KR20030072512A - 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법 - Google Patents
유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20030072512A KR20030072512A KR1020020011381A KR20020011381A KR20030072512A KR 20030072512 A KR20030072512 A KR 20030072512A KR 1020020011381 A KR1020020011381 A KR 1020020011381A KR 20020011381 A KR20020011381 A KR 20020011381A KR 20030072512 A KR20030072512 A KR 20030072512A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- collagen
- organic solvent
- ether
- solution
- solvent
- Prior art date
Links
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 127
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 124
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 124
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 title claims abstract description 27
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N methyl pentane Natural products CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- POLCUAVZOMRGSN-UHFFFAOYSA-N dipropyl ether Chemical compound CCCOCCC POLCUAVZOMRGSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N butyl acetate Chemical compound CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 abstract 1
- 229960004132 diethyl ether Drugs 0.000 abstract 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 14
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- WVCHIGAIXREVNS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC(=O)C(=O)C2=C1 WVCHIGAIXREVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000005456 alcohol based solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000004210 ether based solvent Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- ASYBZHICIMVQII-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxylysine Chemical compound NCCC(O)CC(N)C(O)=O ASYBZHICIMVQII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100331550 Antirrhinum majus DICH gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282941 Rangifer tarandus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000000490 cosmetic additive Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
- A61L31/04—Macromolecular materials
- A61L31/043—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof
- A61L31/044—Collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
- A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L31/146—Porous materials, e.g. foams or sponges
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Surgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 고순도로 정제된 I 형 콜라겐 또는, I 형 콜라겐 및 III 형 콜라겐의 혼합물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 i) 산성용매로 콜라겐을 용해시켜 콜라겐을 추출하는 단계; ii) 펩신으로 콜라겐의 비나선형 부분을 제거하여 아텔로콜라겐을 제조하는 단계; iii) 상기 아텔로콜라겐을 유기용매로 용해시키고, 그로 인해 발생한 비콜라겐성 지방성분 및 불용성 콜라겐으로 이루어진 층을 원심 분리하여 제거하는 단계; 및 iv) 다시 초고속 원심분리 및 염석(salting out)으로 투명한 성상의 콜라겐 용액을 수득하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 효소처리를 통해 비콜라겐성 물질을 제거하고 면역성을 감소시킨 후 유기용매를 이용해 지방성 불순물 및 불용성 콜라겐을 추출하여 제거함으로써, 용해도가 증가되고 높은 순도, 점도, 투명도, 수율 등의 유리한 성질을 갖는 I 형 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이다.
콜라겐은 통상 세포외기질(extra-cellular matrix)의 주 단백질 성분으로서, 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하며, 대부분의 다른 체 구조물에서는 섬유성 봉입체로서 존재한다. 콜라겐은 나선 구조를 가지며, 이로 인해 콜라겐은 단백질 분해에 대한 내성을 갖는다.
콜라겐은 세포접착을 위한 천연 물질이고, 근육-골격 시스템의 주 인장 하중 지지 성분이기 때문에, 콜라겐은 이식 가능한 보철 제조 및 생체 조직 상당물의 제조에 널리 사용된다. 상기 조직 상당물은 피부와 같은 상피 조직 및 결합 조직과, 연골, 뼈, 혈관의 상당물을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니며, 생체 세포 및 세포외기질 분자(주로 콜라겐)를 포함한다. 이러한 조직 상당물은 연구 및 개발, 조직 및 기관 대체 및 시험에의 용도를 포함하는 광범위한 용도들을 갖는다.
많은 연구자들에 의해 콜라겐을 조직으로부터 추출하여 정제하는 방법이 연구되어져 왔는데, 그 대부분의 방법들이 효소추출에 의해 콜라겐 분자의 양 말단에 존재하는 비나선형 부분을 제거하여 면역성을 감소시킨 아텔로콜라겐을 제조하는 방법을 포함하고 있다. 효소 추출에 사용 가능한 효소로는 펩신, 트립신, 파파인, 카뎁신 등이 사용될 수 있으나, 이 중 펩신이 가장 적절한 효소로 알려져있다. (문헌 [Niyibibizi, C 등, J. Biol.Chem., 259, 14170, 1984] 및 [Hill, R.J 등, Anal. Biochem., 141, 83, 1984] 참조)
그러나, 상기한 공지 기술로는 콜라겐을 순수한 모노머(monomer)의 수준으로정제하고자 할때, 지방성분 불순물 및 올리고머 또는, 응집체 형태의 불용성 콜라겐이 포함되는 등의 많은 문제점이 있었다.
상기한 문제점들을 해결하기 위한 많은 연구들이 있어왔는데, 지방성분을 제거하는 방법으로 한국 특허공개 번호 제 1988-0005875 등에 개시된 방법들이 있다. 그러나, 상기 방법들은 지방성분을 제거하기 위한 방법으로, 원료 생가죽을 분쇄한 직후에 유기용매를 사용하는 방법을 채용하고 있기 때문에, 조직의 표면에 노출되어있는 피하지방 층의 일부분만 제거할 수 있는 단점이 있다. 문헌 [Lin 등, 1997, Journal of controlled release, 44, 103-112]에 개시된 방법 또한 유기용매를 단지 조직 절편에 처리하는 방법이기 때문에, 단순히 피부조직의 표면을 세척해줄 뿐이었다.
이상과 같은 종래 기술들은 콜라겐을 추출 및 정제하는 과정에서 비콜라겐성 물질 및 불용성 콜라겐들을 효율적으로 제거할 수 없고, 이로써 생체 재료로서 이용 가능한 순수 등급의 콜라겐을 제조할 수 없는 문제점이 있었다.
따라서, 비콜라겐성 물질 및 불용성 콜라겐을 효율적으로 제거함으로써, 순수 등급의 콜라겐을 제조할 수 있는 방법이 요구되어져 왔다.
본 발명의 목적은 종래 기술과 달리 지방성분 불순물 및 불용성 콜라겐을 효과적으로 제거하여 순수등급의 콜라겐을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다. 즉, 가용성 콜라겐을 제조하는 방법에 있어서, 유기용매를 이용하여 비콜라겐성 물질과 불용성 콜라겐을 효율적으로 추출 및 제거하여 콜라겐 용액의 용해도를 높이고, 극히 투명한 성상을 가지는 고순도 콜라겐을 제공하고자 한다.
도 1은 콜라겐을 전기영동을 하였을 때 나타난 밴드(band)를 나타낸다.
도 2는 콜라겐의 알파 밴드와 베타 밴드의 농도 비교 그래프를 나타낸다.
도 3은 670nm에서 콜라겐 용액의 탁도(turbidity) 측정 그래프를 나타낸다.
도 4는 콜라겐의 투명도 증가 그래프이다.
도 5는 230nm에서 히드록시프롤린의 흡광도 그래프를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 아텔로콜라겐으로 이루어진 스폰지의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 아텔로콜라겐으로 이루어진 스폰지에 섬유아세포(fibroblast)를 배양한 결과의 전자현미경 사진을 나타낸다.
본 발명은 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법에 관한 것이다. 종래의 방법에 의해 추출된 콜라겐은 불용성 콜라겐이므로, 미세결정성 혹은 섬유상 콜라겐으로 구성되는데, 이로 부터, 가용성 콜라겐을 얻고자 할 때에는, 불용성 콜라겐의 제거를 위한 별도의 여과 공정을 실시하는 등의 복잡한 단계를 거쳐야 하며, 그 수득율 또한 낮다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 문제를 극복하기 위한 많은 연구를 통해, 동물의 피부로부터 콜라겐을 추출하는 단계뿐만 아니라 정제하는 단계에서도 다시 유기용매를 사용한 결과, 불용성 콜라겐의 제거 및 가용성 콜라겐의 회수율이 높아짐을 발견하였고, 이를 기초로 하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 원리는 추출되고 효소 처리된 콜라겐 용액 중에 존재하는 불용성 콜라겐이 올리고머 혹은 응집체를 형성함으로써, 입자표면이 소수성을 띠게 되는 성질을 이용하여 유기용매 상으로 추출하여 제거하는 것이며, 본 발명의 방법으로써 용해된 콜라겐 용액 중 지방성분 불순물을 또한 효과적으로 제거할 수 있었다.
이 때 사용되는 유기용매로는 불용성 콜라겐 및 지방 불순물을 용해시킬 수 있는 용매이면 제한되지 않으나, 페트로륨에테르, 디메틸에테르, 디에틸에테르, 디부틸에테르, 디프로필에테르 등의 에테르계 용매, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 등의 알콜계 용매, 노말부틸아세테이트, 헥산, 다이메틸케톤, 이소프로판올, 클로로포름 또는 사염화탄소 등이 바람직하다.
즉, 본 발명의 요지는 종래의 방법과 달리 유기 용매를 산성용액 및/또는 효소 처리 후의 단계에 다시 사용함으로써, 지방성분 불순물 및 불용성 콜라겐을 현저하게 효과적으로 제거하고, 그로써 고순도의 산 용해성 콜라겐의 수율을 증가시키는 것이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 콜라겐의 제조를 위한 원료로는 생소가죽, 송아지가죽, 염장소가죽, 생순록가죽, 일광 건조된 돼지 가죽, 양가죽, 염소가죽, 및 가죽 부산물에서 생성되는 공업용 콜라겐 등이 사용될 수 있다. 상기 원료 중 본 발명의 실시예에서 사용되는 갓 태어난 자돈의 피부가 특히 바람직하다. 일반적으로, 생체 내에 결합조직으로 존재하는 콜라겐은 동물의 수령이 증가함에 따라 체내에서 분자간 가교결합의 정도가 증가하기 때문에, 이러한 재료를 이용해 추출을 하여 수득된 콜라겐은 상당량의 비가용성인 콜라겐을 포함하게 된다. 그러나, 본 발명에서와 같이 자돈의 피부를 사용하는 경우, 생체 내의 가교결합의 정도가 적기 때문에 가용성 콜라겐을 높은 수율로 얻을 수 있을 뿐아니라, 또한 자돈은 농장에서 태어나자마자 부득이하게 폐사하는 경우가 많아 용이하게 재료를 확보할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 가용성 콜라겐을 제조하는 방법은 i) 산성용매로 콜라겐을 용해시켜 콜라겐을 추출하는 단계; ii) 효소로 콜라겐의 비나선형 부분을 제거하여 아텔로콜라겐을 제조하는 단계; iii) 상기 아텔로콜라겐을 유기용매로 용해시키고, 그로 인해 발생한 비콜라겐성 지방성분 및 불용성 콜라겐으로 이루어진 층을 원심 분리하여 제거하는 단계; 및 iv) 다시 초고속 원심분리 및 염석(salting out)으로 투명한 성상의 콜라겐 용액을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 산성용액은 제한되지 않으나, 염산 또는 아세트산이 바람직하며, 염산 수용액이 특히 바람직하다. 본 발명의 방법에서 콜라겐 용액의 pH는 상기 산성용액으로 2 내지 2.5 로 유지시키는 것이 바람직하다.
원심분리는 3 만 내지 4 만 g에서 실시하며, 초고속 원심분리의 경우는 10 만 내지 15 만 g에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 효소로는 콜라겐의 비나선형 부분을 제거할 수 있는 것이면 제한되지 않으나, 펩신, 트립신, 파파인, 카뎁신 등이 바람직하며, 펩신이 특히 바람직하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 유기 용매로는 불용성 콜라겐 및 지방 불순물을 용해시킬 수 있는 용매이면 제한되지 않으나, 페트로륨에테르, 디메틸에테르, 디에틸에테르, 디부틸에테르, 디프로필에테르 등의 에테르계 용매, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 등의 알콜계 용매, 노말부틸아세테이트, 헥산, 다이메틸케톤, 이소프로판올, 클로로포름 또는 사염화탄소 등이 바람직하다. 특히 에테르계 유기 용매가 바람직하다.
본 발명은 본 기술 분야의 숙련된 기술자에 의해 다양하게 변화되어 실시 될 수 있으나, 그 변화가 본 발명의 방법의 균등의 범주에 속하는 한 본 발명의 보호범위에 포함된다.
본 발명에 의해 제조된 콜라겐은 이식 가능한 보철 제조 및 생체 조직 상당물등 다양한 산업 분야에서 사용될 수 있다.
콜라겐을 스폰지 형태의 조직공학용 기질로 사용할 때 적당한 공극(pore)의크기는 대략 50 내지 200um 정도로 알려져 있고, 상처 도포제나 인공피부로서의 적절한 공극 크기는 50 내지 100um로 보고되어 있다(Chvapil M, J. Biomed. mat. Res., 11, 721-741, 1977). 그런데, 본 발명의 방법에 의해 제조된 콜라겐으로 이루어진 스폰지는 약 50 내지 80um의 매우 균일한 형태의 공극구조를 형성하여, 세포가 안정적으로 생착할 수 있으므로, 조직공학용 기질, 상처 도포제 또는 인공피부로서의 용도에 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의하여 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예
이후, 별도 언급이 없는 한, 하기 실시 예에서의 모든 공정은 4℃에서 실시하고, 콜라겐 용액의 pH는 2로 유지한다.
실시예 1 : 산 가용성 콜라겐의 제조
1. 돼지 피부 조직을 직경 3mm 이하의 크기로 분쇄한 후 아세톤으로 조직 표면을 12시간 동안 처리하고, 멸균수로 30분씩 5회 세척한다.
2. Waring blender (Waring™ 33BL79, USA)에 상기 조직을 넣고 액체질소로 동결시킨 후 분말형태로 분쇄한다.
3. 10mM의 염산 수용액(pH 2)을 상기 분말에 첨가하고, 균질화기(homogenizer) (IKA™-Labortechnik ULTRA-TURRAX T25, Germany)로 균질화 시킨 후, 48시간 동안 Direct driven stirrer (SS-20, HANA Instruments, Korea)로 교반한다.
4. 4만 g, 4℃에서 원심분리를 1 시간 동안 실시하여 상등액을 취한다. 이때 조직에 포함되어있던 털은 펠렛(pellet)의 형태로 제거된다.
5. -70℃로 동결건조 하여 데시케이터에 보관한다.
실시예 2 : 산 가용성 아텔로콜라겐의 제조
1. 상기 실시예 1 의 3 단계에서 수득되는 콜라겐 용액에 pH 2를 유지하면서 20mg-펩신/g-콜라겐(건조중량)의 비율로 펩신(P-7000, Sigma)을 첨가하고, 2일 동안 Direct driven stirrer (SS-20, HANA Instruments, Korea)로 교반시킨다.
2. 4만 g, 4℃에서 원심분리를 1 시간동안 실시하여 상등액을 취한다.
3. 단계 2에서 수득한 용액을 0.5N 수산화나트륨 수용액으로 중화하여 펩신을 불활성화시킨다.
4. 0.5N 염산 수용액을 첨가하여 pH를 2로 다시 조정한다.
실시예 3 : 유기용매를 이용한 지방성 불순물 및 불용성 콜라겐의 제거
1. 실시예 2에 따라 제조된 콜라겐 용액 또는 실시예 1 의 콜라겐 고형물을 10mM 염산 수용액에 용해시킨 후, 상기 용액에 유기용매로 노말부틸아세테이트를 첨가한 후 4℃에서 24시간 동안 진탕한다.
2. 4만 g, 4℃에서 원심분리를 1 시간동안 실시하여 비콜라겐성 지방성분 및 불용성 콜라겐 응집체가 용해되어 있는 상등액을 제거한다.
단계 1과 단계 2는 필요에 따라 수회 반복될 수 있다.
3. 단계 2에서 수득한 용액을 투석 튜빙(dialysis tubing)에 옮기고 10mM 염산 수용액(pH 2) 20L에서 48시간 동안 투석하여 용액 내의 잔존 유기용매를 제거한다.이때, 10mM 염산 수용액을 12시간마다 새 용액으로 교체한다.
4. 단계 3에서 수득한 용액을 -70℃로 동결건조 하여 데시케이터에서 보관한다.
하기 표 1에 실시예 3 에서 수득한 콜라겐의 순도 및 수율을 나타내었다. 순도는 ELISA 법(indirect competition method)에 기초하여 일차항체(primary antibody) (C-2456, Sigma) 및 이차 항체(secondary antibody) (A-2304, Sigma)를 각각 사용하여 산출하였고, 수율은 최초 사용한 조직의 건조중량과 최종적으로 얻어진 콜라겐의 건조중량의 비율을 측정하여 계산하였다.
| 순도 | 96.5% |
| 수율 | 15.1% |
실시예 4 : 초고속 원심분리에 의한 콜라겐의 단리
1. 상기 실시예 3의 단계 2에서 수득한 용액을 10만 g, 4℃ 에서 2 시간 동안 초고속 원심분리하여 상등액을 회수하여 취한 후, 동일 부피의 4.0 M 냉각 염화나트륨 용액을 첨가하여 혼합한 후, 4℃에서 12시간동안 침전시킨다.
2. 4만 g, 4℃에서 원심분리를 1 시간동안 실시하여 침전물을 회수한 후 10mM의 염산 수용액(pH 2)에 다시 용해시킨다.
3. 단계 2에서 수득한 용액을 투석 튜빙(dialysis tubing)에 옮기고 10mM 염산 수용액(pH 2) 20L에 48시간 동안 투석하여 용액 내의 잔존 유기용매와 염을 제거한다. 10mM 염산 수용액은 12시간마다 새 용액으로 교체한다.
4. 단계 3에서 수득한 용액을 -70℃로 동결건조 하여 데시케이터에서 보관한다.
하기 표 2에 실시예 4 에 의해 수득한 콜라겐의 아미노산 조성을 나타내었다.
| 종류 | (단위 : 몰%) |
| Hydroxyproline | 10.7 |
| Aspartic acid | 4.9 |
| Threonine | 2.1 |
| Serine | 3.9 |
| Glutamic acid | 8.0 |
| Proline | 11.1 |
| Glycine | 29.9 |
| Alanine | 11.3 |
| Cystine | 0.3 |
| Valine | 2.3 |
| Methionine | 0.7 |
| Isoleicine | 1.4 |
| Leucine | 2.5 |
| Tyrosine | 0.3 |
| Phenylalanine | 1.4 |
| Hydroxylysine | 0.5 |
| Lysine | 3.1 |
| Histidine | 0.6 |
| Arginine | 5.0 |
실시예 5: 콜라겐으로 이루어진 스폰지의 제조
1. 35mm petri dish에 실시예 3 또는 4 의 콜라겐 용액 5g을 넣고 -70℃에서 동결시킨다.
2. 동결된 콜라겐 용액을 동결건조기(SFDSM06, SAMWON freezing engineering, Korea)를 이용하여 -80℃, 10 mmTorr에서 24시간 동안 동결건조하여 다공성 스폰지를 제작한다.
3. 상기 다공성 스폰지를 1% DICH (ACROS, USA)로 가교결합시킨 후, 다시 -70℃에서 동결시키고, 동일 조건에서 동결건조하여 제조한다.
비교예 1(콘트롤)
1. 돼지피부조직을 직경 3mm 이하로 미세분쇄한 후 멸균수로 30분씩 3회 세척한다.
2. Waring blender (Waring™ 33BL79, USA)에 조직을 넣고 액체질소로 동결시킨 후 분말형태로 분쇄한다.
3. 상기 분말에 pH 2.7 염산 수용액을 혼합시켜 2%(건조중량비) 용액을 만들고, 균질기에서 2분 30초 동안 균질시킨다.
4. 단계 3에서 얻어진 용액에 20mg-펩신/g-콜라겐(건조중량)의 비율로 펩신(P-7000, Sigma)을 첨가하여 2일 동안 교반시킨다.
5. 4만 g, 4℃에서 원심분리를 1 시간동안 실시하여 상등액을 취한 후 수산화나트륨 수용액을 이용해 중화시켜 펩신을 불활성한다.
5. 용액의 pH를 2.7로 재조정한다.
비교예 2
1. 돼지피부조직을 직경 3mm 이하로 미세분쇄한다.
2. 아세톤을 사용하여 30분씩 2회 조직표면의 지방을 추출 제거한 후 멸균수로 30분씩 3회 세척한다.
3. 탈지된 원료를 pH 2.7 염산 수용액에 혼합시켜 2%(건조중량비) 용액을 만들고, 균질기에서 2분 30초 동안 균질시킨다.
4. 단계 3에서 얻어진 용액에 20mg-펩신/g-콜라겐(건조중량)의 비율로 펩신(P-7000, Sigma)을 첨가하여 2일 동안 교반시킨다.
5. 4만 g, 4℃에서 원심분리를 1 시간동안 실시하여 상등액을 취한 후 수산화나트륨 수용액을 이용해 중화시켜 펩신을 불활성한다.
5. 용액의 pH를 2.7로 재조정한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 콜라겐이 종래의 기술에 의해 제조된 콜라겐보다 유리한 효과가 있음은 후술하는 몇가지 테스트에 의해 분명해진다.
(a) 전기영동 테스트
콜라겐 성분을 전기영동(SDS)하여 나타나는 알파 밴드, 베타 밴드, 감마 밴드 등의 밴드 양상을 통해 콜라겐의 종류를 확인할 수 있다.
Standard collagen(Koken™, Koken, Japan) 50 ug, 샘플 콜라겐 30 ug을 로딩하며, 세퍼레이팅 겔(separating gel)의 아크릴아마이드 농도는 8 %, 스태킹 겔(stacking gel)의 아크릴아마이드 농도는 5%를 사용하였다.
(b) 탁도(turbidity) 테스트
일반적으로 고분자 용액의 탁도는 600 nm 내지 700 nm로 측정되는데, 본 테스트에서는 670 nm로 측정하였다. 탁도는 분광 광도계를 이용하여 측정하였다.
(c) 흡광도 테스트
콜라겐의 양은 콜라겐에 특이적으로 포함되어 있는 히드록시프롤린과 같은 아미노산에 의해 흡수되는 파장인 230 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하여, 간접적으로 측정할 수 있다(Spinova 등, J. Biochem. Biophys. Method, 32, 33 - 43, 1996).
상기 실시예 3, 4 및 비교예 1, 2 의 결과물을 전기영동하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1 중 각 레인(lane)에 로딩한 샘플은 아래와 같다:
Lane 1 : standard marker (SDS-6H, Sigma)
Lane 2 : standard collagen
Lane 3 : 비교예 1에서 수득된 콜라겐 [콘트롤(control)(유기용매를 전혀 사용하지 않음)]
Lane 4 : 비교예 2에서 수득된 콜라겐
Lane 5 : 실시예 3에서 수득된 콜라겐
Lane 6 : 실시예 4에서 수득된 콜라겐
도 1에서 알 수 있듯이 Lane 3, 4, 5, 6의 샘플이 모두 standard collagen과 같은 밴드 양상을 나타내는 것으로 보아 종래의 방법과 본 발명의 방법 모두 콜라겐의 특이적인 밴드양상을 보여줌을 확인 할 수 있었다.
도 2 는 콜라겐의 각 밴드 중 메인 밴드인 알파 벤드와 베타 밴드의 농도를 이미지 분석 프로그램(Image Master™, Pharmacia)를 통해 비교한 결과이다.
도 2 에 사용된 각 기호의 의미는 다음과 같다.
A : 비교예 1 (콘트롤)
B : 비교예 2
C : 실시예 3
D : 실시예 4
(하기 도 3, 도 4 및 도 5에서의 X-축도 도 2와 같은 순서임)
도 2 로 보아, 비교예 1, 2 에 비해 실시예 3, 4의 방법으로 제작한 콜라겐이 동일 농도에서 더욱 선명한 밴드의 농도를 갖는다는 것을 확인할 수 있다. 즉, 비교예 2 의 콜라겐은 유기용매를 사용하지 않은 콜라겐(콘트롤)에 비해 거의 밴드의 농도가 증가하지 않았으나, 실시예 4에 의해 제조된 콜라겐의 밴드 농도는 약 1.4배 가량 증가했음을 확인할 수 있다.
도 3 은 비교예 1, 2와 실시예 3, 4의 산물에 대한 탁도 측정 그래프를 나타낸다.
도 4 는 탁도 측정결과에서 추산되는 콜라겐의 투명도 증가 그래프를 나타낸다.
도 3 및 4 로 부터, 비교예 2에서 수득되는 콜라겐은 콘트롤 (비교예 1)에 비해서 콜라겐 용액의 투명도가 거의 증가하지 않았지만, 실시예 3의 경우 약 3.5 배정도, 실시예 4의 경우 무려 9.5배나 증가했음을 알 수 있다.
도 5 는 230mn의 파장에서 측정된 히드록시프롤린의 흡광비율을 나타낸다.
도 5 로 부터, 비교예 2에서 수득되는 콜라겐은 콘트롤 (비교예 1)에 비해 흡광도가 약 1.5 배정도 증가한 것에 불과하나, 실시예 3에서 수득되는 콜라겐은 그 흡광도가 2.5배 이상 증가하였고, 실시예 4에서 수득되는 콜라겐은 6배 이상 증가하는 현저한 효과를 보여 준다.
이와 같은 결과들로부터, 본 발명의 콜라겐 제조 방법은 종래의 기술에 비해 투명한 성상을 갖는 가용성 콜라겐을 고수율로 얻을 수 있고, 비콜라겐성 물질을 효과적으로 제거 할 수 있어서, 고순도의 콜라겐을 수득할 수 있는 현저히 개선된방법임을 알 수 있다.
도 6 은 본 발명의 아텔로콜라겐으로 이루어진 스폰지의 전자현미경 사진이다. 도 6 으로 부터, 본 기술을 통해 제조한 스폰지의 공극의 크기는 약 50 내지 80um 정도이고, 매우 균일한 형태의 공극 구조를 형성함을 알 수 있다.
도 7 은 상기 스폰지에 섬유아세포(fibroblast)를 12시간 배양한 후의 전자현미경 사진을 나타낸다. 도 7 로부터, 세포가 안정적으로 생착하여 있는 모습을 확인 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 기술로 제조된 콜라겐이 조직공학용 기질로서도 매우 적합하게 사용되어질 수 있음을 확인 할 수 있다.
본 발명의 방법은 콜라겐 정제 과정에서의 수율 및 순도를 비약적으로 증가시킬 수 있으며, 그 결과 극히 투명한 성상의 콜라겐을 수득할 수 있다. 본 발명의 방법으로 만들어지는 콜라겐 용액은 매우 투명하고 점도가 높은 특징을 가지므로 성형외과용 주사제, 화장품 첨가제 등에 유용하게 사용될 수 있고, 또한 인공피부 등의 조직공학용 생체재료로서 스폰지, 필름, 비드(bead) 등으로 제조하기에도 바람직하게 사용되어질 수 있다.
Claims (6)
- i) 산성용매로 콜라겐을 용해시키는 단계; ii) 효소로 콜라겐의 비나선형 부분을 제거하는 단계; 및 iii) 유기용매로 추출하여, 비콜라겐성 지방성분 및 불용성 콜라겐을 제거하는 단계를 포함하는 가용성 콜라겐 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 단계 iii)를 반복적으로 수행하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 효소가 펩신, 트립신, 파파인, 카뎁신 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 종이상의 효소인 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 사용되는 유기용매가 페트로륨에테르, 디메틸에테르, 디에틸에테르, 디부틸에테르, 디프로필에테르 등의 에테르계 용매, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 등의 알콜계 용매, 노말부틸아세테이트, 헥산, 다이메틸케톤, 이소프로판올, 클로로포름 또는 사염화탄소로 구성된 군에서 선택되는 1 종이상의 유기용매인 방법.
- 제 1항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의해 제조된 콜라겐.
- 제 5 항의 콜라겐으로 이루어진 스폰지형태의 다공성 지지체(scaffolds).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0011381A KR100465015B1 (ko) | 2002-03-04 | 2002-03-04 | 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0011381A KR100465015B1 (ko) | 2002-03-04 | 2002-03-04 | 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030072512A true KR20030072512A (ko) | 2003-09-15 |
| KR100465015B1 KR100465015B1 (ko) | 2005-01-13 |
Family
ID=32223329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0011381A KR100465015B1 (ko) | 2002-03-04 | 2002-03-04 | 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100465015B1 (ko) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006096027A1 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-14 | Sewon Cellontech Co., Ltd. | Manufactured product using and collagen solution manufacturing method and collagen separation method of animal tissue |
| KR200451872Y1 (ko) * | 2008-07-08 | 2011-01-14 | 한국철도공사 | 레일 인상기구 |
| WO2011142543A2 (ko) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | (주)다림티센 | 아텔로콜라겐 분리방법 및 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 그리고 이를 이용하여 제조된 아텔로콜라겐 및 콜라겐 기반 매트릭스 |
| WO2017209334A1 (ko) * | 2016-06-01 | 2017-12-07 | 세원셀론텍(주) | 투명 피부 보호막을 형성하는 제형의 화장료 조성물 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102145057B1 (ko) | 2019-10-31 | 2020-08-14 | 경희대학교 산학협력단 | 숙신화 콜라겐 및 이를 이용한 숙신화 콜라겐-피브리노겐 복합체의 제조방법 |
| KR102119693B1 (ko) | 2019-10-31 | 2020-06-05 | 경희대학교 산학협력단 | 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법 |
| KR102387667B1 (ko) | 2020-09-01 | 2022-04-20 | 농업회사법인 주식회사 옻가네 | 옻 발효액을 이용한 콜라겐 추출 방법 및 무독화된 옻나무 추출 발효물을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 추출용 조성물 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3049932C1 (de) * | 1979-10-08 | 1984-11-29 | Pentapharm Ag, Basel | Verfahren zur Herstellung eines Kollagenproduktes fuer medizinische und kosmetische Zwecke |
| US5436135A (en) * | 1985-09-02 | 1995-07-25 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | New preparation of placenta collagen, their extraction method and their applications |
| WO1994005702A1 (en) * | 1992-09-03 | 1994-03-17 | Edmond Pharma Srl | Extraction of collagen |
| KR100304348B1 (ko) * | 1998-07-09 | 2002-08-27 | 양은경 | 강화된 콜라겐층을 포함하는 생체 조직 및이의 용도 |
| KR20020029859A (ko) * | 2000-10-14 | 2002-04-20 | 지귀환 | 제 1 형 아텔로교원질의 직접 분리추출 방법 |
-
2002
- 2002-03-04 KR KR10-2002-0011381A patent/KR100465015B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006096027A1 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-14 | Sewon Cellontech Co., Ltd. | Manufactured product using and collagen solution manufacturing method and collagen separation method of animal tissue |
| KR100676285B1 (ko) * | 2005-03-11 | 2007-01-30 | 세원셀론텍(주) | 동물의 다양한 조직으로부터의 콜라겐 분리방법 및 콜라겐 용액의 제조방법 그리고 이를 이용하여 생산한 매트릭스 |
| KR200451872Y1 (ko) * | 2008-07-08 | 2011-01-14 | 한국철도공사 | 레일 인상기구 |
| WO2011142543A2 (ko) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | (주)다림티센 | 아텔로콜라겐 분리방법 및 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 그리고 이를 이용하여 제조된 아텔로콜라겐 및 콜라겐 기반 매트릭스 |
| WO2011142543A3 (ko) * | 2010-05-14 | 2012-05-31 | (주)다림티센 | 아텔로콜라겐 분리방법 및 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 그리고 이를 이용하여 제조된 아텔로콜라겐 및 콜라겐 기반 매트릭스 |
| KR101158338B1 (ko) * | 2010-05-14 | 2012-06-22 | (주)다림티센 | 아텔로콜라겐 분리방법 |
| WO2017209334A1 (ko) * | 2016-06-01 | 2017-12-07 | 세원셀론텍(주) | 투명 피부 보호막을 형성하는 제형의 화장료 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100465015B1 (ko) | 2005-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Physicochemical properties of collagen, gelatin and collagen hydrolysate derived from bovine limed split wastes | |
| JP5870398B2 (ja) | 高強度コラーゲン線維膜及びその製造方法 | |
| Li et al. | Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets | |
| US4980403A (en) | Collagen products | |
| US7396912B2 (en) | Collagen production method | |
| KR101020312B1 (ko) | 어류비늘 콜라겐펩타이드의 제조방법 | |
| CA2487642A1 (en) | Collagen and method for producing same | |
| CA2663722A1 (en) | Collagen preparation and method of isolation | |
| KR101871395B1 (ko) | 고수율로 콜라겐을 제조하는 방법 | |
| Senthilkumar et al. | Extraction of keratin from keratinous wastes: current status and future directions | |
| US20050143296A1 (en) | Extraction and utilization of cell growth-promoting peptides from silk protein | |
| KR100465015B1 (ko) | 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법 | |
| Jacob et al. | Isolation, Characterization, and Biochemical Properties of Elastin | |
| JPWO2004020470A1 (ja) | システインプロテアーゼ処理コラーゲンの製造方法およびシステインプロテアーゼ処理コラーゲン | |
| CN107630059B (zh) | 新型自组装胶原蛋白及制备方法 | |
| Bannister et al. | Pepsin treatment of avian skin collagen. Effects on solubility, subunit composition and aggregation properties | |
| Issains et al. | Extraction of collagen Type-I from snakehead fish skin (Channa striata) and synthesis of biopolymer for wound dressing | |
| JP2012126681A (ja) | コラーゲン線維ゲルおよびその用途 | |
| CN113462736A (zh) | 从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法及胶原蛋白 | |
| US8263135B2 (en) | Process for isolating biomaterial from tissue and an isolated biomaterial extract prepared therefrom | |
| Matinong et al. | Collagen Extraction from Animal Skin. Biology 2022, 11, 905 | |
| Ehrlich et al. | Marine collagens | |
| Anokhova et al. | Sensitivity of different collagens to proteolytic enzyme treatment | |
| TWI236501B (en) | Process for extracting soluble collagen from animal tissue and products containing soluble collagen prepared therefrom | |
| Cherim et al. | Obtaining of Collagen Extracts Used as Biomaterials with Applications in the Medical Field |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121011 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131024 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141112 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151029 Year of fee payment: 12 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |