CN116253791B - 一种具有改善骨关节健康作用的非变性ii型胶原蛋白的制备方法与应用 - Google Patents
一种具有改善骨关节健康作用的非变性ii型胶原蛋白的制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116253791B CN116253791B CN202310112046.1A CN202310112046A CN116253791B CN 116253791 B CN116253791 B CN 116253791B CN 202310112046 A CN202310112046 A CN 202310112046A CN 116253791 B CN116253791 B CN 116253791B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- cartilage
- denatured type
- cartilage fragments
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 title claims abstract description 112
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 12
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title abstract description 4
- 230000037231 joint health Effects 0.000 title abstract description 4
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 167
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 117
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 110
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 110
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 106
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 78
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 57
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 55
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims abstract description 47
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 30
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 30
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 6
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 70
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 54
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 54
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 51
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 49
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 47
- 206010034203 Pectus Carinatum Diseases 0.000 description 46
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 25
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 25
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 25
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 23
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 22
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 21
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 20
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 19
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 14
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 8
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 8
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 8
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 8
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 238000005727 Friedel-Crafts reaction Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/10—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from hair, feathers, horn, skins, leather, bones, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
- A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
- A23L5/27—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification by chemical treatment, by adsorption or by absorption
- A23L5/276—Treatment with inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种具有改善骨关节健康作用的非变性II型胶原蛋白的制备方法与应用，涉及食品生物技术领域。一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1、将软骨碎与含NaOH和NaCl的混合溶液混合，进行杀菌脱杂处理，固液分离，得杀菌脱杂后软骨碎；S2、将所述杀菌脱杂后软骨碎与水混合后进行均浆处理，得均浆液；S3、将所述均浆液的pH调至1.5～3后，进行酶解处理，固液分离，得酶解清液；S4、将所述酶解清液的pH调至4.0～6.5后，固液分离，将固相干燥、粉碎，即得非变性II型胶原蛋白。该制备方法的蛋白提取率高，且提取得到的蛋白纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，尤其是涉及一种具有改善骨关节健康作用的非变性II型胶原蛋白的制备方法与应用。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种常见的慢性致残性疾病，近年来，发病率呈逐年上升趋势，给患者、家庭及社会卫生系统均造成沉重负担。目前用于改善关节炎症状的药物包括糖皮质激素、非甾体类抗炎药、营养补充剂(如硫酸软骨素、氨基葡萄糖、透明质酸等)。研究表明药物治疗会带来副作用，而营养补充剂的效果也存在争议。非变性II型胶原蛋白在预防和改善关节炎方面具有良好的效果，且具有方便、安全无毒及抗原特异性等优点。
非变性II型胶原蛋白在提取过程中要保证其三螺旋结构不被破坏，提取难度较大。目前常见方法有华南理工大学赵谋明教授申请专利，专利申请公开号CN111748030A一种可溶性非变性II型胶原蛋白及其制备方法，提取纯化工艺为：软骨解冻、沥干称重、均浆、超声、杀菌消毒、除杂、酸溶胀、酶解、灭酶、盐析、洗涤、干燥、粉碎，可以制备可溶性非变性II型胶原蛋白，提取率为35.0±5.0％。
北京盛美诺公司申请发明专利，专利申请公开号CN106916870A，一种含有非变性II型胶原蛋白的软骨提取物制备方法，提取纯化工艺为：脱脂、消毒、均浆、酶解、过滤、干燥，制备的软骨提取物胶原蛋白含量在45.6％～57.3％，非变性II型胶原蛋白含量为3.9％～12.6％。
四川大学李国英申请专利，专利申请公开号CN105132502A，一种从鸡软骨中提取纯净II型胶原的方法，提取纯化工艺为：脱脂预处理(氯仿、甲醇)、除可溶性杂蛋(Tris-HCl)、酶解、多次盐析(至少5次)、透析得到纯净的II型胶原。
目前现有技术普遍存在工序复杂、能耗高，且得到非变性II型胶原蛋白提取率低或者纯度低。因此，提供一种工艺简单、蛋白提取率高且蛋白纯度高的非变性II型胶原蛋白的提取方法非常重要。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，蛋白提取率高且纯度高。
本发明还提供上述制备方法制备得到的非变性II型胶原蛋白。
本发明还提供上述非变性II型胶原蛋白的应用。
本发明还提供包含上述非变性II型胶原蛋白的药品或保健品。
根据本发明的第一方面实施例的一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1、将软骨碎与含NaOH和NaCl的混合溶液混合，进行杀菌脱杂处理，固液分离，得杀菌脱杂后软骨；
所述混合溶液中，所述NaOH的浓度为0.2wt％～0.8wt％；所述NaCl浓度为0.5mol/L～2.0mol/L；所述杀菌脱杂处理的时间为4h～12h
S2、将所述杀菌脱杂后软骨碎与水混合后进行均浆处理，得均浆液；
S3、将所述均浆液的pH调至1.5～3后，进行酶解处理，固液分离，得酶解清液；
S4、将所述酶解清液的pH调至4.0～6.5后，固液分离，将固相干燥粉碎，即得非变性II型胶原蛋白。
根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：
实施例的制备方法工艺简单，适合产业化生产，蛋白提取率高，能够制备得到蛋白纯度高、三螺旋结构完整的非变性II型胶原蛋白。相关技术中，常采用盐析、水洗方式纯化非变性II型胶原蛋白，导致蛋白提取率低。实施例的制备方法通过调pH值进行非变性II型胶原蛋白纯化分离，不仅能够有效去除杂质制备出纯度高的非变性II型胶原蛋白，还能有效提高蛋白提取率。
杀菌脱杂的处理溶液中不含氯仿、甲醇、盐酸胍等有毒有害成分，不存在残留的安全隐患，且能够有效杀死原料中微生物除去原料中油脂及碱溶性杂蛋白还对鸡软骨起到溶胀、软化作用，更有利于下一步的均浆，能使均浆更顺畅，大大缩短均浆时间，同时避免均浆过程升温过快造成非变性II型胶原蛋白变性。先杀菌脱杂再均浆使均浆液中鸡软骨细度更细，酶解过程中鸡软骨能更充分跟胃蛋白酶接触，使酶解更加完全，同时也降低酶的用量，减少酶解时间。本发明利用多糖、非变性II型胶原蛋白、肽等在体系中于不同pH值下稳定性不同，从而实现分离纯化，工序简单，还能规避盐析带来提取得率低的问题。
根据本发明的一些实施例，所述软骨碎的来源为冷冻软骨；所述制备方法还包括制备前处理。所述制备前处理包括但不限于解冻、清洗、沥干。
根据本发明的一些实施例，所述软骨碎的来源可以为常见家畜、家禽等动物。包括但不限于鸡、鸭、羊、驴、兔、鹅、猪、牛。来源安全，且易获得。
根据本发明的一些实施例，所述软骨碎的粒径为0.5mm～10mm。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述混合溶液中，所述NaOH的浓度为0.2wt％～0.6wt％，所述NaCl浓度为0.5mol/L～1.5mol/L。所述NaCl浓度进一步优选为1.0mol/L～1.5mol/L。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述软骨碎与所述混合溶液的质量比为1：3～5。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述软骨碎与所述水的质量比为1：2～5。优选为1：3～4。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，所述酶解处理的酶包括胃蛋白酶。以所述软骨碎作为参照计，胃蛋白酶的用量为0.25wt％～1wt％，酶解处理的时长为12h～24h，酶解处理的温度为25℃±5℃。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，所述酶解清液的pH值调节范围为4.0～6.5，优选为5.0～5.5。
根据本发明的一些实施例，所述制备方法的处理温度均要求不高于30℃。
根据本发明的一些实施例，所述干燥包括但不限于喷雾干燥、微波干燥或冷冻干燥。
根据本发明的一些实施例，所述固液分离选自过滤、离心、抽滤或压滤中的至少一种。步骤S1的固液分离优选为过滤；步骤S3的固液分离优选为离心；步骤S4的固液分离优选为离心。
根据本发明的一些实施例，所述制备方法的蛋白提取率达50％以上。
根据本发明的一些实施例，通过优选参数之后制备的蛋白质提取率达52％以上。
根据本发明的第二方面实施例的非变性II型胶原蛋白，由本发明第一方面的制备方法制备得到。
根据本发明的一些实施例，述非变性II型胶原蛋白的蛋白质含量为68％以上。
根据本发明的一些实施例，通过优选参数之后制备非变性II型胶原蛋白的蛋白质含量为80％以上。
根据本发明的第三方面实施例的本发明第二方面的非变性II型胶原蛋白在制备治疗和/或预防关节疾病的药品或保健品中的应用。
根据本发明的一些实施例，所述关节疾病包括关节炎。
根据本发明的第四方面实施例的药品或保健品，包括本发明第二方面的非变性II型胶原蛋白。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1是本发明测试例的样品1至样品7的SDS-PAGE电泳图；
图2是本发明测试例的样品8至样品12的SDS-PAGE电泳图；
图3是本发明测试例的样品13至样品19的SDS-PAGE电泳图；
图4是本发明测试例的样品1至样品7的圆二色光谱图；
图5是本发明测试例的样品8至样品13的圆二色光谱图；
图6是本发明测试例的样品14至样品19的圆二色光谱图；
图7是本发明对比例6处理前的鸡软骨照片；
图8是本发明实施例8经杀菌脱杂后的杀菌脱杂后软骨碎照片；
图9是本发明实施例1～4以及对比例1～2中在步骤S4经离心后的样品图片。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下述实施例中所用的鸡胸软骨蛋白质含量为9.24％。
如无特殊说明，下述实施例中所用的碱液为5mol/L氢氧化钠溶液，盐酸溶液为2mol/L。
实施例1
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至4.0，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到1.33kg沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例2
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.0，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到0.61kg沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例3
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到0.75kg沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例4
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至6.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到1.37kg沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例5
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:2。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例6
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:4。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例7
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:5。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例8
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入4kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂12h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.25wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例9
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入5kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂4h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入1wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例10
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为1.5后，加入0.5wt％胃蛋白酶，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例11
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为3.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例12
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.6％，NaCl浓度为1.0mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:4。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例13
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为0.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:4。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
实施例14
本实施例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.8％，NaCl浓度为2.0mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:4。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
对比例1
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至3.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，非变性II型胶原蛋白无法析出，也即无法得到沉淀物。
对比例2
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至7.0，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，非变性II型胶原蛋白无法析出，也即无法得到沉淀物。
对比例3
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为3.5后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，非变性II型胶原蛋白无法析出，也即无法得到沉淀物。
对比例4
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、将软骨碎加入3L乙酸浓度为0.5mol/L的乙酸溶液(pH3.5)中均浆后，再加入1wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在16℃～18℃条件下搅拌24h，10000r/min离心10min，得上清液。
S3、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，非变性II型胶原蛋白无法析出，也即无法得到沉淀物。
对比例5
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:3。
S3、向均浆液中加入盐酸溶液，调pH值为2.0后，加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，边搅拌边加入NaCl(终浓度为1.8mol/L)，以进行盐析，12h后，离心，取沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
对比例6
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，其制备工艺参照CN111748030A，具体步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎，然后向1.0kg鸡软骨碎中加入4.17L纯净水，于胶体磨中均浆，得均浆液。
S2、边搅拌均浆液，边加入0.33kg的NaCl和16.67g的NaOH，40kHz，300W条件下超声10min；离心，取沉淀。
S3、向沉淀中加入5.0L盐酸浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，进行酸溶胀处理，酸溶胀处理的时间为15min，稳定后调节pH 1.0。
S4、加入0.05kg NaCl、0.005g MgCl2，20g胃蛋白酶，酶解6h，酶解温度为4℃，酶解结束后，调pH 7.5，灭酶，离心，取上清液；
S5、将上清液pH调至5.0，边搅拌边加入0.5kg NaCl，盐析20h，离心取沉淀；
S6、沉淀混悬于纯净水中，清洗，离心取沉淀，反复5次；
S7、对上述沉淀进行低温干燥，粉碎，得到非变性Ⅱ型胶原蛋白粉末。
对比例7
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；
S2、把1.0kg鸡软骨碎加入3kg混合溶液中进行杀菌脱杂，混合溶液中NaOH浓度为0.2％，NaCl浓度为1.5mol/L。杀菌脱杂8h后用滤布过滤取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后过滤得杀菌脱杂后软骨碎。
S3、向杀菌脱杂后软骨碎加水，鸡软骨与水比例为1:3进行均浆处理得均浆液，向均浆液中加入盐酸，调pH值为2.0，然后加入0.5wt％胃蛋白酶(以鸡软骨作为参照计)进行酶解，在温度为25±5℃条件下酶解18h，得酶解液。
S4、将酶解液过50目筛网，去除大的颗粒，得过滤液；进一步将过滤液进行冷冻干燥，粉碎，得到非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
对比例8
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为0.1％，NaCl浓度为1.5mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:4。
S3、向均浆液中加入盐酸，调pH值为2.0后，加入0.5％胃蛋白酶，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
对比例9
本对比例提供一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
S1、将鸡胸软骨解冻并沥干水分，粗碎，得粒径为0.5～10mm的鸡软骨碎；向1.0kg鸡软骨碎中加入3kg混合溶液，以进行杀菌脱杂；杀菌脱杂8h后，用滤布过滤，取沉淀，并用蒸馏水洗涤2次后，过滤，得到杀菌脱杂后软骨碎。
其中，混合溶液中，NaOH的质量百分数为1.0％，NaCl浓度为3.0mol/L。
S2、向杀菌脱杂后软骨碎中加水，进行均浆处理，得均浆液。
其中，软骨碎与水的质量比为1:4。
S3、向均浆液中加入盐酸，调pH值为2.0后，加入0.5％胃蛋白酶，在25℃±5℃条件下酶解18h，离心，取上清液。
S4、一边搅拌上清液，一边加碱液调节pH值至5.5，待pH值稳定后，10000r/min离心10min，得到沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，粉碎，得到所述非变性II型胶原蛋白的粉末，粉碎过程中温度控制在30℃以下。
测试例
本测试例对实施例1至14和对比例1至9制备得到沉淀物的蛋白质含量及提取率、非变性Ⅱ型胶原蛋白的纯度、三螺旋结构完整性进行评价。评价方法如下：
(1)参考GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定蛋白质含量，换算系数为5.79，蛋白质提取率计算公式如下：
(2)采用SDS-PAGE电泳分析非变性Ⅱ型胶原蛋白纯度。评价方法具体为：将各实施例或对比例制备得到的非变性Ⅱ型胶原蛋白样品溶于还原型上样缓冲液中(弗德生物，货号FD002/6)，非变性Ⅱ型胶原蛋白样品终浓度为1mg/mL，沸水浴中煮沸5min，5000rpm/min离心10min，取上清，上样10μL，跑SDS-PAGE电泳。
电泳条件：分离胶浓度7.5％(w/v)，浓缩胶浓度5％(w/v)，先80V，稳定后120V，电泳时间约1h。
染色液为0.25％考马斯亮蓝R-250溶液。脱色液的配方为：10％冰醋酸、10％甲醇、80％蒸馏水。
(3)采用评价圆二色光谱非变性Ⅱ型胶原蛋白三螺旋结构的完整性。评价方法具体为：将各实施例或对比例制备得到的非变性II型胶原蛋白样品溶于稀HCl溶液(pH 2.0)中，加入1mm比色皿中，放入圆二色光谱CD仪中于25℃，190nm～260nm进行光谱扫描，绘制各光谱曲线。
蛋白质含量、蛋白质提取率、鉴定结果见表1。样品1至样品19的SDS-PAGE电泳图见图1至图3；光谱曲线测定结果见图4至图6。
表1
由表1，图1-6可知，本发明制备方法制备非变性Ⅱ型胶原蛋白(实施例1-14)其蛋白质(占干物质)含量高达68.2％-91.2％，蛋白质收率为50.54％-60.66％。通过电泳marker图可知实施例制备的样品电泳条带中分子量为130kDa的α1链颜色深，说明非变性Ⅱ型胶原蛋白纯度较高。214nm波长处椭圆率为0、222nm波长处有一正吸收峰是左旋聚脯氨酸构型肽链圆二色光谱的典型特征；202nm波长处有一强的负吸收峰是Ⅱ型胶原蛋白三螺旋结构中无规则卷曲的典型特征。通过圆二色光谱图可知，本发明制备方法得到的样品均没有变性，保持有较好三螺旋结构。
实施例3与对比例5相比，对比例5采用酶解后盐析沉淀制备非变性II型胶原蛋白。而实施例3采用调pH值后离心沉淀。从表1可知，两者蛋白质提取率接近，但对比例5因盐析沉淀物中含有大量的高浓度盐溶液，干燥后制备非变性II型胶原蛋白的蛋白质含量只有30.2％，而实施例3蛋白质含量为88.5％，提高了193％。同等上样浓度下，对比例5因非变性II型胶原蛋白含量低于最低检测限，故在电泳marker图没有显示电泳条带。圆二色光谱图在202nm及222nm波长正负吸收峰值均远低于实施例3。
实施例8与对比例6相比，对比例6多了超声提取、灭酶、盐析、水洗工序，少了调pH值纯化工序，且均浆、杀菌脱杂顺序不同。对比例6蛋白质含量为90.5％，提取率37.76％。而实施例8蛋白质含量为91.2％，提取率为56.09％，蛋白质含量接近，但蛋白质得率却大大提高，提高了48.5％。同时，对比例6鸡软骨粗碎(鸡软骨尺寸大(30mm-60mm)，见图7，不粗碎很难用胶体磨进行均浆处理，故进行粗碎处理)后直接均浆处理，因没有经过预先软化处理，所以均浆时间长，设备高速运转，剪切，摩擦升温过快，如果均浆过程中不采用降温处理易导致Ⅱ型胶原蛋白变性。对比例6采用均浆液达到30℃时，停止均浆，对均浆液进行降温后再进行均浆。生产连续性难于保证。而实施例8的方法先进行杀菌脱杂后再进行均浆，杀菌脱杂还对鸡软骨起到溶胀、软化作用，见图8(鸡软骨碎已软化，漂浮在水面上)，使均浆更顺畅，缩短均浆时间，避免均浆过程升温过快造成非变性II型胶原蛋白变性。另外，对比例6盐析之后进行5次水洗，除了导致非变性II型胶原蛋白提取率降低外，还会产生大量污水。
实施例2与对比例7相比，酶解后的工艺不同，对比例7采用酶解液过滤后直接冻干，缺少调pH值后离心纯化工序，故制备得到非变性II型胶原蛋白中还含有大分子多糖、胶原蛋白肽等成分，故对比例7蛋白质含量、非变性II型胶原蛋白纯度均较低。从表1数据可以看出，对比例7其蛋白含量只有63.0％，而实施例2其蛋白质含量为86.0％，远高于对比例7。另外，从电泳marker图和圆二色光谱图看，在同等进样浓度下，对比例7电泳条带中分子量为130kDa的α1链颜色更浅，说明非变性Ⅱ型胶原蛋白纯度相对实施例低。圆二色光谱图也同样验证此结论，同等浓度下对比例7在202nm及222nm波长正负吸收峰值均低于实施例2。此外，实施例2仅需对0.61kg沉淀物进行冻干处理，而对比例7需要对约4kg酶解液进行冻干处理，其冻干工艺能耗及工时是实施例2的6.5倍左右。
实施例1至实施例4与对比例1、2相比，只是步骤S4的pH值纯化参数不同，当pH值为3.5(即对比例1)时，非变性Ⅱ型胶原蛋白、多糖、肽与水溶液形成稳定性体系，通过高速离心也不能使非变性Ⅱ型胶原蛋白与水分离，无法制备非变性Ⅱ型胶原蛋白。随着pH增加，H+浓度降低，多糖、肽、非变性Ⅱ型胶原蛋白与水溶液形成的稳定性体系逐渐被破坏，非变性Ⅱ型胶原蛋白与水的结合力降低。当pH升至4.0(即实施例1)时，高速离心能够实现非变性Ⅱ型胶原蛋白与水分离，但离心得到的沉淀物含水量高(94.4％)，同时含有少量多糖等杂质，故制备非变性Ⅱ型胶原蛋白的蛋白质含量为80.9％。当pH值达到5.0(实施例2)、5.5(实施例3)时，多糖、肽、非变性Ⅱ型胶原蛋白与水形成稳定体系最不稳定，溶液黏度降低，非变性Ⅱ型胶原蛋白聚集析出，离心得到沉淀物含水量低(分别为88.6％、91.0％)，制备非变性Ⅱ型胶原蛋白的蛋白质含量高(分别为86.0％、88.5％)。随着pH值增加，金属离子、多糖、非变性Ⅱ型胶原蛋白与水又形成较为稳定体系，在pH达到6.5(即实施例4)时，离心得到沉淀物的含水量高达95.6％，制备得到的非变性Ⅱ型胶原蛋白的蛋白质含量也只有75.4％。当pH值增加到7.0(即对比例2)时，通过离心不能使非变性Ⅱ型胶原蛋白与水分离。实施例1～4以及对比例1-2的离心后图片见图9。通过调节合适pH值，能使非变性Ⅱ型胶原蛋白与其他杂质(多糖、肽、其他类型蛋白质)实现分离纯化目的。
实施例3、实施例10、实施例11与对比例3、对比例4相比，只是步骤S3中酶解过程中pH值不同，实施例10、实施例3、实施例11分别调pH值为1.5、2.0、3.0后，加入胃蛋白酶酶解，经胃蛋白酶处理去除两端的非螺旋端肽后，使非变性Ⅱ型胶原蛋白可溶于酸性酶解液中，故酶解上清液通过调pH值可以制备非变性Ⅱ型胶原蛋白。而对比例3、4，酶解pH值为3.5，在此条件下胃酶蛋白酶活力低，没有去除两端非螺旋端肽，还保持着原来粗大而致密的胶原纤维束，难溶于酶解液中，故离心去除了非变性Ⅱ型胶原蛋白，无法通过酶解上清液制备非变性Ⅱ型胶原蛋白。
实施例6、12、13、14与对比例8、9相比，只是步骤S1杀菌脱杂混合溶液中NaOH、氯化钠浓度不同。从表1可以看出，杀菌脱杂混合溶液中NaOH、氯化钠浓度对非变性Ⅱ型胶原蛋白中蛋白含量及提取率至关重要，当氢氧化钠质量分数在0.2％～0.8％，氯化钠浓度在0.5～2.0mol/L时，蛋白质含量及提取率均较高。实施例6相对比例8只有NaOH的浓度不同，当NaOH浓度为0.1wt％(即对比例8)蛋白质含量显著降低，由原来88.5％降低为67％。这是因为在低浓度NaOH环境下，无法有效除去杂质(例如脂类、碱溶性杂蛋白等)。但增加NaOH浓度虽然能有效去除杂质，但高浓度碱液中非变性Ⅱ型胶原蛋白也在一定程度被提取出来，即便使用更高浓度NaCl也不能避免蛋白质提取率显著降低(如：对比例9的蛋白质提取率只有45.38％)。故杀菌脱杂适宜条件为NaOH的浓度为0.2wt％～0.8wt％，NaCl浓度为0.5mol/L～2.0mol/L；最优NaOH的浓度为0.2wt％～0.6wt％，NaCl浓度为0.5mol/L～1.5mol/L。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (3)
1.一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将软骨碎与由NaOH和NaCl组成的混合溶液混合，进行杀菌脱杂处理，固液分离，得杀菌脱杂后软骨碎；
步骤S1中，所述混合溶液中，所述NaOH的浓度为0.2wt%~0.6wt%；所述NaCl浓度为0.5mol/L~1.5 mol/L；所述杀菌脱杂处理的时间为4 h~12 h；
所述软骨碎与所述混合溶液的质量比为1：3~5；
S2、将所述杀菌脱杂后软骨碎与水混合后进行均浆处理，得均浆液；
S3、将所述均浆液的pH调至1.5~3后，进行酶解处理，固液分离，得酶解清液；
步骤S3中，所述酶解处理的酶包括胃蛋白酶；以所述软骨碎作为参照计，所述胃蛋白酶的用量为0.25wt%~1wt%，酶解时间为12h~24h；
S4、将所述酶解清液的pH调至5.0~5.5后，固液分离，将固相干燥、粉碎，即得非变性II型胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述软骨碎与所述水的质量比为1：2~5。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述软骨碎与所述水的质量比为1：3~4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310112046.1A CN116253791B (zh) | 2023-02-10 | 2023-02-10 | 一种具有改善骨关节健康作用的非变性ii型胶原蛋白的制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310112046.1A CN116253791B (zh) | 2023-02-10 | 2023-02-10 | 一种具有改善骨关节健康作用的非变性ii型胶原蛋白的制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116253791A CN116253791A (zh) | 2023-06-13 |
| CN116253791B true CN116253791B (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=86683784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310112046.1A Active CN116253791B (zh) | 2023-02-10 | 2023-02-10 | 一种具有改善骨关节健康作用的非变性ii型胶原蛋白的制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116253791B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109384842A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-02-26 | 美泰科技（青岛）股份有限公司 | 一种产业化非变性ⅱ胶原蛋白的制备方法 |
| CN111748030A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-10-09 | 华南理工大学 | 一种可溶性非变性ii型胶原蛋白及其制备方法 |
| CN113563458A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-10-29 | 嘉兴恒杰生物制药股份有限公司 | 一种非变性ii型胶原蛋白的制备方法 |
-
2023
- 2023-02-10 CN CN202310112046.1A patent/CN116253791B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109384842A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-02-26 | 美泰科技（青岛）股份有限公司 | 一种产业化非变性ⅱ胶原蛋白的制备方法 |
| CN111748030A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-10-09 | 华南理工大学 | 一种可溶性非变性ii型胶原蛋白及其制备方法 |
| CN113563458A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-10-29 | 嘉兴恒杰生物制药股份有限公司 | 一种非变性ii型胶原蛋白的制备方法 |
| WO2023000370A1 (zh) * | 2021-07-19 | 2023-01-26 | 嘉兴恒杰生物制药股份有限公司 | 非变性ii型胶原蛋白的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 鸡胸软骨Ⅱ型胶原的制备及功能性研究;曹慧;中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑 (月刊)(第5期);第68, 109页 * |
| 鸡胸软骨粉中Ⅱ型胶原的提取及结构分析;陆雪芹;许时婴;曹慧;;食品科学(第04期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116253791A (zh) | 2023-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106967169B (zh) | 一种鱼胶原蛋白的提取方法 | |
| US20070166798A1 (en) | Isolating chondroitin sulfate | |
| CN109349419B (zh) | 一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉 | |
| WO2019119998A1 (zh) | 一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂及其制备方法 | |
| CN112778412B (zh) | 一种低内毒素胶原蛋白的制备方法 | |
| CN106350556A (zh) | 一种医用高纯度鱼皮胶原的制备方法 | |
| CN107267587A (zh) | 一种动物软骨生物提取的联产工艺方法 | |
| CN110590938A (zh) | 一种胶原蛋白肽-锌螯合物的制备方法 | |
| CN112410392A (zh) | 一种i型胶原蛋白的提取方法及其应用 | |
| CN110713534A (zh) | 一种具有光老化改善作用的胶原蛋白肽及其制备方法 | |
| CN101934068B (zh) | 胸腺肽注射液的制备方法 | |
| TW201306846A (zh) | 製備軟骨素硫酸鈉的方法 | |
| CN116253791B (zh) | 一种具有改善骨关节健康作用的非变性ii型胶原蛋白的制备方法与应用 | |
| CN112501229B (zh) | 一种牛骨胶原肽的生产工艺 | |
| JP5043215B1 (ja) | チョウザメ類脊索から簡便な抽出方法で得られるｉｉ型コラーゲン | |
| CN115403668A (zh) | 一种斑点叉尾鮰鱼鳔生物活性胶原蛋白肽的提取工艺 | |
| CN115232203A (zh) | 一种提取胶原蛋白的方法 | |
| CN115120618B (zh) | 具有改善免疫应答作用的软骨提取物、其制备方法及其用途 | |
| JP4351461B2 (ja) | コラーゲンタンパク質からのエンドトキシン除去方法 | |
| JP2009173678A (ja) | コラーゲンタンパク質からのエンドトキシン除去方法 | |
| JP2004083451A (ja) | 皮膚外用剤 | |
| CN109280095A (zh) | 一种硫酸软骨素的提取方法 | |
| KR100974080B1 (ko) | 열처리를 이용한 태반 추출물의 제조 방법 | |
| KR102180261B1 (ko) | 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법 | |
| WO2004046199A2 (fr) | Procede d'obtention d'acide chondroitine sulfurique et ses utilisations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |