CN115820779B - 一种鱼皮胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鱼皮胶原蛋白及其制备方法，属于海洋生物工程技术领域。所述的制备方法中包括使用复合酶体系进行酶解；所述的复合酶由风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、沙雷肽酶组成；所述的复合酶体系中风味蛋白酶：菠萝蛋白酶：沙雷肽酶的总比活的比值为20‑30：50‑100：120‑360。本发明制备得到的胶原蛋白收率高，自由基清除能力强，具有良好应用前景。

Description

一种鱼皮胶原蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于海洋生物工程技术领域，具体涉及一种鱼皮胶原蛋白及其制备方法。

背景技术

鱼皮胶原蛋白，就是以鱼皮为原料提取的胶原蛋白。深海鱼由于生活环境的低温低压，使其鱼皮胶原蛋白具有着普通的陆生动物胶原蛋白和淡水鱼、浅海鱼胶原蛋白所不具备的特殊性质。

深海鱼皮胶原蛋白具有很好的美容作用，其良好的保水能力使皮肤水润亮泽，还能增加皮肤紧密度，产生皮肤张力，缩小毛孔，使皮肤富有弹性。此外，深海胶原蛋白能有效加速真皮层细胞生长，活化表皮细胞，防止皱纹出现。深海鱼皮胶原蛋白与人体皮肤的蛋白质相似，对皮肤的渗透性强，可透过角质层与皮肤上皮细胞结合，参与和改善皮肤细胞的代谢，使皮肤中的胶原蛋白活性加强。细胞氧化产生游离自由基，促使肌肤的进一步老化，胶原蛋白因具有抗氧化作用，因此也可以起到一定的防护作用。不断开发深海鱼皮胶原蛋白，优化制备提取方法，能够为深海鱼皮胶原蛋白的应用提供更好的基础。

现有技术中对于深海鱼皮胶原蛋白的制备方法包括酶解和发酵等方式，其中酶解由于产物更易纯化而广为应用。现有酶解体系有酸性酶解体系如胃蛋白酶体系、碱性酶解体系如碱性蛋白酶体系。

中国专利申请202110941440.7中公开了一种低免疫原性鱼皮胶原及其制备方法。所述制备方法以鱼皮为原料，经过鱼皮预处理、除杂脱脂、胶原蛋白的粗提及端肽的去除、胶原蛋白的精制及干燥、内毒素灭活等方式得到杂蛋白、脂肪、端肽、内毒素含量明显降低的胶原蛋白。在鱼皮预处理阶段利用过氧化氢、氢氧化钠处理，在一定时间点换液可使鱼皮预处理效果更佳；在提取及进一步脱除免疫原阶段利用乙酸和蛋白酶进行酶切端肽处理，精制冻干得到胶原蛋白成品后通过辐照灭活内毒素。提取方法简单，提取效率较高，得到的胶原蛋白免疫原物质含量低、纯度较高，有效降低胶原蛋白在医用过程中的不良反应，进一步扩大胶原蛋白的应用领域。但其针对的鱼皮类型为巴沙鱼，实际应用于深海鱼时有很多不必要的步骤，条件上也有优化空间。

中国专利申请202110938911.9中公开了了一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，它是以鱼皮为原料，包括：鱼皮预处理、胃蛋白酶提取胶原蛋白、调节等电点、双水相萃取纯化胶原蛋白、碱性蛋白酶酶解成胶原蛋白肽、葡聚糖凝胶分离小分子鱼皮胶原蛋白肽。制得的鱼皮胶原蛋白肽分子量小，纯度高，且无色无味，比大分子多肽更利于人体吸收。但其实际操作时收率较低。

三文鱼又名大马哈鱼、鲑鱼、撒蒙鱼，属硬骨鱼纲、鲑形目、鲑属，主要分布在大西洋与太平洋、北冰洋交界的水域，属于冷水性的高度洄游鱼类。2000米以下深海三文鱼鱼皮制备得到的胶原蛋白，避免了陆地上生物的激素饲养，也没有动物疫情对于鱼肉污染的担忧，其所受到的生物性污染也更小；通过对铅镉汞等重金属的分析检测结果显示：深海三文鱼鱼皮比陆地养生动物所受的化学污染要少得多；同时极寒气候造就了更高的营养价值。三文鱼鱼皮胶原蛋白与人体高度同源，在应用时更安全、更有效。

发明内容

为了解决现有技术中对深海鱼鱼皮胶原蛋白提取方法产率低、得到的产品功效不好等问题，本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白的制备方法，通过优化酶解条件提取三文鱼鱼皮中的胶原蛋白，以期提高产率和胶原蛋白性能。

一方面，本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白的制备方法。

具体地，包括使用复合酶体系进行酶解。

所述的复合酶由风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、沙雷肽酶组成。

所述的复合酶体系中风味蛋白酶：菠萝蛋白酶：沙雷肽酶的总比活的比值为20-30：50-100：120-360。

优选地，所述的比值为24：50：120-270。

进一步优选地，所述的比值为24：50：135-270。

更进一步地，所述的比值为24：50：180-270。

在一些实施例中，所述的比值为24：50：180或24：50：270或24：50：135或24：100：360。

优选地，所述的复合酶用量为600-700U/g，所述的用量为相对于底物鱼皮质量的比活。

所述的底物鱼皮为经过去脂处理的三文鱼鱼皮。

所述的复合酶用量可以是610-690U/g、620-690U/g、620-680U/g、620-650U/g、630-690U/g、640-680U/g、650-690U/g、670-690U/g、680-700U/g、680-690U/g、690-700U/g、645-685U/g或668-692U/g。

优选地，所述的复合酶用量为635-691U/g，可以是635-688U/g、635-656U/g、656-691U/g、656-688U/g或688-691U/g。

在一些实施例中，所述的复合酶用量为635U/g、656U/g、688U/g或691U/g。

具体地，所述的复合酶的缓冲体系为80-120mMNaCl，8-12mMKCl，2-4mMNaH₂PO₄，4-8mMNa₂HPO₄，1-3mM柠檬酸钠，pH6.8-7.2。

优选地，所述的柠檬酸钠添加量为2mM。

优选地，所述的pH为7。

优选地，所述的复合酶的缓冲体系为100-120mMNaCl，10-12mMKCl，2-4mMNaH₂PO₄，4-8mMNa₂HPO₄，2-3mM柠檬酸钠，pH7-7.2。

所述的酶解的反应条件为25-35℃，低速搅拌，反应18-36h。

优选地，所述的酶解的反应条件为30℃，低速搅拌，反应24h。

优选地，所述的制备方法中还包括鱼皮预处理步骤、胶原蛋白盐析步骤和透析纯化步骤。

具体地，所述的制备方法包括以下步骤：

（1）鱼皮预处理；

（2）酶解；

（3）盐析；

（4）透析。

所述的鱼皮预处理包括去除鱼皮以外其他组织或去脂。

所述的去脂为：鱼皮与0.1M氢氧化钠以1：20（w/V）料液比混合，并添加氢氧化钠用量的1/10的20%过氧化氢溶液。浸泡，每隔1h搅拌5-10分钟，4h后全量换液，重复浸泡搅拌操作，再4h后用纯水将处理好的鱼皮清洗至中性。沥干。

所述的酶解后包括离心步骤：8000rpm常温离心20min，保留上清液。

所述的盐析为：加入1M氯化钠进行盐析，静置6h后10000rpm常温离心15min，收集沉淀。

所述的透析为：盐析后的沉淀物复溶于0.5M乙酸溶液，先用0.1M乙酸溶液作为外液进行透析5h，再用超纯水作为外液进行透析5h，得到精制的胶原蛋白溶液。

所述的透析后还包括冻干步骤。

另一方面，本发明提供了前述制备方法制备得到的鱼皮胶原蛋白。

再一方面，本发明提供了前述的鱼皮胶原蛋白在制备食品、日用品、化妆品或药品中的应用。

又一方面，本发明提供了包含前述鱼皮胶原蛋白的制剂。

又一方面，本发明提供了包含前述鱼皮胶原蛋白的食品、日用品、化妆品或药品。

本发明的有益效果：

本发明通过优化鱼皮胶原蛋白制备过程中的酶解反应体系，改变了常规酶解中的酶体系和缓冲体系、酶解条件，制备得到的胶原蛋白收率高，自由基清除能力强，具有良好应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中：

风味蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司，经测定单位比活约为24000U/g。

菠萝蛋白酶购自重庆天润生物制品有限公司，经测定单位比活约为50000U/g。

沙雷肽酶购自山东丰泰生物科技有限公司，经测定单位比活约为90000U/g。

实施例1

（1）取三文鱼鱼皮，去除鱼皮以外其他组织，洗净剪小块，沥干称重以进行后期收率计算。

（2）鱼皮与0.1M氢氧化钠以1：20（w/V）料液比混合，并添加氢氧化钠用量的1/10的20%过氧化氢溶液。浸泡，每隔1h搅拌5-10分钟，4h后全量换液，重复浸泡搅拌操作，再4h后用纯水将处理好的鱼皮清洗至中性。沥干称重以确定加入酶体系用量。

（3）向鱼皮中加入缓冲液和酶，鱼皮与缓冲液的料液比1：10（w/V），加入的蛋白酶总量为鱼皮重量的0.1%。

缓冲液组分为：100mMNaCl，10mMKCl，2mMNaH₂PO₄，8mMNa₂HPO₄，2mM柠檬酸钠，调pH7.2。

蛋白酶中，风味蛋白酶：菠萝蛋白酶：沙雷肽酶质量比为1：1：2。

（4）酶解：30℃，低速搅拌，反应24h。

（5）反应完毕后，8000rpm常温离心20min，保留上清液；

（6）上清液加入1M氯化钠进行盐析，静置6h后10000rpm常温离心15min，收集沉淀。

（7）沉淀复溶于0.5M乙酸溶液，先用用0.1M乙酸溶液作为外液进行透析5h，再用超纯水作为外液进行透析5h，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到胶原蛋白。

统计收率：收率=（冻干胶原蛋白重量/鱼皮重量）×100%。

本实施例的收率为32.2%。

实施例2

与实施例1的区别在于步骤（3）：向鱼皮中加入缓冲液和酶，鱼皮与缓冲液的料液比1：8（w/V），加入的蛋白酶总量为鱼皮重量的0.1%。

缓冲液组分为：100mMNaCl，12mMKCl，4mMNaH₂PO₄，4mMNa₂HPO₄，1mM柠檬酸钠，调pH7.0。

蛋白酶中，风味蛋白酶：菠萝蛋白酶：沙雷肽酶质量比为1：1：3。

本实施例的收率为30.7%。

实施例3

与实施例1的区别在于步骤（3）：向鱼皮中加入缓冲液和酶，鱼皮与缓冲液的料液比1：12（w/V），加入的蛋白酶总量为鱼皮重量的0.11%。

缓冲液组分为：100mMNaCl，8mMKCl，4mMNaH₂PO₄，4mMNa₂HPO₄，2mM柠檬酸钠，调pH7.0。

蛋白酶中，风味蛋白酶：菠萝蛋白酶：沙雷肽酶质量比为2：2：3。

本实施例的收率为31.3%。

实施例4

与实施例1的区别在于步骤（3）：向鱼皮中加入缓冲液和酶，鱼皮与缓冲液的料液比1：10（w/V），加入的蛋白酶总量为鱼皮重量的0.1%。

缓冲液组分为：80mMNaCl，10mMKCl，4mMNaH₂PO₄，4mMNa₂HPO₄，3mM柠檬酸钠，调pH6.8。

蛋白酶中，风味蛋白酶：菠萝蛋白酶：沙雷肽酶质量比为1：1：2。

本实施例的收率为29.8%。

实施例5

与实施例1的区别在于步骤（3）：向鱼皮中加入缓冲液和酶，鱼皮与缓冲液的料液比1：8（w/V），加入的蛋白酶总量为鱼皮重量的0.1%。

缓冲液组分为：80mMNaCl，10mMKCl，4mMNaH₂PO₄，4mMNa₂HPO₄，3mM柠檬酸钠，调pH7.0。

蛋白酶中，风味蛋白酶：菠萝蛋白酶：沙雷肽酶质量比为1：2：4。

本实施例的收率为27.6%。

实验例

对实施例1-5制备的鱼皮胶原蛋白进行DPPH自由基清除能力检测。

参照现有技术中DPPH自由基清除率的检测方法，具体如下：

实验组为取20µL浓度为100μg/mL的样品（纯水），加入60µmol/L 的DPPH 溶液 (以95%乙醇为溶剂)100µL，在室温下密封避光反应60min，然后检测517nm下的吸光度，设置三组平行计算均值记为A1；

对照组1以95%乙醇替代DPPH溶液，测得吸光度记为A2；

对照组2以纯水替代样品溶液，测得吸光度记为A3。

清除率计算公式如下：DPPH清除率=[1–(A1–A2)/A3]×100%；

以维生素C(Vc)作为阳性对照。

各实施例检测结果如下：

实施例	DPPH 清除率/%
		阳性对照/Vc	82.4
实施例1	46.9
		实施例2	48.1
实施例3	44.6
		实施例4	43.8
实施例5	43.5

对比例

参照实施例1设置对比例，实施例1中以鱼皮重量A计算酶的比活，即总体系比活/鱼皮重量A，计算为635U/g，以此为基础设计对比例，确保对比例中该数值与实施例1一致，具体与实施例1的区别如下：

收率统计如下：

对比例	收率/%
		对比例1	14.8
对比例2	16.9
		对比例3	18.4
对比例4	21.5
		对比例5	20.7

DPPH自由基清除能力统计如下：

对比例	DPPH 清除率/%
		对比例1	23.7
对比例2	18.0
		对比例3	26.5
对比例4	31.9
		对比例5	34.2

以上结果表明，本发明的制备方法制备的胶原蛋白性能更优。

Claims (7)

1.一种鱼皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括使用复合酶体系进行酶解；所述的复合酶由风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、沙雷肽酶组成；所述的复合酶体系中风味蛋白酶：菠萝蛋白酶：沙雷肽酶的总比活的比值为20-30：50-100：120-360；

所述的复合酶用量为600-700U/g，所述的用量为相对于底物鱼皮质量的比活；

所述的复合酶的缓冲体系为80-120mM NaCl，8-12mM KCl，2-4mM NaH₂PO₄，4-8mMNa₂HPO₄，1-3mM柠檬酸钠，pH 6.8-7.2；

所述的酶解的反应条件为25-35℃，低速搅拌，反应18-36h；

所述的底物鱼皮为经过去脂处理的三文鱼鱼皮。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的比值为24：50：120-270。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的比值为24：50：180。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的柠檬酸钠添加量为2mM。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的pH为7。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酶解的反应条件为30℃，低速搅拌，反应24h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中还包括鱼皮预处理步骤、胶原蛋白盐析步骤和透析纯化步骤。