JPH0394676A - コラーゲン分解活性を示す酵素複合物およびその単離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、コラーゲン分解活性を示す酵素複合物および
その単離精製方法に関する。以後、消化酵素（コラーゲ
ン分解プロテアーゼ）は効率よくコラーゲンを加水分解
できる前記複合物を示すであろう。

〔従来の技術〕

特異なアミノ酸配列と特異な構造に起因し、種々のコラ
ーゲン亜型はタンパク質分解性攻撃に著しい抵抗を示し
、コラーゲン分解プロテアーゼによって効率よく開裂さ
れるにすぎない。コラーゲンは、動物界に広く分配する
結合組織の主要なタンパク質の一つである。コラーゲン
分解物は、なめし皮および毛皮工業、魚加工業、バイオ
テクノロジー工業および実験室の現場などにおける食品
添加剤および皮膚科学上の調製品の製造、化粧用および
医療用の医薬製剤およびクリームの製造に必要である。

コラゲナーゼは、初代細胞培養調製品の分子生物学およ
び免疫学上の試薬として広く使用されている。一般に、
病源微生物クロストリジウム・エスビー（Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ　ｓｐ．）が伝統的なコラゲナーゼ起源であ
ったが、微生物によるこれらの特殊な酵素の合成レベル
は相当低く、その大規模製造は複雑になる。さらに、微
生物誘導酵素調製品は、病原性および発熱性不純物に起
因する相当な毒性があった。

深海カニの肝膵臓は、コラーゲン分解プロテアーゼを含
むことが知られている（１）。これらの特殊なカニは、
コラーゲン（コラゲナーゼの基’ｊｆ）を含む動物組織
を頻繁に餌とする清掃動物であるので、これらの動物の
肝膵臓におけるコラゲナーゼ活性の存在は予期できない
ことでない。これらの特殊な深海カニは、通常、約２０
０ｍの深度で温度が約Ｏ″Ｃの場所に生存している。

有機溶媒を使用するカニ肝膵臓からのプロテアーゼの抽
出方法は知られている（２．３）。この既知の方法は、
ホモジナイザーを用い−２０゜Ｃの冷アセトンで肝膵臓
組織を破砕し、遠心によりプロテアーゼを含有するペレ
ット画分から脂質を分離し、引き続き−２０℃で冷アセ
トンおよびｎ−ブタノールを用いてペレットを数回連続
的に洗浄することを基礎とする。脂質ならびに部分的に
多糖類およびタンパク賞不純物が除去された採取ペレッ
トは、酸化アルミニウム上で−２０゜Ｃにて真空乾燥さ
れている。前述の方法で精製されたプロテアーゼの比活
性は、基質としてコラーゲンを使用するタンパク質１■
当たり数百マンドル（Ｍａｎｄｌ）単位より大きくない
（４）。（２）に従うプロテアーゼは、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィーを含む数度のクロマトグラフィーエ
程によってさらに精製されている。これらの方法は、い
くつかの短所を有し、その主なものとしてはプロテアー
ゼ精製の初期段階で多量の有機溶媒を使用する必要性が
あること、抽出手順を低温（−２０℃）で行う必要性が
あることならびに得られたプロテアーゼの収量および比
活性が比較的低いことが挙げられる。さらに、耐火およ
び防煽装置の使用ならびに作業員を特別に保護すること
が必要なため、前記方法は酵素の大規模精製にとって許
容できないものと思われる。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、優れたコラーゲン分解酵素活性を有し
、かつ前記短所または欠点を有さない酵素または酵素組
或物の製造にある。

〔課題を解決するための手段〕

前記課題は、水性溶媒のみを使用するカニの肝膵臓から
抽出される消化酵素（プロテアーゼ）複合物によって達
或される。

この発明は、高いコラーゲン分解活性を有する市販のカ
ニに由来する消化酵素ならびにカニ肝膵臓から消化酵素
精製のための簡単で便利な方法を開示する。以下より本
発明を具体的に説明する。

−２０゜Ｃで凍結された肝膵臓は、均質な懸濁液を得る
ために０．　１〜０．５％の無毒性非イオン洗浄剤およ
び金属塩化物のような１種または数種の手ごろな塩を含
有し、イオン強度を調整した適当な冷（約４゜Ｃ）塩水
緩衝液（ｐＨ６．０〜９．５）中でホモジナイザーによ
って破砕される。塩化ナトリウムまた、安価な海水を使
用することができる。調製されたホモジネートの同一温
度下で１５〜３０分間３．０００〜５．　００Ｏｒｐｍ
の遠心がこの後に続けられる。

上部浮遊脂質層およびペレットを廃棄し、消化酵素を含
有する上澄画分を集め、次いでさらに０．４５ミクロン
の細孔サイズを有するメンブランフィルターまたはメン
ブランカセットを使用するミクロフィルトレーションに
よる精製に供される。メンブランフィルターを通過する
溶液が集められる。

目的酵素の収量を増加するために残渣を再懸濁し、同じ
条件のミクロフィルトレーション下で０．　１〜０．２
Ｍの金属塩化物水溶液で洗浄される。最初のメンブラン
フィルター通過液と第二段階のメンプランフィルトレー
ション通過液を合わせ、低分子不純物、着色物および塩
類を除去するために５　ｋＤａ分離のメンブランフィル
ターまたは中空繊維フィルターを介する限外濾過一透析
によってさらに精製される。最終的に精製され、濃縮さ
れそして透析された消化酵素溶液は凍結乾燥または噴霧
乾燥され、次いで０〜４゜Ｃで保存される。

この発明の第一の熊様に従えば、カニが最も人手容易な
肝膵臓の原料であり、この肝膵臓はかって再利用された
ことがなく今までカニ捕獲の廃棄物であった。これらの
カニの肝膵臓重量は２００　ｇまで達し、プロテアーゼ
含有量は湿肝膵臓重量の０．５〜１％に匹敵する。

第二の態様に従えば、高価または危険な有機溶媒が使用
されず、単に水性塩溶液または海水のみが使用されるの
で、製造設備が海岸のカニ肉製造所近くに設置される場
合には原料原価が無視できる。

さらなる態様に従えば、この方法は特有の一連の抽出お
よび精製段階を使用し、個々の独立した段階が実験室お
よび製造装置規模として認められる材料によって実施で
きる。

さらに別の態様に従えば、消化酵素試料は、驚くべきこ
とに純粋な市販のコラゲナーゼより晶かに高いコラーゲ
ン分解活性（子牛皮コラーゲン型Ｉ’ｌｌ■当たり１５
．０００〜２０．０００マンドル単位）を示し、例えば
クロストリジウム誘導の精製コラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ
から購入した）のコラゲナーゼ活性より４〜５倍高い。

さらに、ＦＰＬＣによって分離された消化酵素画分のす
べて（９〜１１）が、コラーゲンの型にかかわらずコラ
ゲナーゼ活性を示す。

微生物コラゲナーゼと対照的に、カニ酵素複合物は標準
的な合威およびタンパクｉｔ基質を開裂することができ
、キモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼ様活
性を有する。

消化酵素は水緩衝液中の貯蔵において相当安定であり、
ｐＨ７．５で基質として子牛皮コラーゲン型■に対して
最大の活性を示す。消化酵素をｐＨ４．０、７．５およ
び９．９で４時間室温にて保管し、次いで適当に希釈し
た後に活性をｐＨ７．５における標準的な条件下で測定
したところ、各試料はそれぞれ初期活性の６０％、１０
０％および８０％を示した。消化酵素は、４２゜Ｃで不
溶性コラーゲン型■に対して最高の活性を示し、そして
４５℃より高い温度で相当低い活性を有し、２〜５ｍＭ
のＣａ〜は本発明のカニ酵素を有意に安定化する。

〔実施例〕

本発明を以下の例によりさらに具体的に説明する。

鼾 −２０℃で凍結されたパラリトデス・カムチャッチカ（
Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ　ｃａｍｔｓｈａｔｉｃａ）
肝膵臓２０ｋｇを、非イオン無毒性洗浄剤トリトン（Ｔ
ｒｉ　ｔｏｎ）　Ｘ　１００を０．　５％とＩＭのＮａ
Ｃ１を含有する０．０５Ｍのトリス緩衝水性液（ｐＨ７
．　５　）　４０１中に入れ、８．　００Ｏｒｐｍにて
ホモジナイザーブレンダーを使用して３０秒間４゜Ｃで
破砕して均質懸濁液を得た。この調製したホモジネート
（約６０ｌ）を３．　２０Ｏｒｐｍで２０分間遠心し、
ペレットと上部浮遊脂質層を廃棄した。消化酵素を含有
する約５０４２の上澄液を人口圧および出口圧それぞれ
ｌおよび０．　４気圧で流速５８０ｍｆ／分によって２
時間適当な装置ｒＰｒｏｓｔａＪ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
の商標Ｆｒａｎｃｅ）を使用し、細孔サイズ０．４５ミ
ク，ロンのメンブランフィルターを介してミクロフィル
トレーションした。濃厚粘性懸濁液（容量約ｌ５Ｎ）を
、その容量を約１５１の一定に維持維持しながら塩化ナ
トリウムＩＭ水溶液約８０２で同じ条件にてさらに洗浄
した。この洗浄は前記メンプランを通過するタンパク質
の通過物が認められなくなったとき終了した。洗液中の
含有タンパク質を、標準的タンパク質検出方法例えばＵ
Ｖ分光器を使用して測定した。ミクロフィルトレーショ
ンの第一および第二段階におけるメンプラン通過消化酵
素液（約１００ｆｆｉ）を一緒に合わせ、５　ｋＤａ分
離メンブランフィルターまたはカセットを装備した適当
な限外濾過装置（例えば、ｒ　Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　Ｊ　
、旧１１ｉｐｏｒ，ＦｒａｎｃｅｓまたはｒＲｏｍｉｃ
ｏｎ」、Ａｍｉｃｏｎ．Ｈｏｌｌａｎｄ）を使用し、入
口圧および出口圧それぞれ１およびＯ気圧で流速３００
〜４８０ｄ／分により約３倍に濃縮した。濃縮された消
化酵素液の容量が約３０１に達したとき、塩化ナトリウ
ムＩＭ水溶液８０ｌを加え、洗液の着色物が認められな
くなるまで一定容量（約３０ｌ）を維持しながら濃縮透
析を行った。

次に、限外濾過一透析の同じ条件下で蒸留水１００ｌを
加えて消化酵素液から塩類を除去した。最後に、この消
化酵素液を３０１から９ｉ容撥まで濃縮し、１５時間凍
結乾燥した。凍結乾燥固体調製品（１８０ｇ）を集め、
０〜４゜Ｃにて冷蔵庫で保存した。

精製された消化酵素の比活性は、タンパク質１　ｍｇ当
たり１１　，　０００マンドル単位（４）であり、固形
分中のタンパク質含有量は９０％を越えていた。

園主 緩衝液１２０ｌ中で均質化したチオノエステス・オピリ
オ（Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ　ｏＨ旦ｉｏ）　４０ｋ
ｇを使用する以外は例１と同様にすべての段階を実施し
た。

最終的にタンパク質１■当たり８，３００マンドル単位
（４）の比活性を有し、固形分中のタンパク質含有量が
９０％を越える凍結乾燥粉末３７５ｇを得た。

斑主 単離のために非イオン無毒性洗浄剤である０．　５％ト
リトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　１００とｌＭに対応する
塩化ナトリウムを含有する０．０５Ｍの適当なトリス緩
衝液（ｐＦｌ６．０）を使用する以外は例ｌと同様にす
べての段階を実施した。この精製消化酵素の比活性はタ
ンパク質１■当たり７，３００マンドル単位（４）であ
った。

廻工 単離のために０．５％洗浄剤とＩＭの塩化物を含有する
０．０５Ｍの適当な緩衝液（ｐＨ９．５）を使用する以
外は例ｌと同様にすべての段階を実施した。

この精製された消化酵素の比活性は、タンパク質ｌ　ｍ
ｇ当たり６．２００マンドル単位（４）であった。

班工 単離のために０．　１％の非イオン無毒性洗浄剤とＩＭ
の塩化物を含有する０．０５Ｍの緩衝液をｐＨ７．２で
使用する以外は例１と同様にすべての段階を実施した。

この精製された消化酵素はタンパク質１ｍｇ当たり３．
３００マンドル単位（４）であった。

班ｉ 脱塩および着色物質の除去を行わなかったこと以外は例
ｌと同様にすべての段階を実施した。限外濾過濃厚液を
、ｒＢｉｏｇｅｌ　Ｇ−５０Ｊ　（Ｐｈａｒｏ＋ａｃｉ
ａの商標、Ｓｗｅｄｅｎ）または広範囲の細孔を有する
前記キャリャーの類似物もしくはイオン交換キャリャー
のいずれかによってクロマトグラフィーにかけた。この
精製された消化酵素の比活性は、タンパク質１■当たり
１０．　０００〜２５．０００マンドルの範囲内であっ
た。

老ＬＬ 消化酵素から個々のコラーゲン分解プロテアーゼの精製
物は、０．１ＭのＮａＣ１およびｌｍＭのＣａＣ　１．
　２を含有する５０ｍＭのトリスーＨ（Ｊ緩衝液（ｐＨ
７．　５　）によるセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
）　Ｇ−７５カラムクロマトグラフィ−（１００　Ｘ　
２．　６　ｃｍ　）で、次いで活性を有する両分を１ｍ
ＭのＣａＣｌ２を含有する１０ｍＭのトリスー１１Ｃ１
緩衝液（ｐＨ８．８）で平衡化したモノ（Ｍｏｎｏ）　
Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，５Ｘ５０ｍｍ）による
ＦＰＬＣによって得られた。これらの個々のプロテアー
ゼは、同し緩衝液におけるＯから０．　５　ＭまでのＮ
ａＣ１直線グラジエントによって分離することができる
、一般に、９〜１１のプロテアーゼ画分として溶離され
た。これらの見かけの分子量はＳＯＳ−ＰＡＧＥ技法に
よって２３〜３６ｋＤａの範囲内にあると推定された。

この電気泳動はＳＤＳの存在下で１２．５％のポリアク
リルアミドゲルによって行われた。消化酵素から単離さ
れた個々のプロテアーゼは、種々のタンパク質基質を開
裂する能力によって相互に区別される。例として第１表
で具体的に説明すると、’　２８ｋＤａ　Ｊのプロテア
ーゼは’　３６ｋＤａ−Ｃ　Ｊのプロテアーゼに比しラ
ット皮膚由来の線維コラーゲン型１に対してより低い活
性を有する。個々のカニプロテアーゼと消化酵素の最も
顕著な特徴は、クロストリジウム酵素に対して抵抗性を
有するウシレンズ力プセルコラーゲン型■を開裂する能
力である。個々のプロテアーゼはまた、例えばＮ−ペン
ゾイルーＬ−アルギニンエチルエステルまたはＮ−ペン
ゾイルーＬ−チロシンエチルエステルのような小さな合
成ペプチド類に対して特異的な活性をも有する。

第上表：任意のタンパク質基質に対する酵素の比活性を
酵素１■当たりの単位で示す 消化酵素 ’　２８ｋＤａ　」　ブｏテ７−セ ’３６ｋＤａ−ＣＪ　　ブＵ５７−ゼ ６６０ ２６４ ３８６ ５１６ ３８４ ４８６ ６３６００　　１８００ ２３２８０　　１０２０ ２５９２０　　１１７０ コラケナーセ　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　１４１
６　　　　　　０　　　　　　　　０コラケナーセＩＩ
　　　　　　　　　　　　　　　１８５４　　　　　　
０　　　　　　　　０〔発明の効果〕 以上より、カニの肝膵臓は未同定の特性を有するセリン
プロテアーゼの有用な混合物を含有し、タンパク質基質
に対するそれらの作用の相乗効果が説明できることが明
らかである（個々のプロテアーゼ消化酵素に比しタンパ
ク質に対するより低い活性を示す）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カニの肝膵臓由来の水性溶液から単離されたコラー
   ゲン分解活性を有する酵素複合物。 ２、前記酵素複合物が、α−キモトリプシン、トリプシ
   ンおよびエラスターゼ様活性を有する請求項１記載の酵
   素複合物。 ３、前記酵素複合物が、カニの肝膵臓由来のタンパク質
   加水分解複合成分少なくとも９種を含んでなる請求項２
   記載の酵素複合物。 ４、前記水性溶液が、０．１〜２Ｍの塩、ｐＨ６とｐＨ
   ９．５の間にその溶液を緩衝化する緩衝剤および０．１
   〜０．５％の非イオン無毒性洗浄剤を含んでなる請求項
   ３記載の酵素複合物。 ５、前記水性溶液が、海水を含んでなる請求項４記載の
   酵素複合物。 ６、前記肝膵臓が、市販のカニ類、好ましくはパラリト
   デス・カムチャッティカ（￥Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ
   ￥￥ｃａｍｔｓｈａｔｉｃａ￥）またはチオノエセテス
   ・オピリオ（￥Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ￥￥ｏｐｉｌ
   ｌｉｏ￥）の肝膵臓から選ばれる請求項５記載の酵素複
   合物。 ７、カニ由来のコラーゲン分解活性を有する酵素複合物
   の調製品単離方法において、塩および添加物を含有する
   緩衝化された水性溶液で前記カニの肝膵臓からの抽出な
   らびに膜分離技法を使用する水性溶液中での前記酵素複
   合物の精製を含んでなる方法。 ８、前記膜分離技法が、ミクロフィルトレーションおよ
   び限外濾過法を含んでなる請求項７記載の方法。 ９、前記ミクロフィルトレーションおよび前記限外濾過
   法が中空繊維、メンブランフィルター、メンブランカセ
   ットおよび接線流装置から選ばれる装置を使用して実施
   される請求項８記載の方法。 １０、前記限外濾過法に次いでゲルクロマトグラフィー
   が実施される請求項８記載の方法。 １１、前記肝膵臓が緩衝剤、塩および非イオン無毒性洗
   浄剤を含んでなる水性懸濁液で懸濁され、ペレットおよ
   び脂質層から水性上澄液を分離するために遠心にかけら
   れ、前記上澄液がミクロフィルトレーションされた溶液
   を得るために細孔サイズ０．４５μｍのミクロフィルト
   レーションにかけられ、前記ミクロフィルトレーション
   された溶液が濃厚液を得る目的で５ｋＤａにおける分離
   が得られるフィルターを介する限外濾過にかけられる請
   求項７記載の方法。 １２、前記濃厚液がゲルクロマトグラフィーにかけられ
   る請求項１１記載の方法。 １３、前記濃厚液が透析され、次いで凍結乾燥法および
   噴霧乾燥法から選ばれる技法によって乾燥される請求項
   １１記載の方法。