TWI687437B - 高純度未變性膠原蛋白及其製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種高純度未變性膠原蛋白及其製造方法，其係利用酸及非胃蛋白酶(non-pepsin protease)水解雞胸骨及粗濾後，所述濾液無須經離心回溶處理，直接進行加鹽處理及精濾處理，以在較短的製程時間內獲得高純度未變性膠原蛋白，其中高純度未變性膠原蛋白之總膠原蛋白含量為60%以上，且含有至少50%的未變性第二型膠原蛋白。
Description
本發明是有關於一種膠原蛋白及其製造方法，且特別是一種高純度未變性膠原蛋白及其製造方法，其所述高純度未變性膠原蛋白具有高未變性第二型膠原蛋白含量。
第二型膠原蛋白為軟骨的主要結構成份，並與其他型膠原蛋白和蛋白多醣等成份並存於軟骨中，以支撐組織並具有吸收衝力的功效。由於二型膠原蛋白具有良好的生物相容性，故常被應用於食品、醫療和美容等領域。
近來研究指出未變性第二型膠原蛋白(Undenatured type II collagen)對類風溼性關節炎具有顯著的療效。雖然市面上已有許多未變性第二型膠原蛋白之產品，但其在不同酸鹼度溶液中的溶解度不佳、未變性第二型膠原蛋白的含量低且產品中的總膠原蛋白含量也低。
此外，在常見的製程中，常因加熱或化學處理(例如酵素處理)造成未變性第二型膠原蛋白降解而失去活性。再者，常見製程所使用的酵素或其他試劑通常為非食品
級，造成所製得的膠原蛋白產品的應用領域受到限制，製程時間也較長。特別是，常用於純化膠原蛋白的胃蛋白酶，由於其來源複雜且不明確，目前在國內並未列入食品級酵素中。
因此，目前亟需提出一種高純度未變性膠原蛋白及其製造方法，以改善上述種種問題。
本發明的一個態樣在於提供一種高純度未變性膠原蛋白的製造方法，其利用可製得高總膠原蛋白含量(相當於純度)及高未變性第二型膠原蛋白含量(相當於活性)的膠原蛋白。
本發明的另一個態樣在於提供一種高純度未變性膠原蛋白，其係使用上述的製造方法所製得。
根據本發明的上述態樣，提出一種高純度未變性膠原蛋白的製造方法。在一些實施例中，先提供雞胸骨。接著，對雞胸骨進行酸水解，以形成酸水解物。所述酸處理係於0℃至7℃下進行至少30天。然後，將非胃蛋白酶加入酸水解物中進行酵素水解，以形成酵素水解物。所述非胃蛋白酶與雞胸骨之重量比為1：60至1：100。之後，對所述酵素水解物進行粗濾處理，以形成濾液。然後，對所述濾液進行加鹽處理，以形成鹽液。於所述加鹽處理後，使用不同孔徑之陶瓷膜，直接對鹽液進行精濾處理，以獲得所述高純度未變性膠原蛋白。膠原蛋白中包含至少50%的未變性第二
型膠原蛋白。
依據本發明的一些實施例，在獲得膠原蛋白後，可對膠原蛋白進行低溫乾燥處理。
依據本發明的一些實施例，所述酸水解的步驟係使用pH 1.5至2之醋酸來進行。
依據本發明的一些實施例，所述酵素水解係於12℃至36℃下進行8至72小時。
依據本發明的一些實施例，所述加鹽處理之鹽濃度為0.7M至1.1M。
依據本發明的一些實施例，所述精濾處理包含將鹽液稀釋為至少300公升的稀釋液，以及以每分鐘30公升至50公升的流速，將所述鹽液通過複數個陶瓷膜，以去除分子量1至300kD的雜質。
依據本發明的一些實施例，所述精濾處理包含進行上述稀釋步驟及上述通過複數個陶瓷膜的步驟之複數個循環達4至8天。
依據本發明的一些實施例，所述製造方法排除在上述精濾處理前進行離心沉澱處理和回溶處理。
根據本發明的上述態樣，提出一種高純度未變性膠原蛋白。在一些實施例中，所述高純度未變性膠原蛋白係使用上述製造方法所製得。所述高純度未變性膠原蛋白之總膠原蛋白含量為至少60%，且至少50%的高純度未變性膠原蛋白為未變性第二型膠原蛋白。
依據本發明的一些實施例，所述高純度未變性
膠原蛋白中的灰份為少於1.5%。
100‧‧‧方法
110‧‧‧提雞胸骨
120‧‧‧酸水解雞胸骨，以形成酸水解物
130‧‧‧將非胃蛋白酶加入酸水解物中進行酵素水解，以形成酵素水解物
140‧‧‧對酵素水解物進行粗濾處理，以形成濾液
150‧‧‧對濾液進行加鹽處理，以形成鹽液
160‧‧‧於加鹽處理後，直接對鹽液進行精濾處理，以獲得高純度未變性膠原蛋白
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：[圖1]繪示依據本發明的一些實施例所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法的示意流程圖。
本發明的目的在於提供一種高純度未變性膠原蛋白及其製造方法，且特別是高純度未變性食品級膠原蛋白的製造方法，其係利用酸及非胃蛋白酶(non-pepsin protease)水解雞胸骨並經粗濾後，無須離心濾液和回溶沉澱物，直接對濾液進行加鹽處理及精濾處理，以在較短的製程時間內獲得高純度未變性膠原蛋白。
本發明此處所稱之食品級膠原蛋白係由使用食品級試劑所製得。所述食品級的規格係以取得中華民國衛生福利部食品藥物管理署之「食品添加物許可證」而訂之。
以下請參考圖1，其繪示依據本發明的一些實施例所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法的示意流程圖100。
如圖1所示，在方法100的步驟110中，先提供雞胸骨。在一實施例中，提供至少20公斤的雞胸骨。在一較佳的實施例中，雞胸骨的使用量為20公斤至40公斤。一
般而言，由於雞胸骨中的第二型膠原蛋白含量較高，為雞胸骨總蛋白質的45重量百分比至70重量百分比，故雞胸骨適用於生產未變性第二型膠原蛋白。
在一些實施例中，如步驟110所述雞胸骨已先經去肉、切碎及清洗等處理。在一些例子中，所述清洗處理可例如使用乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)來進行。
接下來，如步驟120所示，對雞胸骨進行酸水解，以形成酸水解物。所述酸水解可於0℃至7℃下進行至少30天。在一些實施例中，所述酸水解係使用pH 1.5至2之醋酸來進行。倘若酸水解的時間不足，會造成後續的酵素水解效率不佳。再者，由於酸水解進行時間較長，倘若溫度過高則容易使雞胸骨變質，從而降低未變性第二型膠原蛋白的含量。
然後，如步驟130所示，將非胃蛋白酶加入酸水解物中進行酵素水解，以形成酵素水解物。在一例子中，所述酵素水解是於pH 1.9至6下進行。在一實施例中，酵素水解係於12℃至36℃下進行8至72小時。若超過上述pH、溫度或時間範圍，則酵素水解效果不佳。在一實施例中，步驟120和步驟130之間可更包含調整pH值之步驟，以使酸水解物的pH值可落於酵素水解步驟的適當範圍。在一些實施例中，非胃蛋白酶與雞胸骨之重量比為1：60至1：100。具體而言，本發明使用的非胃蛋白酶之為食品級酵素，其可包括但不限於蛋白酶M(protease M)、木瓜酵素、
鳳梨酵素、其他適合的酵素，或上述酵素的組合。在一些實施例中，本發明排除使用胃蛋白酶進行酵素水解。在一具體例中，酵素水解係於醋酸溶液中進行。
之後，如步驟140所示，對上述酵素水解物進行粗濾處理，以形成濾液。所述粗濾處理可例如使用不同孔徑的網篩，將酵素水解物中殘餘的碎雞骨等固體雜質濾除，並保留濾液進行後續的製程步驟。在另一些實施例中，可使用例如60目(mesh)、300目、500目等不同孔徑的網篩進行粗濾處理。本發明此處對網篩的孔徑及數量並無特別限制，可依照酵素水解物的狀況而調整。
接下來，如步驟150所示，對濾液進行加鹽處理，以形成鹽液。在一些實施例中，所述加鹽處理係於0.7M至1.1M的鹽濃度下進行。在一些實施例中，加鹽處理可例如添加氯化鈉於上述澄清液中，並攪拌至氯化鈉完全溶解。
具體而言，鹽液中包含因等電點平衡而聚集或沉澱的膠原蛋白粗產物以及鹽溶液。本發明排除使用離心處理將聚集或沉澱的膠原蛋白粗產物與鹽溶液分離，而是直接將此鹽液進行後續的精濾處理(如步驟160所示)，以降低膠原蛋白的損失，從而提高總膠原蛋白與未變性第二型膠原蛋白含量。在一例子中，雞胸骨的處理量為至少20公斤，故加鹽處理所產生的鹽液的量也十分可觀(例如總重量達140公斤以上)。倘若對此鹽液進行離心處理，由於離心設備尺寸之限制，及離心後須回溶沉澱物，需耗費大量的時間。
然後，如步驟160所示，在上述步驟150的加鹽
處理後，直接對鹽液進行精濾處理，以獲得本發明之高純度未變性膠原蛋白。在一些實施例中，所述精濾處理包含將鹽液稀釋為至少300公升的稀釋液，以及以每分鐘30公升至50公升的流速，將稀釋液通過複數個陶瓷膜，以去除分子量為1至300kD的雜質(例如：鹽類、灰份)。在一些實施例中，精濾處理係將鹽液稀釋為300公升至500公升的稀釋液。在一些實施例中，所述精濾處理係循環進行(即重複通過前述陶瓷膜)達4天至8天。所述循環進行精濾處理包含上述稀釋及通過陶瓷膜以排除含有雜質的水之二步驟的複數個循環，以提高雜質去除率。
在一些實施例中，所述複數個陶瓷膜的每一者可為管狀陶瓷膜，其材質包含氧化鋁、氧化鋯及/或氧化鈦。在一具體例子中，管狀陶瓷膜可具有例如120公分的長度，截面積可例如為10mm至25mm。在一些例子中，複數個管狀陶瓷膜(例如3個)係串連設置，使稀釋液可依序通過。本發明透過調整精濾處理的時間、設備(例如陶瓷膜規格或配置)、精濾處理的流速等，以保留膠原蛋白之高純度及高未變性第二型膠原蛋白含量。
在一些實施例中，本發明的製造方法更包含在形成高純度未變性膠原蛋白後，對高純度未變性膠原蛋白進行低溫乾燥處理。低溫乾燥處理後的高純度未變性膠原蛋白呈海綿或片狀，以便於保存和延長保存時間。此處所稱之低溫乾燥處理可例如為低於40℃的乾燥處理，且可包括但不限於烘乾或凍乾。
本發明的高純度未變性膠原蛋白的總膠原蛋白含量(相當於膠原蛋白純度)為60%以上，且至少50%的高純度未變性膠原蛋白為未變性第二型膠原蛋白(相當於活性成份)。在一些實施例中，高純度未變性膠原蛋白中的灰份少於1.5%。在一些例子中，未變性第二型膠原蛋白佔總膠原蛋白含量的70重量百分比以上。
以下提供複數個實施例與比較例說明本發明之高純度未變性膠原蛋白的製造方法。
實施例1
首先，將去肉並切碎的雞胸骨20公斤以EDTA清洗三次。接著，在0℃至7℃下，將清洗後的雞胸骨浸泡於pH 2的醋酸中達30天，以形成酸水解物。之後，以醋酸調整酸水解物之pH值為pH 2±0.1，以蛋白酶M(40000U/g，天野酶製品股份公司製造)：雞胸骨之重量比為1：80，將蛋白酶M加入酸水解物中，並於33℃至36℃下反應8小時，以形成酵素水解物。之後，粗濾酵素水解物並獲得濾液。接著，於所述濾液中加入氯化鈉並均勻攪拌，形成氯化鈉的最終濃度為0.9M的鹽液。以大量的去離子水將鹽液稀釋至300至350公升後，以每分鐘30公升的流速依序通過3個管狀陶瓷濾膜(由INSIDE CéRAMTM製)，每個管狀陶瓷膜的截面積為25mm及長度為1200mm，此些管狀陶瓷膜分別具有8個(水力直徑6mm)、23個(水力直徑3.5mm)和39個通道(水力直徑2.5mm)，可濾除1至300kDa的分子。重複上述稀釋及通過陶瓷膜的步驟達四天，可製得實施例1的
高純度未變性膠原蛋白。可進一步將實施例1的高純度未變性膠原蛋白凍乾。實施例1之評價結果如表1和表3所示。
實施例2
首先，將去肉並切碎的雞胸骨20公斤以EDTA清洗三次。接著，在0℃至7℃下，將清洗後的雞胸骨浸泡於pH 2的醋酸中達30天，以形成酸水解物。之後，以醋酸調整酸水解物之pH值為pH 2±0.1，以蛋白酶M(40000U/g，天野酶製品股份公司製造)：雞胸骨之重量比為1：60，將蛋白酶M(40000U/g，天野酶製品股份公司製造)加入酸水解物中，並於12℃至15℃下反應72小時，以形成酵素水解物。之後，粗濾酵素水解物並獲得濾液。接著，於所述濾液中加入氯化鈉並均勻攪拌，形成氯化鈉的最終濃度為0.9M的鹽液。以大量的去離子水將鹽液稀釋至300至350公升後，以每分鐘50公升的流速依序通過3個管狀陶瓷膜(由INSIDE CéRAMTM製)，每個管狀陶瓷膜的截面積為25mm及長度為1200mm，此些管狀陶瓷膜分別具有8個(水力直徑6mm)、23個(水力直徑3.5mm)和39個通道(水力直徑2.5mm)，可濾除1至300kDa的分子。重複上述稀釋和通過陶瓷膜的步驟達六天，可製得實施例2的高純度未變性膠原蛋白。可進一步將實施例2的高純度未變性膠原蛋白低溫乾燥。實施例2之評價結果如表1至表3所示。
比較例1
首先，將去肉並切碎的雞胸骨20公斤以EDTA清洗三次。接著，在0℃至7℃下，將清洗後的雞胸骨浸
泡於pH 2的醋酸中達30天，以形成酸水解物。之後，以醋酸調整酸水解物之pH值為pH 2±0.1，以胃蛋白酶(pepsin，2000-3500U/mg，Avantor Performance Materials,lnc製)：雞胸骨之重量比為1：80，將胃蛋白酶加入酸水解物中，並於12℃至15℃下反應72小時，以形成酵素水解物。之後，粗濾酵素水解物並獲得濾液。接著，於所述澄清液中加入氯化鈉並均勻攪拌，形成氯化鈉的最終濃度為0.9M的鹽液。以35000×g離心此鹽液並獲得沉澱物。以約40公升的去離子水回溶上述沉澱物。上述離心回溶的時間耗時六天。之後，以去離子水將鹽液稀釋至100至150公升後，進行精濾達六天，可製得比較例1的膠原蛋白。比較例1之評價結果如表1至表3所示。
比較例2
比較例2使用市售之未變性第二型膠原蛋白(UCII，美國InterHealth Nutraceuticals公司製)進行下述評價。比較例2之評價結果如表1和表2所示。
比較例3
比較例3使用市售之未變性第二型膠原蛋白(b-2Cool®，歐洲BIOIBERICA公司製)進行下述評價。比較例2之評價結果如表1和表2所示。
評價方式
1.總膠原蛋白含量
本發明此處所稱的總膠原蛋白含量係利用膠原蛋白中的羥脯氨酸(Hydroxyproline；Hyp)含量進行檢
測。Hyp含量越高代表總膠原蛋白含量越高，即膠原蛋白的純度越高。本發明較佳之總膠原蛋白含量為樣品總量的60%以上。
2.未變性第二型膠原蛋白含量
本發明此處所稱的未變性第二型膠原蛋白含量係以市售之第二型膠原蛋白偵測套組(Chondrex製)進行檢測，此含量可相當於所製得之膠原蛋白的活性成份含量。本發明較佳之未變性第二型膠原蛋白含量為樣品總量的50%以上。
3.溶解度
本發明此處所稱之溶解度係指低溫乾燥後的實施例和比較例的膠原蛋白回溶於水、強酸液(模擬胃液，pH值為1至2)或強鹼液(pH值為9至10)中時，是否產生結晶或沉澱，或是可完全溶解。本發明此處所稱之高溶解度係指膠原蛋白完全溶解於上述溶液中，中溶解度代表僅微量不溶物存在於上述溶液中，而低溶解度係指膠原蛋白溶解後仍明顯有沉澱物。此處所稱之溶解度與純度相關，純度越高，膠原蛋白中所含之不溶雜質越少，溶解度則越高。
4.蛋白質純度及含量
本發明此處的蛋白質純度係以蛋白質電泳膠進行檢測，其中電泳膠的色帶單一代表蛋白質種類單一、純度高，且色帶顏色深代表蛋白質含量高。
5.灰份
本發明此處所稱之灰份可視為所製得之膠原蛋
白中所含之雜質。一般而言，灰份的含量越少越佳，且本發明較佳地灰份含量少於1.5重量%。
6.時程
本發明此處所稱之時程係指進行精濾處理的時間。在比較例1中，此精濾處理為離心、回溶與精濾的時間總和。
本發明所揭露的製造方法使用製造食品級產品規格的試劑(例如酵素及反應溶液)並改善製程流程，以縮短製程時間並製造高純度未變性膠原蛋白。如表1所示，實施例1和2之食品級膠原蛋白中含有高純度的膠原蛋白及高含量的未變性第二型膠原蛋白。此外，實施例2之高純度未變性膠原蛋白色帶單一、色帶顏色深、Hyp含量高且灰份少，其在強酸液、強鹼液以及水中都具有良好的溶解度。
另一方面，使用胃蛋白酶進行酵素水解，並經離心回溶後才進行精濾的比較例1需耗費較長的時間，大幅增加時間成本。此外，由於胃蛋白酶非食品級酵素，因此比較例1之膠原蛋白不可做為食品級膠原蛋白，其應用受到限制。
使用市售產品的比較例2和3則有總膠原蛋白含量(純度)和未變性第二型膠原蛋白含量(活性)不足的缺點，致使比較例2和3的膠原蛋白之溶解度不佳。
應用本發明的高純度未變性膠原蛋白及其製造方法，在選用特定酵素及省略離心回溶處理後，可在較短的製程時間內，製造高純度及高未變性第二型膠原蛋白含量的膠原蛋白，且此高純度未變性膠原蛋白可為食品級並在各種溶液環境中具有良好的溶解度。基於上述優點，本發明所製得的高純度未變性膠原蛋白適用於各種食品、醫療、美容之領域。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常
知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
100‧‧‧方法
110‧‧‧提供雞胸骨
120‧‧‧酸水解雞胸骨，以形成酸水解物
130‧‧‧將非胃蛋白酶加入酸水解物中進行酵素水解，以形成酵素水解物
140‧‧‧對酵素水解物進行粗濾處理，以形成濾液
150‧‧‧對濾液進行加鹽處理，以形成鹽液
160‧‧‧於加鹽處理後，直接對鹽液進行精濾處理，以獲得高純度未變性膠原蛋白
Claims (10)
- 一種高純度未變性膠原蛋白的製造方法，包含：提供雞胸骨；於0℃至7℃下酸水解該雞胸骨達至少30天，以形成一酸水解物；將非胃蛋白酶加入該酸水解物中進行一酵素水解，以形成一酵素水解物，其中該非胃蛋白酶與該雞胸骨之一重量比為1：60至1：100；對該酵素水解物進行一粗濾處理，以形成一濾液；對該濾液進行一加鹽處理，以形成一鹽液；以及於該加鹽處理後，直接對該鹽液進行一精濾處理，以獲得一膠原蛋白，其中該膠原蛋白中包含至少50%的未變性第二型膠原蛋白。
- 如申請專利範圍第1項所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法，更包含：在獲得該膠原蛋白後，對該膠原蛋白進行一低溫乾燥處理。
- 如申請專利範圍第1項所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法，其中該酸水解的步驟係使用pH 1.5至2之醋酸來進行。
- 如申請專利範圍第1項所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法，其中該酵素水解係於12℃至36℃下進行8至72小時。
- 如申請專利範圍第1項所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法，其中該加鹽處理之一鹽濃度為0.7M至1.1M。
- 如申請專利範圍第1項所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法，其中該精濾處理包含：稀釋該鹽液為至少300公升的一稀釋液；以及以每分鐘30公升至50公升的一流速，將該稀釋液通過複數個陶瓷膜，以去除分子量1至300kD的雜質。
- 如申請專利範圍第6項所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法，其中該精濾處理包含進行該稀釋步驟及該通過該些陶瓷膜的步驟之複數個循環達4至8天。
- 如申請專利範圍第1項所述之高純度未變性膠原蛋白的製造方法，其中該製造方法排除於該精濾理前進行一離心沉澱處理和一回溶處理。
- 一種高純度未變性膠原蛋白，其係使用如申請專利範圍第1至8項任一項之高純度未變性膠原蛋白 的製造方法所製得，其中該高純度未變性膠原蛋白之一總膠原蛋白含量為至少60%，且至少50%的該高純度未變性膠原蛋白為未變性第二型膠原蛋白。
- 如申請專利範圍第9項所述之高純度未變性膠原蛋白，其中該高純度未變性膠原蛋白中的灰份為少於1.5%。
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