한 다음 원심분리를 이용하여 추출하는 것이 일반적이다.
한편 제 1 형 교원질의 분자 말단에 위치하는 텔로펩타이드(telopeptide)는 면역반응을 일으키는 주된 원인으로서 의약품이나 화장품 등의 원료로 사용할 때에는 산용해성 교원질을 다시 펩신(pepsin)으로 처리하여 텔로펩타이드를 제거한 아텔로교원질(atelocollagen)을 사용하고 있다. 그러나 이 방법은 다단계 처리과정을 거쳐야 하므로 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 포유류의 조직을 산용액에 넣고 분쇄한 다음 효소를 즉시 반응하도록 하여 아텔로교원질을 직접 분리추출하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에서 제조된 아텔로콜라겐과, 표준 시판 제품에 대한 SDS-PAGE running 후 Coomasie Brilliant Blue R250 Staining 사진이다.
A: Collagen Type Ⅰ, Sigma
B: Collagen Type Ⅲ, Sigma
C: 본 발명 Collagen (Regenmed), Calf skin
D: 본 발명 Collagen (Regenmed), Human
도 2는 본 발명의 방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐을 이용한 동물실험으로서 1 % 용액의 피하주사장면 사진이고,
도 3은 피하주사 직후의 피부 상태 사진이고,
도 4는 주사 후 1주 경과시의 피부 (시료 : 시그마사 콜라겐제품) 사진이며,
도 5는 주사 후 1주 경과시의 피부 (시료 : 코겐사 아텔로콜라겐 제품)사진이며,
도 6은 본 발명의 방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐 주사 후 1주 경과시의 피부 사진이며,
도 7은 주사 후 1주 경과시의 조직사진 (시료 : 시그마사 콜라겐제품)이며,
도 8은 주사 후 1주 경과시의 조직사진 (시료 : 코겐사 아텔로콜라겐 제품)이며,
도 9는 본 발명의 방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐 주사 후 1주 경과시의 조직사진이다.
다음에 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 포유류의 조직을 산용액에 넣고, 분쇄한 다음 효소를 즉시 반응하도록 하여 아텔로교원질을 직접 분리추출하는 방법에 관한 것이다.
포유류의 조직의 모발이 잔존하거나 또는 지방조직이 부착되어 있는 경우에는 이를 제거하고 다음 분리추출공정을 진행한다.
본 발명에서는 포유류의 연조직이나 경조직 모두 사용될 수 있다.
포유류의 연조직을 사용하여 제 1 형 아텔로교원질을 제조하는 경우에는 포유류로부터 적출한 연조직을 0.05M Tris-HCl, pH 7.4, 0.9% NaCl로 세척하고, 모발이 있는 경우에는 이를 제거하고 직경 약 1cm 정도로 길이방향으로 절단한 다음, 0.5M 초산용액에서 5-48시간 (12-24시간이 바람직하다) 부종화(swelling)시키고, 1mm3정도의 크기로 잘게 절단한 다음, 조직 50g당 0.5M 초산용액 1L용액의 비율로 혼함한 후 조직분쇄(homogenization)시킨다. 분쇄조직 현탁액(suspension)을 다시 조직 10g당 0.5M 초산 1L용액으로 희석한 후, 희석용액 1L당 약 520,000unit의 펩신(pepsin)을 첨가하여 현탁액을 제조한다. 다음에 호모지나이저나 블렌더를 이용하여 60-240rpm의 속도로 계속하여 교반시켜 주면서 약 4℃에서 5 - 48시간 (약 12 - 24시간이 바람직하다.) 배양하여 펩신(pepsin)을 반응시킨다. 반응이 완료된 후 현탁액 내에 존재하는 불용성 교원질을 약 15,000 × g의 중력조건으로 10 - 120분간 (20 - 60분이 바람직하다.) 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한 다음, 상층액에 5M NaCl용액을 첨가하여 최종농도 약 2M NaCl용액으로 조절하고, 분자량 360,000 걸름용 필터장치 (filter assembly)를 이용하여 축적물을 회수한다. 다음에 발명량 약 300,000이하의 걸름용 초필터장치 (ultrafiltration system)를 이용하여 잔류하는 NaCl과 펩타이드를 제거한다. 다음에 투석막을 이용하여 잔류하는 NaCl과 펩타이드를 최종 제거한다. 회수된 아텔로교원질을 0.1N NaOH와 0.1N HCl을 이용하여 pH 7.4가 되도록 조절하고, 70% 에탄올 용액에 현탁시켜서 멸균처리한 후, -20 - -70℃에서 12 - 72시간 (24 - 48시간이 바람직하다.) 동결건조시켜서 보관한다.
포유류의 경조직으로부터 아텔로교원질을 제조하는 방법은 다음과 같다.
증류수에 2염기성 소디움 포스페이트 및 1염기성 소디움 포스페이트 및 EDTA를 넣고 약 5 - 60분간 (10 - 30분이 바람직하다.), 30 - 80℃ (약 40 - 60℃가 바람직하다.) 로 가열한 다음, NaOH 또는 HCl 약 pH 7.4로 조절한다. 이를 pH 약 7.4인 0.15M 인산염완충액에 첨가하여 탈회용액을 제조한다. pH 7.4로 조절된 0.1M EDTA함유 0.15M 인산염완충액으로 세척한 후 정제수로 세척한다. 다음에, 0.5M 초산용액상에서 1mm3크기로 절단한 다음, 연조직으로부터 분리추출하는 방법으로 공정을 행하여 아텔로교원질을 분리추출한다.
다음에 실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예 1 : 연조직으로부터의 아텔로교원질 분리추출
1) 포유류로부터 적출한 연조직을 0.05M Tris-HCl, pH 7.4, 0.9% NaCl로 세척한다.
2) 모발이 있을 경우에는 이를 제거한 후, 직경 1cm 정도로 길이방향으로 절단한다.
3) 0.5M 초산(Acetic acid) 용액에서 4℃에서 24hr 동안 부종화(swelling)시킨다.
4) 부종화된 진피 부분을 칼로 절제하여 취득한 다음, 0.5M 초산(Acetic acid) 용액상에서 1mm3 정도의 크기로 잘게 절편화한다.
5) 조직절편 50g당 0.5M 초산(Acetic acid) 1L의 비율로 혼합한 다음 조직분쇄(homogenization) 시킨다.
6) 분쇄 조직 현탁액(suspension)을 다시 조직 10g당 0.5M 초산(Acetic acid) 1L용액으로 희석한 후, 희석용액 1L당 520,000unit의 펩신(pepsin) 2-4g을 첨가하여 현탁액(suspension)을 제조한다.
7) 교반기를 이용하여 250 - 450rpm의 속도로 계속 교반시켜주면서 4℃에서 24hr 동안 배양(incubation)하여 펩신(pepsin)을 반응시킨다.
8) 펩신(pepsin)반응이 완료된 현탁액(suspension) 내에 존재하는 불용성 교원질을 제거하기 위하여 15,000 × g의 중력조건으로 30분간 원심분리 또는 100 μm의 필터페이퍼를 이용하여 필터링한다.
9) 불용성 침전물을 제거한 다음, 모아진 상층액에 5M NaCl 용액을 첨가하여 최종농도 2M NaCl 용액으로 조절한다.
10) 4℃에서 15-30분간 200rpm의 속도로 교반한 다음, 100 μm의 필터페이퍼를 이용하여 필터링하여 축적물을 회수한다.
11) 회수한 축적물에 축적물 1L당 0.02 M 우레아(urea) 용액을 4L 첨가하여 overnight 시킨다.
12) 분자량 30만이하 걸름용 초여과장치(ultrafiltration system)을 이용하여 잔류하는 NaCl과 잔류 펩타이드를 제거한다.
13) 투석막을 이용하여 NaCl과 잔류 펩타이드를 최종 제거한다.
14) 회수된 아텔로교원질을 0.1N NaOH와 0.1N HCl을 이용하여 pH 7.4가 되도록 조절한다.
15) 아텔로교원질을 70% 에탄올 용액에 현탁(suspension)시켜서 멸균처리한 후, -20 - -70℃에서 24 - 48시간 동결건조시켜 보관한다.
실시예 2: Human umbilical cord로부터의 아텔로콜라겐 분리추출
1) 탯줄(이하 조직이라 함)을 1차 증류수로 세척하여 혈관을 제거한다.
2) 혈관을 제거한 조직을 3차 증류수로 세척한 후, 조직 10g당 0.9% NaCl용액 100mL를 2-5시간 교반하는 처리과정을 3회 실시하여 혈액을 제거한다.
3) 혈액을 제거한 조직을 3차 증류수로 세척하여, 24시간 70% 에탄올로 멸균처리한다.
4) 멸균처리한 조직을 조직 10g당 0.5M 소디움 아세테이트 (sodium acetate) 용액 50mL의 비율로 혼합한 다음 블랜더와 호모게나이저를 이용하여 조직을 미세하게 분쇄시킨다.
5) 분쇄 조직 용액을 다시 조직 10g당 소디움 아세테이트 (sodium acetate) 용액 100mL의 비율로 혼합한 후, 4℃에서 교반하면서 overnight 처리한다.
6) 소디움 아세테이트 (sodium acetate) 용액에서 처리한 조직을 원심분리기를 이용하여 2500rpm, 20분 원심분리하여 침적시킨다.
7) 침적된 조직을 조직 37g당 0.5M 초산(Acetic acid) 1L용액으로 희석한 후, 호모지나이저(Homogenizer)를 이용하여 조직을 미세하게 분쇄시킨다.
8) 분쇄 조직 현탁액을 희석용액 1L당 975,000unit의 펩신(pepsin) 1.0 - 2.0g을 첨가하여 현탁액(suspension)을 제조한다.
9) 조직 현탁액을 교반기를 이용하여 400rpm의 속도로 계속 교반시키면서 4℃에서 48-72hr 동안 배양(incubation)하여 펩신(pepsin)을 반응시킨다.
10) 펩신(pepsin)반응이 완료된 현탁액(suspension) 내에 존재하는 불용성 콜라겐을 제거하기 위하여 원심분리기를 이용하여 4800rpm, 20분 원심분리한다.
11) 불용성 콜라겐을 제거한 상층액에 2.8M NaCl 용액을 첨가하여 최종농도 0.7M NaCl 용액으로 조절한다.
12) 4℃에서 10-30분간 200rpm의 속도로 교반한 다음, 2-24시간 4℃에 두어, 콜라겐 type III(상층부)와 콜라겐 type I(하층부)으로 분리한다.
13) 분리된 콜라겐 type I을 원심분리기를 이용하여 4800rpm, 20분 원심분리하여 얻은 침적물을 콜라겐 30g당 0.5M 초산(Acetic acid) 100mL용액으로 희석한 후, 소디움 포스페이트(sodium phosphate, dibasic) 용액하에서 투석한다.
14) 투석을 완료한 콜라겐 용액을 콜라겐 용액 1L당 0.5M 초산(Acetic acid) 8mL용액을 첨가하여 생성된 침적물을 용해시키고, 콜라겐 용액 1L당 0.01M 우레아(urea) 용액을 1.2L 첨가하여 4℃ 24시간 처리한다.
15) 분자량 30만이하 걸름용 초여과장치(ultrafiltration system)을 이용하여 잔류하는 NaCl과 잔류 펩타이드를 제거한다.
16) 투석막을 이용하여 NaCl과 잔류 펩타이드를 최종 제거한다.
17) 회수된 아텔로콜라겐 0.1N NaOH를 이용하여 pH 7.4가 되도록 조절한다.
18) -20 - -70℃에서 24 - 48시간 동결건조시켜 보관한다.
실시예 3 : 경조직으로부터의 아텔로교원질 분리추출
1) 증류수 90ml에 2염기성 소디움 포스페이트(Dibasic sodium phosphate) 3.38g, 1염기성 소디움 포스페이트(monobasic sodium phosphate) 3.33g, EDTA 2.92g을 넣고 15분간 50℃로 가열한다.
2) 10ml의 증류수를 첨가한 다음, 1N NaOH 또는 HCl을 첨가하여 pH를 7.4로 조절한다.
3) pH 7.4인 0.15M 인산염(phosphate buffer)용액을 첨가하여 탈회용액을 제조한다.
4) 유리제 용기에 탈회용액과 경조직을 넣은 다음 30 - 120분간 25 - 45℃로 가열한다.
5) pH 7.4로 조절된 0.1M EDTA 함유 0.15M 인산완충용액으로 세척한 후 증류수로 세척한다.
6) 0.5M 초산(Acetic acid) 용액상에서 1mm3 정도의 크기로 잘게 가위질한다.
7) 조직절편 50g당 0.5M 초산(Acetic acid) 1L의 비율로 혼합한 다음 조직분쇄 (homogenization) 시킨다.
8) 분쇄 조직 현탁액(suspension)을 다시 조직 10g당 0.5M 초산(Acetic acid) 1L용액으로 희석한 후, 희석용액 1L당 520,000unit의 펩신(pepsin) 20-40g을 첨가하여 현탁액(suspension)을 제조한다.
9) 호모지나이저(Homogenizer)나 블랜더(blender)를 이용하여 60 - 240rpm의 속도로 계속 교반시켜주면서 4℃에서 24hr 동안 배양(incubation)하여 펩신(pepsin)을 반응시킨다.
10) 펩신(pepsin)반응이 완료된 현탁액(suspension) 내에 존재하는 불용성 교원질을 제거하기 위하여 15,000 × g의 중력조건으로 30분간 원심분리 한다.
11) 불용성 침전물을 제거한 다음, 모아진 상층액에 5M NaCl 용액을 첨가하여 최종농도 2M NaCl 용액으로 조절한다.
12) 10분간 30 - 120rpm의 속도로 교반한 다음 분자량 360,000걸름용 필터장치(filter assembly)를 이용하여 축적물을 회수한다.
13) 분자량 30만이하 걸름용 초여과장치(ultrafiltration system)을 이용하여 잔류하는 NaCl과 잔류 펩타이드를 제거한다.
14) 투석막을 이용하여 NaCl과 잔류 펩타이드를 최종 제거한다.
15) 회수된 아텔로교원질을 0.1N NaOH와 0.1N HCl을 이용하여 pH 7.4가 되도록 조절한다.
16) 아텔로교원질을 70% 에탄올 용액에 현탁(suspension)시켜서 멸균처리한 후, -20 - -70℃에서 24 - 48시간 동결건조시켜 보관한다.
위 실시예들과 같이 본 발명의 방법에 따라 추출한 콜라겐을 기존방법과 비교하였다.
실험예 1. SDS-PAGE
표준 물질로서 시그마사(Sigma, St. Louis, MO, USA)로부터 구입한 Calf skinoriginated typeⅠcollagen과 type Ⅲ collagen을 사용하였으며, 본 발명에서 제조된 시료와 동량을 denaturation시켜서 SDS-PAGE 에 loading 하여 각 helix의 개수 및 위치를 서로 비교하였다.
도 1은 SDS-PAGE running 후 Coomasie Brilliant Blue R250 Staining 사진으로서, 표준 물질로 사용된 Sigma 제품(A, Type Ⅰ)과 본 발명의 Sample(C, D) 모두 α1 (Ⅰ) helix와 α2 (Ⅰ) helix band를 확인할 수 있었으며, Type Ⅲ collagen (Sigma)은 α1 (Ⅲ) helix band를 확인할 수 있었다. 이상의 결과에서 의뢰 샘플은 모두 Type Ⅰ collagen으로 여겨진다. Image analyzer system을 이용한 순도확인시험에서는 C, D 샘플 모두 각각 94.5, 95.4%의 순도 (전체단백질에 대한 collagen의 비율)를 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 아미노산 조성 분석
콜라겐 시료를 섭씨 110℃에서 24시간동안 가수분해시킨 후 페닐이소티오시아네이트( phenylisothiocyanate)로 유도체화 시킨다. 시료를 완전히 말린 후 200ul의 A solvent로 녹인 후 HPLC를 이용하여 분석한다.
HPLC CONDITION (Hewlett Packard 1100 Series)
1. column : PICO-TAG column (3.9× 300mm)
2. column oven tempt. : 46 Celsius
3. HPLC pump : HP 1100 Series, Binary Pump
4. HPLC injector : HP 1100 Series, Autosampler
5. Variable Wavelength Detector : HP 1100 Series, 254nm
6. solvent : A) 1.4mM NaHAc, 0.1% TEA, 6% CH3CN, pH6.1
B) 60% CH3CN
7. elution : Linear gradient of solvent B ( 0-100%)
8. flow rate : 1.0ml/min
9. run time : 30min
10. equil. time : 10min
11. injection vol. : standard 4ul
samples : MT01 : 4ul, MT02/03/04 :10ul
상기 결과를 다음 표 1 내지 3에 나타낸다.
표 1 Sigma사 콜라겐(Type I)에 대한 아미노산 조성표
| AA | Result | MOL% | Residue |
| CYA* | 0.00 | 0.00 | |
| ASX** | 158.18 | 5.26 | |
| GLX** | 238.18 | 7.92 | |
| SER | 106.04 | 3.53 | |
| GLY | 1033.83 | 34.37 | |
| HIS | 16.98 | 0.56 | |
| ARG | 152.69 | 5.08 | |
| THR | 59.44 | 1.98 | |
| ALA | 420.15 | 13.97 | |
| PRO | 367.16 | 12.21 | |
| TYR | 15.33 | 0.51 | |
| VAL | 87.25 | 2.90 | |
| MET | 22.36 | 0.74 | |
| ILE | 56.43 | 1.88 | |
| LEU | 113.74 | 3.78 | |
| PHE | 54.39 | 1.81 | |
| TRP | 0.00 | 0.00 | |
| LYS | 105.48 | 3.51 | |
| TOTAL | 3007.63 | 100.00 |
* CYA mean the sum of cysteine & cystine
** ASX, GLX mean the sum of asparagine & aspartic acid and glutamine & glutamic acid, respectively.
# Each number is expressed as pmol.
표 2. 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐(소유래)에 대한 아미노산 조성표
| AA | Result | MOL% | Residue |
| CYA* | 0.00 | 0.00 | |
| ASX** | 690.93 | 5.11 | |
| GLX** | 1021.27 | 7.56 | |
| SER | 563.20 | 4.17 | |
| GLY | 4740.27 | 35.09 | |
| HIS | 70.48 | 0.52 | |
| ARG | 654.80 | 4.85 | |
| THR | 288.28 | 2.13 | |
| ALA | 1795.95 | 13.29 | |
| PRO | 1729.18 | 12.80 | |
| TYR | 64.66 | 0.48 | |
| VAL | 372.72 | 2.76 | |
| MET | 104.61 | 0.77 | |
| ILE | 260.51 | 1.93 | |
| LEU | 508.18 | 3.76 | |
| PHE | 215.98 | 1.60 | |
| TRP | 0.00 | 0.00 | |
| LYS | 429.49 | 3.18 | |
| TOTAL | 13510.51 | 100.00 |
* CYA mean the sum of cysteine & cystine
** ASX, GLX mean the sum of asparagine & aspartic acid and glutamine & glutamic acid, respectively.
# Each number is expressed as pmol.
표 3. 본 발명 아텔로콜라겐(인체태줄유래)에 대한 아미노산 조성표
| AA | Result | MOL% | Residue |
| CYA* | 0.00 | 0.00 | |
| ASX** | 558.87 | 4.90 | |
| GLX** | 881.24 | 7.72 | |
| SER | 452.20 | 3.96 | |
| GLY | 4157.30 | 36.42 | |
| HIS | 84.91 | 0.74 | |
| ARG | 583.99 | 5.12 | |
| THR | 231.66 | 2.03 | |
| ALA | 1541.84 | 13.51 | |
| PRO | 1431.45 | 12.54 | |
| TYR | 37.94 | 0.33 | |
| VAL | 312.00 | 2.73 | |
| MET | 92.63 | 0.81 | |
| ILE | 175.57 | 1.54 | |
| LEU | 379.77 | 3.33 | |
| PHE | 166.73 | 1.46 | |
| TRP | 0.00 | 0.00 | |
| LYS | 327.34 | 2.87 | |
| TOTAL | 11415.44 | 100.00 |
* CYA mean the sum of cysteine & cystine
** ASX, GLX mean the sum of asparagine & aspartic acid and glutamine & glutamic acid, respectively.
# Each number is expressed as pmol.
이상 3가지 sample 모두 glycine 함량이 가장 많음을 보여주었으며 그 다음으로 alanine 과 proline의 양이 대부분을 차지했다. 이러한 아미노산조성은 전형적인 collagen의 특징을 보여주고 있으며, 아미노산조성 분석을 통하여 Tyr의 함유비율을 볼 때, 본 특허에 의해 제조된 아텔로콜라겐은 코겐사의 콜라겐은 보다 적은 Tyr을 함유하므로 높은 순도의 아텔로콜라겐임을 확인할 수 있다. 시그마사의 콜라겐은 텔로펩타이드를 포함한 상태이다.
실험예 : 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐을 이용한 동물실험
실험동물 : 웅성 스프라그-돌리계 래트(Sprague Dawley rat. 체중 : 200 - 300 g )
실험방법:
1. Sprague Dawley rat에 본 발명에서 제조된 콜라겐과 시판 콜라겐 용액 (1%) 10ml를 각각 피하 주사한다.
2. 1주일이 경과한 후 rat을 희생시킨 후 hematoxilin, eosine 염색 후 조직을 검사한다.
실험시 시료주입량 : 10ml
상기 실험결과를 도 2 내지 9의 사진으로 나타낸다.
도 2는 본 발명의 방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐을 이용한 동물실험으로서 1 % 용액의 피하주사장면이고,
도 3은 피하주사 직후의 피부상태 사진이고,
도 4는 주사 후 1주 경과시의 피부 (시료 : 시그마사 콜라겐제품) 사진이며,
도 5는 주사 후 1주 경과시의 피부 (시료 : 코겐사 아텔로콜라겐 제품) 사진이며,
도 6은 본 발명의 방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐 주사 후 1주 경과시의 피부 사진이며,
도 7은 주사 후 1주 경과시의 조직사진 (시료 : 시그마사 콜라겐제품)으로, 면역성 염증세포가 광범위하게 나타난다.
도 8은 주사 후 1주 경과시의 조직사진 (시료 : 코겐사 아텔로콜라겐 제품)으로, 일부 면역반응에 의한 염증세포가 국부적으로 나타난다.
도 9는 본 발명의 방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐 주사 후 1주 경과시의 조직사진으로 염증세포를 발견할 수 없었다.
위 실험 결과, 본 발명의 방법에 따라 제조된 아텔로콜라겐이 생체 면역반응을 거의 일으키지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서, 기존의 제품에 비하여 화장품이나 의약품에 제한 없이 안전하게 사용할 수 있을 것이다.
제 1 형 교원질의 분자 말단에 위치하는 텔로펩타이드(telopeptide)는 면역반응을 일으키는 주된 원인으로서 의약품이나 화장품 등의 원료로 사용할 때에는 산용해성 교원질을 다시 펩신으로 처리하여 텔로펩타이드를 제거한 아텔로교원질(atelocollagen)을 사용하고 있다. 그러나 이러한 종래 방법은 다단계 처리과정을 거쳐야 하므로 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다. 본 발명은 포유류의 조직을 산용액을 넣고 분쇄한 다음 효소를 즉시 반응하도록 하여 아텔로교원질을 직접 분리추출하는 간단하고 경제적인 방법을 제공하는 것이다.
Claims (1)
- 포유류의 연조직 또는 경조직으로부터 아텔로교원질을 분리 및 추출하여 아텔로교원질(atelocollagen)을 제조하는 공정에 있어서, 통상의 방법으로 포유류의 연조직 또는 경조직을 세척, 모발분리 및 지방을 제거하고, 산용액에 넣고 분쇄하고 효소처리 한 다음, 통상의 방법으로 분리정제하여 아텔로교원질을 제조하는 방법.
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