CN117946250A - 一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法 - Google Patents
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117946250A CN117946250A CN202410076410.8A CN202410076410A CN117946250A CN 117946250 A CN117946250 A CN 117946250A CN 202410076410 A CN202410076410 A CN 202410076410A CN 117946250 A CN117946250 A CN 117946250A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fish skin
- collagen
- tyrosinase
- active peptide
- skin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 241001441722 Takifugu rubripes Species 0.000 title claims abstract description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 117
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 107
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 107
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 105
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 99
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 54
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 45
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 38
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 36
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 28
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 19
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 18
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 13
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 12
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 12
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 11
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 11
- 230000001877 deodorizing effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 claims description 10
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 claims description 9
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 claims description 9
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 claims description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 9
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 9
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 9
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 9
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 9
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 9
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 9
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 8
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 4
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- -1 no Cl - is contained Chemical compound 0.000 claims 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 206010040865 Skin hyperpigmentation Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 abstract 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 8
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 8
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 8
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 5
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCO KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 2
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 241000283007 Cervus nippon Species 0.000 description 1
- 238000001276 Kolmogorov–Smirnov test Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000289581 Macropus sp. Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 101000773110 Pelophylax lessonae Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241000612118 Samolus valerandi Species 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 101710147108 Tyrosinase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000019606 astringent taste Nutrition 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 230000007160 gastrointestinal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000003464 sulfur compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12Y110/03001—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法。该活性肽通过鱼皮处理、脱脂、脱色、除杂蛋白、酸法提取、沉淀胶原蛋白、纯化蛋白、透析、冷冻干燥、酶解、超滤分离、异味脱除的操作步骤制备。制备的红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽具有高抗氧化性、高抗酪氨酸酶活性、无异味，用以预防皮肤过度色素沉着，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于鱼类副产品加工技术领域，具体涉及一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法。
背景技术
红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是养殖河鲀最常见的种类之一，以其高营养价值而闻名，因此具有更大的市场潜力。在生产加工中红鳍东方鲀鱼皮因不能得到充分的利用而被丢弃，造成水产资源的浪费。红鳍东方鲀鱼皮富含I型纤维胶原蛋白，可以作为一种取代哺乳动物合适的胶原蛋白来源。
近年，国内外对于鱼类胶原蛋白肽的研究逐渐增加，胶原蛋白作为皮肤的主要成分结构，其产量以每年1％的速度递减，胶原蛋白流失易引发视力下降、骨质疏松、关节疼痛、肠胃功能紊乱等严重问题。但是，胶原蛋白因其独特的三螺旋结构，一般的加工工艺无法使其被人体直接吸收利用。通过生物或化学降解等途径将其转化为生物适应性强、利用率高的生物活性小分子是当前利用胶原蛋白的有效途径。
酪氨酸酶通过氧化作用加速酪氨酸生成黑色素，过多的黑色素沉积易引发老年斑、雀斑、恶性黑色素瘤等皮肤衰老问题，解决这一问题的有效途径是通过酪氨酸酶抑制剂阻断酶促反应抑制黑色素生成。同时，氧化酶数量的减少是机体衰老和自由基大量堆积的原因，过量的自由基会引发DNA、脂质和蛋白质损伤，因此需要适当摄入抗氧化剂保护机体。来自天然蛋白资源的酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂具有安全性高、易吸收、毒副作用小且可长期使用等优点。红鳍东方鲀鱼皮作为一种产量高、成本低的水产加工副产物，是优质的天然蛋白资源。以抗酪氨酸酶活性肽作为主题进行搜索，目前已知的研究报道多与植物提取物(芦笋、滨海白首乌、芒果和竹子)有关，且大部分文章中的活性肽(袋鼠皮蛋白肽和梅花鹿皮胶原肽)往往只测定抗酪氨酸酶活性这一个反应指标。目前，关于从红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白水解物中评估抗酪氨酸酶活性方面的研究鲜见报道，其胶原肽的其它相关生物活性也未得到表征。因此充分利用红鳍东方鲀鱼皮资源，最大限度地提高其产品附加值，为红鳍东方鲀的精深加工提供新思路和技术支持，进一步满足市场需求和促进红鳍东方鲀产业的发展有着重要意义。
海洋鱼类的蛋白酶解物具有异味，异味往往很难让人接受，在一定程度上可能影响其在食品中的应用。臭味来源于河鲀鱼本身，苦味不是游离氨基酸引起而是由多肽引起的，苦味与肽中疏水性氨基酸的组分、序列和所处位置有关。现在对于多肽异味的脱除也逐渐成为研究的热点。以便在食品中应用水解蛋白中的生物活性肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法。
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在4-6℃条件下，加入鱼皮质量8-12倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；
(3)酸法提取：加入鱼皮质量45-55倍质量的冰醋酸溶液，在2-6℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于4-6℃下搅拌处理20-30h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取1-3次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为0.5-1.2mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析1-3次，得到胶原蛋白酸溶液；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析2-5天，每隔4-8小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入蛋白酶进行酶解；在85-100℃水浴下灭酶5-15min，得到酶解液；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末。
步骤(2)所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为5-15％；所述NaOH溶液的浓度为0.05-0.15mol/L。
步骤(3)所述冰醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L，所述溶胀时间为6-10h，所述离心的转速为8000 -12000rpm，时间为10-20min。
步骤(4)添加NaCl得到浓度为0.8mol/L的盐溶液，所述离心的温度为2-6℃，转速为8000-12000rpm，时间为8-12min。
步骤(5)所述冰醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L，所述离心的温度为2-6℃，转速为8000-12000rpm，时间为8-12min。
步骤(6)中所述的透析采用截留分子量为8-10kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析1-2d再用超纯水透析1-3d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃。
步骤(7)中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶Ⅱ型、中性蛋白酶或胰蛋白酶；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为2.5-3.0g/100mL、酶解时间7-9h、酶添加量7000-9000U/g。
步骤(8)中所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽。
步骤(9)中所述的异味脱除剂为活性炭、酵母、羧甲基壳聚糖、β-环状糊精中的一种或几种；处理条件为：滤过液中加入1-5％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至35-45℃后反应0.5-2h。
所述红鳍东方鲀鱼皮活性肽在制备抗酪氨酸酶的制剂中的应用。
本发明的有益效果：本发明制备了脱味红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽，为大量酶解制备红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶抑制肽提供工艺参考，制备高抗氧化性、高抗酪氨酸酶活性的无异味胶原肽产品，用以预防皮肤过度色素沉着，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白的肉眼观察图和扫描电镜图；
图中，a:冻干样品、b:×200、c:×500。
图2实施例1、对比例3和对比例4制备的红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽电子鼻数据；
图中，A-雷达图、B-显著性分析、C-主成分分析。
图3实施例1、对比例3和对比例4制备的红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽电子鼻数据；
图中，A-雷达图、B-显著性分析、C-主成分分析。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下述实施例采用的试剂见表1：
表1
实施例1
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块(5mm×5mm)，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在5℃条件下，加入鱼皮质量10倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为10％；所述NaOH溶液的浓度为0.01mol/L；
(3)酸法提取：加入鱼皮质量50倍质量的冰醋酸溶液，在4℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于5℃下搅拌处理24h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取2次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述溶胀时间为8h，所述离心的转速为10000rpm，时间为15min；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为0.8mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析2次，得到胶原蛋白酸溶液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析3天，每隔6小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；所述的透析采用截留分子量为8kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析2d再用超纯水透析2d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入中性蛋白酶和胶原酶Ⅱ型进行酶解；在90℃水浴下灭酶10min，得到酶解液；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为2.8g/100mL、酶解时间8h、中性蛋白酶添加量5000U/g，胶原酶Ⅱ型添加量2500U/g；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽；
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末；所述的异味脱除剂为羧甲基壳聚糖和β-环状糊精按照质量比1：1的复合异味脱除剂；处理条件为：滤过液中加入3％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至40℃后反应1h。
实施例2
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块(5mm×5mm)，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在4℃条件下，加入鱼皮质量8倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为6％；所述NaOH溶液的浓度为0.08mol/L；
(3)酸法提取：加入鱼皮质量45倍质量的冰醋酸溶液，在2℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于4℃下搅拌处理30h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取1次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.3mol/L，所述溶胀时间为10h，所述离心的转速为8000rpm，时间为20min；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为0.5mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；所述离心的温度为2℃，转速为8000rpm，时间为12min；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析1次，得到胶原蛋白酸溶液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.3mol/L，所述离心的温度为2℃，转速为8000rpm，时间为12min；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析2天，每隔4小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；所述的透析采用截留分子量为8kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析1d再用超纯水透析1d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入蛋白酶进行酶解；在85-100℃水浴下灭酶5-15分钟，得到酶解液；所述的蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为2.5g/100mL、酶解时间7h、碱性蛋白酶添加量5000U/g、木瓜蛋白酶添加量2000U/g；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽；
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末；所述的异味脱除剂为活性炭和β-环状糊精按照质量比1：1混合的复合异味脱除剂；处理条件为：滤过液中加入2％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至35℃后反应2h。
实施例3
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块(5mm×5mm)，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在6℃条件下，加入鱼皮质量12倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为15％；所述NaOH溶液的浓度为0.15mol/L
(3)酸法提取：加入鱼皮质量55倍质量的冰醋酸溶液，在6℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于6℃下搅拌处理20h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取3次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.7mol/L，所述溶胀时间为6h，所述离心的转速为12000rpm，时间为10min；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为1.0mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；所述离心的温度为6℃，转速为12000rpm，时间为8min；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析3次，得到胶原蛋白酸溶液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.7mol/L，所述离心的温度为6℃，转速为12000rpm，时间为8min；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析5天，每隔8小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；所述的透析采用截留分子量为10kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析2d再用超纯水透析3d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入蛋白酶进行酶解；在100℃水浴下灭酶5分钟，得到酶解液；所述的蛋白酶为中性蛋白酶和胰蛋白酶；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为3.0g/100mL、酶解时间9h、中性蛋白酶添加量5000U/g、胰蛋白酶添加量4000U/g；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末；所述的异味脱除剂为活性炭和酵母按照质量比1：1混合的复合异味脱除剂；处理条件为：滤过液中加入5％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至45℃后反应0.5h。
对比例1
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块(5mm×5mm)，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在5℃条件下，加入鱼皮质量10倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为10％；所述NaOH溶液的浓度为0.01mol/L；
(3)酸法提取：加入鱼皮质量50倍质量的冰醋酸溶液，在4℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于5℃下搅拌处理24h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取2次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述溶胀时间为8h，所述离心的转速为10000rpm，时间为15min；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为0.8mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析2次，得到胶原蛋白酸溶液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析3天，每隔6小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；所述的透析采用截留分子量为8kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析2d再用超纯水透析2d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入中性蛋白酶进行酶解；在90℃水浴下灭酶10min，得到酶解液；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为2.8g/100mL、酶解时间8h、中性蛋白酶添加量7500U/g；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽；
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末；所述的异味脱除剂为羧甲基壳聚糖和β-环状糊精按照质量比1：1的复合异味脱除剂；处理条件为：滤过液中加入3％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至40℃后反应1h。
对比例2
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块(5mm×5mm)，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在5℃条件下，加入鱼皮质量10倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为10％；所述NaOH溶液的浓度为0.01mol/L；
(3)酸法提取：加入鱼皮质量50倍质量的冰醋酸溶液，在4℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于5℃下搅拌处理24h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取2次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述溶胀时间为8h，所述离心的转速为10000rpm，时间为15min；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为0.8mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析2次，得到胶原蛋白酸溶液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析3天，每隔6小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；所述的透析采用截留分子量为8kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析2d再用超纯水透析2d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入胶原酶Ⅱ型进行酶解；在90℃水浴下灭酶10min，得到酶解液；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为2.8g/100mL、酶解时间8h、胶原酶Ⅱ型添加量7500U/g；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽；
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末；所述的异味脱除剂为羧甲基壳聚糖和β-环状糊精按照质量比1：1的复合异味脱除剂；处理条件为：滤过液中加入3％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至40℃后反应1h。
对比例3
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块(5mm×5mm)，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在5℃条件下，加入鱼皮质量10倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为10％；所述NaOH溶液的浓度为0.01mol/L；
(3)酸法提取：加入鱼皮质量50倍质量的冰醋酸溶液，在4℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于5℃下搅拌处理24h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取2次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述溶胀时间为8h，所述离心的转速为10000rpm，时间为15min；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为0.8mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析2次，得到胶原蛋白酸溶液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析3天，每隔6小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；所述的透析采用截留分子量为8kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析2d再用超纯水透析2d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入中性蛋白酶和胶原酶Ⅱ型进行酶解；在90℃水浴下灭酶10min，得到酶解液；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为2.8g/100mL、酶解时间8h、中性蛋白酶添加量5000U/g，胶原酶Ⅱ型添加量2500U/g；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽；
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末；所述的异味脱除剂为羧甲基壳聚糖；处理条件为：滤过液中加入3％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至40℃后反应1h。
对比例4
一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块(5mm×5mm)，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在5℃条件下，加入鱼皮质量10倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为10％；所述NaOH溶液的浓度为0.01mol/L；
(3)酸法提取：加入鱼皮质量50倍质量的冰醋酸溶液，在4℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于5℃下搅拌处理24h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取2次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述溶胀时间为8h，所述离心的转速为10000rpm，时间为15min；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为0.8mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析2次，得到胶原蛋白酸溶液；所述冰醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述离心的温度为4℃，转速为10000rpm，时间为10min；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析3天，每隔6小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；所述的透析采用截留分子量为8kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析2d再用超纯水透析2d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入中性蛋白酶和胶原酶Ⅱ型进行酶解；在90℃水浴下灭酶10min，得到酶解液；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为2.8g/100mL、酶解时间8h、中性蛋白酶添加量5000U/g，胶原酶Ⅱ型添加量2500U/g；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽；
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末；所述的异味脱除剂为β-环状糊精；处理条件为：滤过液中加入3％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至40℃后反应1h。
实验例：
以实施例1为研究对象，步骤(6)制得的红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白的肉眼观察图和扫描电镜图如图1所示。
抗酪氨酸酶活性的测定：配制50mmol/mL磷酸盐缓冲液(pH 6.8)作为溶剂。将10μL酶解液(实施例1-3及对比例1-2制备的抗酪氨酸酶活性肽配制为50mg/mL的溶液)用40μL50mmol/mL磷酸盐缓冲液(pH 6.8)和70μL酪氨酸酶(100U/mL)稀释反应10min。在每个孔中加入80μL L-多巴(2mmol/L)，37℃下反应30min。测定λ＝475nm处吸光值。抗酪氨酸酶活性计算公式如下：
式中：Ab为去离子水的吸光度；Ac为由样品和磷酸盐缓冲液组成的混合物的吸光度；Aa为由蒸馏水、缓冲液、酪氨酸酶和L-多巴组成的混合物的吸光度；As为样品反应产生的吸光度。
每组实验平均测定3次，取平均值，采用SPSS24.0软件进行统计学分析，计量资料结果用(均数士标准差)表示，采用Kolmogorov-Smirnov检验法进行数据正态性检验，对于符合正态分布数据，两组间均值差异比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
测定结果见表2：
表2
注：*代表与实施例1组比较P<0.05。
电子鼻测定采用德国Airsense(PEN3)，电子舌测定采用日本Insent公司(SA402B)，测定对象为实施例1、对比例3和对比例4制备的红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽，对比例3和对比例4与实施例1的区别在于实施例1采用羧甲基壳聚糖和β-环状糊精进行异味脱除，对比例3和对比例4分别采用羧甲基壳聚糖、β-环状糊精进行异味脱除，对照(Control)为不进行异味脱除。
测定结果如图2-3所示，电子鼻数据显示，实施例1与对比例3和对比例4相比主要异味物质硫化合物、芳烃化合物等均有显著的降低，电子舌数据显示，实施例1与对比例3和对比例4相比苦涩味显著降低。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)鱼皮处理：将冷冻的鱼皮样品进行解冻、用清水将鱼皮清洗干净，将鱼皮剪成小块，沥干；
(2)脱脂、脱色、除杂蛋白：在4-6℃条件下，加入鱼皮质量8-12倍质量的正丁醇水溶液脱脂，脱脂后的鱼皮用蒸馏水充分洗涤，直至无醇味；然后再用NaOH溶液来脱除杂蛋白和脱色，处理后的鱼皮用蒸馏水洗至中性，沥干；
(3)酸法提取：加入鱼皮质量45-55倍质量的冰醋酸溶液，在2-6℃下进行溶胀，然后使用捣碎机匀浆，于4-6℃下搅拌处理20-30h，离心收集上清，将沉淀的鱼皮继续用上述相同方法重复提取1-3次，混合上清得到红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白提取液；
(4)沉淀胶原蛋白：添加NaCl得到浓度为0.5-1.2mol/L的盐溶液，静置过夜，待出现白色沉淀，离心，得到胶原蛋白沉淀；
(5)纯化蛋白：将胶原蛋白沉淀复溶于冰醋酸溶液中，离心，重复溶解和盐析1-3次，得到胶原蛋白酸溶液；
(6)透析、冷冻干燥：胶原蛋白酸溶液于透析袋中进行除盐，透析2-5天，每隔4-8小时换一次透析液，冷冻干燥，得到鱼皮胶原蛋白；
(7)酶解：用PBS缓冲液与鱼皮胶原蛋白混合，加入蛋白酶进行酶解；在85-100℃水浴下灭酶5-15min，得到酶解液；
(8)超滤分离：将步骤(7)所得酶解液超滤，收集滤液得到抗酪氨酸酶活性强的酶解液；
(9)异味脱除：利用异味脱除剂进行脱腥、脱苦和脱色，过滤，得到异味脱除液；将异味脱除液进行真空冷冻干燥，得到无色无味的抗酪氨酸酶活性肽粉末。
2.根据权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述正丁醇水溶液中正丁醇的体积浓度为5-15％；所述NaOH溶液的浓度为0.05-0.15mol/L。
3.根据权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述冰醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L，所述溶胀时间为6-10h，所述离心的转速为8000-12000rpm，时间为10-20min。
4.根据权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)添加NaCl得到浓度为0.8mol/L的盐溶液，所述离心的温度为2-6℃，转速为8000-12000rpm，时间为8-12min。
5.根据权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述冰醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L，所述离心的温度为2-6℃，转速为8000-12000rpm，时间为8-12min。
6.根据权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的透析采用截留分子量为8-10kDa的透析袋，透析液先用0.5mol/L乙酸溶液透析1-2d再用超纯水透析1-3d，用硝酸银检验透析液中无白色沉淀即不含Cl-，透析结束；所述的冷冻干燥的真空度为20Pa，温度为-50℃。
7.根据权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶Ⅱ型、中性蛋白酶或胰蛋白酶；所述酶解的工艺参数为：鱼皮胶原蛋白的质量浓度为2.5-3.0g/100mL、酶解时间7-9h、酶添加量7000-9000U/g。
8.根据权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(8)中所述酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，收集小于3kDa组分，在-50℃下冻干，得到胶原蛋白抗酪氨酸酶活性肽。
9.根据权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(9)中所述的异味脱除剂为活性炭、酵母、羧甲基壳聚糖、β-环状糊精中的一种或几种；处理条件为：滤过液中加入1-5％的异味脱除剂，在恒温水浴摇床中加热至35-45℃后反应0.5-2h。
10.权利要求1所述红鳍东方鲀鱼皮活性肽在制备抗酪氨酸酶的制剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410076410.8A CN117946250A (zh) | 2024-01-18 | 2024-01-18 | 一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410076410.8A CN117946250A (zh) | 2024-01-18 | 2024-01-18 | 一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117946250A true CN117946250A (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=90800452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410076410.8A Pending CN117946250A (zh) | 2024-01-18 | 2024-01-18 | 一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117946250A (zh) |
-
2024
- 2024-01-18 CN CN202410076410.8A patent/CN117946250A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108998488B (zh) | 一种活性蜂王浆oco多肽冻干粉及其制备方法 | |
| CN103243144B (zh) | 一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其制备方法 | |
| CN102702346B (zh) | 一种从鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白的方法及所得到的产品 | |
| CN106967169B (zh) | 一种鱼胶原蛋白的提取方法 | |
| CN110272485B (zh) | 超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法 | |
| CN112778412B (zh) | 一种低内毒素胶原蛋白的制备方法 | |
| AU2021105562A4 (en) | Preparation Method of Tilapia Protein Peptide with Antioxidant and Antifatigue Activities | |
| WO2007002074A2 (en) | Avian eggshell membrane polypeptide extraction via fermentation process | |
| CN112410392A (zh) | 一种i型胶原蛋白的提取方法及其应用 | |
| JP2000026272A (ja) | 甘い白色ルピンの種子から植物活性成分を抽出する方法、得られた抽出液および該抽出液の少なくとも一部分を用いる組成物 | |
| CN108977488B (zh) | 皮肤密集修复用弹性蛋白及其制备方法 | |
| CN107629122A (zh) | 鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白 | |
| CN117946250A (zh) | 一种红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备方法 | |
| CN115232203A (zh) | 一种提取胶原蛋白的方法 | |
| CN113603768B (zh) | 一种鱼源胶原蛋白的制备方法 | |
| CN107815480A (zh) | 用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取鱼皮胶原蛋白的方法 | |
| CN114573682A (zh) | 一种弹性蛋白肽及其制备方法 | |
| CN107629145B (zh) | 一种林蛙皮透明质酸的提取方法 | |
| KR100844386B1 (ko) | 오징어 콜라겐으로부터 피부주름 억제활성을 갖는펩타이드를 제조하는 방법 및 그 제조물 | |
| CN107653288A (zh) | 用鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取鱼皮胶原蛋白的用途 | |
| CN109943614A (zh) | 一种羊胎盘活性肽的制备方法及其应用 | |
| CN111548433B (zh) | 一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法 | |
| CN114106148B (zh) | 一种鱼皮源医用级非变性胶原及其制备方法 | |
| CN115820779B (zh) | 一种鱼皮胶原蛋白及其制备方法 | |
| CN112646856B (zh) | 一种螺旋藻活性肽的制备方法及其在护肤品中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |