KR100354960B1 - 겔 여과법에 의한 고순도 실크 펩타이드 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 겔 여과법에 의한 고순도 실크 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 실크 피브로인의 중성염 용해물로부터 염과 실크 펩타이드의 분리를 위해 겔 여과법을 사용하는 것을 특징으로 하는 고순도 실크 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조되어진 고순도 실크 펩타이드 용액은 화장품 및 식품 첨가용으로 사용될 수 있으며, 얻어진 실크 펩타이드 용액 및 분말을 적정 단백질 가수분해용 효소로 더 분해하면 분자량 수 백~수 천 단위의 올리고 펩타이드 수준의 고순도 실크 펩타이드를 제공할 수 있다.

Description

겔 여과법에 의한 고순도 실크 펩타이드 제조방법{A method for preparation of high purified silk peptide by gel filtration chromatography}

본 발명은 겔 여과법에 의한 고순도 실크 펩타이드 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 실크 피브로인의 중성염 용해물로부터 염과 실크 펩타이드의 분리를 위해 겔 여과법(GFC)을 사용하여 고순도 실크 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

실크 피브로인은 필수 아미노산을 포함한 18종의 아미노산이 골고루 함유되어 있는 몇 안 되는 천연 단백질 자원으로서 그 성분을 감안할 때 유효 기능성을 충분히 활용할 가치를 가지고 있다.

최근, 실크 피브로인 용해물을 식품첨가물 및 건강 기능성 응용 분야로 확대하여 사용함에 따라 중화과정에서 발생하는 염 혹은 용액 속에 존재하는 단백질 이외 물질의 순수 분리가 문제시 될 수 있다.

지금까지 실크 피브로인을 용해 혹은 가수분해시키고자 할 경우, 주로 산(HCl) 및 중성염(CaCl₂)를 많이 사용하고 있으나, 그 중에서 염산을 사용한 산 가수분해법이 거의 주종을 이루고 있다(일본잠사학회지, 60(5), pp. 358-361, 1991). 그런데 염산을 사용할 경우, 거의 모든 실크 펩타이드가 아미노산 수준까지 가수분해되어 중화 및 탈염 과정을 거친 후의 단백질 회수 측면의 문제뿐만이 아니라 회수된 물질의 분자량이 너무 작아 유효기능성을 기대하기에는(식품과학과 산업 30(1), pp. 22-29) 문제점이 있다.

한편, 중성염 계통인 CaCl₂로 용해한 경우, 용액 상에 존재하는 Ca²⁺및 Cl^-을 제거해야 하는데, 특히 실크 피브로인 용액 내에 존재하는 Ca²⁺의 제거는 4~10%의 카마라이트(carmalite)를 대량으로 혼합하여 2시간 정도 반응시킨 다음 침전된 Ca²⁺이온을 분리(대한민국 특허 공고 제 94-2871)하기도 하는데, 이는 공정이 다소 복잡하며 아울러 침전될 때 실크 펩타이드도 함께 침전할 수 있는 문제 및 최종 산물인 분말이 수용성이 아니라는 점 때문에 식품 첨가용으로 사용될 수 없는 문제점이 있다.

또한, 실크 피브로인을 산 혹은 중성염으로 용해시켜 순수 실크 펩타이드만을 회수하고자 할 때, 실험실에서 보편적으로 사용하는 방법은 일정 분자량 단위의 셀룰로오스 투석 튜브를 이용한 실크 펩타이드의 회수법인데(일본잠사학회지, 63(1), pp. 21-27, 1994), 이 방법은 염 성분이 완전히 제거될 때까지 여러 번 물을 치환해야 한다는 시간상 문제, 고가임에도 불구하고 투석 튜브는 거의 1~2회밖에 사용할 수 없다는 경제적인 문제 및 사용한 투석 튜브의 포어(pore) 사이즈 이하의 유효 성분이 모두 빠져나간다는 결정적인 문제로 비실용적이며 저효율적인 분리 방법이다. 그렇기 때문에 혼합 용액 내의 단백질과 단백질 이외 물질과의 순수 분리를 감안할 경우, 일정 분자량 단위의 막(Membrane) 혹은 튜브에 의한 물리적 분리 방법과는 차별화된 순수 분리 방법을 찾을 필요가 있는데, 이것은 순도가 높은 고부가가치 제품의 생산 여부를 결정하는 중요한 요인으로 작용할 수 있기 때문이다.

이에, 본 발명자들은 이미 알려져 있는 실크 피브로인의 중성염 용해물에서 실크 펩타이드만을 순수 분리할 때 나타나는 문제점을 해결하기 위한 연구를 거듭한 결과, 실크 피브로인 중성염 용해물을 일정 크기의 겔이 충진된 겔 여과 장치에 통과시키는 겔 여과법(GFC)을 사용함으로써 고순도 실크 펩타이드를 고효율로 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 겔 여과법을 이용하여 실크 피브로인의 중성염 용해물로부터 고순도 실크 펩타이드를 고수율로 얻는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 고순도 실크 펩타이드 용액을 특정 효소로 가수분해하여 올리고 펩타이드 수준 분자량까지 조절 가능한 순수 실크 펩타이드분말을 제공하는 것이다.

제 1도는 실크 피브로인 염화칼슘 용해액의 겔 여과법(Gel filtration Chromatography, 이하 GFC)에 의한 단백질과 염의 분리 그림이다.

제 2도는 겔 여과법으로 분리한 순수 실크 펩타이드 수용액의 겔 침투 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, 이하 GPC) 분자량이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 고순도 실크 펩타이드의 제조방법은 실크 피브로인 중성염 용해물로부터 염과 실크 펩타이드의 분리를 위해 겔 여과법을 사용하는 것을 특징으로 한다.

이하, 고순도 실크 펩타이드의 제조방법을 각 단계별로 설명한다.

(1) 견 단백질에서 세리신을 제거하는 단계

견 단백질에서 세리신을 제거하기 위한 전 처리과정으로, 고온 고압법으로 정련을 실시하여 실크 피브로인(fibroin)만을 얻는다.

(2) 실크 피브로인을 CaCl₂·H₂O·에탄올에 용해하는 단계

실크 피브로인을 CaCl₂·H₂O·에탄올에 용해하여 실크 피브로인 중성염 용해물을 얻는 단계로 50%의 CaCl₂·H₂O·에탄올의 몰비가 1:8:2 M%가 되도록 조절하여 95℃에서 5시간 동안 실크 피브로인을 용해한다.

(3) 겔 여과법에 의한 순수 실크 펩타이드 용액을 얻는 단계

실크 피브로인 중성염 용해물 내에 존재하는 Ca²⁺및 Cl^-와 실크 펩타이드만의 순수 분리를 위하여 비드 사이즈(Bead size) 1-150㎛, 바람직하게는 20-80㎛의 미디어(media)로 충진된 겔 여과 크로마토그래피장치를 사용하여 순수 실크 펩타이드를 얻는다. 미디어(media)로는 파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech 社,스웨덴)의 세파덱스(Sephadex) G-10, G-25의 겔이 가장 분리능이 좋은 것으로 나타났다. 겔 여과법에 의한 염과 단백질의 분리는 표면 사이사이로 먼저 분자량이 작은 염 성분이 채워지고, 그 후 상대적으로 분자량이 큰물질(아미노산 혹은 단백질) 등이 빠져 나오게 되므로 염 성분보다 분자량이 큰 단백질 성분이 먼저 빠져 나오게 된다. 실시예 1의 염과 단백질의 분리를 나타내는 그래프를 도 1에 나타내었는데, 이때 도 1에서 보는 것과 같이 단백질과 염의 완벽한 분리가 이루어짐을 알 수 있다.

(4) 얻어진 순수 실크 펩타이드 용액을 급속 동결시킨 후 동결 건조기(Freezing Dryer) 혹은 분무건조기(Spray Dryer)를 이용해 순수 실크 펩타이드 분말을 제조하는 단계

상기 제 3공정에서 얻는 순수 실크 펩타이드 용액을 급속 동결시킨 후 동결건조기 혹은 분무건조기로 순수 실크 펩타이드 분말을 제조하고 특성을 조사한다.

이하 실시예를 통해 본 발명에 따른 고순도 실크 펩타이드의 제조방법에 대해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

제 1 공정: 중성염을 이용한 실크 피브로인의 용해

섬유화할 수 없는 부잠사, 절각견 등에서 협잡물을 제거한 견사 100g을 준비하고, 준비된 견사 1g에 대하여 물 50g을 준비한 후, 121℃에서 3시간 고온 고압을 이용하여 정련을 실시하여(이때의 연감율은 22%내외였다.) 순수 실크 피브로인 단백질을 얻었다. 얻어진 실크 피브로인을 무수 CaCl₂·H₂O·에탄올에 몰비가 1:8:2 M%가 되도록 조절한 후 95℃에서 5시간 동안 용해시킨 후 3겹의 부직포에 의한 잔유물 등의 이물질을 제거하고 이 염화칼슘-피브로인 용해액 500㎖에 대하여 초순수 증류수 500㎖를 첨가하여 희석된 염화칼슘-피브로인 용해액을 얻었다.

제 2공정: 겔 여과장치를 이용한 실크 펩타이드 용액과 중성염의 분리

상기 제 1공정에서 제조한 염화칼슘-피브로인 용해액을 비드 사이즈(Bead size) 20-80㎛의 미디어(media)로 충진된 저압 겔 여과 크로마토그래피(Low-pressure gel filtration chromatograpy) 장치를 이용하여 실크 피브로인 용액 속의 염을 제거하였다. 즉, 상기에서 염화칼슘-피브로인 용해액 500㎖를 샘플라인(sample line)에 연결한 뒤, 유속 25㎖, 분획 30㎖, 차트 스피드(chart speed) 5㎜/분의 조건으로 충진 컬럼의 25%의 용액에 해당하는 250㎖를 주입하였다. 그 후 증류수를 같은 조건으로 흐르게 하여 실크 펩타이드와 염의 분리를 행한 결과, 도 1과 같은 실크 펩타이드 및 염의 분리 그림을 얻었다.

제 3공정: 순수 피브로인 분말 제조 및 그 특성

상기 제 2공정에서 제조한 순수 실크 펩타이드 용액을 농축기로 농축한 뒤 동결건조기 혹은 스프레이 드라이어(spray dryer)를 사용하여 순수 실크 펩타이드 분말을 얻었다. 이때의 평균 수율은 90% 이상이었다.

<시험예 1>

실시예 1에서 얻은 실크 펩타이드 용액을 0.8㎛의더블-레이어-멤브레인(double-layer-membrane)으로 여과하고, 겔 침투 크로마토그래피(GPC) 분자량 측정 장치에 여과액 100㎕를 주입하여 절대 분자량을 측정하고, 도 2와 같은 분자량 분포 그림을 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이 중량 평균 분자량(Mw)이 25,000 부근에 분포하고 있음을 확인하였다.

<시험예 2>

시험예 1에서 얻어진 각각의 여과액을 건조한 후 구연산(pH 2.2)으로 희석하여 자동아미노산 분석장치로 유리아미노산의 함량을 조사하였다. 또한 실크 피브로인 5㎎에 6N 염산 25㎖를 110℃에서 24시간 완전 가수분해한 후, 염산을 완전 증발시킨 다음 구연산으로(pH 2.2) 희석하여 전아미노산 분석을 실시하였다. 상기에서 얻어진 유리 아미노산 및 전 아미노산의 함량을 표 1에 나타내었다.

염화칼슘으로 용해한 순수 피브로인의 유리 아미노산 및 전 아미노산 함량

아미노산	유리아미노산(mol%)	전 아미노산(mol%)
글리신(Gly)	13.1	42.9
알라닌(Ala)	13.6	30.4
세리신(Ser)	4.3	12.2
티로신(Tyr)	3.2	4.8
발린(Val)	1.1	2.5
아스파라긴(Asp)	0.5	1.9
글루타민(Glu)	0.8	1.4
트레오닌(Thr)	0.6	0.9
총 계	37.2	97.0

표 1의 결과에서도 알 수 있듯이, 유리 아미노산과 전 아미노산의 함량에는 큰 차이가 있다. 즉 염화칼슘으로 용해한 경우, 유리 아미노산의 함량이 전 아미노산의 약 38% 수준으로 나타났는데 이것은 염화칼슘으로 용해할 경우, 일정 부분의 아미노산, 즉 주로 실크 피브로인의 비결정 영역에 존재하는 아미노산이 유리되어 유리 아미노산의 형태로 존재함을 추정할 수 있다. 이러한 결과로 보아 실크 피브로인의 주사슬(main-chain)을 구성하는 부분은 상대적으로 크게 잘라졌음을 의미하며 이것은 단백질 분해효소에 의한 2차 가수분해를 생각할 경우, 일정 크기의 분자량을 조절할 수 있음을 나타낸다고 할 수 있다.

<비교예 1>

상기 참고예의 염화칼슘-피브로인 용해액 150㎖씩을 셀룰로오스 투석 튜브(Spectrum Medical 社, Mw 3,500)에 넣은 후, 증류수로 4일 간 염화칼슘을 제거시킨 후 50℃로 농축을 거친 후 동결 건조에 의하여 분말을 회수한 결과 평균 30%가 회수되었다.

<비교예 2>

상기 참고예의 염화칼슘-피브로인 용해액 양의 2배의 증류수를 넣어 점도를 낮춘 후, 1ℓ씩 전기 탈염장치(旭化成 전기투석장치)를 사용하여 염화칼슘을 제거시킨 후 얻어진 용액을 동결건조에 의하여 분말을 회수한 결과 평균 50%가 회수되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 고순도 실크 펩타이드 용액 및 분말 등은 화장품 및 식품 첨가용으로 사용될 수 있으며, 얻어진 실크 펩타이드를 적정 단백질 가수분해용 효소로 더 분해하면 분자량 수 백~수 천 단위의 올리고 펩타이드 수준의 고순도 실크 펩타이드를 제공할 수 있다.

Claims (2)

1. 실크 피브로인으로부터 실크 펩타이드를 제조하는 방법에 있어서,

   (1) 견 단백질에서 세리신을 제거하여 실크 피브로인을 제조하는 단계;

   (2) 상기 실크 피브로인을 50% CaCl₂·H₂O·에탄올의 몰비가 1:8:2인 염용액으로 용해시켜 중성염 용해물을 제조하는 단계;

   (3) 상기 중성염 용해물을 비즈 사이즈 1∼150㎛의 미디어로 충진된 겔 여과 크로마토그래피에 통과시키는 단계; 및

   (4) 상기 칼럼을 증류수로 용출시키는 단계를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 평균분자량 25,000 이상의 고순도 실크 펩타이드 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 미디어의 비즈 사이즈가 20∼80㎛임을 특징으로 하는 고순도 실크 펩타이드 제조방법.