KR100923326B1 - 케라틴 유도체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

단백질의 구조적 완전함에 거의 또는 전혀 손상을 주지 않고 고분자량의 가용성 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 이 방법은 사용되는 시약의 비용 및 이들 시약 중 일부의 재활용의 점에서 경제적으로 또한 환경적으로 허용 가능하고, 대규모로 가용성 단백질을 제조하는데 적합하다. 이 방법은 산화적 아황산분해를 이용하는 제1 단계와, 이것에 이어지는, 온화한 조건을 사용하여 가용성 단백질을 추출하는 제2 단계를 포함한다. 단백질 자원이 양모인 경우에는, 이 방법은 S-술폰화 케라틴 중간 필라멘트 단백질과 S-술폰화 케라틴 고 유황 단백질로 분류되는 가용성 케라틴 단백질의 제조로 이어진다.

케라틴 유도체, 생체 고분자, 단백질, 산화적 아황산분해, S-술폰화

Description

케라틴 유도체의 제조방법{Process for the preparation of keratin derivatives}

본 발명은 경제적이고 환경적으로 허용 가능한 공정에 의해 양모, 모발, 뿔, 발굽, 깃털 및 비늘과 같은 동물 원료로부터 케라틴 유도체를 제조하는 방법, 및 그 제조방법에 의해 제조되는 케라틴 유도체 생성물에 관한 것이다. 케라틴 유도체 중 일부는 가용성이고, 다양한 생체 고분자 재료를 제조하는데 사용될 수 있다.

케라틴은 생물 조직, 특히 고등 척추동물의 상피 조직에 널리 존재하는 구조 단백질의 일종이다. 케라틴은 2가지의 주요 종류, 즉, 연질 케라틴(피부 및 소수의 다른 조직에 존재하는)과 경질 케라틴(손톱, 발톱, 모발, 뿔, 깃털 및 비늘과 같은 물질을 형성하는)으로 구분될 수 있다.

많은 생물계에서 기본적 구조의 역할을 하는 것을 가능하게 하는, 경질 케라틴의 인성(toughness) 및 불용성은, 현재 합성 폴리머로부터 얻어지는 많은 공업용 및 소비자용 재료에서의 바람직한 특성이기도 하다. 케라틴은 우수한 물리적 특성을 가지는 것에 추가하여, 단백질로서 고도의 화학적 기능성을 가지는 물질이고, 따라서, 합성 재료에서는 얻을 수 없는 많은 특성을 나타낸다. 따라서, 케라틴은 높은 가치가 있는 틈새시장 용도를 가지는 제품을 개발하는데 매우 적합하다. 케라틴은 또한, 지속적인 자원으로부터 제조되는 환경적으로 허용 가능한 폴리머이기 때문에, 합성 재료에 비해 환경적인 이점이 있다. 환경 파괴 없이 계속할 수 있는 공정으로 제조되는 재생 가능한 자원으로부터 재료를 개발하는 세계적 경향에 따라, 다양한 재료가 케라틴으로부터 가장 일반적으로는 케라틴 필름의 형태로 제조되어 왔다.

케라틴으로부터 생체 고분자 재료를 제조하는 새로운 공업의 근저에는, 경제적으로 실용 가능하고 또한 환경상의 관점에서 지속 가능하며, 안정하고 다용도의 제품을 제조하는 케라틴을 자원으로부터 추출하는 공정을 갖추는 것이 필수적이다. 개개의 단백질의 완전함(integrity)을 유지하는, 지금까지 사용되고 있는 케라틴 추출 방법은 단백질의 분석 및 특성 결정을 위해 설계되었기 때문에, 경제성 및 환경상의 관점에서 공업적 규모로는 실용적이지 못하였다. 지금까지 사용되고 있는 케라틴의 경제적인 용해 방법은 단백질을 크게 열화(劣化)시키는 작용을 가지기 때문에, 용해된 단백질은 인성 재료로 재구성하는 능력과 같은 생체 고분자로서의 케라틴의 바람직한 성능을 초래하는 물리화학적 특성을 거의 유지하고 있지 않다.

본 발명의 목적은, 공지의 방법들의 단점을 극복하거나 또는 적어도 공중(公衆)에 유용한 선택을 제공하는데 있다.

적어도 하나의 실시형태에서, 본 발명은, 용해 공정 중에 케라틴 단백질의 구조적 완전함 및 화학적 기능성을 유지하고 또한 생체 고분자 재료의 개발을 위한 안정하고 다용도의 케라틴 유도체 제품을 얻을 수 있게 하는, 경제적이고 환경적으로 허용 가능한 케라틴 단백질 용해 방법을 제공하고자 하는 것이다.

제1 양태에 따르면, 본 발명은, 1군의 안정하고 가용성인 고분자량 케라틴 유도체를 제조하기 위한 용해 방법으로서, 그 분자량은 케라틴 원(源)에서 본래 나타내어지는 단백질의 분자량과 유사하거나 그보다 크고, 구성 단백질의 구조적 완전함에 거의 또는 전혀 손상을 주지 않는 용해 방법을 제공한다. 이 용해 방법은 2단계 공정으로 행해진다.

바람직한 양태에 따르면, 본 발명은, 고분자량의 케라틴 유도체를 제조하는 방법으로서, 산화적 아황산분해(oxidative sulfitolysis)에 의해 케라틴 원을 S-술폰화하는 제1 단계로서의 소화(digestion) 단계와, 물에 의한 제어된 세정을 이용하여 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체를 얻는 제2 단계로서의 추출 단계를 포함하는 케라틴 유도체 제조방법을 제공한다.

고도로 S-술폰화된 케라틴의 고체 상태로부터 용액으로의 전환은, 추출 과정으로부터의 잔류 화학 시약을 씻어내고 추출 용액의 이온 강도를 변경시키기 위해 술폰화 케라틴을 물로 제어하면서 서서히 세정하는 것에 의해, 카오트로픽제(chaotropic agent)의 사용 없이 행해진다.

상기 제1 단계는, 술폰화를 위한 저렴한 시약 (예를 들어, 아황산 나트륨) 및 산화를 위한 저렴한 시약 (예를 들어, 수산화 쿠프라암모늄(cupraammonium))의 산업적으로 허용 가능한 농도를 사용하여, 단백질 내에 존재하는 시스틴(cystine)기를 S-술포시스테인으로 전환하는 산화적 아황산분해를 포함한다.

다른 양태에 따르면, 본 발명은, 상기 방법에 의해 제조되는 S-술폰화 케라틴의 용액으로부터 젤라틴상(狀) 케라틴 생성물을 분리하는 방법으로서, 상기 S-술폰화 케라틴 유도체 용액을 중력 여과 장치를 사용하여 처리한 다음, 분리하는 것을 포함하는, 젤라틴상 케라틴 생성물의 분리방법을 제공한다. 상기 분리는 원심분리인 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 젤라틴상 케라틴을 제거한 후 잔류하는 액체 흐름을 세정된 양모(scoured wool)에 통과시켜 용액으로부터 잔류 화학 시약을 제거하고, 그 양모를 후속의 단백질 추출 공정을 위해 준비한다.

시스틴기의 전환에 이어지는, 이 공정의 제2 단계는, 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체를 물로 광범위하게 희석하여 고체 또는 젤라틴 상태로부터 용액으로 되게 하는 것이다. 용해 속도 및 정도는 열, 계면활성제, 완만한 교반 및 강력한 쵸핑(chopping) 또는 균질화를 이용함으로써 제어될 수 있다. 용해 속도를 제어함으로써 반응 용액을 분리할 수 있다. 예를 들어, 구리 산화제를 사용하면, 구리가 풍부한 반응 용액이 생성되지만, 그 용액에는 단백질이 거의 또는 전혀 함유되지 않거나, 또는 단백질은 풍부하지만 구리는 거의 또는 전혀 함유하지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 공정의 제2 단계로부터 생성되는 액체 흐름은 S-술폰화 케라틴 유도체 뿐만 아니라 황산 구리 및 아황산 구리와 같은 잔류 화학 시약도 함유하고 있는데, 이 액체 흐름은, 용액으로부터 시약들을 재활용할 수 있게 하고 또한 정제된 S-술폰화 케라틴 중간 필라멘트 단백질(들)(SIFP : S-sulfonated Keratin Intermediate Filament Protein)과 S-술폰화 케라틴 고 유황 단백질(들)(SHSP : S-sulfonated Keratin High Sulfur Protein)을 별개로 분리할 수 있게 하는 다양한 방법 중 어느 하나 이상의 방법을 사용하여 처리된다. 이 처리는, 에틸렌디아민 테트라아세트산과 같은 킬레이트화제, 또는 이미노디아세트산 관능기를 함유하는 것과 같은 킬레이트 이온 교환 수지를 사용하고, 이어서, 등전(isoelectric) 침전법을 이용하여 단백질을 유형별로 분리함으로써 달성된다. 시약 제거 또는 단백질 분리의 효율을 향상시키기 위해, 공정의 여러 단계에서 한외여과법(ultrafiltration)을 이용할 수 있다. 단백질 생성물 중의 금속 불순물은 단백질 유도체(들)를 침전 후 묽은 산, 물 또는 킬레이트화제로 세정함으로써 더욱 감소될 수 있다. 단백질 생성물은 일단 분리된 후, 유동 상(床)(fluid bed) 건조법, 분무 건조법 또는 동결 건조법과 같은 다양한 방법에 의해 건조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 2단계 아황산분해 공정에 의해 용해되지 않은 잔류 케라틴을 과산화수소, 황화 나트륨 또는 단백질 분해 효소와 같은 다른 시약을 사용하여 더 처리함으로써 케라틴 펩타이드가 제조된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 단백질(들)의 적어도 일부를 수용성으로 하기에 충분한 처리를 천연 단백질 자원에 행한 다음, 수용성 단백질(들)을 분리하는 것을 포함하는, 천연 자원으로부터 단백질을 대규모로 회수하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다량의 천연 단백질 자원을 수용하고 그 자원에 함유된 단백질(들)의 적어도 일부를 수용성으로 하기에 충분한 처리를 상기 단백질 자원에 행하기 위한 처리 용기, 및 상기 수용성 단백질(들)을 분리하기 위한 분리 장치를 포함하는, 천원 자원으로부터 단백질을 대규모로 회수하기 위한 장치가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 단백질들의 혼합물에 산화적 아황산분해 반응을 가하여 가용성 S-술폰화 단백질 분획물을 제조하는 것을 포함하는, 단백질들의 혼합물로부터 다수의 이황화 결합을 갖는 단백질을 선택적으로 가용화하는 방법이 제공된다. 상기 산화적 아황산분해 반응은 단백질의 구조적 완전함에 거의 또는 전혀 손상을 주지 않고 카오트로픽제 없이 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 단백질(들)의 적어도 일부를 수용성으로 하기에 충분한 처리를 단백질 자원에 행한 다음, 카오트로픽제 없이 상기 수용성 단백질(들)을 분리하는 것을 포함하는, 단백질의 구조적 완전함에 거의 또는 전혀 손상을 주지 않고 불순 단백질 자원으로부터 정제된 단백질을 얻는 방법이 제공된다.

도 1은 본 발명에 따른 단백질 추출 방법을 전체적으로 나타내는 흐름도이다.

전체로서 본 발명의 제조 방법을 구성하는 양태들의 조합을 첨부된 도 1에 요약하여 나타낸다.

이 제조 방법은 고도로 술폰화된 케라틴 유도체의 제조를 위한 것으로, 동물의 양모, 모발, 뿔, 발굽, 깃털 또는 비늘과 같은 어떠한 케라틴 원(源)에도 적용될 수 있다. 이 방법을 다른 케라틴 원에 적용하면, 다른 구조 및 특성을 가지는 가용성 케라틴을 제공할 수 있으나, 시스틴이 s-술포시스테인으로 전환되는 용해 공정의 기본적인 단계는 모든 케라틴 함유 재료에 똑같이 잘 적용된다.

이 방법은 2 단계로 행해지는 것으로 생각될 수 있다.

제1 단계는 시스틴을 S-술포시스테인으로 전환하는 것을 포함하고, 산화적 아황산분해의 과정을 통해 행해진다. 이것은, 시스틴을 비대칭으로 쪼개어 시스테인과 S-술포시스테인으로 하는, 아황산 나트륨 또는 메타중아황산(metabisulfite) 나트륨과 같은 술폰화제, 및 술폰화 반응에서 생성된 시스테인을 시스틴으로 전환하는 산화제를 사용하여 달성될 수 있다. 시스틴을 더욱 술폰화함으로써, 모든 시스틴을 S-술포시스테인으로 완전히 전환시킬 수 있다.

사용 가능한 산화제로서는, 테트라티온산 나트륨, 요오도소벤조에이트 및 수산화 쿠프라암모늄을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 사용되는 술폰화제는 0.02M∼0.2M 농도 범위의 아황산 나트륨이고, 사용되는 산화제는 황산 구리와 암모니아의 조합에 의해 얻어지는 0.02M∼0.08M 농도 범위의 수산화 쿠프라암모늄이다. 케라틴을 용해시키는 과정의 제1 단계는, 시스틴을 S-술포시스테인으로 전환시키는 한가지 용액 또는 일련의 용액(액체 대 양모의 비(부피: 중량)가 5: 1 내지 50: 1의 범위 내인)에 케라틴 원을 24시간과 같은 체류 시간 동안 침지하는 것이다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 사용되는 술폰화제는 산성 pH로 유지된 0.1M∼0.5M 농도 범위의 메타중아황산 나트륨이다. 이 실시형태에서는, 양모는 메타중아황산 나트륨을 함유하는 용액으로부터 제거된 후에 0.02M∼0.08M 농도 범위의 쿠프라암모늄 착체를 함유하는 용액에 첨가된다.

산화적 아황산분해 과정을 이용하는 종래의 작업은, 케라틴 원을 팽윤시키고 케라틴의 용해를 용이하게 하기 위해 요소(urea) 또는 염산 구아니디늄과 같은 고농도의 카오트로픽제를 사용할 필요가 있었다. 이러한 과정은 공업적 규모에서는 고가이고 또한 비실용적이다. 산화제로서 구리를 사용하는 산화적 아황산분해를 이용하는 종래의 작업은, 시스틴으로부터 란티오닌(lanthionine)으로의 높은 비율의 전환을 일으키는, 단백질의 완전함에 유해한 온도 및 pH의 조건하에서 행해져 왔다.

본 발명의 방법의 제2 단계는, 카오트로픽제를 사용하지 않고, 단백질의 구조적 완전함을 유지하는 온도 및 pH의 조건하에, 추출 과정에서 유래하는 잔류 화학 시약을 씻어 내어 추출 용액의 이온 강도를 변경하기 위해, 물로 술폰화된 케라틴을 제어하면서 서서히 세정함으로써, 고도로 술폰화된 케라틴을 고체 상태로부터 용액 상태로 전환하는 것을 포함한다. 이들 작용의 조합에 의해, 고도로 술폰화된 케라틴이 고체 상태로부터 수용액으로 전환된다. 바람직한 과정에서는, 반응 용적은 배치(batch)법으로 또는 연속적으로 12∼48시간 마다 교체된다.

용해 속도 및 용해도는 계면활성제의 사용, 열의 작용, 교반, 및 술폰화 케라틴의 균질화에 의해 제어될 수 있다. 본 발명의 특징은 이들 인자를 사용하여 추출 속도를 제어하는데 있다. 따라서, 고도로 S-술폰화된 케라틴은 고체 상태로 유지되고, 술폰화 공정에 사용되는 다량의 화학 시약을 함유하는 추출 용액으로부터 분리될 수 있다. 바람직한 조작에서는, Triton X 100과 같은 비(非)이온 계면활성제를 0.1∼5 중량%로 사용하고, 온도는 15∼50℃로 유지된다.

구리를 기재로 하는 산화제가 사용되는 경우의 본 발명의 이점은, 구리가 풍부한(copper-rich) 추출 용액을 후속의 추출 공정에 재사용하여 본 발명의 방법의 비용 및 환경에 대한 영향을 크게 감소시키는 것이다. 구리가 풍부한 용액의 재사용은 부분적으로는 공기 중에서의 산화(aerial oxidation)를 통한 활성 구리 종(種)의 재생에 의해 가능하다. 구리가 풍부한 용액을 효율적으로 재사용할 수 있는 한가지 방법은 그 용액을 양모에 통과시키는 것이다. 양모는 상기 용액 중의 구리와 결합하고, 이 양모를 이후의 추출 공정에 사용하는 경우 후속 추출 공정에서의 구리의 필요성이 크게 감소된다. 이렇게 하여, "양모 필터"는 구리가 풍부한 추출 용액의 처리에서 필수의 단계로서 사용되어, 후에 유출액을 처리할 필요성과 구리를 후속 공정에 부가할 필요성을 감소시킬 수 있다. 전형적인 과정에서, 제1 단계로부터의 액체 흐름은 약 1800∼1500 (ppm)의 구리를 함유하지만, 양모 필터 통과 후에는 약 400∼300 ppm으로 감소되었다.

본 발명에 따른 방법의 제1 단계 및 공정에 사용하는 시약의 회수를 첨부된 도 1에 나타낸다.

S-술폰화 및 균질화 후, 케라틴 원료는 젤라틴 상태로 팽윤된 섬유성 덩어리로 된다.

본 발명의 또 다른 이점은, 추출 공정에서 사용된 화학 시약 또는 용해하여 있는 케라틴 단백질을 함유하는 용액으로부터, 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체를 고체 상태로 분리하는 것이다. 이 분리는, 미세한 메시(mesh)의 스크린을 통한 느린 중력 여과를 이용하고, 이어서, 여액(濾液)을 미립자로부터 원심분리하는 것에 의해 효율적으로 달성된다.

고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체의 용액은, 이온 교환 매체, 특히 2가 금속 이온에 대해 높은 친화성을 가지는 것으로 알려진 이미노디아세트산 관능성을 가지는 이온 교환 매체를 사용함으로써 금속 이온에 대하여, 구체적으로는 추출 공정의 일부로서 사용되는 구리 이온에 대하여 정제될 수 있다. 이 이온 교환 매체는 단백질 용액이 통과하는 충전된 수지 칼럼(column)의 형태로 제공될 수 있거나, 또는 인가된 전압 및 투석 막을 포함하는 시스템을 사용함으로써 구리를 이온 교환 매체로부터 회수하는 전기화학적 전지의 일부를 형성할 수도 있다.

고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체가 일단 용액으로 되면, 특정의 단백질, 예를 들어, S-술폰화 케라틴 중간 필라멘트 단백질은 황산, 염산, 시트르산 또는 아세트산과 같은 산을 사용하여(황산을 사용하는 것이 바람직하다) pH 4 이하에서 등전 침전법에 의해 용이하게 단리(單離)될 수 있다. 본 발명의 이점은, 등전 침전을 행하기 전에, 상기한 이온 교환 매체를 사용하거나 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트화제를 단백질 용액에 첨가함으로써 구리와 다른 금속 불순물이 단백질에 결합하는 것을 최소로 하는 것이다. 바람직한 실시예에서는, EDTA(0.2M)가 리터 당 25 ml의 비율 또는 용액 분석에 의해 나타내어지는 것과 같은, 용액 중에 존재하는 모든 구리 이온을 격리시키는데 적합한 비율로 제2 단계로부터의 액체 흐름에 첨가된다. 침전에 의해 일단 단리된 단백질을 묽은 산 용액 또는 EDTA와 같은 킬레이트화제의 용액 또는 물로 세정함으로써 금속 불순물을 더욱 감소시킬 수 있다.

침전 및 세정을 행한 후, 분리된 단백질은, 대략 실온의 공기 흐름을 이용하는 건조법을 사용하여, 예를 들어, 유동 상(床) 건조기를 사용하여, 안정한 건조 상태로 단리될 수 있다. 또는, 상기 생성물은 동결 건조기를 사용하여 건조될 수도 있다. 이렇게 건조된 단백질 생성물은 S-술폰산 형태의 시스틴기를 함유하기 때문에, 단백질은 수산화 나트륨 또는 수산화 암모늄과 같은 염기의 존재하에서만 가용성이다. 이들 공정은 첨부된 도 1에 건조로서 나타내어져 있다.

등전 침전을 행한 후 용액에 남아 있는 고도로 가용성의 케라틴 유도체(이는 양모의 경우에는 주로 양모 섬유 내로부터의 고 유황 매트릭스(high sulfur matrix) 단백질이다)는, 잔류 구리 또는 EDTA와 같은 비단백질성 종(種)을 제거하기 위해 한외여과 공정을 행하고, 이어서, 분무 건조를 행함으로써, 용액으로부터 안정한 형태로 단리될 수 있다.

본 발명의 특징은, 등전 침전과 한외여과를 조합하여 사용하고, 이어서, 분무 건조하여, 고도로 S-술폰화된 케라틴을 용액 중의 그들 케라틴의 특성에 따라 분리하는데 있다. 양모 케라틴의 경우, 본 발명의 방법은 저 유황 중간 필라멘트 단백질류를 고 유황 메트릭스 단백질류로부터 효율적으로 분리하고, 상이한 화학 특성을 가지는 2 종류의 생성물 흐름을 제공한다.

본 발명의 특징은, S-술폰산 형태의 케라틴을 염기의 존재하에서 용해하고, 그 결과 얻어진 용액을 분무 건조함으로써, 안정한 수용성 형태의 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체를 제조하는데 있다.

본 발명의 특징은, 연속법, 반연속법 또는 배치(batch)법으로 케라틴을 가용화하고 또한 용액으로부터 S-술폰화 케라틴을 단리하도록 공학적 요소들을 조합하는데 있다. 이러한 공학적 요소들과 단위 조작의 조합이 도 1에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 이점은, 공정의 반응 혼합물 및 유출액 흐름으로부터 구리를 회수 하여 재사용할 수 있다는 것이다. 전기화학적으로 석출되기 전에 EDTA로부터 구리 이온을 분리하기 위해 선택성 투과 막을 사용하는 것을 포함하는 전기화학적 방법을 사용하여 구리를 회수할 수 있다. 또는, 구리 특이적(copper specific) 이온 교환 수지 형태의 고정화 결합제(immobilized binding agent)를 사용하여, 유출액 흐름으로부터 구리를 제거할 수도 있다. 이들 방법을 사용하여 제거된 구리는 재사용될 수 있기 때문에, 본 발명의 방법이 환경에 미치는 영향을 최소로 할 수 있다.

이온 교환 매체 및/또는 킬레이트화제의 사용이 첨부된 도 1에는 정제로서 나타내어져 있다.

본 발명의 또 다른 이점은, 추출 과정 후에 고체 상태로 남아 있는 잔류 케라틴을 더 처리하는 것이다. 이 관능기화된 케라틴은 고도로 S-술폰화되어 있기 때문에, 케라틴을 화학적 공격 및 효소 공격에 대해 저항성으로 하는, 천연 케라틴 중에 존재하는 이황화 결합이 개열(開裂)되어 있어, 그 케라틴은 다른 추출 방법에 의해 용이하게 소화(digest)될 수 있다. 예를 들어, 케라틴 펩타이드가 풍부한 용액은 알칼리성 조건하에서 잔류 케라틴 kg 당 10∼100 ml 농도 범위의 50% 과산화수소와 같은 강력 산화제가 알칼리성 용액의 상기 잔류 케라틴에 작용함으로써 제조될 수 있다. 상기 잔류 케라틴은 약 5%의 고형분을 함유한다. 또는, 0.5%∼15% 농도 범위의 황화 나트륨과 같은 강력 환원제의 용액을 잔류 케라틴에 첨가한 것을 사용하여, 케라틴 펩타이드가 풍부한 용액을 제조할 수도 있다. 또는, 서브틸리신(subtilisin), 파파인(papain) 또는 트립신(trypsin) 그룹의 효소와 같은 단백질 분해 효소를, 케라틴 잔류물 그램 당 효소 1 mg∼20 mg의 범위 내의 레벨로 특이적 효소에 대해 적절한 온도 및 pH 조건에서 사용하여, 잔류 케라틴을 용이히게 소화하고, 케라틴 펩타이드가 풍부한 용액을 제조할 수도 있다. 이들 방법 모두는 이온 교환 매체, pH 조절 및 건조(도 1에는 정제 및 건조로 나타내어짐)를 사용하여 케라틴 펩타이드 고체를 생성하는 상기 제2 단계에서 얻어지는 액체 흐름에 대하여 행하는 방법과 유사한 방법으로 처리될 수 있는 케라틴 펩타이드가 풍부한 용액을 형성할 수 있다. 이러한 잔류 케라틴의 소화에 의해, 공정 전체에서 생성되는 케라틴 폐기물이 최소로 되고, 또한, 케라틴 원에 존재하는 케라틴 단백질의 최대 이용이 보증될 수 있다.

본 발명의 방법으로 얻어지는 2종류의 완전 단백질(intact protein) 생성물은 S-술폰화 케라틴 중간 필라멘트 단백질과 S-술폰화 케라틴 고 유황 단백질이다. 상기 방법으로 전형적으로 제조되는 S-술폰화 케라틴 중간 필라멘트 단백질은 환원/알킬화 과정을 사용하는 도데실황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석법을 이용하여 분석되었다. 그 결과, 분자량 분포는 주로 30∼60kD의 범위 내(중간 필라멘트 단백질)이고, 소성분의 질량이 10kD인 단백질(고 글리신 고 티로신 단백질)을 포함하는 것을 알 수 있었다. 이 생성물의 아미노산 조성이 하기 표 1에 나타내어져 있고, 이것은 양모 케라틴 중간 필라멘트 단백질에 전형적인 조성이다. S-술폰화 케라틴 고 유황 단백질은 환원/알킬화 과정 후 SDS-PAGE 분석법을 이용하여 분석되었다. 그 결과, 분자량 분포는 주로 15∼20kD의 범위 내에 있는 것을 알 수 있었다. 이 생성물의 아미노산 조성이 하기 표 1에 나타내어져 있고, 이것은 양모 케라틴 고 유황 단백질에 전형적인 조성이다.

	Cya	Asp	Glu	Ser	Gly	His	Arg	Thr	Ala	Pro	Tyr	Val	Met	Lan	Ile	Leu	Phe	Lys	Cys
SIFP	0.4	7.9	15.4	10.9	8.1	0.9	7.9	6.5	7.5	5.4	1.1	6.5	0.2	0.2	3.7	8.9	2.5	2.1	4.2
SHSP	1.7	2.6	8.6	14.3	9.1	0.8	6.8	10.4	3.6	12.6	1.8	6.3	0.0	0.2	2.9	3.9	1.5	0.4	12.4
IFP	0.0	9.6	16.9	8.1	5.2	0.6	7.9	4.8	7.7	3.3	2.7	6.4	0.6	0.0	3.8	10.2	2.0	4.1	6.0
HSP	0.0	2.3	7.9	13.2	6.2	0.7	6.2	10.2	2.9	12.6	2.1	5.3	0.0	0.0	2.6	3.4	1.6	0.6	22.1

표 1: S-술폰화 케라틴 중간 필라멘트 단백질(SIFP), S-술폰화 케라틴 고 유황 단백질(SHSP), 중간 필라멘트 단백질(IFP) 및 고 유황 단백질(HSP)의 아미노산 조성(후자의 2개의 단백질은 Gillespie and Marshall, Variability in the proteins of wool and hair, Proc. Sixth Int. Wool Text. Res. Conf., Pretoria, 2, 67-77, 1980 참조). 모든 잔기는 몰%로서 표시되어 있다. S-술포시스테인, 시스틴 및 시스테인은 환원 및 알릴화를 행한 후 S-카르복시메틸 시스테인으로서 측정되었다.

본 발명에 따른 방법의 일례가 첨부된 도 1에 도식적으로 나타내어져 있다. 한외여과는 각 정제 단계에서 가능성이 있는 요소로 고려된다. 주요 요소를 단백질 추출 과정의 하기 실시예들에 의해 예시한다.

실시예:

실시예 1 : 제1 단계, 소화(digestion)

본 발명에 따른 방법의 소화 단계는 산화적 아황산분해를 이용하여 케라틴 원(源) 내의 시스틴을 S-술포시스테인으로 전환하는 것을 포함한다.

실시예 la : 제1 단계, 소화

양모 10 kg으로부터 케라틴을 추출하기 위해, 먼저, 황산구리 5수화물 2 kg을 고전단력 혼합기(high shear mixer)를 사용하여 진한 암모니아 8리터와 혼합하였다. 이 혼합물을 물로 200 L까지 희석하고, 이어서, 양모 10 kg을 첨가하였다. 황산(2M) 약 15리터를, 교반되는 상기 혼합물에 pH가 9.4로 될 때까지 첨가하였다. 무수 황화 나트륨(5.04 kg)을 첨가하고, 이어서, 그 용액을, 모든 시약이 완전히 용해하고 pH가 9.5에서 안정화될 때까지 혼합하였다. 구리 암모니아 착체의 최종 농도는 0.04M이었다. 황화 나트륨은 최종 농도가 0.2M이었다. 소화 용액의 온도는 20℃로 유지하였다. 천천히 24시간 교반한 후, 연화(軟化)된 양모의 섬유상(狀)이고 젤라틴상(狀)의 덩어리를 여과하였다. 얻어진 여액을 새로운 양모 필터로 여과한 바, 용액 중의 구리 농도가 1725 ppm으로부터 130 ppm로 감소되었고, 이어서, Purolite S930 IDA 이온 교환 수지를 사용하여 추가로 정제한 바, 산성 조건하에서 구리 농도가 12 ppm으로 더욱 감소되었다. 신선한 물을 상기 연화된 양모에 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다.

실시예 1b : 제1 단계, 계면활성제를 사용한 소화

실시예 1a의 변형예로서, 비이온성 계면활성제 Triton X 100 1%를 첨가하여 소화 용액을 조제하였다. 이 계면활성제의 첨가에 의해, 양모 섬유로부터의 가용성 단백질의 방출이 지연되었기 때문에, 추출 용액 중의 구리염과 같은 잔류 시약으로부터 단백질이 보다 효율적으로 분리될 수 있었다.

실시예 1c : 제1 단계, 소화

실시예 1a의 변형예로서, 소화 단계를 2부분으로 나누어 행한다. 제1 부분에서는, 양모를 pH 4.2에서 농도 0.2M의 메타중아황산 나트륨으로 전(前)처리한다. 이 용액으로부터 양모를 제거한 후, 양모로부터 잔류 아황산염을 제거하고자 하는 어떠한 시도 없이 그 양모를 실시예 1a에서 기재한 농도 및 pH의 수산화 쿠프라암모늄 용액에 20℃에서 24시간 침지하였다.

실시예 2 : 제2 단계, 추출

실시예 2a : 제2 단계, 배치(batch)식 추출

실시예 1에 기재되어 있는 제1 단계를 완료한 후, 그 혼합물을 16시간 교반한 다음, 균질화하였다. 4시간 더 교반한 후, 고형물과 용액을, 웨지 와이어 스크린(wedge wire screen)과 이것에 이어지는 침강 탱크 및 스피닝(spinning) 디스크 원심분리기를 포함하는 2단 여과법을 이용하여 분리하였다. 그 고체 상(相)을 반응 용기로 복귀시키고, 물을 첨가하여, 원래의 양모 고체 기준으로 최종 액체 대 양모의 비율이 20:1이 되도록 하였다. 24시간 교반 또는 연속 균질화를 행한 후, 얻어진 혼합물을 상기 2단 여과법을 반복하여 분리하였다. 얻어진 고체 상을 추출 용기로 복귀시키고 추가로 희석하였다. 이 사이클을 7∼12회 반복하였다. 가용성 단백질을 함유하는 액체 상을 후술하는 실시예 3에서 설명하는 바와 같이 더 처리하였다.

실시예 2b : 제2 단계, 연속 추출

제1 단계를 완료한 후, 2단 여과 공정을 연속법으로 행하고 또한 고체 및 신선한 물을 반응 탱크의 용적이 24시간에 치환되는 것과 동등한 속도로 반응 탱크에 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 2a에 기재된 대로 혼합물을 처리하였다. 이 과정을 120시간 지속하였다.

실시예 3 : 단백질 용액의 처리

용액을 농축시키고 건조와 이온 교환 공정을 보다 효율적으로 행하기 위해, 단백질 용액 처리 중에 몇몇 시점에 한외여과를 사용할 수 있다. 한외여과는 후술하는 실시예에서 개략적으로 설명하는 임의의 처리 단계 전에 사용할 수도 있다.

실시예 3a : EDTA를 사용한 단백질 용액 처리

실시예 2에 기재되어 있는 바와 같은 제2 단계의 결과로 생성된 용액을 더 처리하여 정제된 가용성 케라틴을 단리하였다. EDTA(0.2M)를 리터 당 25 mL의 비율로 또는 용액 분석에 의해 나타내어지는 용액 중에 존재하는 모든 구리 이온을 격리시키기에 적합한 비율로 액체 상에 첨가하였다. 1시간 혼합한 후, 황산을 사용하여 여액의 pH를 3.5까지 낮추었다.

단백질 침전물을 스크린을 사용하여 단리하고, 묽은 황산과 물을 차례로 사용하여 세정하였다. 단백질인 S-술폰화 케라틴 중간 필라멘트 단백질을 묽은 수산화 나트륨으로 용해한 후 3가지 경로의 건조법, 즉, 동결 건조법, 유동 상(床) 건조법 및 분무 건조법 중 하나의 건조법으로 건조시켰다. 단백질 침전 과정 후의 여액을 한외여과를 이용하여 더 처리하고, 단백질 성분들을 잔류 시약으로부터 분리하였다. 얻어진 보유물(retentate)을 분무 건조시켜, 더 가용성의 단백질인 S-술폰화 케라틴 고 유황 단백질을 단리하였다. 얻어진 투과물(permeate)을 더 처리하여, 이온 교환 매체를 이용하여 유출물 흐름으로부터 구리와 EDTA를 회수하였다.

실시예 3b : 이온 교환 매체를 사용한 단백질 용액 처리

실시예 2에 기재되어 있는 바와 같은 제2 단계의 결과로 생성된 용액을 더 처리하여, 정제된 가용성 케라틴을 단리하였다. 용액으로부터 구리 이온을 제거하기 위해, 액체 상을 이미노디아세트산 관능기를 함유하는 킬레이트 수지 Purolite S930IDA 이온 교환 수지와 같은 이온 교환 수지에 통과시켰다. 이온 교환을 행한 후, 황산을 사용하여 여액의 pH를 3.5까지 낮추고, 실시예 3a에 기재한 바와 동일한 방식으로 더 처리하였다.

실시예 3c : 이온 교환 전에 pH 조절을 사용한 단백질 용액 처리

실시예 2에 기재되어 있는 바와 같은 제2 단계의 결과로 생성된 용액을 더 처리하여, 정제된 가용성 케라틴을 단리하였다. 황산을 사용하여 액체 상의 pH를 3.5까지 낮추었다. 얻어진 단백질 침전물을 스크린을 사용하여 단리하고, 묽은 수산화 나트륨을 사용하여 재용해시키고, 이어서, EDTA를 첨가하거나 이온 교환 칼럼에 통과시킴으로써 더 정제하였다. 이 추가적인 정제 후에, 황산을 사용하여 용액의 pH를 3.5까지 낮추고, 단백질을 상기한 실시예들에 기재되어 있는 바와 같이 단리하였다. 최초의 pH 감소 단계에서 얻어진 여액은 상당량의 가용성 단백질과 다른 시약을 여전히 함유하고 있어, 이 여액을 이온 교환 매체에 통과시켜 정제하고 분무 건조시켜, 더 가용성의 단백질인 S-술폰화 케라틴 고 유황 단백질을 단리하였다.

실시예 4 : 제2 단계로부터의 잔류물의 용해

제2 단계의 결과로서 단리된 고체 흐름을 다양한 방법으로 더 처리하여 케라틴 펩티드를 제조할 수 있다. 잔류물의 술폰화를 고 레벨로 행하면, 화학적 소화나 효소에 의한 소화가 용이하게 행해지게 된다. 이는 화학적 공격이나 효소 공격에 대해 저항성이 있는 원래의 케라틴 원에 존재하는 이황화 결합이 거의 개열(開裂)되었기 때문이다.

실시예 4a : 황화 나트륨을 사용한 잔류물 용해

황화 나트륨 용액(5 중량%)을, 약 5%인 고형분을 함유하고 있는 공정의 제2 단계로부터의 고체 흐름의 동일 부피에 첨가한다. 얻어진 혼합물을 12시간 교반한 후, 고형분을 여과 및 원심분리에 의해 제거하고, 그 단백질 용액에 황산을 첨가하여 pH를 2∼3.5의 범위까지 낮추었다. 침전물을 스크린 상에 수집하고 물로 철저히 세정하였다.

실시예 4b : 과산화수소를 사용한 잔류물 용해

과산화수소(50%)를 케라틴 잔류물 kg 당 25∼30 ml의 레벨로 제2 단계로부터의 고체 흐름에 첨가한다(상기 케라틴 잔류물은 약 5%의 고형분을 함유하고 있다). 이것을 혼합하고, 1M 수산화 나트륨을 첨가하여 pH를 10∼13의 범위로 한다. 그 혼합물을 24시간 천천히 교반하고, 실시예 2에 기재되어 있는 2단 여과법에 의해 단백질과 고형분을 분리하고, 이어서, 실시예 4a에 기재되어 있는 바와 같은 산성화에 의해 단백질을 단리한다. 또 다르게는, 단백질 용액을 이온 교환 수지에 통과시킨 다음, 산성화하고, 침전된 고체를 수집한다. 다음에, 산성화된 용액을 이온 교환 칼럼에 통과시킨 후, 동결 건조 또는 분무 건조를 행하여 단백질이 더욱 풍부한 생성물을 수집할 수 있다.

실시예 4c. 단백질 분해 효소를 사용한 잔류물 용해

공업적 서브틸리신(subtilisin) 효소 제제(활성 효소를 2.5% 함유하는 용액)를 케라틴 잔류물 그램 당 활성 효소 10 mg의 양으로 제2 단계로부터의 고체 흐름에 첨가하였다. 수산화 나트륨을 첨가하여 pH를 9.5로 유지하고, 얻어진 반응물을 2시간에 걸쳐 60℃까지 가열하였다. 생성된 단백질 용액을 고체로부터 단리하고, 실시예 4a에 기재된 바와 같이 처리하거나 또는 실시예 4b에 기재되어 있는 바와 같은 산성화를 행하기 전 및/또는 후에 이온 교환 수지에 통과시켰다.

이와 같이, 본 발명에 의하면, 경제적이고 환경적으로 허용 가능한 가용성 케라틴 유도체 제조방법이 제공된다.

본 발명의 상세한 실시예들을 기재하였으나, 후술하는 청구범위로부터 벗어남이 없이 개량 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (50)

1. 고분자량의 케라틴 유도체를 제조하는 방법으로서, 산화적 아황산분해(oxidative sulfitolysis)에 의해 케라틴 원(源)을 술폰화하는 제1 단계로서의 소화(digestion) 단계와, 가용성 및 불용성 케라틴의 분리와 불용성 케라틴의 재추출을 차례로 행하여, 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체를 제조하는 제2 단계로서의 반복적 수성 추출 단계를 포함하는 케라틴 유도체 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 단계가 카오트로픽제(chaotropic agent)의 사용 없이 행해지는 케라틴 유도체 제조방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제1 단계가 단백질의 구조적 완전함(integrity)을 유지하는 pH 조건하에서 행해지는 케라틴 유도체 제조방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 산화적 아황산분해가 산화제로서의 수산화 쿠프라암모늄 또는 티온산염, 및 아황산염을 사용하는 케라틴 유도체 제조방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 2개의 단계가 계면활성제, 열, 교반 및 균질화 조작을 이용하여 상기 제1 단계에서의 소화 속도 및 상기 제2 단계에서의 추출 속도를 제어하는 케라틴 유도체 제조방법.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 방법이 계면활성제, 열, 교반 및 균질화 조작을 이용하여 잔류 시약 및 가용성 단백질의 방출 속도를 제어함으로써, 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체를 분리하는 케라틴 유도체 제조방법.
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에 의해 제조된 S-술폰화 케라틴의 용액으로부터 젤라틴상(狀) 케라틴 기질(基質)을 분리하는 방법으로서, S-술폰화 케라틴 유도체 용액을 중력 여과 장치를 이용하여 처리한 후 원심분리하는 것을 포함하는, S-술폰화 케라틴 용액으로부터 젤라틴상 케라틴 기질을 분리하는 방법.
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서, S-술폰화 케라틴의 용액이, 금속 이온을 격리시키도록 킬레이트화제를 사용하여 정제되는 케라틴 유도체 제조방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 S-술폰화 케라틴 유도체를 함유하는 용액이, 금속을 포함하는 잔류 시약을 제거하도록 이온 교환 매체를 사용하여 정제되는 케라틴 유도체 제조방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 용액이 한외여과막 또는 유사물을 사용하여 이온 교환 처리를 행하기 전에 농축되는 케라틴 유도체 제조방법.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 잔류 시약이 단리(單離)되어 후속 공정에서 재사용되는 케라틴 유도체 제조방법.
13. 삭제
14. 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체 용액으로부터 고도로 S-술폰화된 케라틴 중간 필라멘트 단백질을 단리(單離)하는 방법으로서, 고도로 S-술폰화된 케라틴 중간 필라멘트 단백질을 산성 pH 하에서 등전 침전법에 의해 단리하는 것을 포함하는, 고도로 S-술폰화된 케라틴 중간 필라멘트 단백질의 단리방법.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 산화적 아황산분해에 의해 케라틴 원(源)을 술폰화하는 제1 단계로서의 소화(digestion) 단계와, 가용성 및 불용성 케라틴의 분리와 불용성 케라틴의 재추출을 차례로 행하여, 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체를 제조하는 제2 단계로서의 반복적 수성 추출 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 고도로 S-술폰화된 케라틴 유도체의 용액으로부터 산성 pH 하에서 등전 침전법에 의해 고도로 S-술폰화된 케라틴 중간 필라멘트 단백질을 단리(單離)하는 것에 의해 중간 필라멘트 단백질을 제거한 후에, 제 9 항에 따라 정제된 S-술폰화 케라틴 유도체의 용액을 분무 건조시키는 것을 포함하는, 고도로 S-술폰화된 케라틴 고 유황 단백질(high sulphur protein)의 제조방법.
19. 삭제
20. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에서 생성되는 젤라틴상(狀) 잔류물에 대하여 과산화수소 용액을 작용시킴으로써 가용성 케라틴 펩티드를 제조하는 방법.
21. 삭제
22. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에서 생성되는 젤라틴상 잔류물에 대하여 황화 나트륨 용액을 작용시킴으로써 가용성 케라틴 펩티드를 제조하는 방법.
23. 삭제
24. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에서 생성되는 젤라틴상 잔류물에 대하여 서브틸리신, 파파인 및 트립신계 효소로 이루어진 군에서 선택된 단백질 분해 효소를 작용시킴으로써 가용성 케라틴 펩티드를 제조하는 방법.
25. 삭제
26. 제 4 항에 따른 방법에서 생성되는 구리가 풍부한 용액을 처리하는 방법으로서, 양모를 필터 매체로서 사용하여, 구리를 결합시켜 상기 용액으로부터 구리를 제거하는 것을 포함하는, 구리가 풍부한 용액의 처리방법.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 구리가 풍부한 용액의 처리에 의해 생성되는 구리 결합 양모를, 단백질 추출 처리를 위해 제 1 항에 따른 방법의 제 1 단계로서의 소화 단계로 재순환시키는, 구리가 풍부한 용액의 처리 방법.
28. 제 9 항에 있어서, 상기 킬레이트화제가 EDTA이고, 상기 금속 이온이 구리인 케라틴 유도체 제조방법.
29. 제 10 항에 있어서, 상기 잔류 시약에 포함된 금속이 구리인 케라틴 유도체 제조방법.
30. 제 12 항에 있어서, 상기 잔류 시약이 구리인 케라틴 유도체 제조방법.
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