KR101158338B1 - 아텔로콜라겐 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 아텔로콜라겐 분리방법은, (a) 텔로펩타이드가 제거된 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 용기 내에 준비하는 단계와, (b) 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에 압력을 인가하여 상기 시료가 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되도록 하는 한외여과 과정을 수행하는 단계와, (c) 상기 한외여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와, (d) 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되는 아텔로 콜라겐 용액의 유량을 측정하여 한외여과 속도를 결정하는 단계와, (e) 상기 한외여과 속도가 일정한 속도 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 단계와, (f) 상기 시료 중 상기 여과 멤브레인을 통과하지 못하고 상기 용기로 복귀되는 잔류물에 물을 첨가한 후 이를 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시켜 정용여과 과정을 수행하는 단계와, (g) 상기 정용여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와, (h) 상기 (f) 단계와 상기 (g) 단계를 반복하는 단계를 포함한다.

Description

아텔로콜라겐 분리방법 {Method for isolating atelocollagen}

본 발명은 아텔로콜라겐 분리방법 및 이를 이용하여 제조된 고순도의 아텔로 콜라겐에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하여 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리하는 아텔로콜라겐 분리방법 및 이를 이용하여 제조된 고순도의 아텔로 콜라겐에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 중성의 용액에도 용해되고 생체적합성이 우수하여 다양한 제형으로의 적용이 가능한 사용편의성이 개선된 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 개질된 아텔로 콜라겐에 관한 것이다.

그리고, 본 발명은 전술한 바와 같은 아텔로콜라겐 및 개질된 아텔로콜라겐을 이용하여 경질층 및 다공성층을 만들고 이들을 가교화시킴으로써 기계적 강도를 향상시킨 3차원 매트릭스 구조의 콜라겐 기반 매트릭스 및 그 제조방법에 관한 것이다.

조직 공학적으로 생체기능을 할 수 있는 조직을 재생하려면 다양한 세포가 충분히 분화되고 증식할 수 있는 환경을 제공해야 하는데, 조직의 형태를 유지하고 세포의 생장을 보장하는 결정적인 역할은 세포외기질(Extra-Cellular Matrix)이 담당하고 있다.

인공적으로 조직을 만들기 위해서는 기본적으로 세포가 생장하는 환경을 제공하고 세포를 증식시키는 기술이 필요하다. 일반적으로, 인공 조직 공학 분야에서는 콜라겐이나 프로테오글리칸 등의 세포외기질을 이용하여 세포의 생장환경을 제공하면서 세포증식을 위해 다양한 성장인자를 사용하고 있다.

인공조직을 만들기 위한 생체재료로서 이용되는 천연고분자의 대표적인 것은 세포외기질 중에서 콜라겐(collagen), 섬유결합소(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin) 등이 있다. 예를 들어, 콜라겐이나 섬유결합소에는 세포접착을 유도하는 아르기닌(arginine)-글리신(glycine)-아스파르트산(aspartic acid)으로 구성된 펩티드(소위, "RGD 펩티드"라고 함) 서열이 포함되어 있어, 생체재료의 표면에 RGD 펩티드를 인공적으로 배열하면 생체재료 표면과 세포의 접착을 유도하는 환경을 제공하므로 생체재료 표면과 주위 세포와의 결합으로 천연조직의 기능을 모방할 수 있다.

특히, 단백질을 생체재료로 응용하는 분야에 있어서는 전술한 다양한 천연고분자들 중에서 콜라겐이 매우 중요한 천연소재 중의 하나라고 볼 수 있다. 왜냐하면 생체내의 거의 모든 조직에 분포하는 콜라겐은 세포의 지지 및 증식을 위한 구조체로서 세포와 결합하여 장기와 조직의 형태를 형성 및 유지함으로써 생체를 구축하는데 필수 불가결한 단백질이기 때문이다.

콜라겐은 세포외기질(extra-cellular matrix)의 주 단백질 성분으로서 피부, 건(tendon), 혈관 등과 같은 결체조직을 포함한 연조직은 물론 뼈 및 치아 등과 같은 경조직에도 매우 많이 들어 있으며, 포유동물의 경우 전체 단백질의 약 1/3정도를 차지하면서 어느 일정한 질서를 갖추며 세포가 집합하여 조직이나 기관의 기본적인 구조를 형성시키는 역할을 한다. 만일 콜라겐이 없다면 다세포동물은 존재할 수가 없다. 따라서 생체의 손상부위를 그 본래의 조직으로 재생시키려고 할 때 손상부위에 조직의 세포외기질이 공급될 경우 그 조직세포가 재생력을 갖게 될 것이므로, 콜라겐을 인공 조직대체물의 기본적인 기질(matrix)로 제공한다는 것은 매우 유리하다.

한편, 생체에는 피부, 인대, 골, 혈관, 양막, 심막, 심장판막, 태반, 각막 등 콜라겐이 함유되어 있는 조직이 많지만 콜라겐의 종류는 각 조직마다 다르다. 특히 제1형 콜라겐은 피부, 인대, 골 등 거의 모든 조직에 다량 포함되어 있기 때문에 조직공학에서 가장 널리 이용되고 있다.

또한, 제1형 콜라겐 분자의 양쪽 말단에는 나선을 형성하지 않은 텔로펩타이드(telopeptide)라고 불리는 부분이 있는데, 이는 면역반응을 일으키는 주된 원인이므로, 의약품이나 화장품 등의 원료로 사용 시에는 이 부분을 제거한 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 이용한다.

현재까지 일반적으로 사용되는 있는 제1형 콜라겐 분리방법은 동물 조직을 트립신(trypsin)으로 처리하여 세포와 분리시킨 후 세포외기질로부터 무기질과 각종 당단백을 제거하고, 콜라겐의 고유 극성이나 산 용해도를 이용하여 산 불용성 콜라겐 등을 제거하는 방식을 채택하고 있다. 이러한 방식의 제1형 콜라겐 분리를 위해 종래에는 침전법, 우레아 완충용액을 이용한 크로마토그래피 방법 및 원심분리법 등을 이용하고 있으며, 전술한 바와 같이 면역반응을 일으키는 텔로펩타이드를 제거하기 위해 펩신을 처리하고 있다.

그런데, 이러한 종래의 제1형 콜라겐 분리방법은 다단계 처리과정을 거쳐야 하므로 분리과정이 불편하고 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있을 뿐만아니라, 제1형 콜라겐을 분리하기 위해 필수적으로 사용되는 우레아를 추가적으로 분리해야 하는 불편과 텔로펩타이드 제거를 위해 사용된 펩신의 제거나 불활성화 과정이 반드시 필요한 문제가 있다. 즉, 종래의 제1형 콜라겐 분리방법은 분리과정을 더욱 복잡하고 어렵게 만들고 있으며 고순도의 제1형 콜라겐을 경제적으로 얻는 것을 어렵게 하고 있다.

또한, 콜라겐 사용에 의한 창상 치료 효과가 우수함에도 불구하고, 콜라겐을 이용한 생체재료 물질은 아직도 낮은 인장강도와 생분해적인 특성 때문에 사람 조직에서 바로 사용하기에 한계를 가지고 있다.

이와 같은 콜라겐의 특성으로 인해 콜라겐을 이용한 인공조직 등에 대한 연구는 지금까지도 활발하게 진행되고 있으며 이와 함께 동물조직에서 콜라겐을 추출하는 방법도 연구되고 있다.

이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0465015호에서는 효소처리를 통해 비콜라겐성 물질을 제거하고 면역성을 감소시킨 후 유기용매를 이용해 지방성 불순물 및 불용성 콜라겐을 추출하여 제거함으로써 높은 순도의 제1형 콜라겐을 제조하는 방법에 대해 기술하고 있다. 그러나, 상기 대한민국 등록특허 제10-0465015호와 같이 유기용매를 사용하는 경우에는 콜라겐의 변성이 있을 수 있고 인체에 유해한 유기용매의 사용은 분리된 콜라겐의 생체적용시 부작용을 낳을 수 있다는 문제점이 있었다.

또한, 대한민국 등록특허 제10-0676285호에서는 돼지의 골조직, 연골조직, 피부조직, 건/힘줄 조직을 분말화 또는 절편화하고 산처리한 후 펩신을 반복처리하여 제1형 콜라겐을 1차적으로 분리하고, 불순물 제거를 위해 3차에 걸친 염처리 및 중성으로의 적정과정을 반복한 다음, 30 내지 37℃ 저온에서 중성처리 후 원심분리하여 침전된 콜라겐을 분리하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 대한민국 등록특허 제10-0676285호의 분리방법은 콜라겐의 변성을 막으면서 지방이나 불용성 물질을 제거하는 관점에서 유리할 수 있으나 염처리 과정 및 중성으로의 적정과정이 다단계로 복잡하고 고순도의 제1형 콜라겐을 수율 좋게 경제적으로 분리하기에는 부적합한 문제점이 있었다.

이러한 문제들 때문에 지방, 불순물 단백질, 각종 불용성 불순물, 분리과정에 사용되는 우레아, 펩신 또는 기타 효소, 각종 염 등을 완전히 제거하면서 동물조직으로부터 고순도의 제1형 콜라겐을 분리하는 것은 매우 복잡하고 어려운 기술로 여겨지고 있다. 한편, 대한민국 공개특허공보 제10-2002-0029859호에서는 포유류의 연조직 또는 경조직을 산용액에 넣고 분쇄한 다음 바로 효소를 처리하고 통상의 방법으로 분리정제하는 아텔로콜라겐을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 이 기술 역시 분리정제 과정의 전(前) 단계의 공정을 일체화하여 단순화시켰다는 점에서 장점이 있을 뿐 추후 이루어지는 분리정제 과정에서는 투석과 여과를 이용하여 순도를 높이는 방식을 채택하고 있었다.

이와 관련하여 지금까지 콜라겐의 추출과정은 동물조직으로부터 1차적으로 분리된 콜라겐에서 각종 불순물 제거를 통한 순도를 높이는 과정에 있어서 투석(dialysis) 방법, 여러 회에 걸친 여과 방법 또는 다양한 공극의 크기를 가진 3~4개의 필터(filter)를 겹쳐서 사용하는 방법을 사용하고 있었다. 그러나, 투석 방법은 12,000~14,000 달톤(Dalton)의 제한된 막의 공극의 크기로 인해 순도를 높이는데 한계가 있었고, 다양한 공극의 크기를 가진 필터들을 여러 단계로 겹쳐서 사용하는 방법은 재사용이 불가능하여 여러 개의 고가의 필터들의 이용으로 인해 비용의 소모가 크다는 단점이 있다.

따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하여 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리하는 아텔로콜라겐 분리방법의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술들의 문제점들을 해결하기 위해 재사용이 가능한 필터를 이용하는 한외여과(ultrafiltration) 및 정용여과(diafiltration) 방법을 융합시킨 분리방법을 제공하여 단일의 공정라인을 통해서도 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법을 개발하였다.

또한, 본 발명자들은 중성의 용액에도 용해되고 생체적합성이 우수하여 다양한 제형으로의 적용이 가능한 사용편의성이 개선된 개질된 아텔로콜라겐을 제조방법을 개발하여 콜라겐의 펩타이드화 및 효소처리 등에 의한 가수분해 없이 콜라겐 본연의 상태로 화장품, 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서도 적용할 수 있도록 하였다. 아울러, 본 발명자들은 콜라겐을 경질층 및 다공성층의 2층 구조(공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층)로 만들고 가교화시킨 다공성 매트릭스 제조기법을 전술한 바와 같은 기술에 도입하여 기계적 강도를 향상시킨 3차원 매트릭스 구조를 제작함으로써 콜라겐의 낮은 인장강도와 생분해 문제를 해결하였다.

본 발명은 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하여 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리하는 아텔로콜라겐 분리방법 및 이를 이용하여 제조된 고순도의 아텔로 콜라겐을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 중성의 용액에도 용해되는 수용성의 콜라겐으로 변형시켜 생체적합성을 향상시킴으로써 다양한 제형으로의 적용이 가능한 사용편의성이 개선된 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 개질된 아텔로 콜라겐을 제공하는데 그 목적이 있다.

추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 아텔로콜라겐 및 개질된 아텔로콜라겐을 이용하여 경질층 및 다공성층(공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층)을 만들고 이들을 가교화시킴으로써 기계적 강도를 향상시킨 3차원 매트릭스 구조의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 한외여과(ultrafiltration)란 용어는 정밀여과와 역삼투압법의 중간에 위치하는 여과방법으로서, 고분자 용액으로부터 저분자물질을 제거하되 여과 멤브레인을 사이를 두고 농도차가 아닌 압력차를 이용하여 물질을 분리 여과하는 방법을 의미한다. 한외여과에 사용되는 여과 멤브레인은 분리대상이 되는 물질에 따라 다양한 크기의 세공(pore)을 갖고 있다.

또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 정용여과(diafiltration)란 용어는 한외여과에서 피드(공급물), 잔류물, 여과물의 관계에서 여과 멤브레인의 세공 보다 큰 물질들은 농축이 되고 작은 것은 여과되어 여과 멤브레인을 통과하게 되는데, 농축되는 잔류물 중에는 여과대상이 되는 원하는 물질이 일부 남아 있게 되므로 이를 다시 피드 쪽으로 복귀시킨 후 정제수 등을 첨가하여 재차 여과 멤브레인을 통해 농축을 수행하여 점진적으로 정제되는 원하는 물질의 비율을 높이는 방법을 의미한다.

이하에서는, 전술한 바와 같은 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어들을 사용하여 본 발명의 구성을 설명한다.

본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법은,

(a) 텔로펩타이드가 제거된 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 용기 내에 준비하는 단계와,

(b) 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에 압력을 인가하여 상기 시료가 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되도록 하는 한외여과 과정을 수행하는 단계와,

(c) 상기 한외여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,

(d) 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되는 아텔로 콜라겐 용액의 유량을 측정하여 한외여과 속도를 결정하는 단계와,

(e) 상기 한외여과 속도가 일정한 속도 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 단계와,

(f) 상기 시료 중 상기 여과 멤브레인을 통과하지 못하고 상기 용기로 복귀되는 잔류물에 물을 첨가한 후 이를 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시켜 정용여과 과정을 수행하는 단계와,

(g) 상기 정용여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,

(h) 상기 (f) 단계와 상기 (g) 단계를 반복하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 펌프에 의한 펌핑 작용에 의해 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에는 약 10~30psi의 압력을 인가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서, 상기 (e) 단계에서 상기 한외여과 속도가 약 1g/분 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서, 상기 (f) 단계에서 상기 용기로 복귀되는 잔류물에는 한외여과 과정을 통해 여과된 용액과 동일한 양의 정제수를 첨가할 수 있다.

본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서, 상기 정용여과 과정은 적어도 5회 수행할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐은 전술한 바와 같은 아텔로콜라겐 분리방법에 따라 제조된 것이다.

또한, 본 발명의 일실시예의 숙시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법은,

(a) 아텔로 콜라겐 용액에 숙신산 무수물을 넣어 반응시키고, 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 염기성 상태로 유지시키는 단계와,

(b) 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 저온에서 일정 시간 동안 교반하는 단계와,

(c) 상기 (b) 단계에서 교반한 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 일정 시간 동안 pH 9～10 근처로 유지시키는 단계와,

(d) 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액에 산을 첨가하여 상기 반응용액을 산성 상태로 전환시켜 숙시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 형성하는 단계와,

(e) 상기 숙시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 분리하여 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 숙시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계와 상기 (c) 단계를 반복하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하기로는 상기 (b) 단계와 상기 (c) 단계는 적어도 4회 반복하는 것이 좋다.

본 발명의 일실시예의 숙시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법은 상기 숙시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 산성의 증류수로 세정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하기로는, 본 발명의 일실시예의 숙시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법은 상기 숙시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예의 숙시닐화 아텔로 콜라겐은 전술한 바와 같은 숙시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법으로 제조된 것이다.

또한, 본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법은,

(a) 에탄올 또는 메탄올에 아텔로 콜라겐을 넣은 아텔로 콜라겐 분산액을 준비하고 산을 첨가하여 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 산성 상태로 만든 후 교반하는 단계와,

(b) 상기 (a) 단계에서 교반된 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 대략 중성 상태로 만드는 단계와,

(c) 상기 (b) 단계에서 대략 중성 상태로 된 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 원심분리하여 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 수득하는 단계와,

(d) 상기 (c) 단계에서 수득된 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 투석 멤브레인에 넣어 정제수 내에서 투석을 실시하는 단계를 포함한다.

바람직하기로는 본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법은 상기 (d) 단계에서 투석된 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐은 전술한 바와 같은 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법으로 제조된 것이다.

추가로, 본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법은,

(a) 전술한 아텔로콜라겐 분리방법에 의해 수득한 아텔로 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시켜 일정 두께의 균일한 막을 형성한 후 이를 동결건조시켜 콜라겐 다공성층을 형성하는 단계와,

(b) 전술한 아텔로콜라겐 분리방법에 의해 수득한 아텔로 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시키고 다공성의 흡착판으로 압력을 가해서 수분은 침출시키고 콜라겐 입자들은 밀착시켜 조직이 치밀한 콜라겐 경질층을 형성하는 단계와,

(c) 상기 (b) 단계에서 형성된 콜라겐 경질층 상에 상기 (a) 단계에서 형성된 콜라겐 다공성층을 적층시키고 풍건하여 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 1차적으로 결합시키는 단계와,

(d) 상기 (c) 단계를 통해 1차적으로 결합된 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 가교화 수단을 이용하여 가교화시킴으로써 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 2차적으로 결합시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법은, (e) 상기 가교화 수단이 가교화제인 경우 가교화제를 세정하는 단계를 더 포함한다.

또한, 더욱 바람직하기로는 상기 (e) 단계에서 가교화제를 세정한 후 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층의 이중층을 추가로 동결건조할 수 있다.

본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 다공성의 흡착판으로 가해지는 압력은 1~20psi인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 가교화 수단은 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide] 또는 글루타르알데히드인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 사용되는 아텔로 콜라겐 분산액에는 히알루론산이 첨가될 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스는 전술한 바와 같은 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법으로 제조된 것이다.

본 발명의 아텔로콜라겐 분리방법에 따르면, 재사용이 가능한 필터를 이용하는 한외여과(ultrafiltration) 및 정용여과(diafiltration) 방법을 융합시킨 분리방법을 이용하여 단일의 공정라인을 통해 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하고 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리추출할 수 있다.

또한, 본 발명의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법에 따르면 중성의 용액에도 용해되고 생체적합성이 우수하여 다양한 제형으로의 적용이 가능한 사용편의성이 개선된 개질된 아텔로콜라겐의 제조가 가능하고, 이러한 개질된 아텔로콜라겐은 콜라겐의 펩타이드화 및 효소처리 등에 의한 가수분해 없이 콜라겐 본연의 상태로 화장품, 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서도 적용할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법에 따르면, 콜라겐을 경질층 및 다공성층의 2층 구조(공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층)로 만든 후 이들을 가교화시킴으로써 콜라겐 기반 매트릭스의 기계적 강도를 향상시키고, 이러한 제조방법에 의해 제조된 3차원 다공성 콜라겐 기반 매트릭스는 수용액 중에서 다공성의 막이 부분적으로 파괴되어 손실되고 경질층과 쉽게 분리되는 문제점이 발생하지 않는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서 한외여과 및 정용여과 방법을 융합시킨 분리방법을 이용한 아텔로콜라겐 분리 및 정제에 사용되는 분리 정제 장치(100)를 개략적으로 도시하는 블럭도이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐(시료 농도 0.5mg/mL)의 수분제거 후 아텔로 콜라겐을 정량한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 3은 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 대해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomasie Brilliant Blue)로 염색한 전기영동결과 사진 및 이에 대한 정량적인 분석 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 대해 전기영동을 수행한 후 웨스턴 블롯팅을 시행하여 콜라겐 타입이 제1형 콜라겐임을 확인한 전기영동사진이다.
도 5는 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 대해 원편광 이색성(圓偏光二色性) 스펙트럼(circular dichroism spectrum) 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 각각 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 텔로펩타이드 제거를 위해 사용된 펩신이 잔류하는지 여부를 확인하기 위해 펩신을 정량한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 7은 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 돼지 유래 바이러스인 HEV(Hepatitis E virus)가 검출되는지 여부를 확인하기 위해 리얼타임 PCR을 수행한 결과를 나타내는 데이터 도표이다.
도 8은 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 돼지 유래 바이러스인 JEV(Japanese encephalitis virus)가 검출되는지 여부를 확인하기 위해 RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR)을 수행하고 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 본 발명의 일실시예의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 수득한 숙시닐화 아텔로 콜라겐(음이온화된 아텔로 콜라겐)의 용해도를 통상의 아텔로 콜라겐과 비교한 사진이다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예 1: 아텔로 콜라겐 분리 방법

실시예 1-1: 동물조직의 전처리 과정

우선, 동물조직으로 돼지 피부를 준비하고, 수돗물을 이용하여 세척하였다. 본 실시예에서는 동물조직으로서 돼지 피부를 사용하였으나, 콜라겐을 함유하는 다양한 동물조직, 예를 들어, 소꼬리, 돼지의 연골 조직, 골조직, 건조직 등을 사용할 수 있음은 물론이다.

세척된 돼지 피부를 2cm×10cm 크기로 절단하고 절단된 돼지 피부를 0.1~1M 초산용액에 담군 후, 4℃에서 16~24시간 동안 팽윤(swelling)시켰다. 팽윤된 돼지 피부 조직의 지방 및 표피를 칼을 이용하여 제거하고, 지방 및 표피가 제거된 조직을 1cm×1cm의 크기로 절단하였다.

1cm×1cm의 크기로 절단된 조직을 정제수로 5~10회 세척한 후 90~99% 에탄올 용액에 넣어 4℃에서 16~24시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 1cm×1cm의 크기로 절단된 조직을 체에 걸러서 에탄올 용액을 제거한 후, 재차 90~99% 에탄올 용액에 넣어 4℃에서 5시간 이상 교반하였다.

그리고 나서, 에탄올 용액에서 교반되어 처리된 조직을 체에 거르고 0.1~1M 초산용액에 담군 후, 20~60분 동안 팽윤시켰다. 팽윤된 조직을 0.1~1M 초산용액으로 블렌딩(blending)하였다. 이렇게 블렌딩한 조직을 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 균질화하였다.

실시예 1-2: 텔로펩타이드 제거 및 아텔로 콜라겐의 추출 과정

① 실시예 1-1에서 전처리 과정을 수행하여 수득한 용액에 펩신을 처리하고 4℃에서 24~72시간 동안 교반한 후, 상기 용액의 pH를 8로 조정하여 펩신을 불활성화시켰다.

② 상기 ①번 과정을 통해 얻은 용액을 4℃에서 10~30분 동안 7,000~15,000g로 원심분리한 후, 상층의 지방 및 하층의 불순물을 제거하고 중간층의 용액을 취하였다.

③ 원심분리과정을 통해 분리한 상기 중간층 용액의 중량을 측정한 후, 1~10M NaCl 용액을 첨가하고 4℃에서 10~60분간 교반하여 아텔로 콜라겐을 추출하였다.

④ 상기 ③번 과정을 거친 용액을 원심분리하여, 추출된 아텔로 콜라겐 침사를 얻었다.

⑤ 상기 ④번 과정에서 추출한 아텔로 콜라겐 침사를 90~99% 에탄올 용액에 첨가하고 4℃에서 16~24시간 동안 교반하였다.

⑥ 상기 ⑤번 과정을 거친 용액을 추가로 원심분리하여 아텔로 콜라겐 침사를 얻고, 상기 ⑤번 과정을 한 번 더 반복하였다.

실시예 1-3: 아텔로 콜라겐의 분리 정제 과정

① 실시예 1-2의 아텔로 콜라겐 추출 과정을 수행하여 수득한 용액을 원심분리하여 침사를 얻은 후, 0.01~0.1M 우레아 용액에 넣어 4℃에서 16~24시간동안 교반한다.

② 상기 ①번 과정을 통해 얻은 용액(이하, "정제대상이 되는 콜라겐 용액"이라 함)을 한외여과 및 정용여과 방법을 융합시킨 분리방법을 이용하여 단일의 공정라인을 통해 분리정제한다. 이를 위해 도 1에 도시된 바와 같은 분리 정제 장치(100)를 준비하였다. 도 1의 장치는 직접 제작할 수도 있고, Pall corporation이 판매하는 장치(모델명: CENTRASETTE^TM System)를 이용하여 구성할 수도 있다.

③ 도 1의 분리 정제 장치(100)의 여과모듈 (30) 내에 여과 멤브레인(미도시)을 조립하고, 정제수를 이용하여 여과 멤브레인에 남아 있는 NaOH를 세척한다.

④ 도 1에 도시된 분리 정제 장치(100)의 여과모듈(30)에 제공된 피드 압력계(32)와 잔류물 압력계(34)를 확인하면서 "정제대상이 되는 콜라겐 용액"이 유입되는 피드 부분(33)과, 여과모듈(30)에 잔류하여 피드탱크(10)로 복귀되는 "잔류물(retentate)"이 유출되는 잔류 부분(35)의 압력을 모두 해제하고, 여과 멤브레인의 앞부분을 정제수를 이용하여 세척한다.

⑤ 도 1에 도시된 분리 정제 장치(100)의 압력조절밸브(40)를 조정하여 여과모듈(30)의 잔류 부분(35)에 10~30psi의 압력을 인가하여, 피드 부분(33)으로부터 자유롭게 유입된 정제수가 가압되도록 함으로써 정제수가 여과 멤브레인의 뒷부분도 세척하도록 한다. 세척완료 후에는 잔류 부분(35)의 압력을 해제한다.

⑥ "정제대상이 되는 콜라겐 용액"을 수용하기 위한 용기와 분리정제된 아텔로 콜라겐 용액을 수용하는 용기를 준비하고 이들 용기들을 도 1의 분리 정제 장치(100)에 호스를 통해 연결한다.

⑦ 도 1의 분리 정제 장치(100)의 압력조절밸브(40)를 조정하여 여과모듈(30)의 잔류 부분(35)에 10~30psi의 압력을 인가한다. 이렇게 하면, 피드 펌프(20)에 의한 펌핑 작용에 의해 피드 탱크(10)로부터 피드 부분(33)을 통해 여과모듈(30)에 유입되는 "정제대상이 되는 콜라겐 용액"이 가압되고 아텔로 콜라겐이 여과 멤브레인을 통과되어 여과된다. 이로써 1차적으로 "정제대상이 되는 콜라겐 용액"에 대한 한외여과가 이루어지게 되고, 정제된 일부 아텔로 콜라겐은 여과모듈(30)로부터 빠져 나와 미리 준비된 용기에 수용된다.

⑧ 그리고, 상기 ⑦번 과정의 한외여과 과정에서 여과 용액의 속도가 대략 1g/분 이하로 감소하면 여과를 멈춘다.

⑨ 그리고, 아텔로 콜라겐의 분리정제 과정의 간편성과 효율성을 위해 한외여과 과정과 정용여과 과정을 융합하여 도 1에 도시된 분리 정제 장치(100)를 이용한 단일공정에 의해 아텔로 콜라겐의 수율과 순도를 높이는 분리 정제를 수행한다. 즉, 도 1의 분리 정제 장치(100)에서 여과모듈(30)내의 여과 멤브레인을 통해 여과되지 않은 잔류물은 여과모듈(30)의 잔류 부분(35)을 통해 일정한 유량으로 피드탱크(10)로 복귀되는데, 상기 ⑧번 과정에서 한외여과 속도가 일정한 속도 이하로 감소하면 한외여과를 중단하고 피드탱크(10)로 복귀된 잔류물에 대한 정용여과 과정을 이어서 수행하게 되는 것이다. 이때, 한외여과된 용액과 동일한 양의 정제수를 피드 탱크(10)에 복귀된 잔류물에 추가하고 도 1에 도시된 분리 정제 장치(100)를 이용하여 5회 이상 정용여과를 수행한다.

⑩ 상기 ⑦번 과정을 통해 한외여과되어 수득된 아텔로 콜라겐 용액과 상기 ⑨번 과정을 통해 정용여과되어 수득된 아텔로 콜라겐 용액을 pH 7.0이 되도록 조정한 후, 동결건조하여 스펀지 형태의 아텔로 콜라겐을 최종적으로 얻는다.

본 실시예의 아텔로 콜라겐 분리정제 방법을 사용하면 여러 개의 필터를 겹쳐서 사용할 경우 고가의 필터를 다수 소모함으로써 정제비용이 많이 소요되고 정제가 불편한 문제를 해소할 수 있다. 즉, 재사용이 가능한 필터를 이용하는 한외여과로 우선 아텔로 콜라겐을 일부 정제하고 여과 속도를 기준으로 한외여과의 효율이 떨어지는 것으로 판단되면 필터의 교체나 장치의 재정비 없이 바로 여과모듈(30)을 잔류물에 대한 정용여과장치로 활용할 수 있다. 즉, 본 실시예의 아텔로 콜라겐 분리정제 방법은 도 1에 도시된 바와 같은 분리 정제 장치(100)를 이용한 순환식의 단일 공정라인을 통해 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하고 동물 조직으로부터 아텔로 콜라겐을 경제적으로 수율 좋게 고순도로 분리추출할 수 있다.

실시예 2: 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐의 순도 및 안전성 등의 분석시험

실시예 2-1: 분리정제된 아텔로 콜라겐의 순도, 변성 여부, 타입 등 분석

실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐(시료 농도 0.5mg/mL)의 수분제거 후 아텔로 콜라겐을 정량하였다. 그 결과, 도 2a 및 도 2b에 도시된 같이, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리 정제된 아텔로 콜라겐의 순도가 98% 이상임을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐 아텔로 콜라겐에 대해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomasie Brilliant Blue)로 염색하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리 정제된 아텔로 콜라겐의 펩타이드 α사슬의 존재를 확인할 수 있었고 그 순도가 98% 이상임을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 대해 원편광 이색성(圓偏光二色性) 스펙트럼(circular dichroism spectrum) 분석을 수행하였다. 도 5에 도시된 그래프에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리 정제된 아텔로 콜라겐은 변성되지 않고 펩타이드 나선쇄(α사슬) 3개가 수소결합을 한 구조를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.

그리고, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 텔로펩타이드 제거를 위해 사용된 펩신이 잔류하는지 여부를 확인하기 위해 펩신을 정량하였다. 그 결과, 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에는 펩신이 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 아텔로콜라겐 분리방법은 동물조직으로부터 아텔로 콜라겐을 변성되지 않은 상태로 유지하면서 고순도로 분리정제하는데 효과적인 방법임을 알 수 있다.

한편, 도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 대해 전기영동을 수행한 후 웨스턴 블롯팅을 시행하여 콜라겐 타입을 확인한 결과 분리정제된 아텔로 콜라겐은 제1형 콜라겐임을 확인할 수 있었다. 웨스턴 블롯팅 과정에서 1차 항체로는 마우스의 항-제1형 콜라겐 단일클론 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 페록시다아제가 접합된 토끼의 항-마우스 IgG를 사용하였다.

실시예 2-2: 분리정제된 아텔로 콜라겐의 안전성 검사

실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐이 돼지 조직으로부터 유래한 것임을 감안하여 돼지 유래 바이러스의 존재를 검출하여 안전성 검사를 시행하였다.

우선, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 돼지 유래 바이러스인 HEV(Hepatitis E virus)가 검출되는지 여부를 확인하기 위해 리얼타임 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 7에서 확인되는 바와 같이, 돼지 유래 바이러스인 HEV가 음성인 것으로 확인되어 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리정제된 아텔로 콜라겐에서는 HEV가 검출되지 않아 인체에 무해함을 알 수 있었다.

다음으로, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 돼지 유래 바이러스인 JEV(Japanese encephalitis virus)가 검출되는지 여부를 확인하기 위해 RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR)을 수행하고 전기영동하였다. 도 8의 전기영동결과 사진에서 확인되는 바와 같이, JEV에 해당하는 유전자 밴드가 나오지 않는 것으로 확인되어 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리정제된 아텔로 콜라겐에서는 JEV가 검출되지 않아 인체에 무해함을 알 수 있었다.

이상과 같은 분리정제된 아텔로 콜라겐의 순도 및 안전성 등의 분석시험에 따르면, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리정제된 아텔로 콜라겐은 제1형 콜라겐으로서 텔로펩타이드 제거시 사용된 펩신과 기타 불순물이 제거된 고순도의 아텔로 콜라겐으로서 동물 바이러스의 감염 위험성 측면에서도 안전한 것으로 판명되었다. 따라서, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리정제된 아텔로 콜라겐은 본연의 상태로 화장품, 의약품, 식품 등 다양한 분야에 적용할 수 있다.

실시예 3: 개질된 아텔로 콜라겐 제조방법

이하에서는 중성의 용액에도 용해되어 다양한 제형으로의 적용이 용이하여 사용편의성 및 생체적합성이 향상된 개질된 아텔로콜라겐인 숙시닐화 아텔로 콜라겐 및 에스테르화 아텔로 콜라겐의 제조방법을 설명한다. 본 발명의 개질된 아텔로 콜라겐의 제조방법은 종래의 방법 보다 수율을 향상시키고 순도를 높이는 면에서 개선된 것이다.

실시예 3-1: 숙시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법

본 발명의 일실시예의 숙시닐화 아텔로 콜라겐의 제조방법은 다음과 같다.

① 0.1M 초산 용액에 0.002~0.01 중량%에 해당하는 아텔로 콜라겐(실시예 1에서 분리정제된 것 또는 상업적으로 구입가능한 것 모두 사용가능)을 넣고 4℃에서 1~2일간 교반시켜 아텔로 콜라겐을 용해시킨다.

② 상기 ①번 과정에서 얻은 아텔로 콜라겐 용액에, 상기 ① 과정에서 첨가한 아텔로 콜라겐 1g당 0.8~1.3g 정도의 비율로 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 넣고, 10분 동안 0.05~1M NaOH를 이용하여 pH를 9～10근처로 유지시킨다.

③ 상기 ②번 과정에서 얻은 용액을 4℃에서 30분 동안 교반시킨다.

④ 상기 ③번 과정에서 교반한 용액을 0.05~1M NaOH를 이용하여 10분 동안 pH를 9～10근처로 유지시킨다.

⑤ 상기 ④번 과정에서 얻은 용액을 4℃에서 30분 동안 교반시킨다.

⑥ 상기 ⑤번 과정에서 교반한 용액을 0.05~1M NaOH를 이용하여 10분 동안 pH를 9～10근처로 유지시킨다.

⑦ 상기 ⑥번 과정에서 얻은 용액을 4℃에서 20분 동안 교반시킨다.

⑧ 상기 ⑦번 과정에서 교반한 용액을 0.05~1M NaOH를 이용하여 10분 동안 pH를 9～10근처로 유지시킨다.

⑨ 상기 ⑧번 과정에서 얻은 용액을 4℃에서 10분 동안 교반시킨다.

⑩ 상기 ⑨번 과정에서 교반한 용액을 0.05~1M NaOH를 이용하여 pH 9～10으로 조절한다.

⑪ 상기 ⑩번 과정에서 얻은 용액을 3~7M HCl을 이용하여 pH 4.03으로 조절하여 숙시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 형성시키고, 4℃에서 15분 동안 교반한다.

⑫ 상기 ⑪번 과정에서 교반한 용액을 원심분리하여 숙시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 얻는다.

⑬ 상기 ⑫ 과정에서 얻은 아텔로 콜라겐 침사에, 상기 ①번 과정에서 첨가한 아텔로 콜라겐 1g당 20mL 정도의 비율로 3~7M HCl을 이용하여 pH 4.03으로 조절된 증류수를 첨가하고, 4℃에서 15분 동안 교반하여 세정한다.

⑭ 상기 ⑬번 과정에서 얻은 용액을 원심분리하여 세정된 숙시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 얻는다.

⑮ 상기 ⑬번 과정과 ⑭번 과정을 한번 더 반복하여 얻은 세정된 숙시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 -70℃에서 30시간 동안 동결건조하여 최종적으로 숙시닐화 아텔로 콜라겐을 얻는다.

전술한 바와 같은 제조공정을 통해 아텔로 콜라겐이 숙시닐화되는 반응을 나타내는 반응식은 다음과 같다.

반응식 1

한편, 기존의 방법을 이용하여 숙시닐화 콜라겐을 제조할 경우 숙신산 무수물의 pH가 너무 낮아도 또는 너무 높아도 용해되지 않는 문제가 있다. 숙신산 무수물은 pH가 9~10 정도일 때 용해가 가장 잘 되며 pH가 11이상이 될 경우에는 용해가 되지 않는다. 이러한 문제점에 착안하여 본 발명자들은 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응에 따라 pH가 변화되면 숙신산 무수물의 용해도가 떨어져 반응속도가 떨어지고 수율이 낮아지는 문제점을 확인하고, 이러한 문제점을 해결하기 위해 이들 반응용액의 pH를 반복하여 9~10으로 유지하는 공정(상기 ③～⑪ 과정)을 새로이 도입하였다.

즉, 전술한 바와 같은 본 발명의 일실시예의 숙시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법에서는 저온에서 일정 시간 동안 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응물을 교반한 후 교반한 용액을 일정 시간 동안 pH 9～10으로 유지함으로써 숙신산 무수물의 용해가 잘 일어나도록 하여 숙시닐화 반응을 촉진하였다. 이로써 본 발명의 일실시예의 숙시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법에 따르면, 숙시닐화 아텔로 콜라겐의 수율을 향상시킬 수 있다.

실시예 3-2: 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법

본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐의 제조방법은 다음과 같다.

① 70~90% 에탄올(또는 메탄올)에 1~5 중량%에 해당하는 아텔로 콜라겐(실시예 1에서 분리정제된 것 또는 상업적으로 구입가능한 것 모두 사용가능)을 넣은 분산액에 0.5~1M 초산(acetic acid) 또는 0.1~0.5M HCl을 넣어 pH 2~4로 조절한 후 4℃에서 4~10일 동안 교반한다.

② 상기 ①번 과정에서 얻은 아텔로 콜라겐 분산액을 0.1~0.5M NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 조정한 후 원심분리하여 침사만 얻는다.

③ 상기 ②번 과정에서 얻은 침사를 1g당 10~100mL 정도의 비율의 정제수에 교반한 후 투석 멤브레인(dialysis membrane)에 넣어 정제수(dialysis buffer) 내에서 투석(dialysis)을 실시한다.

④ 16~24시간 동안 교반한 후 정제수(dialysis buffer)를 교체하고, 그 후에는 3~5시간 마다 정제수(dialysis buffer)를 3~12번 교체한다.

⑤ 상기 ③번 과정 및 ④번 과정을 통해 투석된 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 -70℃에서 30시간 이상 동결건조하고, 동결건조된 에스테르화 아텔로 콜라겐을 얻는다.

전술한 바와 같은 제조공정을 통해 아텔로 콜라겐이 에스테르화되는 반응을 나타내는 반응식은 다음과 같다.

반응식 2

한편, 기존의 방법을 이용한 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법에서는 수율과 순도 향상을 위해 단순히 정제수를 이용한 투석만을 수행하는 반면에, 본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법에서는 에탄올 또는 메탄올에 아텔로 콜라겐을 넣은 아텔로 콜라겐 분산액을 중성화시키고, 원심분리하여 침사만을 얻은 후 투석 멤브레인을 이용하여 투석을 수행하여 순도 및 수율을 향상시켰다.

실시예 4: 개질된 아텔로 콜라겐의 물성 평가

실시예 3에서 본 발명의 일실시예의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 수득한 숙시닐화 아텔로 콜라겐(음이온화된 아텔로 콜라겐)의 용해도를 통상의 아텔로 콜라겐과 비교하였다. 도 9의 사진에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 제조된 숙시닐화 아텔로 콜라겐은 중성의 pH(pH 6.0～7.0)에서 높은 용해도를 보이는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일실시예의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 수득한 "아텔로 콜라겐에 숙신산 무수물을 결합시킨 숙시닐화 아텔로 콜라겐"은 음이온적인 성질을 띠고 있어 중성의 pH에서도 용해되며 세포의 부착, 증식, 이동을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 수득한 "아텔로 콜라겐에 에탄올(또는 메탄올)을 결합시킨 에스테르화 아텔로 콜라겐" 역시 중성의 pH에서도 용해되며, 양이온적인 성질을 띠고 있어 세포와 더욱 빠르고 쉽게 결합할 수 있는 장점이 있다.

따라서, 본 발명에서는 한외여과 및 정용여과 방법을 통해 얻어진 고순도의 아텔로 콜라겐을 숙시닐화 및 에스테르화하여 중성의 pH 용액에서도 용해될 수 있도록 변형시켜 콜라겐의 펩타이드화 및 효소처리 등에 의한 가수분해 없이 콜라겐 본연의 상태로 화장품, 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서도 적용할 수 있는 장점이 있는 것이다.

실시예 5: 3차원 매트릭스 구조의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법

이하에서는 본 발명은 전술한 바와 같은 아텔로콜라겐 및 개질된 아텔로콜라겐을 이용하여 경질층 및 다공성층(공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층)을 만들고 이들을 가교화시킴으로써 기계적 강도를 향상시킨 3차원 매트릭스 구조의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법을 구체적으로 단계별로 설명하기로 한다.

본 발명에 포함되는 콜라겐 기반 매트릭스는 다공성막과 경질막의 2중막으로 구성되며 기본적으로 다공성막과 경질막은 아텔로 콜라겐 분산액으로부터 얻어진다.

실시예 5-1: 아텔로 콜라겐 분산액의 제조방법

우선, 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액은 증류수에 1~3 중량%에 해당하는 실시예 1에서 수득한 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃에서 1~2일간 교반 분산시킨 후 0.05~1N NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 조절하여 준비한다.

그리고, 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액은 증류수에 2~5 중량%의 실시예 1에서 수득한 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지한 상태에서 1~2일간 교반하여 분산시킨 후 0.05~1N NaOH를 첨가하여 pH를 7.4로 조절하여 준비한다.

실시예 5-2: 아텔로 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법

이하에서는 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액과, 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액으로 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하는 실시예를 설명한다.

① 우선, 실시예 5-1에서 준비한 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 페트리디쉬(Petri dish) 또는 이형성의 평판 위에 확산시켜 0.05~1mm 범위의 균일한 막을 형성시킨 다음 -60~-80℃에서 1~2일간 동결건조기에서 동결건조시켜 다공성막을 제조한다.

② 그리고, 실시예 5-1에서 준비한 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 이형성의 평판바닥에 확산시켜 1~20psi의 압력을 가해 0.05~1mm의 경질막을 제조한다.

③ 그런 다음, 상기 ②번 과정에서 얻은 경질막을 10~20분정도 상온에서 건조시킨 후 그 위에 상기 ①번 과정에서 얻은 다공성막을 가볍게 적층시켜 상온에서 1~2일간 풍건하여 경질막과 다공성막을 결합시켜 2중막을 얻는다.

④ 90~99 중량%의 에탄올 용액에 EDC를 10~100mM농도로 첨가하여 4℃에서 10~15분간 교반하여 얻은 혼합용액에, 상기 ③번 과정에서 얻은 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 1~2일간 다공성막과 경질막을 가교화시키거나, 90~99 중량%의 에탄올 용액에 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 0.5～1% 비율로 첨가한 후 4℃에서 10～15분 동안 교반하여 얻은 혼합용액에, 상기 ③번 과정에서 얻은 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 4~8 시간 동안 다공성막과 경질막을 가교화시킨다.

⑤ 상기 ④번 과정에서 가교화된 2중막에서 EDC 또는 글루타르알데히드를 제거하기 위해 증류수로 4~6회 세정하고, 세정된 2중막을 다시 -60℃~-80℃에서 1~2일간 동결건조하여 정형의 2중막을 제조한다.

⑥ 상기 ⑤번 과정에서 제조된 2중막을 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm크기로 재단하여 조직수복재로서의 활용도를 높인 콜라겐 기반 매트릭스를 완성한다.

실시예 5-3: 아텔로 콜라겐 기반 매트릭스의 구체적인 제조방법

이하에서는 상기 실시예 5-2로 제시된 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법을 좀더 구체적으로 설명한다.

① 우선, 증류수에 2 중량%에 해당하는 실시예 5-1에서 준비한 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지하여 40시간 교반하여 분산시켜 콜라겐 분산액을 얻었고, 이 분산액에 0.5N NaOH를 넣어 pH를 7.4로 조절한 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 얻었다. 그리고, 증류수에 4 중량%에 해당하는 실시예 5-1에서 준비한 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지하여 30시간 교반하여 분산시켜 콜라겐 분산액을 얻고 이 분산액에 0.5N의 NaOH를 넣어 pH를 7.4로 조절한 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 얻었다.

② 상기 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 이형성의 평판 위에 확산시켜 0.5mm의 균일한 막을 형성시킨 다음 -70℃로 유지된 동결건조기에서 30시간 동결건조시켜 다공성막을 제조하였고, 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 이형성의 평판바닥에 확산시키고 다공성의 흡착판으로 10psi의 압력을 가해 0.5mm의 경질막을 제조하였다.

③ 상기 ②번 과정에서 얻은 경질막을 15분간 상온에서 건조시킨 후 그 위에 상기 ②번 과정에서 얻은 다공성막을 가볍게 적층시키고 상온에서 30시간 풍건하여 경질막과 다공성막을 결합시켜 2중막을 얻었다.

④ 95 중량%의 에탄올 용액에 EDC를 50mM농도로 첨가하여 4℃에서 15분간 교반하여 혼합용액을 얻었다.

⑤ 상기 ④번 과정에서 얻은 혼합용액에 상기 ③번 과정에서 얻은 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 40시간 동안 다공성막과 경질막을 가교화시켰다.

⑥ 가교화시키는 또 다른 방법으로서, 95 중량%의 에탄올 용액에 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 0.625% 비율로 첨가하여 4℃에서 15분간 교반하여 혼합용액을 얻었다.

⑦ 상기 ⑥번 과정에서 얻은 혼합용액에 상기 ③번 과정에서 얻은 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 4시간 동안 다공성막과 경질막을 가교화시켰다.

⑧ 상기 ⑤번 과정 및 ⑦번 과정에서 가교화된 2중막에서 EDC 또는 글루타르알데히드를 제거하기 위해 증류수로 15분간 5회 세정하였다.

⑨ 세정된 2중막을 다시 -70℃에서 30시간 동결건조하여 정형의 2중막을 얻었다.

⑩ 상기 ⑨번 과정에서 얻은 2중막을 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm 크기로 재단하여 조직 수복재료로서의 활용도를 높인 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하였다.

한편, 본 발명의 아텔로 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에서는 아텔로 콜라겐 분산액 대신에 콜라겐 섬유와 결합시 세포의 이동을 증가시킬 수 있는 무코다당(mucopolysaccharide)인 히알루론산을 첨가한 "아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액"을 사용할 수 있고, 또한 이들 분산액에 페니실린 등의 항생제를 첨가할 수도 있다(대한민국 등록특허 제10-0947765호 참조).

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

10: 피드 탱크 20: 피드 펌프
30: 여과 모듈
32: 피드 압력계 34: 잔류물 압력계
33: 피드 부분 35: 잔류 부분
40: 압력조절밸브
100: 분리 정제 장치

Claims (19)

1. (a) 텔로펩타이드가 제거된 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 용기 내에 준비하는 단계와,
   (b) 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에 압력을 인가하여 상기 시료가 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되도록 하는 한외여과 과정을 수행하는 단계와,
   (c) 상기 한외여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,
   (d) 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되는 아텔로 콜라겐 용액의 유량을 측정하여 한외여과 속도를 결정하는 단계와,
   (e) 상기 한외여과 속도가 일정한 속도 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 단계와,
   (f) 상기 시료 중 상기 여과 멤브레인을 통과하지 못하고 상기 용기로 복귀되는 잔류물에 물을 첨가한 후 이를 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시켜 정용여과 과정을 수행하는 단계와,
   (g) 상기 정용여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,
   (h) 상기 (f) 단계와 상기 (g) 단계를 반복하는 단계를 포함하는 아텔로콜라겐 분리방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서 펌프에 의한 펌핑 작용에 의해 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에는 10~30psi의 압력을 인가하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐 분리방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 (e) 단계에서 상기 한외여과 속도가 1g/분 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐 분리방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 (f) 단계에서 상기 용기로 복귀되는 잔류물에는 한외여과 과정을 통해 여과된 용액과 동일한 양의 정제수를 첨가하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐 분리방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 정용여과 과정은 적어도 5회 수행하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐 분리방법.
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