CN101087802A - 从原料中分离角蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从含有角蛋白的原料中分离角蛋白的方法，该方法包括以下步骤：将含有角蛋白的原料在液体介质中还原，在角蛋白水解最小化的条件下将角蛋白溶解，生成角蛋白溶液和不溶固体；在不插入任何角蛋白沉淀步骤的情况下，对角蛋白溶液进行过氧化物氧化；以及在氧化步骤之前、同时或之后，将角蛋白溶液与不溶固体分离。进行还原步骤的优选条件包括使含有角蛋白的原料与碱金属硫化物还原剂在25℃至50℃的温度接触30至90分钟，假设在大气压下。过氧化物氧化优选在还原步骤后不超过4小时内进行，包括将溶液的pH值降低至不低于pH为10的水平，尽管最优选pH为11.3。产物被证实具有分子量在10kDa以上的主要部分，反映了角蛋白中的二硫键在蛋白不水解的情况下被破坏。
Description
技术领域
本发明涉及一种从角蛋白原料中分离角蛋白的方法和装置，以及通过该方法得到的角蛋白。
背景技术
本领域公开的多种从含有角蛋白的原料分离角蛋白的方法包括在导致蛋白水解的极端条件下处理含有角蛋白的原料。结果，由这些方法得到的角蛋白的分子量低于原始蛋白(original protein)。Harrap和Woods(Biochem J.902，1964，16)报道了来自羽毛的单体蛋白分子量为10.4kDa。结果，从现有技术方法得到的角蛋白分子量通常低于10.4kDa。
本发明的发明人假设，对于许多潜在应用，需要以使天然分子量降低最少或者保持天然分子量的方式制备蛋白。特别是在预期应用为当需要高分子量时提供聚合材料替代品的情况下。使所分离的蛋白分子量最大也会使后续的蛋白改性的化学可能性最大化。
本领域公开的多种从含有角蛋白的原料分离角蛋白的方法并不适用于放大的工业过程。例如，现有技术中公开的一些方法包括用“干酪包布(cheese cloth)”物理分离。一些方法涉及二氧化硫或硫化氢气体，这样尽管在实验室规模上并不被禁止，然而当放大时就会造成严重的问题。而且，一些方法包括形成凝胶，这在工业规模的方法中是非常难处理的。
因此，需要一种以下述形式从角蛋白原料中分离角蛋白的方法：其提供进一步化学或物理修饰的机会、并且利用对工业规模的处理来说可实施的方法。
发明内容
根据第一方面，提供了一种从含有角蛋白的原料中分离角蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
i.将含有角蛋白的原料在液体介质中还原，在角蛋白水解最小化的条件下将角蛋白溶解，生成角蛋白溶液和不溶固体；
ii.在不插入任何角蛋白沉淀步骤的情况下，对角蛋白溶液进行过氧化物氧化；和
iii.在氧化步骤之前、同时或之后，将角蛋白溶液与不溶固体分离。
上文概述的方法消除了产生硫化氢或二氧化硫的危险。工业过程中产生这些气体是非常成问题的。本发明的各个实施方式提供了相对于现有技术的进一步的优势。
优选还原进行到如下程度：角蛋白中存在的胱氨酸的二硫键被破坏，形成半胱氨酸残基，但是未发生水解。通过在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS-PAGE”)中检测对应于分子量10kDa以上的主要分子量谱带，与已知标准物比较，可以对此进行可视化评价。该谱带反映了步骤i.中溶解的角蛋白中大部分的分子量为10.4kDa或更高。通常，这种电泳结果反映了步骤i.中溶解的角蛋白中至少90％的分子量在该范围内。在角蛋白源自木材的情况下，如果还原进行到胱氨酸残基的二硫键还原成半胱氨酸而角蛋白未发生水解，这对应于步骤i.中溶解的角蛋白中至少90％、典型地至少94％的分子量高于11kDa。
根据第二方面，还提供了一种通过以上列出的方法生产的产品。
根据第三方面，提供了一种从含有角蛋白的原料制造角蛋白的装置，该装置包括：
i.洗涤设备，其用于洗涤含有角蛋白的原材料；
ii.消化器(digestion vessel)，其用于还原含有角蛋白的原料以产生角蛋白溶液和不溶固体；
iii.氧化处理区，其用于氧化角蛋白溶液；
iv.分离设备，其用于将角蛋白溶液与不溶固体分离；
v.超滤设备，其用于除去过量的盐，并浓缩角蛋白溶液；和
vi.输送器，其用于将含有角蛋白的原料或物流通过该装置的各个其它部件从洗涤设备输送至超滤设备。
优选该装置进一步包括：
vii.磨机，其用于在还原之前将含有角蛋白的原材料破碎。
该磨机在装置中适合位于消化器之前。
氧化处理区可以由容器、输送器、消化器或者其它任何角蛋白溶液可以在其中与过氧化物氧化剂接触的设备部件或区域构成。分离设备在装置中位于消化器(在其中产生角蛋白溶液和不溶固体)之后，但是可以位于氧化处理区之前或之后，或者与其结合。
附图说明
图1是说明根据本发明一个优选实施方式从含有角蛋白的原材料中分离角蛋白的方法步骤的示意图。
图2是显示通过该方法得到的角蛋白样品的Tris-Tricine凝胶电泳的照片，从左至右的条带代表精确MW标准物；经氧化的羽毛@30℃；经氧化的羽毛@45℃；经还原的羽毛@30℃；以及多肽标准物。
图3是显示通过该方法得到的角蛋白样品的Tris-HCl 15％凝胶电泳的照片，从左至右的条带(条带1和3为空)为：条带2-标准物，条带4-pH11.3(1∶5)，条带5-pH11.3(1∶10)，条带6-pH10.8(1∶5)，条带7-pH10.8(1∶10)，条带8-pH10.1(1∶5)，条带9-pH(1∶0)，条带10-标准物。
具体实施方式
现在，更详细地说明本发明的优选实施方式。
含有角蛋白的原料
含有角蛋白的原料可以来自任何角蛋白源，包括羽毛、羊毛、毛发、动物的蹄或爪、动物的角、动物的鳞片或任何其它角质表皮原料或上述原料的混合物。一种优选的含有角蛋白的原料来源是羽毛，例如鸡和/或火鸡的羽毛。另一种优选的来源是羊毛。提供至该方法步骤(i)的含有角蛋白的原料可以经受洗涤，并任选地经受破碎过程。下文中更详细地说明这种原材料的制备步骤。
原材料的制备
角质原材料优选地进行洗涤，并任选地破碎成较小的颗粒，以便处于适于经受该方法的还原步骤的形式。在非羽毛原料的情况下，制备有利地包括擦洗和洗涤，以除去外来的杂质、油脂和脂质。在这些原料如羊毛中，破碎通常可以是不必要的，尽管使用短羊毛可能会有实践上或经济上的优势。
根据本发明的一个合适实施方式，角蛋白原料可以用含有适当的表面活性剂的温水洗涤，并用水漂洗。如果不打算在洗涤步骤之后立刻处理角蛋白原料，则可以将其干燥。
在羽毛的情况下，有利地将其洗涤并破碎成更小的碎片，以便有助于在该方法的还原步骤中消化。洗涤可以通过在含有表面活性剂的水中洗涤而进行，如上文所述。之后，根据本发明的一个实施方式，通过剁碎和/或研磨将洗涤过的羽毛破碎。类似地，在还原步骤中的消化之前，还可以通过剁碎或研磨将干羽毛破碎。破碎可以在任何合适的设备中进行，例如屠夫所用类型的剁碎机、或者旋转刀片(如Wiley)磨。破碎使得更大量的角蛋白能够从羽毛原料中被提取出来，但其代价是进行破碎的能量和设备成本。在多数情况下，破碎步骤会是允许的。
还原步骤
根据一个实施方式，含有角蛋白的原料可以是羽毛或羊毛原料，将其在液体介质中还原，使角蛋白溶解。该方法的这一步骤有时也称为“消化”。
还原步骤将含有角蛋白的原料中角蛋白的胱氨酸残基中的二硫键还原成半胱氨酸(含有末端硫醇基团)，将联结的角蛋白链破坏成较小的链。在羽毛角蛋白的情况下，较小的链的长度为大约10.4kDa，尽管可能保留了一些较大的链，但优选大多数产物是10.4kDa的产物(即，正好高于10.0kDa)。在羊毛角蛋白的情况下，有许多种二硫键之间的分子量不同的蛋白。其中的大多数，大约94％以上，大于11kDa。大约6％的蛋白被称为“高Gly/Tyr”蛋白，其分子量为9-13kDa，因此还原蛋白中的非常少的百分比(低于6％)将包括一些分子量为9-11kDa的蛋白。但是，凝胶电泳的直观评价结果反映了主要分子量部分高于10kDa。
还原步骤合适地在使角蛋白水解最少的条件下进行。换句话说，还原条件破坏二硫键，但没有剧烈到使角蛋白水解。参考还原步骤后角蛋白的分子量，可以测量角蛋白的水解程度。如果蛋白产物的分子量低于上述特定角蛋白类型的水平，则还原条件没有做到使角蛋白水解最少。特别是，对于羽毛来说如果多数角蛋白的分子量低于10.4kDa，或者对于羊毛来说如果多数角蛋白的分子量低于10.4kDa(或更具体地说11kDa)(注意，当条件符合要求时，高达6％的羊毛蛋白将在9-13kDa)，则还原条件太过苛刻了。在本发明方法的典型条件下，实施例中所述类型的直观评价表明，产物的主要分子量部分对应于分子量为10.4kDa或更高的产物。该直观评价对应于下述产物：该产物的至少90％、通常为至少95％在该分子量范围内。由于来自所收取羽毛的杂质材料如碎片或翎管中粘附的肉组织和血，产物可能不会100％不含低分子量的物质。
蛋白的大小通常使用所提取的羽毛蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行定性评价，其分子量下限为5kDa。注意到所有提到的分子量评价均基于聚丙烯酰胺凝胶电泳与用于比较的分子量部分已知的标准物比较，其分子量下限为5kDa。对羽毛蛋白产物进行定性PAGE时，观察到对应于10.4kDa的重条带，以及在大约25kDa、35kDa和50kDa的轻条带。在10.4kDa的条带下至5KDa的下限，不能检测到明显的条带。对于羊毛角蛋白产品，条带通常反映了能够被溶解的羊毛的组成角蛋白部分，如下：
| 可溶蛋白部分 | 低硫 | 高硫 | 超高硫 | 高Gly/Tyr |
| 量(％) | 58％ | 18％ | 8％ | 6％ |
| 含硫量(％) | 1.5-2.0 | 4-6 | 8 | 0.5-2.0 |
| 摩尔质量(kDa) | 45-50 | 14-28 | 28 | 9-13 |
参考文献：Wool Science-The Chemical Reactivity of the Wool Fibre.John AMaclaren and Brian Milligan，Science Press(1981)page 13.
为使角蛋白的水解最少，还原时间和温度之间必须达到适当的平衡。以下数字应用于在大气压下进行的还原，如果在压力下进行，相应地应当对时间和温度进行修改。通常，在羽毛角蛋白的情况下，对于反应温度为50℃或更低，还原时间应当为1小时或更少，例如，对于在大气压下持续消化大约45分钟，还原温度适当地为45℃。但是，如果还原温度为25℃或更低，则还原阶段可以进行超过高达1.5小时或更长的一段时间。在羊毛角蛋白的情况下，25℃下还原时间可以是1小时至72小时，温度更低使还原温度能够更长，温度更高使还原时间能够更短。假设在大气压下，对于25℃至50℃的温度，时间适当地为30分钟至1.5小时。
还原阶段可以在空气或含氧气氛中进行，或者另外可选地，可以在减氧(oxygen-reduced)或不含氧的气氛中进行。还原可以在惰性气体气氛如氮气气氛中进行。假设在氮气气氛中还原可以进一步减少角蛋白溶液形成凝胶的倾向。随后的试验表明，凝胶化性质的差异不足以观察得到。
还原剂可以是任何合适的使角蛋白消化同时使其水解最少的还原剂。根据本发明的优选实施方式，还原剂为碱金属硫化物，例如硫化钠或硫化钾。在碱金属硫化物还原剂的情况下，其适当的用量为5克/100升到1,000克/100升，这取决于含有角蛋白的原料(例如羽毛或羊毛)的性质、温度、压力、pH和时间条件。使用来自还原产物的分子量信息作为指标，并结合本文所述的实施例，通过合理的反复试验，可以确定适当的平衡。通常，对于羊毛基角蛋白原料条件将会更剧烈。
优选还原阶段在碱的存在下进行，更优选在碱金属氢氧化物的存在下进行。适当的碱的例子为氢氧化钠和氢氧化钾。
还原阶段中还可以使用其它添加剂。适当的添加剂包括表面活性剂等。在某些情况下，在还原过程中的不同阶段加入表面活性剂(包括阴离子、阳离子和非离子表面活性剂)可以用于改善最终角蛋白产品的特性。
根据一个实施方式，碱的加入量足以将pH调节至12.0-13.5。根据一个优选实施方式，pH被调节至13.0。
将原料从还原容器中排出之后角蛋白的还原将继续发生，除非加入合适的试剂而将还原容器中的还原终止。因此，已经发现需要对后续步骤进行控制，以保证持续的还原不会进行到发生水解的程度。
不溶固体的分离
使用避免过量凝胶形成的技术，通过角蛋白的聚集将角蛋白与不溶固体分离。
对于小规模过程，溶解蛋白与不溶固体的分离可以通过下述方式进行：在离心之后，进行快速真空过滤除去残余的细颗粒物质。但是，根据特别适合于较大规模过程的优选实施方式，使用真空或压力过滤设备。所试验的最适用设备是压滤机，尽管预计其它持续或半持续地在进行分离的进料材料上呈现新鲜过滤表面的过滤器也是可行的。要注意，转鼓过滤机不像压滤机那样适用于该方法。优选类型的压滤机是混合板或全板型膜式压滤机。大量这种类型的过滤器是市售的，例如，在Filters and Filtration Handbook(过滤器和过滤手册)，第三版(1994)Christopher Dickenson，Elsevier Advanced Technology中所述的那些。
如果使用连续倾析式离心机，则需要G力高到足以实现固体与蛋白溶液的高度分离，以避免需要进一步的分离阶段来除去残余原料。
根据一个优选实施方式，分离步骤在溶解角蛋白的聚集之前进行。优选固体的分离在还原步骤之后不超过4小时的时间之内进行。
根据本发明的一个具体实施方式，分离步骤在还原步骤结束后1小时的时间之内开始，且所分离的不溶固体经历第二还原阶段。该第二还原阶段与第一阶段类似，在液体介质中进行，在使角蛋白水解最少的条件下使角蛋白溶解于该液体介质中，从而得到质量与第一阶段中所生成者类似的角蛋白溶液。第二还原阶段的残余固体可以被视作不溶固体废料。
第二还原/消化阶段可以在与第一或初级阶段相同的条件下进行，或者在修改条件下进行，以便在该过程中进一步处理而进一步回收角蛋白。角蛋白的“二级溶液”可以与“初级溶液”合并，或者可以保持分开。使角蛋白二级溶液与初级溶液分开的一个原因是如下事实：来自二级还原/消化的蛋白量和所提取的蛋白的分子量可以是可变的(通常低于初级阶段)。在蛋白的碱消化过程中，特别是在硫化物的存在下，二硫键逐渐转变成羊毛硫氨酸和溶素丙氨酸(lysinoalanine)残基，其不能被额外的还原剂如硫化物切割。
优选如果进行二级还原/消化，则在步骤i的初级还原阶段完成后不超过4小时的时间内进行。如果在进一步消化之前固体在碱性条件下保留4小时以上，羊毛硫氨酸和溶素丙氨酸残基的量对二级收率具有显著影响。
过氧化物氧化
过氧化物氧化步骤可以用任何适当的过氧化物氧化剂进行，例如选自过氧化氢、过氧化钠、过酸、过硼酸钠和过碳酸钠的那些。出于经济原因，优选过氧化氢。过氧化氢通常以溶液形式提供。水溶液的浓度可以变化，但合适地为10％至50％，例如大约30％。
过氧化物氧化步骤有效地终止了含有角蛋白的原料中的角蛋白还原。过氧化物与溶液中残余的还原剂反应或使其淬灭。因此，开始(初级)还原阶段和开始氧化阶段之间的时间优选少于6小时。
过氧化物氧化步骤将半胱氨酸残基中的硫醇键氧化成磺丙氨酸。因此，氧化程度优选足以完全转化成磺丙氨酸。
优选过氧化物的用量将pH降低至不低于10.0，优选不低于10.5，更优选不低于10.8。根据所进行的氨基酸分析的结果，优选用过氧化物将pH降低至大约11.3。
根据本发明的一个实施方式，从还原步骤开始到完成过氧化物氧化步骤之前，角蛋白溶液的pH没有降低至低于pH10，优选11。
根据本发明的优选实施方式，在进行过氧化物氧化步骤之前，溶液中的角蛋白不会沉淀。
固体处理
当从最初的含有角蛋白的原料中提取的角蛋白仍处于溶液中时，残余的不溶固体(“固体废料”)被分离出来。该分离可以在氧化步骤之前、同时、或之后进行。在一个适合的实施方式中，固体在还原之后、氧化之前被分离出来。
这些“不溶固体”可以进行上述的第二还原，或者废弃。
在进行过氧化物还原之前将不溶固体(固体废料)与角蛋白溶液分离的情况下，优选在分离和过氧化物氧化之间不插入其它处理步骤。此外，角蛋白溶液的过氧化物氧化优选在分离步骤完成后不超过1小时的时间之内开始。
为避免任何混淆，要注意此处所称的“固体”并不是沉淀的角蛋白，而是在角蛋白从其中提取出来之后的残余固体。尽管这些固体废料可能含有残余的角蛋白，它们被方便地称作“无角蛋白固体”，因为要进行进一步处理的角蛋白已经从中除去。
可以对固体废料进行处理以除去残余的硫化物、中和、并作为添加剂提供给饲料或废料制造厂。具体地根据包括从羽毛中提取角蛋白的实施方式，将固体在这些用途中再利用以使环境废物最少。根据该实施方式，在消化液氧化之后仅有擦洗洗涤物和盐需要排放到废水处理。
任选的中和
根据本发明的一个实施方式，在过氧化物氧化阶段结束时，将蛋白溶液的pH调节至中性pH或在pH7-10之间，以避免肽键通过碱水解断裂。蛋白溶液的pH可以通过任何适当的酸中和或调节。该酸包括无机酸如盐酸、硫酸、碳酸、硝酸和硼酸，或者有机酸如甲酸、乙酸和乙醇酸。
在某些不会被溶液中残余的盐影响的应用中，这种中和的蛋白溶液可以不经进一步处理而使用。中和的蛋白溶液可以以溶液形式使用，或者可以任选地进行干燥。与未氧化的蛋白相反，干燥的蛋白很容易溶于水。
干燥中和的含盐蛋白溶液的可能技术与下文中在涉及脱盐和浓缩的角蛋白溶液的实施方式中所述者相同。
因此，根据本发明的优选实施方式，该方法还包括以下步骤：
iv.中和经氧化的角蛋白溶液。
脱盐
如上所述，中和的含盐角蛋白溶液在某些应用中可以不经进一步处理使用。但是，根据本发明的优选实施方式，该方法还包括以下步骤：
v.对中和的角蛋白溶液脱盐。
脱盐是指除去在中和阶段中产生的盐。存在的盐取决于中和步骤中使用的碱。
一种尤其适合对角蛋白溶液脱盐的技术是使用超滤技术通过渗滤(diafiltration)脱盐。渗滤有效地将大约1kD到1000kD的蛋白与小肽和盐分离。渗滤使用交叉流超滤膜进行。优选使用3体积或更多倍体积的交换水(pH7)或缓冲溶液除去过量的盐。但是，5体积或更多倍体积的交换水或缓冲液产生纯度更高的产物。目前，正在使用大约10体积的交换。
在渗滤过程中引入纯水或弱缓冲水溶液，以置换起始溶液中的盐。
已经发现，根据本发明的方法产生的氧化蛋白的渗滤以优异的收率进行，且滤膜的阻塞最小。
浓缩
任选对脱盐的角蛋白溶液进行浓缩。
浓缩可以通过任何适当的技术进行。超滤是一种这样的方法。具体地说，可以使用超滤设备将一些水从角蛋白溶液中除去或分离，从而对溶液进行浓缩。
超滤技术
较大规模的超滤设备是可获得的，其用于乳品工业。已经进行了多次尝试，以测定在不堵塞膜或发生蛋白聚集的情况下超滤有效地将大于或等于10.4kDa的角蛋白与盐分离并且使溶液浓缩的能力。通过如上所述地对处理步骤加以控制而实现这一点，其中将过去导致蛋白聚集或沉淀的官能团转化成稳定的官能团。
能够进行所需分离和浓缩的膜柱(membrane cartridge)或膜匣(membrane cassette)可获自多个供应商如Millipore公司。这些膜的极限分子量通常略低于经还原和氧化的角蛋白的水平10.4kDa。本发明所使用膜的通常极限值低于10kDa但高于5kDa。
超滤阶段中的渗滤和浓缩可以连续或半连续、或分批进行。半连续处理特别适合，使得一定量的溶液能够在处理下一批量之前多次通过设备。
任选的角蛋白修饰
在产生脱盐并任选地浓缩的角蛋白溶液之后，可以进行蛋白侧链的加成或修饰，如任意具体应用所要求的那样。因此，根据本发明的一个实施方式，该方法还包括以下步骤：
vi.修饰角蛋白，以产生修饰的角蛋白基产品。
作为例子，可以通过独立或结合地引入羧基、酰胺、羟基、芳基、烷基或芳香性基团而对角蛋白进行化学修饰。根据所做修饰的类型，修饰的角蛋白基产品可以保持可溶于水或基本可溶于水。
任选的干燥
根据本发明的一个实施方式，该方法还包括以固体形式从溶液中回收角蛋白的步骤，例如，通过对经氧化的角蛋白的溶液进行干燥。该干燥步骤合适地在对角蛋白溶液进行脱盐和/或浓缩之后进行。
用于干燥蛋白的合适技术包括冷冻干燥或喷雾干燥。出于经济上的原因，喷雾干燥是优选的方法。但是，大规模冷冻干燥设备是市售的，其可以在24-36小时内处理大约1,000升溶液。由于资金和运行成本，冷冻干燥干燥通常仅用于高附加值的应用。
实施例
实施例1
图1图示说明了根据本发明的一个实施方式的方法。
图1所示的实施方式涉及从羽毛A中提取角蛋白。羽毛A在洗涤设备(1)中洗涤和擦洗以除去血、污物和其它杂质。使用Dose GmbH公司制造的容量为250L的不锈钢滚筒容器作为洗涤设备。然后，将洗涤过的羽毛在磨机(2)中破碎或研磨。所用的磨机是澳大利亚Butcher’sSuppliers Pty Ltd提供的屠夫剁碎机。
然后，将磨碎的羽毛产品转移到消化器(3)中，在该消化器中还原磨碎的羽毛，产生含有角蛋白溶液和不溶固体的产物。消化器是另一种容量为250L的不锈钢转筒。产物混合物被转移至Chemical Plantand Engineering Pty Ltd提供的0.87m2转筒真空过滤器(4)，以便将固体与角蛋白溶液分离。该设备后来在装配(assembly)中已经被压滤机代替。压滤机是例如意大利Diemme公司提供的膜式压滤机。固体收集在容器(5)中，并且经历第二还原/消化阶段。在图1中，箭头表示固体返回到消化器(3)中，但通常返回第二消化/还原的固体被单独处理。
在转筒真空过滤设备(4)(现在被压滤机4a代替)中的固体过滤阶段之后，过滤器中排出的液流在氧化器(6)中经受氧化。氧化器是250L HDPE搅拌槽。
根据图1所示的方法，氧化阶段产物的中和在氧化器(6)中进行。但是，对此进行变化是可以的，中和可以在加工厂的独立容器或区域中进行。
在该步骤之后，在超滤设备(7)中，对(中和)氧化的角蛋白溶液进行渗滤和浓缩。所用超滤设备具有MilliporeTM纤维素滤筒阵列，其分子量极限(MWCO)为5kDa。
如图1中向左的箭头所示，浓缩的角蛋白溶液可以是提取过程的产物(9)。另外可选地，如图1中向右的箭头所示，可以在喷雾干燥设备(8)中对浓缩的角蛋白溶液进行干燥。
该方法可以作为连续法或作为分批法进行。但是，优选连续法。术语“连续”包括半连续。
尽管图1中没有直接描述，在适当的设备如转筒真空过滤设备或优选的压滤机中，对二级消化/还原阶段的产物进行固体过滤。该设备中分离出的固体废料送至废物处理，并用于制造饲料或肥料。
实施例2
以下方法在图1所示的设备和上文所述的设备中进行。
在洗涤设备中，用水和获自Bayer公司的表面活性剂Baymol ATM洗涤和擦洗10kg羽毛。将洗涤过的羽毛在磨机中研磨，并将切碎的产品转移至转筒式混合机中。在转筒式混合机中，将磨碎的羽毛在25℃用320克硫化钠(以100％Na2S计)/100升水的溶液(因此，浓度为3.2克/升)消化。还原混合物的pH用氢氧化钠调节至pH13。
磨碎的羽毛进行45分钟以上的消化。消化之后，产物立即转移到过滤设备中，在其中将固体与含有角蛋白的溶液分离。分离阶段进行1小时以上。
将角蛋白溶液转移至氧化器。在该容器中，向溶液中加入30％过氧化氢，直至pH降低至11.3。
然后，使用正切流过滤针对数倍体积的交换水(pH7)对氧化的溶液进行渗滤，对溶液进行脱盐，pH降低至大约10。使用相同的超滤设备浓缩脱盐的蛋白溶液，生成10％蛋白溶液。蛋白收率为40％。
实施例3
以下方法在图1所示的设备和上文所述的设备中进行，不同之处洗涤之后没有将羊毛在磨机中破碎。
在转筒式混合机中，将擦洗过的羊毛在25℃用100克硫化钠(以100％Na2S计)/20升水(因此，浓度为5克/升)的溶液消化。还原混合物的pH用氢氧化钠调节至pH13。
羊毛进行24小时以上的消化。消化之后，产物立即转移到过滤设备中，在其中将固体与含有角蛋白的溶液分离。分离阶段进行多达60分钟以上。
将角蛋白溶液转移至氧化器。在该容器中，向溶液中加入30％过氧化氢，直至pH降低至11.3。氧化之前未发生沉淀，因为从还原步骤开始到过氧化物氧化步骤完成，pH保持在10以上(实际上在11以上)。
然后使用正切流过滤针对数倍体积的交换水(pH7)对氧化的溶液进行渗滤，对溶液进行脱盐，pH降低至大约10。使用相同的超滤设备浓缩脱盐的蛋白溶液，生成5％蛋白溶液。
对该方案可以进行各种修改。具体地，可以撤去氧化器(6)，并且在同一容器(3)中进行氧化与还原。这将导致设备设置中进一步的后续变化。
实施例4
以下方法在图1所示的设备和上文所述的设备中进行。
在洗涤设备中，用水和获自Bayer公司的表面活性剂Baymol ATM洗涤和擦洗1.5kg羽毛。将洗涤过的羽毛在磨机中研磨，将切碎的产品转移至转筒式混合机中。在转筒式混合机中，将磨碎的羽毛在45℃用65克硫化钠(以100％Na2S计)/15升水的溶液(因此，浓度为4.3克/升)消化。还原混合物的pH用氢氧化钠调节至pH 13。
磨碎的羽毛进行45分钟以上的消化。消化之后，产物立即转移到过滤设备中，在其中将固体与含有角蛋白的溶液分离。分离阶段进行1小时以上。
将角蛋白溶液转移至氧化器。在该容器中，向溶液中加入30％过氧化氢，直至pH降低至11.3。
然后使用正切流过滤针对数倍体积的交换水(pH7)对氧化的溶液进行渗滤，对溶液进行脱盐，pH降低至大约10。使用相同的超滤设备浓缩脱盐的蛋白溶液，生成17％蛋白溶液。蛋白收率为31％。
实施例5
进行多次试验，以优化从含有角蛋白的原料中提取角蛋白的条件，重点是还原温度和氧化步骤的具体pH条件。实施例5a和5b优选用于羽毛优选，而5c和6d优选用于羊毛。条件在所附表格中列出，注意未提及的任何条件或实施例方面均如实施例4所述。
实施例5a
| 羽毛(磨碎)水Na2S(以100％Na2S计)NaOH(50％) | 500g5L16g50ml | 45分钟@30℃ |
| 离心 | 7000rpm，10分钟 | |
| 回收的固体 | 1977.6g@14.03％固体 | 全部消化45％ |
| 真空过滤器 | 回收2800ml蛋白 | |
| 氧化蛋白H2O2(10％) | 至pH11.3285ml | |
| 渗滤器(用1mM EDTA) | 28L | |
| 浓缩蛋白 | 1500ml | |
| 蛋白浓度 | 5.37％ |
实施例5b
| 羽毛(磨碎)水Na2S(以100％Na2S计)NaOH(50％) | 500g5L16g50ml | 45分钟@45℃ |
| 离心 | 7000rpm，10分钟 | |
| 回收的固体 | 1426g@14.45％固体 | 全部消化59％ |
| 真空过滤器 | 回收3300ml蛋白 | |
| 氧化蛋白H2O2(10％) | 至pH11.3300ml | |
| 渗滤器(用1mM EDTA) | 33L | |
| 浓缩蛋白 | 1600ml | |
| 蛋白浓度 | 8.4％ |
实施例5c
| 羊毛(切碎)水Na2S(以100％Na2S计)NaOH(50％) | 300g4L16g50ml | 70分钟@30℃ |
| 离心 | 7000rpm，10分钟 | |
| 回收的固体 | 1253g@10.94％固体 | 全部消化54％ |
| 真空过滤器 | 回收3100ml蛋白 | |
| 氧化蛋白H2O2(10％) | 至pH11.3360ml | |
| 渗滤器(用1mM EDTA) | 31L | |
| 浓缩蛋白 | 1350ml | |
| 蛋白浓度 | 5.16％ |
实施例5d
| 羊毛(切碎)水Na2S(以100％Na2S计)NaOH(50％) | 300g4L16g50ml | 70分钟@45℃ |
| 离心 | 7000rpm，10分钟 | |
| 回收的固体 | 873.5@11.4％固体 | 全部消化67％ |
| 真空过滤器 | 回收3200ml蛋白 | |
| 氧化蛋白H2O2(10％) | 至pH11.3340ml | |
| 渗滤器(用1mM EDTA) | 32L |
| 浓缩蛋白 | 1400ml | |
| 蛋白浓度 | 4.74％ |
对于羊毛和羽毛，结果表明在45℃的较高温度下，所消化的原料量增加了多达14％。表1和表2详细列举了结果。如果温度进一步升高，预计所消化的原料体积也会增加。考虑到放大到工业生产的能量消耗，选择温度为45℃。注意羊毛需要更高的固液比来消化(还原)。对时间和温度条件进行优化时还考虑到避免蛋白水解和实现适当的蛋白分子量。
表1：不同温度下(氧化至pH11.3)所消化的羊毛(300g，70分钟)
| 30℃ | 45℃ | |
| 回收的体积 | 3100ml | 3200ml |
| 所需H2O2(10％) | 360ml | 340ml |
| ％固体消化 | 54％ | 67％ |
表2：不同温度下(氧化至pH11.3)消化的羽毛(500g，45分钟)
| 30℃ | 45℃ | |
| 回收的体积 | 2800ml | 3300ml |
| 所需H2O2(10％) | 285ml | 300ml |
| ％固体消化 | 45％ | 59％ |
进行进一步试验，以评估氧化蛋白的适当条件，对硫醇基团转化成磺基丙氨酸残基进行定量。当氧化蛋白溶液时，需要显著更多的过氧化氢以氧化至更低的pH值。表3和4含有这些试验的数据，并说明了这一点。实施例7中报道的氨基酸分析结果也显示氧化至低于pH11.4是不需要的。
表3：氧化至不同pH(30℃下)下所消化的羊毛(300g，70分钟)
| pH11.3 | pH10.8 | pH10.0 | |
| 回收的体积 | 2300ml | 2000ml | 2000ml |
| 所需H2O2(10％) | 450ml | 200ml | 500ml |
| ％固体消化 | 56％ | 53％ | 53％ |
| 浓缩体积 | 1600ml | 1150ml | 1200ml |
| 蛋白浓度 | 4.38％ | 4.18％ | 3.92％ |
| 产生的蛋白(g) | 70.08 | 48.07 | 47.04 |
表4：不同pH下(30℃下)消化的羽毛(500g，45分钟)
| pH11.3 | pH10.8 | pH10.0 | |
| 回收的体积 | 2000ml | 2000ml | 2000ml |
| 所需H2O2(10％) | 150ml | 200ml | 500ml |
| ％固体消化 | 35％ | - | - |
| 浓缩体积 | 1250ml | 1250ml | 950ml |
| 蛋白浓度 | 5.87％ | 5.33％ | 5.98％ |
| 产生的蛋白(g) | 73.375 | 66.625 | 56.81 |
实施例6
通过SDS-PAGE电泳对从以上各实施例2-5分离的蛋白样品进行分析，以评价所分离的蛋白的分子量。以下列出各样品的结果。
方法：
使用现成的凝胶小型凝胶系统(Ready Gel Mini Gel System)。该技术通过分子量来分离蛋白混合物。与已知样品比较时，可以推测未知蛋白样品的分子量。(更进一步的信息参见Bio-Rad 2004/2005 LifeScience Research Products catalogue中关于SDS-PAGE凝胶方面的内容)。
在含有2-巯基乙醇的还原变性样品缓冲液中制备待分析的蛋白样品。使用两种Bio-Rad预制凝胶Tris-HCl和Tris-Tricine。这些分别精确地确定羊毛和羽毛蛋白的分子量。Tris-HCl 15％预制凝胶用Tris/甘氨酸/SDS缓冲液操作。Tris-Tricine/肽现成凝胶具体用于分离低于10kDa的蛋白。Tris-Tricine 10-20％线性梯度凝胶用Tris-Tricine/SDS缓冲液操作。两种凝胶对羊毛蛋白和羽毛蛋白均具有良好的溶解能力。溶解能力的说明可获自Bio-Rad。
由多肽制备Bio-Rad多肽SDS-PAGE标准物。它们在1.4、3.4、6.5、14.4、16.9和26.6kDa具有低分子量标记。
Precision Plus蛋白标准物是重组蛋白，在10、15、20、25、37、50、75、100、150、250kDa含有10个蛋白标记，包括3个参比带(25、50和75kDa)。
凝胶用Coomassie Brilliant Blue R-250染色30分钟，之后脱色，以显示出分子量谱带。
结果：
Tris-Tricine凝胶在羽毛蛋白的分子量方面产生明显的指征。图5显示了3个氧化的羽毛蛋白样品，其在Tris-Tricine 10-20％梯度凝胶中的分子量在10kDa以上。图2中的5个条带从左至右如下：条带1-精确标准物，条带2-经氧化的羽毛@30℃；条带3-经氧化的羽毛@45℃；条带4-经还原的羽毛@30℃；条带5-多肽标准物。
6.56kDa和10kDa的标准标记表明没有分子量低于10kDa的蛋白。凝胶在大约50kDa处不会表示出一些轻质量谱带。凝胶用精确标准物和多肽标准物运行，其表现略有不同，因此没有精确对齐。这并不会有损于试验样品高于10kDa的清晰谱带。
图3表示了Tris-HCl 15％凝胶中的从羊毛提取的角蛋白的分子量分析结果。有10个条带，条带1和3为空。从左至右的条带如下：条带2一标准物，条带4-pH11.3(1∶5)，条带5-pH11.3(1∶10)，条带6-pH10.8(1∶5)，条带7-pH10.8(1∶10)，条带8-pH0.1(1∶5)，条带9-pH(1∶10)，条带10-标准物。
图3表明羊毛中的低分子量蛋白非常少。文献表明多数羊毛蛋白在15-60kDa的范围内。结果还说明所用的消化和氧化技术不会产生大量分子量低于10kDa的蛋白。
实施例7
进行试验，以优化实施例4中所述方法的氧化步骤的pH，对所提取的蛋白的氨基酸水平进行定量分析，以确认结果。
方法：
使用Waters Alliance HPLC系统，通过Waters proprietary Enpower软件进行控制。采用Waters阳离子交换柱(Wat080002)和如下两种洗脱缓冲液：
缓冲液ApH 2.96[0.2M]Na+
缓冲液BpH 6.50[1.2M]Na+
洗脱温度为65℃。
使用反应温度为125℃的水合茚三酮柱后反应生成通过Waters2487紫外/可见光检测器检测的发色团。一级氨基酸在570nm处检测，二级氨基酸在440nm处检测。使用Enpower软件进行数据采集和计算。
结果：
所有角蛋白均具有大量二硫键(-S-S-)，其必须被破坏以使蛋白溶解。羽毛具有独特的氨基酸组成，甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸的比例非常高。而且它们的组氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸的水平很低。在碱性消化过程中，胱氨酸残基上的二硫键被还原成半胱氨酸。氧化过程防止了半胱氨酸残基重新形成这些二硫键。
对于氧化蛋白的消化条件进行比较，以对胱氨酸硫醇-SH基团向磺丙氨酸残基的转化进行定量。原料羽毛含有100％胱氨酸二硫键。消化和随后氧化至不同pH水平改变了硫醇-SH基团与磺丙氨酸残基的比例。表5中的数据表明，pH11.3是获得最大转化率的最佳pH。在较低的pH下，该比例更接近50∶50，表明重新形成了二硫键。少量的这种情况通常是可接受的，因此在该方法中可以使用较低的pH，但是不低于10.0。不同的温度30℃和45℃对转化率没有影响。
表5：
| 氨基酸 | 原料羽毛％总量 | 羽毛氧化pH10@30℃％总量 | 羽毛氧化pH10.8@30℃％总量 | 羽毛氧化pH11.3@30℃％总量 | 羽毛氧化pH11.3@45℃％总量 |
| 1/2cys(-SH)cysA(-SO3 -) | 7.1710.000 | 4.9473.071 | 4.2663.451 | 0.8435.322 | 0.9914.072 |
如预计的那样，羊毛的结果与此类似并遵照相同的趋势。表6对此进行了详细说明。
表6：
| 氨基酸 | 原料羊毛％总量 | 羊毛氧化pH10@30℃％总量 | 羊毛氧化pH10.8@30℃％总量 | 羊毛氧化pH11.3@30℃％总量 | 羊毛氧化pH11.3@45℃％总量 |
| 1/2cys(-SH)cysA(-SO3 -) | 10.6020.199 | 2.3675.690 | 5.4922.646 | 0.4486.751 | 1.7115.524 |
本领域技术人员将会认识到可以在不偏离本发明精神和范围的情况下对实施例中所述的优选实施方式进行任何改变。
Claims (31)
1.一种从含有角蛋白的原料中分离角蛋白的方法，所述的方法包括以下步骤：
i.将所述的含有角蛋白的原料在液体介质中还原，在角蛋白水解最小化的条件下使角蛋白溶解，生成角蛋白溶液和不溶固体；
ii.在不插入任何角蛋白沉淀步骤的情况下，对所述的角蛋白溶液进行过氧化物氧化；和
iii.在所述的氧化步骤之前、同时或之后，将所述的角蛋白溶液与所述的不溶固体分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的还原破坏角蛋白中的二硫键而不会使蛋白水解。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中对用所述的方法分离的角蛋白进行凝胶电泳试验，与标准物相比，其含有反映出所分离的角蛋白的主要分子量部分在10kDa以上的主要谱带。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述的含有角蛋白的原料是羽毛和/或羊毛。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的含有角蛋白的原料在还原之前被洗涤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的含有角蛋白的原料在还原之前被破碎。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中在大气压下，还原时间为30分钟至1.5小时，且还原温度为25℃至50℃。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述的还原剂包括碱金属硫化物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的碱金属硫化物的用量为5到1000克/100升液体介质。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述的还原在碱的存在下进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的碱的用量将pH值调节到12.0-13.5的范围内。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中所述的分离通过压滤机进行。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中所述的分离步骤在所述的还原步骤之后不超过4小时的时间内进行。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其中在过氧化物氧化之前将角蛋白溶液与所述的不溶固体分离。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在过氧化物氧化之前将所述的角蛋白溶液与所述的不溶固体分离，并且不插入任何处理步骤。
16.根据权利要求1-15中任意一项所述的方法，其中所述的过氧化物氧化剂的形式是浓度为10％到50％的溶液。
17.根据权利要求1-16中任意一项所述的方法，其中所述的过氧化物氧化步骤在所述的还原步骤开始后不超过6小时开始。
18.根据权利要求1-17中任意一项所述的方法，其中所述的过氧化物氧化的程度足以将半胱氨酸残基的硫醇基完全转化成磺丙氨酸。
19.根据权利要求1-18中任意一项所述的方法，其中所述的过氧化物的用量将pH降低至不低于10.0的水平。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的过氧化物的用量将pH降低至大约11.3。
21.根据权利要求1-20中任意一项所述的方法，其中从所述的还原步骤开始到所述的过氧化物氧化步骤结束之前，所述的角蛋白溶液的pH不会降低至低于pH 10。
22.根据权利要求1-21中任意一项所述的方法，所述的方法还包括以下步骤：
iv.对所述的氧化的角蛋白溶液进行中和。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的方法还包括以下步骤：
v.对所述的中和的角蛋白溶液进行脱盐。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的脱盐通过渗滤进行。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述的脱盐的角蛋白溶液进行浓缩。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的浓缩通过超滤进行。
27.根据权利要求22-26中任意一项所述的方法，其中所述的方法还包括以下步骤：
vi.对所述的角蛋白进行修饰，产生修饰的角蛋白基产品。
28.通过根据权利要求1-27中任意一项所述的方法制造的角蛋白产品。
29.一种用于从含有角蛋白的原料生产角蛋白的装置，所述的装置包括：
i.洗涤设备，其用于洗涤含有角蛋白的原材料；
ii.消化器，其用于还原所述的含有角蛋白的原料，产生角蛋白溶液和不溶固体；
iii.氧化处理区，其用于氧化所述的角蛋白溶液；
iv.分离设备，其用于将所述的角蛋白溶液与所述的不溶固体分离；
v.超滤设备，其用于除去过量的盐并浓缩所述的角蛋白溶液；
和
vi.输送器，其用于将含有角蛋白的原料或流通过所述的装置的各个其它部件从所述的洗涤设备输送至所述的超滤设备。
30.根据权利要求29所述的装置，其中所述的装置包括：
vii.磨机，其用于在还原之前将所述的含有角蛋白的原材料破碎。
31.一种基本如本文所述并参考所附实施例和/或附图的方法或装置。
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| EP1809651A4 (en) | 2007-10-24 |
| CA2585342A1 (en) | 2006-04-27 |
| EP1809651A1 (en) | 2007-07-25 |
| US20090209738A1 (en) | 2009-08-20 |
| WO2006042374A1 (en) | 2006-04-27 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20071212 |