CN102933595A - 去端肽胶原及其分离方法、改性去端肽胶原及其制备方法、胶原型基质 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种去端肽胶原的分离方法，其中将利用可重复使用过滤器的超滤过程和渗滤过程组合，从而通过单一程序，通过有效并方便地去除杂质，经济地从动物组织中提取高纯度去端肽胶原。

Description

去端肽胶原及其分离方法、改性去端肽胶原及其制备方法、胶原型基质

技术领域

本发明涉及去端肽胶原的分离方法以及使用该方法制备的高纯度去端肽胶原，特别涉及去端肽胶原的分离方法，其包括以下步骤：通过有效并方便地去除杂质，经济地从动物组织中分离高纯度去端肽胶原，及使用相同的方法制备的高纯度去端肽胶原。

另外，本发明涉及改性去端肽胶原的制备方法，所述改性去端肽胶原溶解于中性溶液中，具有显著的生物相容性，适用于各种制剂且使用方便，以及使用相同方法制备的高纯度改性去端肽胶原。

此外，本发明涉及机械强度提高并具有三维基质结构的胶原型基质，及其制备方法，其包括以下步骤：形成密集层和多孔层，并使用上述去端肽胶原和改性去端肽胶原使上述密集层和多孔层交联。

背景技术

为了使生物功能组织再生，最佳地需要建立使各种细胞能够分化和增殖的培养环境。为此，细胞外基质(ECM)对于维持组织形状及支持细胞生长起着重要作用。

基本上，为了建立人造组织，需要用于提供细胞生长和细胞增殖环境的技术。在人造组织的组织工程领域中，使用诸如胶原或蛋白聚糖的细胞外基质以提供细胞生长的环境，而且添加用于细胞增殖的多种生长因子。

作为人造组织的生物材料，广泛使用天然高分子，其可能包括胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白及类似的细胞外基质。例如，胶原或纤连蛋白含有肽序列，所述序列诱导细胞粘附并包含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（下文中被称为“RGD肽”）。当RGD肽被人工地置于生物材料表面时，其能够在生物材料表面提供产生细胞粘附的环境。因此，RGD肽使生物材料表面与相邻细胞结合以模仿固有组织的功能。

特别地，在使用蛋白质的生物材料领域，据信胶原是上述多种天然高分子中最重要的。原因是胶原几乎存在于生物体的所有组织中且其提供细胞支持和细胞分裂的结构系统。此外，胶原是附着细胞、形成并维持器官和组织，及最终构建生物体的不可缺少的材料。

细胞外基质的主要蛋白成分胶原，主要存在于包括骨骼和牙齿的硬组织中，但也存在于包括皮肤、肌腱和血管的软组织中。在哺乳动物中，胶原约占整体蛋白质的三分之一，且按顺序地组装细胞以形成组织或器官的基本结构。多细胞动物在没有胶原的情况下无法存活。因此，当使生物体内的病变组织恢复成正常组织时，组织的细胞外基质可以赋予病变组织细胞的再生能力。因此，给人造组织替代物的基础基质提供胶原是非常有利的。

存在许多含有胶原的组织，诸如皮肤、韧带、骨骼、血管、羊膜、心包、心瓣膜、胎盘、角膜等，但胶原的种类取决于组织而彼此不同。特别地，I型胶原是组织工程领域中应用最广泛的，因为其存在于几乎所有组织中，包括皮肤、韧带、骨骼等。

另外，I型胶原的两端具有称为端肽的非螺旋结构域。该端肽成为免疫反应的主要原因。事实上，当I型胶原用作药品或化妆品等的原料时，优选使用通过去除端肽的去端肽胶原。

目前，一般的I型胶原的分离方法采用的步骤包括，用胰蛋白酶处理动物组织，分离细胞，然后去除细胞外基质的矿物质和各种蛋白，并使用其固有的极性或酸溶解度去除其他不溶于酸的胶原。通常，在I型胶原的分离过程中，进行沉淀、利用尿素缓冲液的色谱分析、离心等，并用胃蛋白酶处理以去除上述引起免疫反应的端肽。

遗憾地，这些方法中存在许多问题。分离I型胶原的过程并不方便，且因为其需要多步骤处理，消耗了大量时间和成本。此外，为了仅分离I型胶原，在后面的步骤要去除所需的尿素，且在去除端肽后需要去除或灭活胃蛋白酶。也就是说，I型胶原的常规分离方法使分离过程更复杂并困难。而且，很难经济地获得高纯度的I型胶原。

此外，包含胶原的生物材料由于其低强度及生物降解性具有限制。其不能直接应用于人体组织，即使胶原对于治疗损伤是有效的。

针对胶原的这种属性，研究人员已经积极推进了关于使用胶原的人造组织的研究。此外，从动物组织中提取胶原的方法也正在研究中。

关于这些，韩国专利公开号10-0465015已描述了高纯度I型胶原的制备方法，其包括以下步骤：酶处理去除非胶原物质以降低免疫性，用有机溶剂提取脂类杂质和不溶性胶原，并去除脂类杂质和不溶性胶原。然而，韩国专利公开号10-0465015中描述的使用无机溶剂的情况下，当应用于人体时，胶原可能变性，且毒性有机溶剂可能导致人体的不良反应。

另外，在韩国专利公开号10-0676285中，已公开了从猪中分离胶原的方法，其包括以下步骤：将猪的骨组织、软骨组织、皮肤组织、肌腱/腱组织磨碎至粉末或片状，用酸处理，然后用胃蛋白酶重复处理以首先分离I型胶原，重复3次盐处理并滴定至中性3次以去除杂质，在30至37°C的低温下中和，然后离心以使胶原沉淀。韩国专利公开号10-0676285的方法对于防止胶原变性及去除脂类和不溶性物质是有利的，但该方法复杂地包含多次盐处理及滴定至中性状态的步骤，且不足以经济地分离高纯度的I型胶原得到良好产率。

由于这些缺点，据信从动物组织中高产率地分离I型胶原的过程，同时完全去除脂类、蛋白质杂质、各种不溶性杂质、残留的尿素、胃蛋白酶及其他剩余的酶，各种盐类等是非常复杂和困难的技术。与此同时，在韩国专利公开号10-2002-0029859中已公开了去端肽胶原的制备方法，其包括用酸溶液均质化哺乳动物的软组织或硬组织，然后立即酶处理，用典型方法分离并纯化的步骤。即使该方法有利地组合并简化了胶原纯化之前的步骤，其在纯化后面的步骤进行了透析和过滤以提高纯度。

迄今为止，在提取胶原的过程中，已采用几种方法以在首先分离胶原后去除各种杂质而提高纯度，所述方法包括透析、反复数次的过滤，或使用3至4个不同孔径的过滤器重叠过滤。然而，这种透析方法不能有效地提高纯度，因为膜的孔径大小限制在12,000至14,000道尔顿之间。使用3至4个不同孔径的过滤器重叠过滤不能再循环且成本高，因为其消耗一些昂贵的过滤器。

因此，在属于本发明的这个领域，有必要提供一种去端肽胶原的分离方法，其包括以下步骤：通过有效并方便地去除杂质，经济地从动物组织中分离高纯度去端肽胶原。

相应地，为了解决上述常规方法中的上述问题，本发明人提供了胶原的分离方法，其中组合使用可重复使用过滤器的超滤和渗滤，因此，完成了通过单一步骤能高纯度提取胶原的方法。

而且，本发明人开发了一种制备改性去端肽胶原的方法，所述改性去端肽胶原溶解于中性溶液，具有显著的生物相容性，适用于各种制剂且更方便使用。这种方法能使固有胶原不需要任何水解作用直接应用于多种领域，其包括化妆品领域、药品领域和食品领域等，所述水解作用包括胶原的肽解和酶消化。此外，本发明人在上述方法基础上提出了制造多孔基质的方法，其包括以下步骤：形成包含密集层和多孔层（2种胶原层的孔隙率彼此不同）的胶原双层结构，并使密集层和多孔层交联。事实上，本发明的发明人制造了机械强度提高的三维基质结构，并由此解决了低强度和生物降解性的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种去端肽胶原的分离方法，其包括以下步骤：通过有效并方便地去除杂质，经济地从动物组织中分离高纯度去端肽胶原，及使用相同方法制备的高纯度去端肽胶原。

本发明的另一目的在于提供一种改性去端肽胶原的制备方法，该改性去端肽胶原使胶原溶解于中性溶液以改善生物相容性，且适用于各种制剂并更方便使用，及使用相同方法制备的改性去端肽胶原。

本发明的另一目的在于提供一种机械强度提高并具有三维基质结构的胶原型基质，及其制备方法，其包括以下步骤：形成密集层和多孔层(2种胶原层的孔隙率彼此不同)，并使用上述去端肽胶原和改性去端肽胶原使密集层和多孔层交联。

发明详述

首先，下面将详细地解释本说明书中使用的术语。

如本文所使用的，术语“超滤”指的是介于精密过滤和反渗透压法之间的过滤方法，特别是使用由滤膜引起的压差分离和过滤材料，以去除高分子中的小分子的方法。超滤中使用的滤膜孔径大小取决于靶材料，具有各种不同的范围。

如本文所使用的，术语“渗滤”指的是逐渐提高所需材料的比例的方法。在渗滤过程中，在进料液（原液）、滞留物和滤液中，比滤膜孔径大的分子被浓缩，且比滤膜孔径小的分子被过滤以通过滤膜。但是，在滞留物中，纯化的分子被部分保留，且如果需要，可恢复为原液。在这种情况下，添加净化水以稀释所获得的分子，重复通过滤膜浓缩并纯化以逐渐增加所需材料的比例。

下文中，将使用本说明书中使用的上述术语详细地描述本发明。

根据本发明的一方面涉及去端肽胶原的分离方法，其包括以下步骤：

(a)在容器中制备含有去端肽胶原而不含任何端肽的样品；

(b)将含有去端肽胶原的样品从容器中转移至具有滤膜的过滤模块，并对过滤模块施压使样品通过滤膜进行超滤；

(c)收集在超滤步骤中通过滤膜过滤后从过滤模块流出的去端肽胶原溶液；

(d)测量通过滤膜过滤的去端肽胶原溶液的流速以确定超滤速率；

(e)当超滤速率达到预定水平或低于预定水平时停止超滤；

(f)收集滤膜上滞留的样品的滞留物并回收到容器中，向收集的滞留物中加水，并将其转移到具有滤膜的过滤模块中进行渗滤；

(g)收集在渗滤步骤中通过滤膜过滤后从过滤模块流出的去端肽胶原溶液；

(h)重复步骤(f)和步骤(g)。

在根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法中,在步骤(b)中，通过泵装置的泵送将含有去端肽胶原的样品从容器中转移至具有滤膜的过滤模块，且对过滤模块施加大约10至30psi的压力。

在根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法中,在步骤(e)中，当超滤速率渐减地达到约1g/min或更低时停止超滤。

在根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法中,在步骤(f)中，可向回收到容器中的滞留物加入与超滤过滤的溶液等体积的净化水。

在根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法中，渗滤可以至少重复5次。

与此同时，根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原通过上述分离去端肽胶原的方法进行制备。

根据本发明的另一方面涉及琥珀酰化去端肽胶原的制备方法,其包括以下步骤：

(a)使去端肽胶原溶液与琥珀酰酐反应，并使去端肽胶原和琥珀酰酐的反应溶液维持在碱性条件下；

(b)低温下，搅拌去端肽胶原和琥珀酰酐的反应物一段时间；

(c)在步骤(b)的搅拌后，使去端肽胶原和琥珀酰酐的反应物在约pH值9~10的条件下维持一段时间；

(d)通过加入酸将去端肽胶原和琥珀酰酐的反应物转化成酸性状态，从而形成琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物；

(e)分离并获得琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物。

在根据本发明的一个实施方案的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法中，优选地，重复步骤(b)和步骤(c)，更优选地步骤(b)和步骤(c)重复至少4次。

根据本发明的一个实施方案的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法进一步包括使用酸性蒸馏水洗涤琥珀酰化去端肽胶原沉淀物的步骤。优选地，根据本发明的一个实施方案的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法进一步包括将琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物冻干的步骤。

与此同时，根据本发明的一个实施方案的琥珀酰化去端肽胶原通过上述制备琥珀酰化去端肽胶原的方法进行制备。

根据本发明的另一方面涉及酯化去端肽胶原的制备方法，其包括以下步骤：

(a)通过在乙醇或甲醇中加入去端肽胶原而制备去端肽胶原胶体，通过加入酸，将去端肽胶原胶体转化成酸性状态，然后搅拌；

(b)在步骤(a)的搅拌后，将去端肽胶原胶体转化成接近中性状态，

(c)在步骤(b)的将去端肽胶原胶体转化成接近中性状态后，通过离心收集酯化去端肽胶原的沉淀物；以及

(d)将步骤(c)中获得的酯化去端肽胶原的沉淀物倒入透析膜以在净化水中进行透析。

优选地，根据本发明的一个实施方案的酯化去端肽胶原的制备方法进一步包括在步骤(d)的透析后，将酯化去端肽胶原的沉淀物冻干的步骤。

与此同时，根据本发明的一个实施方案的酯化去端肽胶原通过上述制备酯化去端肽胶原的方法进行制备。

根据本发明的另一方面涉及胶原型基质的制备方法，其包括以下步骤：

(a)将通过上述制备去端肽胶原的方法而获得的去端肽胶原胶体均匀地涂布以形成具有均匀厚度的膜，然后冻干从而形成胶原多孔层；

(b)将通过上述制备去端肽胶原的方法而获得的去端肽胶原胶体均匀地涂布，并用多孔吸附板按压，从而滤出水分，并使胶原颗粒紧密连接以形成胶原密集层；

(c)将在步骤(a)中形成的胶原多孔层铺在步骤(b)中形成的胶原密集层上，并使其在空气中干燥从而使胶原多孔层与胶原密集层初级结合；以及

(d)使用交联工具，使在步骤(c)中初级结合的胶原多孔层与胶原密集层之间产生交联，从而使胶原多孔层与胶原密集层次级结合。

在根据本发明的一个实施方案的胶原型基质的制备方法中，当上述交联工具为交联剂时，该方法进一步包括洗脱交联剂的步骤(e)。

更优选地，在步骤(e)中，洗脱交联剂后进一步冻干包括胶原密集层和胶原多孔层的双层结构。

在根据本发明的一个实施方案的胶原型基质的制备方法中，优选地，步骤(b)中由多孔吸附板施加的压力为1~20psi。

在根据本发明的一个实施方案的胶原型基质的制备方法中，交联工具可以是EDC[1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺]或戊二醛。

在根据本发明的一个实施方案的胶原型基质的制备方法中，向步骤(a)中使用的去端肽胶原胶体中加入透明质酸。

与此同时，根据本发明的一个实施方案的胶原型基质通过上述制备胶原型基质的方法进行制备。

有益效果

根据去端肽胶原的分离方法，将利用可重复使用过滤器进行的超滤过程和渗滤过程的组合，从而通过单一程序，通过有效并方便地去除杂质，经济地从动物组织中提取高纯度去端肽胶原。

另外，根据本发明的改性去端肽胶原的制备方法，能够制备在中性溶液中溶解的改性去端肽胶原，其具有显著的生物相容性，适用于各种制剂且更方便使用。有利地，这种改性去端肽胶原能够完美的应用于各个领域，包括化妆品领域、药品领域和食品领域等，而不需要任何水解作用，包括胶原的肽解和酶消化。

此外，根据本发明的胶原型基质的制备方法，通过形成包括密集层和多孔层的双层胶原结构（两种胶原层的孔隙率彼此不同）并使密集层和多孔层交联而制备胶原型基质，密集层和多孔层的交联改进了胶原型基质的机械强度。通过该方法制备的三维多孔胶原型基质有利地克服了以下问题，即，在溶液中多孔膜被破坏并部分损失，且容易从密集层分离。

附图说明

本发明的以上和其它目的、特征及优势结合以下详细描述和附图说明，对于本领域技术人员将更加明确。

图1示出了通过根据本发明的去端肽胶原的分离方法，用于分离和纯化去端肽胶原的纯化装置100的方框图，上述分离方法组合了超滤过程和渗滤过程。

图2和图3是图表和表格，其分别示出了在去除水后，通过根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原的定量结果（样品浓度为0.5mg/mL）。

图4是一幅图片和一幅图，其分别示出了进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）后用考马斯亮蓝染色的电泳结果，和通过根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原的定量分析结果。

图5示出了通过对根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原进行电泳和蛋白质印迹，鉴定纯化的去端肽胶原为I型胶原的图片。

图6示出了根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原的圆二色谱的分析结果的图表。

图7和图8是图表和表格，其分别示出了为了鉴定是否存在用于去除端肽的胃蛋白酶，而在根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原中进行的胃蛋白酶的定量结果。

图9是一个数据表，其示出了根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原的实时PCR结果，以确定是否存在来自猪的HEV（戊型肝炎病毒）。

图10是一幅图片，其示出了根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原的RT-PCR(逆转录PCR)结果，以确定是否存在来自猪的JEV（日本脑炎病毒）。

图11一幅图片，其示出了与常规的胶原相比较，通过根据本发明的一个实施方案的用于分离改性去端肽胶原的方法而获得的琥珀酰化去端肽胶原（电离的去端肽胶原）的溶解度。

具体实施方式

在以下实施例中将更加清楚的示出本发明实践中和优选的实施方式。然而，应当理解的是本领域技术人员，在考虑了本文公开的内容后，可以在本发明的精神和范围内做出变形和改进。说明书中的参考文献都已引入的方式纳入本发明中。

实施例1：去端肽胶原的分离

实施例1-1：动物组织的预处理

首先，制备作为动物组织的猪皮，并用自来水洗涤猪皮。在该实施例中，用猪皮作为动物组织，但是当然也可以使用各种含有胶原的动物组织，例如牛尾、猪软骨组织、骨组织或肌腱组织等。

将上述洗涤的猪皮切成2cmx10cm大小的碎片。切好的猪皮浸没在0.1~1M的醋酸溶液中，并在4°C下泡发16至24小时。从泡发的猪皮组织中，用小刀去除脂类和上皮，将得到的已去除脂类和上皮的组织切成1cmx1cm大小的碎片。

将切好的1cmx1cm大小的碎片组织用净化水洗涤5至10次，然后加入到90~99%的乙醇溶液中，并在4°C下搅拌16至24小时。然后，将切好的1cmx1cm大小的碎片组织过筛以去除乙醇溶液，再次加入到90~99%的乙醇溶液中，并在4°C下搅拌5小时或更久。

然后，将在乙醇溶液中搅拌处理获得的组织过筛，浸没在0.1~1M的醋酸溶液中，并泡发20至60分钟。泡发的组织与0.1~1M的醋酸溶液混合。用均化器将混合的组织均化。

实施例1-2：端肽的去除以及去端肽胶原的提取

(1)用胃蛋白酶处理在实施例1-1中进行预处理过程而获得的溶液，在4°C下搅拌24~72小时，然后调节pH值至8以使胃蛋白酶失活。

(2)将步骤(1)中获得的溶液在4°C下以7,000~15,000g离心10~30分钟。然后，去除上层脂类和下层杂质，收集中间层溶液。

(3)通过离心分离中间层溶液，并称重，然后加入到1~10M的NaCl溶液中，在4°C下搅拌10~60分钟以提取去端肽胶原。

(4)离心步骤(3)中获得的溶液，从而获得以沉淀形式的去端肽胶原。

(5)将步骤(4)中以沉淀形式获得的去端肽胶原加入到90~99%的乙醇溶液中，在4°C下搅拌16~24小时。

(6)将步骤(5)中获得溶液再次离心，以获得沉淀形式的去端肽胶原，再一次重复步骤(5)。

实施例1-3：去端肽胶原的分离和纯化

(1)离心在实施例1-2中进行去端肽胶原的提取而获得的溶液，以收集沉淀物，然后加入到0.01~0.1M的尿素溶液中，并在4°C下搅拌16至24小时。

(2)通过单一程序纯化步骤(1)中获得的溶液(下文中，称为“目的胶原溶液”)，该程序通过超滤和渗滤过程的组合而进行。为此，如图1所示制备纯化装置100。图1的装置可以手工制造，并用从Pall公司购买的商业设备（型号名称：CENTRASETTE^TM系统）组装。

(3)在图1中的纯化装置100中的过滤模块30装备有滤膜（未示出）。用净化水洗涤留在滤膜上的NaOH。

(4)进料压力计32和滞留物压力计34安装在如图1所示的纯化装置100的过滤模块30中，并释放注入“目的胶原溶液”的进料部分33，以及使留在过滤模块30中的滞留物流出返回到进料槽10中的滞留部分35的所有压力。用水洗涤滤膜的前侧。

(5)调整在如图1所示的纯化装置100中的压力控制阀40以对过滤模块30的滞留部分35施加10~30psi的压力。给从进料部分33自由注入的净化水增压以洗涤滤膜的后侧。洗涤后，释放滞留部分35的压力。

(6)制备容纳“目的胶原溶液”的容器和容纳纯化的去端肽胶原溶液的容器，并通过软管将这些容器与图1的纯化装置100连接。

(7)调整在如图1所示的纯化装置100中的压力控制阀40以对过滤模块30的滞留部分35施加10~30psi的压力。在这种情况下，通过进料泵20的泵送给从进料槽10的通过进料部分33流入到过滤模块30的“目的胶原溶液”加压，去端肽胶原通过滤膜并过滤。结果是，“目的胶原溶液”首先被超滤，并且部分纯化的去端肽胶原从过滤模块30释放并收集在之前制备的容器中。

(8)然后，在步骤(7)的超滤中，当滤液的速度降低至约1g/min或更低时停止过滤。

(9)此外，为了改进去端肽胶原分离过程的便利性与效率，使用如图1所示的纯化装置100执行由超滤和渗滤组合的单一程序，从而提高去端肽胶原的产率和纯度。也就是说，滞留在图1所示的纯化装置100的过滤模块30中的滤膜上的滞留物，以一定流速通过过滤模块30的滞留部分35均匀地回收至进料槽10。在步骤(8)中，当超滤的速度达到均匀速率或更低时，停止超滤，接着对回收至进料槽10中的滞留物进行渗滤。然后，将回收到进料槽10中的滞留物加入到与超滤的溶液体积相同体积的净化水中，并使用图1所示的纯化装置100将其渗滤5次或更多。

(10)将由步骤(7)中的超滤获得的去端肽胶原溶液和由步骤(9)中的渗滤获得的去端肽胶原溶液的pH值调节至7.0，然后冻干，以最终获得海绵样的去端肽胶原。

在本实施例中所描述的去端肽胶原的分离方法已经克服了如下的问题。当几种过滤器重叠时，纯化成本高并且变得很麻烦，因为消耗了很多昂贵的过滤器。也就是说，使用可重复使用过滤器通过超滤部分地纯化了去端肽胶原，直到超滤效率下降到低于预定的过滤速度。之后，过滤模块30可以应用为渗滤装置去过滤滞留物，而不需要替换过滤器并重装装置。换句话说，在本实施例中所描述的去端肽胶原的分离方法能够通过使用如图1所示的纯化装置100的循环的单一程序有效且方便地去除杂质，从动物组织中以高产率节约地提取并分离高纯度的去端肽胶原。

实施例2：在实施例1中提取并纯化的去端肽胶原的纯度和安全性 等的分析实验

实施例2-1：纯化的去端肽胶原中的纯度、变性状态以及类型等的 分析

将实施例1中提取并纯化的去端肽胶原（样品浓度为0.5mg/mL）去除水后定量。如图2和图3所示，结果是发现根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原具有98%或更高的纯度。

另外，通过进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）并用考马斯亮蓝染色分析实施例1中提取并纯化的去端肽胶原。如图4所示，发现根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原具有α肽链，并且具有98%或更高的纯度。

此外，使用圆二色谱分析实施例1中提取并纯化的去端肽胶原。如图6中的图表所证实，根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原没有观察到变性，并且维持了由氢键键合的3-肽螺旋（α链）结构。

此外，定量用于去除端肽的胃蛋白酶，从而确定在实施例1中纯化的去端肽胶原中是否残留有胃蛋白酶。结果如图7和图8所示，观察到的结果是，在根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原中，没有检测到胃蛋白酶。

因此，根据本发明的去端肽胶原的分离方法能够有效地从动物组织中以高纯度纯化没有变性的去端肽胶原。

另一方面，如图5所示，通过进行电泳和蛋白质印迹分析实施例1中提取并纯化的去端肽胶原，从而确定胶原类型。结果是，上述纯化的去端肽胶原被鉴定为I型胶原。在蛋白质印迹中，利用鼠抗I型胶原单克隆抗体作为初级抗体，并与过氧化物酶共轭的兔抗-鼠IgG作为次级抗体。

实施例2-2：纯化的去端肽胶原的安全性试验

由于实施例1中提取并纯化的去端肽胶原来自猪的组织，所以进行安全性试验以检测是否有源于猪的病毒。

首先，为了鉴定实施例1中提取并纯化的去端肽胶原中是否有来自猪的HEV（戊型肝炎病毒），进行了实时PCR。结果如图9所示，观察到根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原呈现HEV（来自猪的）阴性。因为没有检测到HEV，所以鉴定该去端肽胶原对人类无害。

然后，为了鉴定实施例1中提取并纯化的去端肽胶原中是否有来自猪的JEV（日本脑炎病毒），进行了RT-PCR（逆转录PCR）和电泳。由电泳图的结果证实，观察到没有出现相当于JEV的基因条带。因此，因为没有检测到JEV，所以确定根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原对人类无害。

根据上述纯化的去端肽胶原的纯化、安全性等的分析数据，确定根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原为I型胶原并具有高纯度，因为在去除端肽过程中添加的胃蛋白酶和其他杂质已被去除，并且没有动物病毒感染。因此，根据本发明的一个实施方案的去端肽胶原的分离方法纯化的去端肽胶原可完美地应用于各个领域，包括化妆品领域、药品领域和食品领域等。

实施例3：改性去端肽胶原的制备

下文中，将描述改性的琥珀酰化去端肽胶原和酯化去端肽胶原的制备方法，所述改性使去端肽胶原可溶于中性溶液中，适合于各种制剂，使用更方便并且生物相容性提高。相比于常规方法，根据本发明的的改性去端肽胶原的制备方法是改良的，其提高了产率和纯度。

实施例3-1：琥珀酰化去端肽胶原的制备

根据本发明的一个实施方案的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法如下所述：

(1)将相应于0.002~0.01wt%的去端肽胶原（在实施例1中纯化的或市售的都是可以的）加入到0.1M的醋酸溶液中，并在4°C下搅拌1~2天，以溶解去端肽胶原。

(2)以0.8~1.3g：1g(琥珀酰酐：步骤(1)中加入的去端肽胶原)的比例，将琥珀酰酐加入到步骤(1)中获得的去端肽胶原溶液中，利用0.05~1M的NaOH使pH值保持在9~10左右10分钟。

(3)在4°C下搅拌步骤(2)中获得的溶液30分钟。

(4)利用0.05~1M的NaOH使步骤(3)中获得的溶液的pH值保持在9~10左右10分钟。

(5)在4°C下搅拌步骤(4)中获得的溶液30分钟。

(6)利用0.05~1的M NaOH使步骤(5)中获得的溶液的pH值保持在9~10左右10分钟。

(7)在4°C下搅拌步骤(6)中获得的溶液20分钟。

(8)利用0.05~1M的NaOH使步骤(7)中获得的溶液的pH值保持在9~10左右10分钟。

(9)在4°C下搅拌步骤(8)中获得的溶液10分钟。

(10)利用0.05~1M的NaOH使步骤(9)中获得的溶液的pH值保持在9~10左右10分钟。

(11)利用3~7M的HCl将步骤(10)中获得的溶液的pH值调节至4.03，从而形成琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物，并在4°C下搅拌15分钟。

(12)离心步骤(11)中搅拌获得的溶液以收集琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物。

(13)利用3~7M的HCl将步骤(12)中获得的去端肽胶原的沉淀物加入（以20mL/g在步骤(1)中加入的去端肽胶原的比例）到pH值调节至4.03的蒸馏水中，并在4°C下搅拌15分钟，然后洗涤。

(14)离心步骤(13)中获得的溶液以收集洗涤后的琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物。

(15)重复步骤(13)和步骤(14)一次，并将获得的洗涤后琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物在-70°C下冻干30小时以最终获得琥珀酰化去端肽胶原。

在下列反应式1中示出通过上述过程制备的去端肽胶原的琥珀酰化过程：

反应式1

与此同时，在通过常规的方法制备的琥珀酰化的胶原的情况下，琥珀酰酐在过高的pH值或在过低的pH值下都是不溶的。最优选在pH值9-10左右，琥珀酰酐可溶，但在pH值为11或以上时琥珀酰酐不溶。就该问题，本发明人发现，当随着去端肽胶原和琥珀酰酐的反应而pH值改变时，由于琥珀酰酐的溶解度降低，反应速度下降，从而产率下降。为了解决该问题，新引入了在反应溶液中将pH值重复调节为9~10的额外的步骤(步骤(3)到步骤(11))。

也就是说，在如上所述的根据本发明的一个实施方案的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法中，去端肽胶原与琥珀酰酐在低温下反应，并搅拌预定的时间，然后在预定的时间内将pH值调节至9~10，从而通过充分地溶解琥珀酰酐以促进琥珀酰化。事实上，根据本发明的一个实施方案的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法提高了琥珀酰化去端肽胶原的产率。

实施例3-2：酯化去端肽胶原的制备

根据本发明的一个实施方案的酯化去端肽胶原的制备方法如下所述：

(1)将相应于1~5wt%的去端肽胶原（在实施例1中纯化的或市售的都是可以的）加入到70~90%的乙醇（或甲醇）中以获得胶体溶液，利用0.5~1M的醋酸或0.1~0.5M的HCl将pH值调节为2~4，并在4°C下搅拌4~10天。

(2)利用0.1~0.5M的NaOH将步骤(1)中获得的去端肽胶原胶体的pH值调节为7.4，然后离心只收集沉淀物。

(3)以10~100mL：1g去端肽胶原沉淀物的比例将步骤(2)中获得的沉淀物加入到净化水中，然后转移到透析袋中，在透析缓冲液中进行透析。

(4)搅拌16~24小时后，更换透析缓冲液，然后每隔3~5小时重复更换3~12次。

(5)将步骤(3)和步骤(4)中透析获得的酯化去端肽胶原沉淀物在-70°C下冻干30小时或更久，以获得冻干的酯化去端肽胶原。

在下列反应式2中示出通过上述过程制备的去端肽胶原的酯化过程：

反应式2

在典型的酯化去端肽胶原的制备方法中，仅使用净化水进行透析从而提高产率和纯度。相比之下，在根据本发明的一个实施方案的酯化去端肽胶原的制备方法中，去端肽胶原混合到乙醇或甲醇中，并中和获得的去端肽胶原胶体，离心并只收集沉淀物，然后使用透析膜进行透析从而提高产率和纯度。

实施例4：改性去端肽胶原的物理性质的评价

比较通过根据本发明的一个实施方案的改性去端肽胶原的制备方法在实施例3中获得的琥珀酰化去端肽胶原（阴离子去端肽胶原）与典型的去端肽胶原的溶解度。由图11的图表中所证实，观察到根据本发明的改性去端肽胶原的制备方法而制备的琥珀酰化去端肽胶原在中性pH值（pH值6.0~7.0）下具有高的溶解度。

结果是，由于其阴离子特性，通过根据本发明的改性去端肽胶原的制备方法而获得的结合去端肽胶原与琥珀酰酐的琥珀酰化去端肽胶原，甚至能够在中性pH值下溶解，并且提高了细胞附着、增殖和迁移的能力。由于其阴离子特性，通过根据本发明的改性去端肽胶原的制备方法而获得的结合去端肽胶原与乙醇（或甲醇）的酯化去端肽胶原也有利地能在中性pH值下溶解，并能快速且容易地结合到细胞上。

因此，根据本发明，将由超滤和渗滤获得的高纯度的去端肽胶原进行琥珀酰化或酯化改性，使其甚至能够在中性pH值下溶解。该优势可完美的应用于各个领域，包括化妆品领域、药品领域和食品领域等，而不需要任何水解作用，包括胶原的肽解和酶消化。

实施例5：三维基质结构的胶原型基质的制备

下文中将根据以下步骤清楚地描述本发明的具有三维基质结构的胶原型基质的制备方法，其中通过使用去端肽胶原和/或改性去端肽胶原构建密集层和多孔层（两个胶原层的孔隙率彼此不同），并将密集层和多孔层交联以增加机械强度。

属于本发明的胶原型基质由密集层和多孔层的双层组成，并且基本上密集层和多孔层由去端肽胶原胶体制备。

实施例5-1：去端肽胶原胶体的制备

首先，为了制备用于多孔膜的去端肽胶原胶体，将实施例1中获得的相当于1~3wt%的去端肽胶原加入到蒸馏水中，并在4°C下搅拌并扩散1~2天，然后利用0.05~1N的NaOH将pH值调节为7.4。

另外，为了制备用于密集膜的去端肽胶原胶体，将实施例1中获得的相当于2~5wt%的去端肽胶原加入到蒸馏水中，并在维持4°C下搅拌并扩散1~2天，然后利用0.05~1N的NaOH将pH值调节为7.4。

实施例5-2：去端肽胶原型基质的制备

下文中，使用用于多孔膜的去端肽胶原胶体和用于多孔膜的去端肽胶原胶体制备胶原型基质的实施例如下所述：

(1)首先，将在实施例5-1中制备的用于多孔膜的去端肽胶原胶体涂布在培养皿或可释放的板中，以制备0.05~1mm范围内的均匀的膜，然后在-60～-80°C在冻干器中冻干1~2天，从而制备多孔膜。

(2)另外，将在实施例5-1中制备的用于密集膜的去端肽胶原胶体涂布在可释放的板中，并用1~20psi的压力增压从而制备0.05~1mm范围内的均匀的膜。

(3)然后，将步骤(2)中获得的密集膜在室温下干燥10~20分钟，轻柔地铺在步骤(1)中获得的多孔膜上，并室温下空气干燥1~2天，以获得结合密集膜与多孔膜的双层膜。

(4)将EDC以10~100mM的浓度加入到90~99wt%的乙醇中，在4°C下搅拌10~15分钟，以获得混合物。在该获得的混合物中，使在步骤(3)中获得的双层膜浸没，然后，在4°C下，使密集膜和多孔膜交联1~2天。另外，将戊二醛以0.5~1%的比例加入到90~99wt%的乙醇中，在4°C下搅拌10~15分钟，以获得混合物。在该获得的混合物中，浸没在步骤(3)中获得的双层膜，然后，在4°C下，使密集膜和多孔膜交联4~8小时。

(5)使用蒸馏水洗涤步骤(4)中交联的双层膜4~6次，从而去除EDC或戊二醛，并将洗涤的双层膜在-60～-80°C下冻干1~2天，从而制备定型的双层膜。

(6)将步骤(5)中获得的双层膜裁剪成200μmx200μmx200μm~10mmx15mmx15mm大小，从而完成胶原型基质的制备，所述胶原型基质提高了组织修复材料的适用性。

实施例5-3：去端肽胶原型基质的详细制备方法

下文中，将更清楚地描述在实施例5-2中的胶原型基质的制备方法

(1)首先，将实施例5-1中制备的相当于2wt%的去端肽胶原加入到蒸馏水中，并在4°C下搅拌并扩散40小时以获得胶原胶体，然后利用0.5N的NaOH将pH值调节为7.4从而获得用于制备多孔膜的去端肽胶原胶体。另外，将实施例5-1中制备的相当于4wt%的去端肽胶原加入到蒸馏水中，并在4°C下搅拌并扩散30小时以获得胶原胶体，然后利用0.5N的NaOH将pH值调节为7.4从而获得用于制备密集膜的去端肽胶原胶体。

(2)将用于制备多孔膜的去端肽胶原胶体涂布在可释放的板中，以形成0.05mm厚度的均匀的膜，然后在-70°C下在冻干器中冻干30小时，从而制备多孔膜。另外，将用于制备密集膜的去端肽胶原胶体涂布在可释放的板中，并用多孔吸附板在10psi的压力下增压以形成0.05mm厚度的均匀的膜。

(3)将步骤(2)中获得的密集膜在室温下干燥15分钟，然后轻柔地铺在步骤(2)中获得的多孔膜上，并在室温下空气干燥30小时，以获得结合密集膜与多孔膜的双层膜。

(4)将EDC以50mM的浓度加入到95wt%的乙醇中，并在4°C下搅拌15分钟，以获得混合物。

(5)在步骤(4)获得的混合物中，浸没在步骤(3)中获得的双层膜，然后，在4°C下，使密集膜和多孔膜交联40小时。

(6)在膜交联的另一种方法中，将戊二醛以0.625%的比例加入到95wt%的乙醇中，并在4°C下搅拌15分钟，以获得混合物。

(7)在步骤(6)获得的混合物中，完全浸没在步骤(3)中获得的双层膜，然后，在4°C下，使密集膜和多孔膜交联4小时。

(8)使用蒸馏水洗涤步骤(5)和步骤(7)中交联的双层膜15分钟5次，从而去除EDC或戊二醛。

(9)将洗涤的双层膜在-70°C下冻干30小时，从而制备定型的双层膜。

(10)将步骤(9)中获得的双层膜裁剪成200μmx200μmx200μm~10mmx15mmx15mm大小，从而完成胶原型基质的制备，所述胶原型基质提高了组织修复材料的适用性。

另一方面，在根据本发明的去端肽胶原型基质的制备方法中，去端肽胶原胶体可用去端肽胶原和透明质酸的胶体混合物替代，该混合物中加入了透明质酸，其是一种当与胶原纤维结合时，能够增加细胞迁移的粘多糖。此外，例如青霉素等的抗生素也可以加入到这些胶体中(参见韩国专利公开号10-0947765)。

尽管已经参照本发明列举的具体实施方式对本发明进行了说明和描述，但是应当理解的是对于本发明的各种变化、变形和增加都不脱离本发明的精神和范围。

Claims (19)

1.一种去端肽胶原的分离方法，其包括以下步骤：

(a) 在容器中制备含有去端肽胶原而不含任何端肽的样品；

(b) 将含有去端肽胶原的样品从容器中转移至具有滤膜的过滤模块，并对过滤模块施压使样品通过滤膜进行过滤； 

(c) 收集在步骤(b)中通过滤膜过滤后从过滤模块流出的去端肽胶原溶液；

(d) 测量通过滤膜过滤的去端肽胶原溶液的流速以确定超滤速率；

(e) 当超滤速率达到预定水平或低于预定水平时停止超滤；

(f) 收集过滤膜上滞留的样品的滞留物并回收到容器中，向收集的滞留物中加入水，然后将其转移到具有滤膜的过滤模块进行渗滤；

(g) 收集在步骤(f)中通过滤膜过滤后从过滤模块流出的去端肽胶原溶液；以及

(h) 重复步骤(f) 和步骤 (g)。

2.根据权利要求1所述的去端肽胶原的分离方法，其中在步骤(b)中，通过泵装置的泵送将含有去端肽胶原的样品从容器中转移至具有滤膜的过滤模块，且对过滤模块施加10至30 psi的压力。

3.根据权利要求1所述的去端肽胶原的分离方法，其中在步骤(e) 中，当超滤速率达到1 g/min或更低时停止超滤。

4.根据权利要求1所述的去端肽胶原的分离方法，其中在步骤(f)中，可向回收到容器中的滞留物加入与超滤过滤的溶液等体积的净化水。

5.根据权利要求1所述的去端肽胶原的分离方法，其中所述渗滤重复至少5次。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法制备的去端肽胶原。

7.一种制备琥珀酰化去端肽胶原的方法：其包括以下步骤：

(a)使去端肽胶原溶液与琥珀酰酐反应，并使去端肽胶原和琥珀酰酐的反应溶液维持在碱性条件下；

(b) 低温下，搅拌去端肽胶原和琥珀酰酐的反应物一段时间；

(c) 在步骤(b)的搅拌后，使去端肽胶原和琥珀酰酐的反应物在pH值9 ~10左右的条件下维持一段时间；

(d) 通过加入酸将去端肽胶原和琥珀酰酐的反应物变成酸性状态，从而形成琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物；以及

(e) 分离并获得琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物。

8.根据权利要求7所述的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法，其中步骤(b)和步骤(c)重复至少4次。

9.根据权利要求7所述的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法，其还包括使用酸性蒸馏水洗涤琥珀酰化去端肽胶原沉淀物的步骤。

10.根据权利要求7所述的琥珀酰化去端肽胶原的制备方法，其还包括将琥珀酰化去端肽胶原的沉淀物冻干的步骤。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法制备的琥珀酰化去端肽胶原。

12.一种酯化去端肽胶原的制备方法，其包括以下步骤：

(a) 通过在乙醇或甲醇中加入去端肽胶原而制备去端肽胶原胶体，通过加入酸，将去端肽胶原胶体转化成酸性状态，然后搅拌；

(b) 将步骤(a)中搅拌的去端肽胶原胶体转化成中性状态，

(c) 通过离心步骤(b)的转化成中性状态的去端肽胶原胶体，收集酯化去端肽胶原沉淀物；以及

(d) 将步骤(c)中获得的酯化去端肽胶原沉淀物倒入透析膜以在净化水中进行透析。

13.根据权利要求12所述的酯化去端肽胶原的制备方法，其还包括将步骤(d)的透析后的酯化去端肽胶原的沉淀物冻干的步骤。

14.根据权利要求12或13中所述的方法制备的酯化去端肽胶原。

15.一种胶原型基质的制造方法，其包括以下步骤：

(a) 将通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法获得的去端肽胶原胶体均匀地涂布以形成具有均匀厚度的膜，然后冻干从而形成胶原多孔层；

(b) 将通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法获得的去端肽胶原胶体均匀地涂布，并用多孔吸附板按压，从而滤出水分，并使胶原颗粒紧密连接以形成胶原密集层；

(c) 将在步骤(a)中形成的胶原多孔层铺在步骤(b)中形成的胶原密集层上，并使其在空气中干燥从而使胶原多孔层与胶原密集层初级结合；以及

(d)使用交联工具，在步骤(c)中初级结合的胶原多孔层与胶原密集层之间产生交联，从而使胶原多孔层与胶原密集层次级结合。

16.根据权利要求15所述的胶原型基质的制造方法，其中所述交联工具是EDC[1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺]或戊二醛。

17.根据权利要求15所述的胶原型基质的制造方法，其还包括当交联工具是交联剂时，洗脱交联剂的步骤，且其中在洗脱交联剂之后进一步冻干包含胶原密集层和胶原多孔层的双层结构。

18.根据权利要求15所述的胶原型基质的制造方法，其中向步骤(a)中使用的去端肽胶原胶体中加入透明质酸。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法制备的胶原型基质。

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