JP3592163B2 - ゲル濾過法による高純度シルクペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲル濾過法による高純度シルクペプチドの製造方法に関し、より詳しくは、シルクフィブロインの中性塩溶解物から塩とシルクペプチドを分離するため、ゲル濾過法(Gel Filtration Chromatography;以下「GFC」という) を用いて高純度シルクペプチドを製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
シルクフィブロインは、必須アミノ酸を含む18種のアミノ酸が含有されている天然蛋白質資源であって、その成分から見て有効機能性を十分に活用する価値を有している。
【0003】
最近、シルクフィブロイン溶解物を食品添加物及び健康機能性応用分野に拡大して使用しているが、中和過程で発生する塩又は溶液中に存在する蛋白質以外物質の純粋分離が問題視されている。
【0004】
シルクフィブロインを溶解又は加水分解させようとする場合、酸(HCl)及び中性塩(CaCl2 )を多く使用しており、そのうち、塩酸を用いた酸加水分解法が主に使用されている(日本蚕糸学会誌、60(5), pp.358−361, 1991)。しかしながら、塩酸を使用する場合、ほぼ大部分のシルクペプチドがアミノ酸水準まで加水分解されるので、中和及び脱塩過程を経た後の蛋白質回収に問題があり、回収された物質の分子量が非常に小さいので、有効機能性を期待しがたいという問題がある(食品科学と産業、30(1), pp.22−29)。
【0005】
一方、中性塩系統のCaCl2 を用いて溶解する場合、溶液中に存在するCa2+及びCl− を除去しなければならない。特に、シルクフィブロイン溶液内に存在するCa2+の除去は、4〜10%カーマライト(carmalito) を大量混合して2時間程度反応させた後、沈殿されたCa2+イオンを分離することにより行われる(韓国特許公告第94−2,871号公報)。この工程は、多少複雑で、また沈殿の際、シルクペプチドも一緒に沈殿するおそれがあり、最終産物である粉末が水溶性ではないので、食品添加用として使用することができないという不都合がある。
【0006】
また、シルクフィブロインを酸又は中性塩で溶解させて純粋シルクペプチドだけを回収しようとする場合、実験室で一般的に使用する方法は、一定分子量単位のセルロース透析チューブを用いたシルクペプチドの回収方法である(日本蚕糸学会誌、63(1), pp.21−27, 1994)。しかし、この方法では、塩成分が完全に除去されるまで複数回水を置換しなければならないし、透析チューブが高価にもかかわらずほとんど1〜2回しか使用できず、また、使用した透析チューブのポア(pore)サイズ以下の有効成分が全部抜け出てしまうので、非実用的でかつ底効率的な方法である。
【0007】
従って、混合溶液内の蛋白質と蛋白質以外の物質との純粋分離を行うためには、一定分子量単位の膜又はチューブによる物理的な分離方法とは異なる純粋分離方法を探す必要がある。これは、純度が高い高付加価値製品の生産可否を決定するのに重要な要因として作用することができるからである。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
これより、本発明者らは、シルクフィブロインの中性塩溶解物からシルクペプチドだけを純粋分離する際の問題点を解決するために研究を重ねた結果、シルクフィブロイン中性塩溶解物を一定サイズのゲルが充填されたゲル濾過装置を通過させるゲル濾過法(GFC)を用いて、高純度シルクペプチドを高効率で提供することができることを発見し、本発明を完成するに至った。
【0009】
従って、本発明の目的は、シルクフィブロインの中性塩溶解物からゲル濾過法を用いて高純度シルクペプチドを高効率で得る方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記高純度シルクペプチド溶液を特定酵素で加水分解して、オリゴペプチド水準の分子量まで調節可能な純粋シルクペプチド粉末を提供することにある。
【0010】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明による高純度シルクペプチドの製造方法は、シルクフィブロイン中性塩溶解物から塩とシルクペプチドを分離するため、ゲル濾過法を使用することを特徴とする。
【0011】
以下、高純度シルクペプチドの製造方法を各段階別に説明する。
(1) 絹蛋白質からセリシンを除去する段階:
前処理過程であって、高温高圧法で精錬を実施して、シルクフィブロインだけを得る。
【0012】
(2) シルクフィブロインをCaCl2 ・H2 O・エタノールに溶解する段階:
シルクフィブロインをCaCl2 ・H2 O・エタノールに溶解して、シルクフィブロイン中性塩溶解物を得る段階であって、50%のCaCl2 ・H2 O・エタノールのモル比が1:8:2M%となるように調節して、95℃で5時間シルクフィブロインを溶解する。
【0013】
(3) ゲル濾過法による純粋シルクペプチド溶液を得る段階:
シルクフィブロイン中性塩溶解物中に存在するCa2+及びCl− とシルクペプチドとの純粋分離のため、ビードサイズ(bead size) 1〜150μm、好ましくは20〜80μmのメディア(media) で充填されたゲル濾過クロマトグラフィ装置を用いて、純粋シルクペプチドを得る。メディアとしては、ファルマシアバイオテック社(Pharmacia Biotech 社、スウェーデン)のセファデックス(Sephadex)G−10、G−25のゲルが最も分離能に優れている。ゲル濾過法による塩と蛋白質の分離は、まずゲル表面の間に分子量の少ない塩成分が充填され、その後分子量の大きい物質(アミノ酸又は蛋白質)等が抜け出るので、塩成分より分子量の大きい蛋白質成分が先に抜け出ることになる。実施例1の塩と蛋白質の分離を示すグラフを図1に示す。図1から明らかなように、蛋白質と塩の完璧な分離がなされることがわかる。
【0014】
(4) 得られた純粋シルクペプチド溶液を急速凍結させた後、凍結ドライヤ又は噴霧ドライヤを用いて純粋シルクペプチド粉末を製造する段階:
前記第3工程で得られた純粋シルクペプチド溶液を急速凍結させた後、凍結ドライヤ又は噴霧ドライヤで純粋シルクペプチド粉末を製造し、特性を調査する。
【0015】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により、本発明による高純度シルクペプチドの製造方法について詳しく説明する。しかし、本発明がこれらの例のみに限定されるものではない。
【0016】
(実施例1)
第1工程:中性塩を用いたシルクペプチドの溶解
繊維化できない副蚕糸、切殻繭等から雑物を除去した絹糸100gを準備し、準備された絹糸1gに対して水50gを準備した後、121℃で3時間高温高圧下で精練を実施して(この際、練減率は22%程度であった)、純粋シルクフィブロイン蛋白質を得た。得られたシルクフィブロインを無水CaCl2 ・H2 O・エタノールに、モル比が1:8:2M%となるように調節し、95℃で5時間溶解した後、3重の不織布により残留物等の異物質を除去し、この塩化カルシウム−フィブロイン溶解液500mlに対して超純粋蒸留水500mlを添加して、希釈された塩化カルシウム−フィブロイン溶解液を得た。
【0017】
第2工程:ゲル濾過装置を用いたシルクペプチド溶液と中性塩の分離
前記第1工程で製造した塩化カルシウム−フィブロイン溶解液を、ビードサイズ20〜80μmのメディアで充填された低圧ゲル濾過クロマトグラフィ装置を用いて、シルクフィブロイン溶液中の塩を除去した。すなわち、塩化カルシウム−フィブロイン溶解液500mlをサンプルラインに連結した後、流速25ml、分画30ml、チャートスピード5mm/分の条件で充填カラムの25%の溶液に該当する250mlを注入した。その後、蒸留水を同じ条件で流して、シルクペプチドと塩の分離を行ったところ、図1に示すようなシルクペプチド及び塩の分離図を得た。
【0018】
第3工程:純粋フィブロイン粉末の製造及びその特性
前記第2工程で製造した純粋シルクペプチド溶液を濃縮機で濃縮した後、凍結乾燥器又はスプレードライヤを用いて純粋シルクペプチド粉末を得た。この際、平均収率は90%以上であった。
【0019】
(試験例1)
実施例1で得られたシルクペプチド溶液を0.8μmのダブル−レイア−メンブレイン(double−layer membrane) で濾過し、ゲル浸透クロマトグラフィ(Gel Permeation Chromatograhy;以下、GPCという) 分子量測定装置に濾過液100μlを注入して、絶対分子量を測定し、図2のような分子量分布図を示す。図2に示すように、重量平均分子量(Mw)が25,000付近に分布していることを確認した。
【0020】
(試験例2)
試験例1で得られた各々の濾過液を乾燥した後、クエン酸(pH2.2)で希釈して、自動アミノ酸分析装置により遊離アミノ酸の含量を調査した。また、シルクフィブロイン5mgに6N塩酸25mlを110℃で24時間完全加水分解し、塩酸を完全蒸発させた後、クエン酸(pH2.2)で希釈して、全アミノ酸分析を実施した。上記で得られた遊離アミノ酸及び全アミノ酸の含量を表1に示した。
【0021】
【表1】
【0022】
表1の結果から明らかなように、遊離アミノ酸と全アミノ酸の含量には、大きな差異がある。すなわち、塩化カルシウムで溶解した場合、遊離アミノ酸の含量が全アミノ酸の約38%であった。これは、塩化カルシウムで溶解する場合、一定部分のアミノ酸、すなわちシルクフィブロインの非結晶領域に存在するアミノ酸が遊離されて、遊離アミノ酸の形態で存在することが推測される。このような結果から見て、シルクフィブロインの主鎖を構成する部分は、相対的に大きく切られることを意味する。これは、蛋白質分解酵素による2次加水分解を考える場合、一定サイズの分子量を調節することができることを示す。
【0023】
(比較例1)
前記実施例1の塩化カルシウム−フィブロイン溶解液150mlずつをセルロース透析チューブ(Spectrum Medical 社、Mw3500) に入れ、蒸留水で4日間塩化カルシウムを除去させた後、50℃で濃縮し、凍結乾燥により粉末を回収した結果、平均30%が回収された。
【0024】
(比較例2)
前記実施例1の塩化カルシウム−フィブロイン溶解液量の2倍の蒸留水を入れて、粘度を低めた後、1リットルずつ電気脱塩装置(旭化成社、電気透析装置)を用いて塩化カルシウムを除去させた後、得られた溶液を凍結乾燥により粉末を回収した結果、平均50%が回収された。
【0025】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法により得られた高純度シルクペプチド溶液及び粉末等は、化粧品及び食品添加用として使用されることができ、得られたシルクペプチドを適正蛋白質加水分解用酵素でさらに分解すると、分子量数百〜数千単位のオリゴペプチド水準の高純度シルクペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、シルクフィブロイン塩化カルシウム溶解液のゲル濾過法(GFC)による蛋白質と塩の分離図である。
【図2】図2は、ゲル濾過法で分離した純粋シルクペプチド水溶液のゲル浸透クロマトグラフィ(GPC)分子量である。
Claims (1)
- シルクフィブロインからシルクペプチドを製造する方法であ って、シルクフィブロインの中性塩溶解物から塩を除去するため、ビードサイズ1〜150μmのメディアで充填されたゲル濾過クロマトグラフィ装置に前記溶解物を通過させることを特徴とする高純度シルクペプチドの製造方法。
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