JP2001122894A - ゲル濾過法による高純度シルクペプチドの製造方法 - Google Patents
ゲル濾過法による高純度シルクペプチドの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 シルクフィブロインの中性塩溶解物からゲル
濾過法を用いて高純度シルクペプチドを高収率で得る方
法を提供する。 【解決手段】 本発明による高純度シルクペプチドの製
造方法は、シルクフィブロインからシルクペプチドを製
造する方法であって、シルクフィブロインの中性塩溶解
物から塩を除去するため、ビードサイズ１〜１５０μｍ
のメディアで充填されたゲル濾過クロマトグラフィ装置
に前記溶解物を通過させる。
濾過法を用いて高純度シルクペプチドを高収率で得る方
法を提供する。 【解決手段】 本発明による高純度シルクペプチドの製
造方法は、シルクフィブロインからシルクペプチドを製
造する方法であって、シルクフィブロインの中性塩溶解
物から塩を除去するため、ビードサイズ１〜１５０μｍ
のメディアで充填されたゲル濾過クロマトグラフィ装置
に前記溶解物を通過させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ゲル濾過法による
高純度シルクペプチドの製造方法に関し、より詳しく
は、シルクフィブロインの中性塩溶解物から塩とシルク
ペプチドを分離するため、ゲル濾過法（Gel Filtration
Chromatography;以下「ＧＦＣ」という) を用いて高純
度シルクペプチドを製造する方法に関する。
高純度シルクペプチドの製造方法に関し、より詳しく
は、シルクフィブロインの中性塩溶解物から塩とシルク
ペプチドを分離するため、ゲル濾過法（Gel Filtration
Chromatography;以下「ＧＦＣ」という) を用いて高純
度シルクペプチドを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】シルクフィブロインは、必須アミノ酸を
含む１８種のアミノ酸が含有されている天然蛋白質資源
であって、その成分から見て有効機能性を十分に活用す
る価値を有している。
含む１８種のアミノ酸が含有されている天然蛋白質資源
であって、その成分から見て有効機能性を十分に活用す
る価値を有している。
【０００３】最近、シルクフィブロイン溶解物を食品添
加物及び健康機能性応用分野に拡大して使用している
が、中和過程で発生する塩又は溶液中に存在する蛋白質
以外物質の純粋分離が問題視されている。
加物及び健康機能性応用分野に拡大して使用している
が、中和過程で発生する塩又は溶液中に存在する蛋白質
以外物質の純粋分離が問題視されている。
【０００４】シルクフィブロインを溶解又は加水分解さ
せようとする場合、酸（ＨＣｌ）及び中性塩（ＣａＣｌ
2 ）を多く使用しており、そのうち、塩酸を用いた酸加
水分解法が主に使用されている（日本蚕糸学会誌、60
(5), pp.358-361, 1991)。しかしながら、塩酸を使用す
る場合、ほぼ大部分のシルクペプチドがアミノ酸水準ま
で加水分解されるので、中和及び脱塩過程を経た後の蛋
白質回収に問題があり、回収された物質の分子量が非常
に小さいので、有効機能性を期待しがたいという問題が
ある（食品科学と産業、30(1), pp.22-29)。
せようとする場合、酸（ＨＣｌ）及び中性塩（ＣａＣｌ
2 ）を多く使用しており、そのうち、塩酸を用いた酸加
水分解法が主に使用されている（日本蚕糸学会誌、60
(5), pp.358-361, 1991)。しかしながら、塩酸を使用す
る場合、ほぼ大部分のシルクペプチドがアミノ酸水準ま
で加水分解されるので、中和及び脱塩過程を経た後の蛋
白質回収に問題があり、回収された物質の分子量が非常
に小さいので、有効機能性を期待しがたいという問題が
ある（食品科学と産業、30(1), pp.22-29)。
【０００５】一方、中性塩系統のＣａＣｌ2 を用いて溶
解する場合、溶液中に存在するＣａ 2+及びＣｌ- を除去
しなければならない。特に、シルクフィブロイン溶液内
に存在するＣａ2+の除去は、４〜１０％カーマライト(c
armalito) を大量混合して２時間程度反応させた後、沈
殿されたＣａ2+イオンを分離することにより行われる
（韓国特許公告第94-2,871号公報）。この工程は、多少
複雑で、また沈殿の際、シルクペプチドも一緒に沈殿す
るおそれがあり、最終産物である粉末が水溶性ではない
ので、食品添加用として使用することができないという
不都合がある。
解する場合、溶液中に存在するＣａ 2+及びＣｌ- を除去
しなければならない。特に、シルクフィブロイン溶液内
に存在するＣａ2+の除去は、４〜１０％カーマライト(c
armalito) を大量混合して２時間程度反応させた後、沈
殿されたＣａ2+イオンを分離することにより行われる
（韓国特許公告第94-2,871号公報）。この工程は、多少
複雑で、また沈殿の際、シルクペプチドも一緒に沈殿す
るおそれがあり、最終産物である粉末が水溶性ではない
ので、食品添加用として使用することができないという
不都合がある。
【０００６】また、シルクフィブロインを酸又は中性塩
で溶解させて純粋シルクペプチドだけを回収しようとす
る場合、実験室で一般的に使用する方法は、一定分子量
単位のセルロース透析チューブを用いたシルクペプチド
の回収方法である（日本蚕糸学会誌、63(1), pp.21-27,
1994)。しかし、この方法では、塩成分が完全に除去さ
れるまで複数回水を置換しなければならないし、透析チ
ューブが高価にもかかわらずほとんど１〜２回しか使用
できず、また、使用した透析チューブのポア(pore)サイ
ズ以下の有効成分が全部抜け出てしまうので、非実用的
でかつ底効率的な方法である。
で溶解させて純粋シルクペプチドだけを回収しようとす
る場合、実験室で一般的に使用する方法は、一定分子量
単位のセルロース透析チューブを用いたシルクペプチド
の回収方法である（日本蚕糸学会誌、63(1), pp.21-27,
1994)。しかし、この方法では、塩成分が完全に除去さ
れるまで複数回水を置換しなければならないし、透析チ
ューブが高価にもかかわらずほとんど１〜２回しか使用
できず、また、使用した透析チューブのポア(pore)サイ
ズ以下の有効成分が全部抜け出てしまうので、非実用的
でかつ底効率的な方法である。
【０００７】従って、混合溶液内の蛋白質と蛋白質以外
の物質との純粋分離を行うためには、一定分子量単位の
膜又はチューブによる物理的な分離方法とは異なる純粋
分離方法を探す必要がある。これは、純度が高い高付加
価値製品の生産可否を決定するのに重要な要因として作
用することができるからである。
の物質との純粋分離を行うためには、一定分子量単位の
膜又はチューブによる物理的な分離方法とは異なる純粋
分離方法を探す必要がある。これは、純度が高い高付加
価値製品の生産可否を決定するのに重要な要因として作
用することができるからである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】これより、本発明者ら
は、シルクフィブロインの中性塩溶解物からシルクペプ
チドだけを純粋分離する際の問題点を解決するために研
究を重ねた結果、シルクフィブロイン中性塩溶解物を一
定サイズのゲルが充填されたゲル濾過装置を通過させる
ゲル濾過法（ＧＦＣ）を用いて、高純度シルクペプチド
を高効率で提供することができることを発見し、本発明
を完成するに至った。
は、シルクフィブロインの中性塩溶解物からシルクペプ
チドだけを純粋分離する際の問題点を解決するために研
究を重ねた結果、シルクフィブロイン中性塩溶解物を一
定サイズのゲルが充填されたゲル濾過装置を通過させる
ゲル濾過法（ＧＦＣ）を用いて、高純度シルクペプチド
を高効率で提供することができることを発見し、本発明
を完成するに至った。
【０００９】従って、本発明の目的は、シルクフィブロ
インの中性塩溶解物からゲル濾過法を用いて高純度シル
クペプチドを高効率で得る方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記高純度シルクペプチド溶液を
特定酵素で加水分解して、オリゴペプチド水準の分子量
まで調節可能な純粋シルクペプチド粉末を提供すること
にある。
インの中性塩溶解物からゲル濾過法を用いて高純度シル
クペプチドを高効率で得る方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記高純度シルクペプチド溶液を
特定酵素で加水分解して、オリゴペプチド水準の分子量
まで調節可能な純粋シルクペプチド粉末を提供すること
にある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、本発明による高純度シルクペプチドの製造方法は、
シルクフィブロイン中性塩溶解物から塩とシルクペプチ
ドを分離するため、ゲル濾過法を使用することを特徴と
する。
め、本発明による高純度シルクペプチドの製造方法は、
シルクフィブロイン中性塩溶解物から塩とシルクペプチ
ドを分離するため、ゲル濾過法を使用することを特徴と
する。
【００１１】以下、高純度シルクペプチドの製造方法を
各段階別に説明する。 (1) 絹蛋白質からセリシンを除去する段階：前処理過程
であって、高温高圧法で精錬を実施して、シルクフィブ
ロインだけを得る。
各段階別に説明する。 (1) 絹蛋白質からセリシンを除去する段階：前処理過程
であって、高温高圧法で精錬を実施して、シルクフィブ
ロインだけを得る。
【００１２】(2) シルクフィブロインをＣａＣｌ2 ・Ｈ
2 Ｏ・エタノールに溶解する段階：シルクフィブロイン
をＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ・エタノールに溶解して、シルク
フィブロイン中性塩溶解物を得る段階であって、５０％
のＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ・エタノールのモル比が１：８：
２Ｍ％となるように調節して、９５℃で５時間シルクフ
ィブロインを溶解する。
2 Ｏ・エタノールに溶解する段階：シルクフィブロイン
をＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ・エタノールに溶解して、シルク
フィブロイン中性塩溶解物を得る段階であって、５０％
のＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ・エタノールのモル比が１：８：
２Ｍ％となるように調節して、９５℃で５時間シルクフ
ィブロインを溶解する。
【００１３】(3) ゲル濾過法による純粋シルクペプチド
溶液を得る段階：シルクフィブロイン中性塩溶解物中に
存在するＣａ2+及びＣｌ- とシルクペプチドとの純粋分
離のため、ビードサイズ(bead size) １〜１５０μｍ、
好ましくは２０〜８０μｍのメディア(media) で充填さ
れたゲル濾過クロマトグラフィ装置を用いて、純粋シル
クペプチドを得る。メディアとしては、ファルマシアバ
イオテック社（Pharmacia Biotech 社、スウェーデン）
のセファデックス（Sephadex）Ｇ−１０、Ｇ−２５のゲ
ルが最も分離能に優れている。ゲル濾過法による塩と蛋
白質の分離は、まずゲル表面の間に分子量の少ない塩成
分が充填され、その後分子量の大きい物質（アミノ酸又
は蛋白質）等が抜け出るので、塩成分より分子量の大き
い蛋白質成分が先に抜け出ることになる。実施例１の塩
と蛋白質の分離を示すグラフを図１に示す。図１から明
らかなように、蛋白質と塩の完璧な分離がなされること
がわかる。
溶液を得る段階：シルクフィブロイン中性塩溶解物中に
存在するＣａ2+及びＣｌ- とシルクペプチドとの純粋分
離のため、ビードサイズ(bead size) １〜１５０μｍ、
好ましくは２０〜８０μｍのメディア(media) で充填さ
れたゲル濾過クロマトグラフィ装置を用いて、純粋シル
クペプチドを得る。メディアとしては、ファルマシアバ
イオテック社（Pharmacia Biotech 社、スウェーデン）
のセファデックス（Sephadex）Ｇ−１０、Ｇ−２５のゲ
ルが最も分離能に優れている。ゲル濾過法による塩と蛋
白質の分離は、まずゲル表面の間に分子量の少ない塩成
分が充填され、その後分子量の大きい物質（アミノ酸又
は蛋白質）等が抜け出るので、塩成分より分子量の大き
い蛋白質成分が先に抜け出ることになる。実施例１の塩
と蛋白質の分離を示すグラフを図１に示す。図１から明
らかなように、蛋白質と塩の完璧な分離がなされること
がわかる。
【００１４】(4) 得られた純粋シルクペプチド溶液を急
速凍結させた後、凍結ドライヤ又は噴霧ドライヤを用い
て純粋シルクペプチド粉末を製造する段階：前記第３工
程で得られた純粋シルクペプチド溶液を急速凍結させた
後、凍結ドライヤ又は噴霧ドライヤで純粋シルクペプチ
ド粉末を製造し、特性を調査する。
速凍結させた後、凍結ドライヤ又は噴霧ドライヤを用い
て純粋シルクペプチド粉末を製造する段階：前記第３工
程で得られた純粋シルクペプチド溶液を急速凍結させた
後、凍結ドライヤ又は噴霧ドライヤで純粋シルクペプチ
ド粉末を製造し、特性を調査する。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、実施例により、本発明によ
る高純度シルクペプチドの製造方法について詳しく説明
する。しかし、本発明がこれらの例のみに限定されるも
のではない。
る高純度シルクペプチドの製造方法について詳しく説明
する。しかし、本発明がこれらの例のみに限定されるも
のではない。
【００１６】（実施例１） 第１工程：中性塩を用いたシルクペプチドの溶解 繊維化できない副蚕糸、切殻繭等から雑物を除去した絹
糸１００ｇを準備し、準備された絹糸１ｇに対して水５
０ｇを準備した後、１２１℃で３時間高温高圧下で精練
を実施して（この際、練減率は２２％程度であった）、
純粋シルクフィブロイン蛋白質を得た。得られたシルク
フィブロインを無水ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ・エタノール
に、モル比が１：８：２Ｍ％となるように調節し、９５
℃で５時間溶解した後、３重の不織布により残留物等の
異物質を除去し、この塩化カルシウム−フィブロイン溶
解液５００ｍｌに対して超純粋蒸留水５００ｍｌを添加
して、希釈された塩化カルシウム−フィブロイン溶解液
を得た。
糸１００ｇを準備し、準備された絹糸１ｇに対して水５
０ｇを準備した後、１２１℃で３時間高温高圧下で精練
を実施して（この際、練減率は２２％程度であった）、
純粋シルクフィブロイン蛋白質を得た。得られたシルク
フィブロインを無水ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ・エタノール
に、モル比が１：８：２Ｍ％となるように調節し、９５
℃で５時間溶解した後、３重の不織布により残留物等の
異物質を除去し、この塩化カルシウム−フィブロイン溶
解液５００ｍｌに対して超純粋蒸留水５００ｍｌを添加
して、希釈された塩化カルシウム−フィブロイン溶解液
を得た。
【００１７】第２工程：ゲル濾過装置を用いたシルクペ
プチド溶液と中性塩の分離 前記第１工程で製造した塩化カルシウム−フィブロイン
溶解液を、ビードサイズ２０〜８０μｍのメディアで充
填された低圧ゲル濾過クロマトグラフィ装置を用いて、
シルクフィブロイン溶液中の塩を除去した。すなわち、
塩化カルシウム−フィブロイン溶解液５００ｍｌをサン
プルラインに連結した後、流速２５ｍｌ、分画３０ｍ
ｌ、チャートスピード５ｍｍ／分の条件で充填カラムの
２５％の溶液に該当する２５０ｍｌを注入した。その
後、蒸留水を同じ条件で流して、シルクペプチドと塩の
分離を行ったところ、図１に示すようなシルクペプチド
及び塩の分離図を得た。
プチド溶液と中性塩の分離 前記第１工程で製造した塩化カルシウム−フィブロイン
溶解液を、ビードサイズ２０〜８０μｍのメディアで充
填された低圧ゲル濾過クロマトグラフィ装置を用いて、
シルクフィブロイン溶液中の塩を除去した。すなわち、
塩化カルシウム−フィブロイン溶解液５００ｍｌをサン
プルラインに連結した後、流速２５ｍｌ、分画３０ｍ
ｌ、チャートスピード５ｍｍ／分の条件で充填カラムの
２５％の溶液に該当する２５０ｍｌを注入した。その
後、蒸留水を同じ条件で流して、シルクペプチドと塩の
分離を行ったところ、図１に示すようなシルクペプチド
及び塩の分離図を得た。
【００１８】第３工程：純粋フィブロイン粉末の製造及
びその特性 前記第２工程で製造した純粋シルクペプチド溶液を濃縮
機で濃縮した後、凍結乾燥器又はスプレードライヤを用
いて純粋シルクペプチド粉末を得た。この際、平均収率
は９０％以上であった。
びその特性 前記第２工程で製造した純粋シルクペプチド溶液を濃縮
機で濃縮した後、凍結乾燥器又はスプレードライヤを用
いて純粋シルクペプチド粉末を得た。この際、平均収率
は９０％以上であった。
【００１９】（試験例１）実施例１で得られたシルクペ
プチド溶液を０．８μｍのダブル−レイア−メンブレイ
ン(double-layer membrane) で濾過し、ゲル浸透クロマ
トグラフィ(GelPermeation Chromatograhy；以下、ＧＰ
Ｃという) 分子量測定装置に濾過液１００μｌを注入し
て、絶対分子量を測定し、図２のような分子量分布図を
示す。図２に示すように、重量平均分子量（Ｍｗ）が２
５，０００付近に分布していることを確認した。
プチド溶液を０．８μｍのダブル−レイア−メンブレイ
ン(double-layer membrane) で濾過し、ゲル浸透クロマ
トグラフィ(GelPermeation Chromatograhy；以下、ＧＰ
Ｃという) 分子量測定装置に濾過液１００μｌを注入し
て、絶対分子量を測定し、図２のような分子量分布図を
示す。図２に示すように、重量平均分子量（Ｍｗ）が２
５，０００付近に分布していることを確認した。
【００２０】（試験例２）試験例１で得られた各々の濾
過液を乾燥した後、クエン酸（ｐＨ２．２）で希釈し
て、自動アミノ酸分析装置により遊離アミノ酸の含量を
調査した。また、シルクフィブロイン５ｍｇに６Ｎ塩酸
２５ｍｌを１１０℃で２４時間完全加水分解し、塩酸を
完全蒸発させた後、クエン酸（ｐＨ２．２）で希釈し
て、全アミノ酸分析を実施した。上記で得られた遊離ア
ミノ酸及び全アミノ酸の含量を表１に示した。
過液を乾燥した後、クエン酸（ｐＨ２．２）で希釈し
て、自動アミノ酸分析装置により遊離アミノ酸の含量を
調査した。また、シルクフィブロイン５ｍｇに６Ｎ塩酸
２５ｍｌを１１０℃で２４時間完全加水分解し、塩酸を
完全蒸発させた後、クエン酸（ｐＨ２．２）で希釈し
て、全アミノ酸分析を実施した。上記で得られた遊離ア
ミノ酸及び全アミノ酸の含量を表１に示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】表１の結果から明らかなように、遊離アミ
ノ酸と全アミノ酸の含量には、大きな差異がある。すな
わち、塩化カルシウムで溶解した場合、遊離アミノ酸の
含量が全アミノ酸の約３８％であった。これは、塩化カ
ルシウムで溶解する場合、一定部分のアミノ酸、すなわ
ちシルクフィブロインの非結晶領域に存在するアミノ酸
が遊離されて、遊離アミノ酸の形態で存在することが推
測される。このような結果から見て、シルクフィブロイ
ンの主鎖を構成する部分は、相対的に大きく切られるこ
とを意味する。これは、蛋白質分解酵素による２次加水
分解を考える場合、一定サイズの分子量を調節すること
ができることを示す。
ノ酸と全アミノ酸の含量には、大きな差異がある。すな
わち、塩化カルシウムで溶解した場合、遊離アミノ酸の
含量が全アミノ酸の約３８％であった。これは、塩化カ
ルシウムで溶解する場合、一定部分のアミノ酸、すなわ
ちシルクフィブロインの非結晶領域に存在するアミノ酸
が遊離されて、遊離アミノ酸の形態で存在することが推
測される。このような結果から見て、シルクフィブロイ
ンの主鎖を構成する部分は、相対的に大きく切られるこ
とを意味する。これは、蛋白質分解酵素による２次加水
分解を考える場合、一定サイズの分子量を調節すること
ができることを示す。
【００２３】（比較例１）前記実施例１の塩化カルシウ
ム−フィブロイン溶解液１５０ｍｌずつをセルロース透
析チューブ(Spectrum Medical 社、Ｍｗ３５００) に入
れ、蒸留水で４日間塩化カルシウムを除去させた後、５
０℃で濃縮し、凍結乾燥により粉末を回収した結果、平
均３０％が回収された。
ム−フィブロイン溶解液１５０ｍｌずつをセルロース透
析チューブ(Spectrum Medical 社、Ｍｗ３５００) に入
れ、蒸留水で４日間塩化カルシウムを除去させた後、５
０℃で濃縮し、凍結乾燥により粉末を回収した結果、平
均３０％が回収された。
【００２４】（比較例２）前記実施例１の塩化カルシウ
ム−フィブロイン溶解液量の２倍の蒸留水を入れて、粘
度を低めた後、１リットルずつ電気脱塩装置（旭化成
社、電気透析装置）を用いて塩化カルシウムを除去させ
た後、得られた溶液を凍結乾燥により粉末を回収した結
果、平均５０％が回収された。
ム−フィブロイン溶解液量の２倍の蒸留水を入れて、粘
度を低めた後、１リットルずつ電気脱塩装置（旭化成
社、電気透析装置）を用いて塩化カルシウムを除去させ
た後、得られた溶液を凍結乾燥により粉末を回収した結
果、平均５０％が回収された。
【００２５】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の方法によ
り得られた高純度シルクペプチド溶液及び粉末等は、化
粧品及び食品添加用として使用されることができ、得ら
れたシルクペプチドを適正蛋白質加水分解用酵素でさら
に分解すると、分子量数百〜数千単位のオリゴペプチド
水準の高純度シルクペプチドを提供することができる。
り得られた高純度シルクペプチド溶液及び粉末等は、化
粧品及び食品添加用として使用されることができ、得ら
れたシルクペプチドを適正蛋白質加水分解用酵素でさら
に分解すると、分子量数百〜数千単位のオリゴペプチド
水準の高純度シルクペプチドを提供することができる。
【図１】 図１は、シルクフィブロイン塩化カルシウム
溶解液のゲル濾過法（ＧＦＣ）による蛋白質と塩の分離
図である。
溶解液のゲル濾過法（ＧＦＣ）による蛋白質と塩の分離
図である。
【図２】 図２は、ゲル濾過法で分離した純粋シルクペ
プチド水溶液のゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）分
子量である。
プチド水溶液のゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）分
子量である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 李 龍 雨 大韓民国京畿道水原市長安區泉川洞333、 住公アパート154−404 Ｆターム(参考） 4H045 AA20 CA51 EA01 GA01 GA22 HA05
Claims (1)
- 【請求項１】 シルクフィブロインからシルクペプチド
を製造する方法であって、シルクフィブロインの中性塩
溶解物から塩を除去するため、ビードサイズ１〜１５０
μｍのメディアで充填されたゲル濾過クロマトグラフィ
装置に前記溶解物を通過させることを特徴とする高純度
シルクペプチドの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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