TWI605760B - Mucin and collagen extraction method respectively - Google Patents
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Description
本發明係有關於黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，更特別有關於以水母為一種原料，有效地分別萃取出黏蛋白及膠原蛋白之黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法。
先前，專利文獻1揭露「一種水中生物有用物質的萃取方法，包括將水中生物破碎、撕裂成為碎片，使酵素由水中生物中釋放出來的第1步驟；使碎片中的蛋白質與酵素作用而將碎片分解為液狀物質的第2步驟；由液狀物質萃取有用物質的第3步驟」。此專利文獻1記載的水生物包括水母(參照專利文獻1第0027~0038段)。雖然，此專利文獻1中所萃取的有用物質，例如為「鹼性蛋白酶或膠原蛋白等」(參照專利文獻1第0020段)，但並未揭示有用物質為「黏蛋白」。
專利文獻2揭示一種黏蛋白型的醣蛋白，其具有以特定8個胺基酸序列重複3-2000次的重複構造，其中此構造中1個以上的胺基酸殘基與1個以上單醣之醣鏈結合(參照專利文獻2的請求項1)。由專利文獻2可知，此黏蛋白型的醣蛋白可利用含有下列步驟的方法製備，此步驟包括：將水母固體部分切斷的步驟、將切斷之水母以鹽溶液萃取的步驟、將萃取物離心及透析以分離粗黏蛋白的步驟，以及精製黏蛋白型醣
蛋白的步驟。黏蛋白型醣蛋白的具體製造方法為，將水母切斷所獲得的碎片置於水中膨脹，將膨脹的碎片以低濃度食鹽水溶性進行震盪萃取，加入3倍量的乙醇至所獲得的萃取物中以獲得沉澱物，利用離心將沉澱物分離，將沉澱物溶於水中並分離上清液，將上清液經透析處理精製後，冷凍乾燥獲得(參照專利文獻2第0088段)。專利文獻2雖然揭露了黏蛋白型醣蛋白的獲得方法，但完全未揭露膠原蛋白及其製造方法。
專利文獻3揭露「一種水母類膠原蛋白的回收方法，包括將水母冰凍的冰凍步驟，為了活化水母自身的內源性酵素以開始進行水母分解反應，而將冰凍之水母解凍的解凍步驟；為了使水母的膠原蛋白在未變性的狀態下溶解，以生成含未變性膠原蛋白的中性鹽溶液，而攪拌解凍水母的攪拌步驟；由中性鹽溶液回收未變性膠原蛋白的回收步驟。」(參照專利文獻3的請求項)。然而，專利文獻3並未記載黏蛋白的分離回收。
專利文獻4揭露「一種水母類膠原蛋白的回收方法，包括為了活化水母自身的內源性酵素以開始進行水母的分解反應，為了使水母的膠原蛋白在未變性狀態下溶解，以生成含未變性膠原蛋白的中性鹽溶液，將水母儲藏於所設定低溫的低溫儲藏步驟；由中性鹽溶液回收未變性膠原蛋白的回收步驟。」(參照專利文獻4的請求項1)。專利文獻4所揭示的膠原蛋白回收方法是基於「在低溫儲藏水母時，可溶化膠原蛋白的酵素具有活性」的發現(參照專利文獻4第0019段)。低溫儲藏時的低溫較佳為「-2℃至25℃」(參照專利文獻4第0021段)。
【專利文獻1】 日本特開2001-178492號公報
【專利文獻2】 國際公開公報WO2007/020889號公報
【專利文獻3】 日本特開2007-051191號公報
【專利文獻4】 日本特開2008-31106號公報
本發明所要解決的課題為，以水母為一種原料，提供一種由水母有效地分別萃取出黏蛋白及膠原蛋白之黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法。
(1)黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，包括：將水母破碎形成含水破碎物，經固液分離以獲得液體成分，液體成分與碳數1-4的水溶性醇類混合，使碳數1-4之水溶性醇類的濃度至少佔整體的50體積%，混合所獲得的混合物經固液分離獲得固體成分的蛋白質分離步驟(A)；以及由上述蛋白質分離步驟(A)所獲得的固體成分與10-40質量%醇類濃度之碳數1-4的水溶性醇類水溶液混合，接著經固液分離劃分成含黏蛋白的液體成分與含膠原蛋白的固體成分的劃分步驟(B)；(2)如(1)所述之黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，
其中蛋白質分離步驟(A)中利用固液分離獲得之固體成分，利用碳數1-4水溶性醇類及/或水清洗此固體成分獲得之洗淨固體成分作為上述蛋白分離步驟(A)的固體成分，以提供至上述劃分步驟(B)；(3)如(2)所述之黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，其中上述碳數1-4水溶性醇類及/或水對於上述蛋白質分離步驟(A)中固液分離所獲得之固體成分的質量比為1-4倍，並與該固體成分混合。
本發明提供可由水母分別萃取出黏蛋白及膠原蛋白的方法。本發明提供從水母萃取黏蛋白、獲得比先前更高的黏蛋白萃取量，可分離黏蛋白與膠原蛋白的分別萃取方法。
第1圖為本發明分別萃取方法之一實施例的流程示意圖。
本發明中所述之「水母」為刺細胞動物門的水母。此水母包括海月水母、赤水母、御椀水母、越前水母、行灯海月、備前水母、與波布水母等。較佳之水母為確定對人類安全，且已供食用的海月水母、備前水母、越前水母等。
本發明方法中的水母形態並無特別限制，例如，可使用生水母、冷凍水母、乾燥水母、鹽醃水母等。
以本發明之方法所分離之黏蛋白，具有重複下列式(I)(SEQ ID NO：1)胺基酸序列3次以上的重複單元構造。
Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Pro (I)(在式(I)中，Xaa為Val或Ile)
黏蛋白為無特定分子量之高分子化合物。上述單元的重複次數，即使是由同屬水母原料以本發明方法所獲得的黏蛋白，其各分子也不盡相同。由凝膠過濾分析的結果可知，本發明方法之一實施例的具體方法所獲得的黏蛋白分子量，使用胺基酸序列分析結果的平均數來校正凝膠過濾的分析，為10-1400kDa，若與後述醣鏈構造共同分析，則可預測自然界也存在比本發明方法所獲得之分子量(重複次數為3-700次)大3倍的高分子，由於黏蛋白的物性或功能沒有太大變化，因此本發明黏蛋白的重複次數約3-2000次，較佳為3-700次。在本發明中，蘇胺酸(Thr)殘基全部與醣鏈連接，且最典型的醣鏈為-GalNac-Gal，假設例如若分子量為4.5kDa時，上述單元的重複次數為約3次；若分子量為約750kDa時，上述單元的重複次數為約40次。此外，若無特別註明，本發明在由分子量推算重複次數時，使用相同的假設。
上述重複單元可直接結合，或透過間隔子結合。間隔子並無特別限制，在一具體例中可使用半胱氨酸作為間隔子的S-S結合。
本發明方法所獲得的黏蛋白除了重複構造之外，可含有不影響黏蛋白的功能(例如，黏性、抗菌性、保濕性等)的其它胺基酸。此外，重複構造中的重複單元也可位移。亦言之，赤水母之黏蛋白，其重複單元為VEXXAAPV，此為式(I)
重複單元僅1個胺基酸的位移。因此，本發明方法所分離之黏蛋白，其重複單元N端具有1或數個胺基酸的刪除，因此本發明也包含位移重複單元的黏蛋白，此種重複單元位移的黏蛋白中較佳之黏蛋白為欠缺重複單元N端所具有之Val的黏蛋白。
再者，本發明之黏蛋白具有1個以上的上述重複單元構造，特別為1個以上5個以下胺基酸殘基與1個以上，特別為1個以上5個以下單醣所形成的醣鏈結合。與醣鏈結合的胺基酸殘基種類並無特別限制，較佳醣鏈連接至蘇胺酸殘基(Thr)。例如，本發明方法分離之黏蛋白中，98%-100%的醣鏈結合胺基酸殘基為蘇胺酸(Thr)。此外，由上述可知，黏蛋白型醣蛋白的特性為無特定分子量之高分子化合物，與醣鏈結合的胺基酸殘基數目會依各分子而有所不同。然而，預期上述重複單元構造中2個蘇胺酸幾乎全部與醣鏈結合。因此，本發明方法分離之黏蛋白，其結合醣鏈的數目會因上述單元的重複次數而異。
構成醣鏈的單醣可為一般黏蛋白中已知的單醣，例如，N-乙醯半乳糖胺(Acetylgalactosamine)、半乳醣、N-乙醯葡萄糖胺(Acetyl glucosamine)、唾液酸、阿拉伯糖、海藻糖等，較佳為N-乙醯半乳糖胺及/或半乳醣所構成的醣鏈，具體來說，上述重複單元的蘇胺酸(Thr)與N-乙醯半乳糖胺及/或半乳醣結合，形成Thr-GalNAc-Gal的構造，或僅與N-乙醯半乳糖胺結合形成Thr-GalNAc構造。例如，此黏蛋白可以下列式(II)表示。
[化1]
(式(II)中，□為GalNAc，￮為Gal。￮的Gal可有缺損。)
此外，醣鏈通常為1-10個，特別為1-8個，更特別為1-5個單醣以直鏈狀或分枝狀連接。由於黏蛋白具有無特定分子量的特性，因此黏蛋白中所含的醣鏈數、種類、構造、大小等會因黏蛋白而有所不同，且一個黏蛋白中所含的醣鏈也可分別不同。例如，由某一海月水母分離之黏蛋白與其它海月水母分離之黏蛋白相比，胜肽鏈的重複部分完全相同，僅構成醣鏈之糖類的種類及其成分比例彼此不同。此外，此醣鏈不同但胜肽重複部分相同的黏蛋白，被認為已經存在於海月水母或赤水母等自然界中且具有相同功能。此2種水母之黏蛋白的作用並無顯著差異，醣鏈結構並不改變黏蛋白的主要特性，猜測僅扮演稍微改變特異性的角色。因此，即使醣鏈部分不同，只要具有胜肽鏈的重複結構，皆屬於本發明方法分離之黏蛋白。
本發明方法分離之膠原蛋白，其中的甘胺酸佔胺基酸總量的約1/3。因此，本發明方法分離之物質，可藉由對所含甘胺酸的量進行定量，以確定此物質即為膠原蛋白。本發明方法所分離之膠原蛋白與習知的膠原蛋白相同，含有羥脯胺
酸與羥賴胺酸特有的胺基酸。水母萃取的膠原蛋白為α1α2α3之異源三聚體，與哺乳動物的V型膠原蛋白具有類似結構，與其它種類的膠原蛋白相比，醣的含量較多，羥賴胺酸的含量比羥脯胺酸多。
本發明的分別萃取方法包括，
將水母破碎形成含水破碎物，經固液分離所獲得的液體成分與碳數1-4的水溶性醇類混合，使碳數1-4之水溶性醇類的濃度至少佔整體的50體積%，混合所獲得的混合物經固液分離獲得固體成分的蛋白質分離步驟(A)(蛋白質分離步驟(A)以下簡稱步驟(A))，以及
由上述蛋白質分離步驟(A)所獲得的固體成分與10-40質量%醇類濃度之碳數1-4的水溶性醇類水溶液混合，接著經固液分離劃分成含黏蛋白的液體成分與含膠原蛋白的固體成分的劃分步驟(B)(蛋白質分離步驟(B)以下簡稱步驟(B))。
本發明之步驟(A)，首先將水母破碎以形成含水破碎物。被破碎的水母可為由海洋捕獲的水母，或由海洋捕獲後，冷凍保存的冷凍水母。較佳為將冷凍水母解凍後，再進行本發明之方法。
將作為原料的水母以水清洗，將固體與液體分離。將固體與液體分離的方法包括，例如，較佳為離心機、過濾器、濾水器、脫水機。
水母固體物可利用剪刀、均質機、攪拌器、破碎機破碎以獲得含水破碎物。含水破碎物可為破碎形成的粒子集合體、破碎形成之絲狀或條狀的片斷集合體、破碎形成的
5mm-1cm四方體、不特定形狀的片斷集合物等。
步驟(A)為，攪拌上述含水破碎物，接著利用固液分離以獲得液體成分。含水破碎物可靜置，也可攪拌。若為靜置時，靜置的時間通常為1-24小時。靜置或攪拌混合物時的混合物溫度較佳維持於0-25℃。藉由靜置，較佳攪拌此混合物，可使水母的水溶性成分溶解於溶液中。將混合物固液分離的方法可為使用離心裝置、過濾裝置、擠壓裝置等。
步驟(A)中，固液分離的液體成分與碳數1-4的水溶性醇類混合，使碳數1-4水溶性醇類的濃度相對於整體至少為50體積%，較佳為60體積%-80體積%。
碳數1-4的水溶性醇類可為碳數1-4的一價烷基醇，具體來說，可擇自於甲基醇、乙基醇、丙基醇、丁基醇等的烷基醇。在這之中，較佳為乙基醇與丙基醇。由對人體毒性的觀點來看，比起甲醇，乙醇或丙醇更佳。
上述液體成分與水溶性醇類的混合比例為，在液體成分與水溶性醇類混合液中，若水溶性醇類的濃度未滿50體積%，黏蛋白不會變為固體成分，而為液體成分，則無法達成本發明之目的。
以下列實驗內容進一步詳述。
以上述液體成分與水溶性醇類混合液中水溶性醇類濃度為20體積%的條件，混合上述液體成分與水溶性醇類所生成的沉澱物，其主成分為膠原蛋白，但此沉澱物不完全是原液體成分中的膠原蛋白，而含有固液分離後液體成分(稱為第1液體成分)中殘留的膠原蛋白與黏蛋白。因此，例如，以水溶性醇
類濃度為20體積%的條件混合液體成分與水溶性醇類，僅是以固液分離程序，並無法有效地分離膠原蛋白與黏蛋白。
以水溶性醇類濃度為30體積%的條件混合上述第1液體成分與水溶性醇類所生成的沉澱物，與上述液體成分相同，主成分為膠原蛋白，但此沉澱物不完全是第1液體成分中所含的膠原蛋白，而含有固液分離後液體成分(稱為第2液體成分)中殘留的膠原蛋白與黏蛋白。因此，例如，以水溶性醇類濃度為30體積%的條件混合第1液體成分與水溶性醇類，僅是以固液分離程序，並無法有效地分離膠原蛋白與黏蛋白。
以水溶性醇類濃度為40體積%的條件混合上述第2液體成分與水溶性醇類所生成的沉澱物含有數種胜肽，因此第2液體成分幾乎不含有膠原蛋白。固液分離後的液體成分(稱為第3液體成分)中含有黏蛋白。因此，例如，以水溶性醇類濃度為40體積%的條件混合第2液體成分與水溶性醇類，僅是以固體液分離程序無法獲得膠原蛋白與黏蛋白的沉澱物，且無法有效地分離。
以水溶性醇類濃度為50體積%的條件混合上述第3液體成分與水溶性醇類所生成的沉澱物含有黏蛋白。因此，由此可知第3液體成分幾乎不含有膠原蛋白。
此實驗可知，水母之含水破碎物以固液分離所獲得的液體成分與水溶性醇類，以液體成分與水溶性醇類混合物全體中水溶液醇類濃度至少50體積%的條件進行混合，產生膠原蛋白與黏蛋白沉澱，藉由收集所獲得的固體成分，可有效地分離膠原蛋白與黏蛋白。
此實驗中的水溶液醇類可使用，例如，本發明人最初所發現的乙醇及丙醇。在乙醇與丙醇中所觀察到的現象，和與乙醇及丙醇同族且近似的碳數1-4低級醇類中所觀察到的現象相同。
本發明係以此實驗為基礎。
此外，水母之含水破碎物以固液分離所獲得的液體成分與水溶性醇類混合，使上述液體成分與上述水溶性醇類混合物全體中水溶液醇類濃度未滿50體積%，分離混合所生成的沉澱物與濾液，由於沉澱物含有膠原蛋白，濾液含有黏蛋白，若濾液中水溶性醇類的濃度為50體積%以上，可能會使黏蛋白沉澱，因此，為了萃取上述濾液中所含的膠原蛋白，必須反覆以水溶性醇類進行萃取，且沉澱物中含有膠原蛋白與胜肽，必須進行去除沉澱物中胜肽的步驟，故膠原蛋白的取得效率不佳。
液體成分與上述水溶性醇類的混合通常在0-25℃的範圍內進行。在上述溫度範圍內的溫度下進行混合，較佳不會影響黏蛋白與膠原蛋白。混合時間通常為1-48小時，較佳為12-24小時。
步驟(A)中，在上述混合後，將混合物固液分離，獲得固體成分。固液分離的方法為可使用離心裝置、過濾裝置、擠壓裝置等。
可將固液分離所生成的固體成分提供給步驟(B)，但也可為了去除固體成分所含的鹽類或脂質等雜質、以及為了使固體成分中的醇類呈一定濃度，進行清洗處理。此清洗處理步驟稱為清洗步驟(A1)。
清洗步驟(A1)為對上述蛋白質分離步驟(A)中經固液分離所獲得固體成分，在考量成本下，與固體成分質量1-4倍之碳數1-4的水溶性醇類水溶性混合。
上述水溶性醇類為碳數1-4之一價烷基醇，具體來說，可擇自於甲基醇、乙基醇、丙基醇、丁基醇等烷基醇。在這之中，較佳為乙基醇與丙基醇。
固體成分與上述水溶性醇類的混合物可靜置，也可攪拌以達到清洗的效果。此外，持續靜置混合物的時間或攪拌時間即為清洗時間，通常為1小時以內，靜置或攪拌時的溫度通常為0-25℃。清洗時的溫度通常為0-25℃。在上述溫度範圍內進行清洗，較佳不會影響黏蛋白與膠原蛋白。
在靜置混合物、或攪拌混合後，進行固液分離。固液分離的方法為可使用離心裝置、過濾裝置、擠壓裝置等。
清洗步驟(A1)中，可進行1次，或數次固體成分與特定濃度水溶性醇類的混合、以及後續的固液分離程序。反覆清洗的次數大致上在固體質量變化為5%以下時，停止清洗程序，進行下個步驟。
清洗步驟(A1)中所獲得的固體成分，其具有比清洗處理前固體成分較低的鹽含量，因此，為了區別清洗步驟(A1)所獲得之固體成分與未經清洗處理之固體成分，故稱為「洗淨固體成分」。
本發明中，將上述步驟(A1)所獲得之洗淨固體成分或未經上述步驟(A1)的固體成分，提供給步驟(B)。
步驟(B)中，將上述蛋白質分離步驟(A)所獲
得的固體成分(洗淨固體成分，或未經清洗步驟(A1)的固體成分)與10-40質量%醇類濃度的碳數1-4水溶性醇類水溶液混合，接著經固液分離程序，以分離含黏蛋白的液體成分與含膠原蛋白的固體成分。
上述水溶性醇類可擇自於甲基醇、乙基醇、丙基醇、丁基醇等一價烷基醇。在這之中，較佳為乙基醇與丙基醇。
在本發明中，與固體成分混合之上述水溶性醇類的醇類濃度為10質量%-40質量%，利用後續的固液分離程序以生成含膠原蛋白的固體成分、含黏蛋白的液體成分。此外，若將醇類濃度超過40質量%之水溶性醇類水溶液與固體成分混合，混合所生成之固體成分中，膠原蛋白以外胜肽的含量極低，含有高純度的膠原蛋白。
在步驟(B)中，由步驟(A)所獲得的固體成分與水溶性醇類混合，溫度為0-25℃，攪拌約1小時。在此溫度範圍進行混合，不會對黏蛋白與膠原蛋白造成影響。
混合結束後，進行固液分離程序，以獲得含有黏蛋白的液體成分與含有膠原蛋白的固體成分。
含黏蛋白的液體成分可利用習知的精製程序，例如，離子交換層析，以及乾燥程序，例如，冷凍乾燥來分離黏蛋白。含黏蛋白的液體成分中所含有的黏蛋白或分離的黏蛋白，可利用胺基酸分析來確定含有與式(I)(SEQ ID NO：1)相同的胺基酸。
含膠原蛋白的固體成分可利用習知的精製程序，例如離子交換層析，以及乾燥程序，例如，冷凍乾燥來分離膠
原蛋白。膠原蛋白可利用胺基酸分析、甘胺酸(Gly)定量來確定。
以下，利用作為例子、非限定的實施例進行說明，以深入了解本發明。
【實施例1】利用下列方法由海月水母(Aurelia aurita)獲得黏蛋白與膠原蛋白。
1)以水清洗冷藏的水母，以過濾器分離固體物及液體物。
2)將分離的固體物，以破碎機粉碎。將粉碎的細小片斷作為樣本。
3)將由2)所獲得的樣本與水置於萃取攪拌槽中，於4℃進行攪拌萃取。
4)由3)攪拌萃取所獲得的水溶液於4℃，以10000G離心10分鐘，獲得液體成分。
5)加入異丙醇至4)所獲得的液體成分，使異丙醇的濃度為70體積%，生成凝膠狀的沉澱物。
6)將5)所獲得之含凝膠狀沉澱物的溶液維持在4℃下，攪拌一個晚上後，於4℃下，以10000G離心10分鐘，獲得固體成分。
7)加入為6)所獲得固體成分3倍質量之60%質量濃度的異丙醇水溶液。
8)將7)生成的混合於4℃下攪拌5分鐘後，於4℃下，以10000G離心10分鐘，獲得固體成分。
9)分別對8)所獲得的固體成分，再次進行7)與8)清洗程序。
以上，蛋白質分離步驟(A)結束。
10)加入9)所獲得之固體成分3倍質量之25質量%濃度的異丙醇溶液。
11)10)所獲得之溶液於4℃攪拌5分鐘後，於4℃下，以10000G離心10分鐘，獲得固體成分。
12)分別對11)所獲得之固體成分，再進行2次10)與11)程序，以分離固體成分與液體成分。
13)分別對12)所獲得之液體成分進行透析處理與冷凍乾燥，以獲得最終的固體成分(L)。此外，將12)所獲得之固體成分懸浮於水中後，進行透析處理與冷凍乾燥，以獲得最後的固體成分(S)。
對本發明之固體成分(L)與固體成分(S)，以自動胺基酸分析儀進行分析，得知胺基酸組成，其結果為固體成分(L)是黏蛋白，固體成分(S)是膠原蛋白。
分別將固體成分(L)與固體成分(S)以上述離子交換層析精製，將透析的樣本(約12μg)移至水解管中，以離心蒸發器乾燥固化，放入具有恆定沸點鹽酸(5.7N)的外管中，減壓封閉。加水分解，於110℃下進行20小時的氣相法。
將封閉的外管打開，同樣地，乾燥水解管中的內容物，將乾燥的水解物溶於100μl的0.02N鹽酸中。使用日立公司(股)製的高速胺基酸分析儀L-8500A進行水解物的胺基
酸的分析。在日立公司(股)特定的胺基酸分析方法中，使用離子交換管柱以5種緩衝液分離水解物中的胺基酸。利用管柱後法(post-column)，將分離的胺基酸與茚三酮反應，以2種波長的可見光進行檢測。胺基酸醣類與胺基酸以570nm進行層析，脯胺酸以440nm進行層析，並利用2nM的標準胺基酸混合物與葡萄糖胺、半乳糖胺進行定量。
胺基酸組成的分析結果如表1所示。由表1的胺基酸濃度比，獲得黏蛋白胜肽組成為：蘇胺酸(Thr)：谷胺酸(Glu)：脯胺酸(Pro)：丙胺酸(Ala)：纈胺酸(Val)+異亮胺酸(Ile)：N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)為2：1：1：2：2：2，各誤差為15%，確認為高純度的黏蛋白。
此外，獲得之膠原蛋白的胜肽部組成中，甘胺酸(Gly)的濃度佔全部胺基酸的約1/3，確認為高純度的膠原蛋白。
表2顯示黏蛋白與膠原蛋白的收率。
利用下列方法由海月水母(Aurelia aurita)獲得黏蛋白與膠原蛋白
1)以水清洗冷藏的水母，以過濾器分離固體物及液體物。
2)將分離的固體物，以破碎機粉碎。將粉碎的細小片斷作為樣本。
3)將由2)所獲得的樣本與水置於萃取攪拌槽中，於4℃進行
攪拌萃取。
4)由3)攪拌萃取所獲得的水溶液於4℃，以10000G離心10分鐘，獲得液體成分。
5)加入乙醇至4)所獲得的液體成分，使乙醇的濃度為70體積%，生成凝膠狀的沉澱物。
6)將5)所獲得之含凝膠狀沉澱物的溶液維持在4℃下，攪拌一個晚上後，於4℃下，以10000G離心10分鐘，獲得固體成分。
7)加入為6)所獲得固體成分3倍質量之60%質量濃度的乙醇水溶液。
8)將7)生成的混合物於4℃下攪拌5分鐘後，於4℃下，以10000G離心10分鐘，獲得固體成分。
9)分別對8)所獲得的固體成分，再次進行7)與8)清洗程序。
以上，蛋白質分離步驟(A)結束。
10)加入9)所獲得之固體成分3倍質量之25質量%濃度的乙醇溶液。
11)10)所獲得之溶液於4℃攪拌5分鐘後，於4℃下，以10000G離心10分鐘，以獲得固體成分。
12)分別對11)所獲得之固體成分，再進行2次10)與11)程序，以分離固體成分與液體成分。
13)分別對12)所獲得之液體成分進行透析處理與冷凍乾燥，以獲得最終的固體成分(L)。此外，將12)所獲得之固體成
分懸浮於水中後，進行透析處理與冷凍乾燥，以獲得最後的固體成分(S)。
表2顯示黏蛋白與膠原蛋白的收率。
以與實施例2之1)-4)相同的程序所獲得的液體成分，加入乙醇，使乙醇濃度為50體積%，生成凝膠狀的沉澱物。使用含此凝膠狀沉澱物之液體，進行與實施例1之6)-13)相同的程序，以獲得最後的固體成分(L)與固體成分(S)。
表2顯示黏蛋白與膠原蛋白的收率。
以與實施例2之1)-4)相同的程序所獲得的液體成分，加入乙醇，使乙醇濃度為60體積%，生成凝膠狀的沉澱物。使用含此凝膠狀沉澱物之液體，進行與實施例1之6)-13)相同的程序，以獲得最後的固體成分(L)與固體成分(S)。
表2顯示黏蛋白與膠原蛋白的收率。
實施例2之10)程序的固體成分，除了加入異丙醇混合，使異丙醇濃度為60體積%以外，使用與實施例2相同的程序，以獲得最後的固體成分(L)與固體成分(S)。
表2顯示黏蛋白與膠原蛋白的收率。
由實施例1-3與比較例1及2的結果可知，本發明可有效地分別萃取黏蛋白與膠原蛋白。
實施例2之10)程序的固體成分，除了加入固體成分3倍質量的水之外，使用與實施例2相同的程序，分別將最後程序12)之液體成分進行透析處理與冷凍乾燥，以獲得最後固體成分(Lc)。此外，將程序12)所獲得之固體成分懸浮於水中後，進行透析處理與冷凍乾燥，獲得最後固體成分(Sc)。表3顯示黏蛋白與膠原蛋白的收率。
與實施例1相同，分別將最後固體成分(Lc)與(Sc)以自動胺基酸分析儀分析胺基酸的組成。
胺基酸組成的分析結果如表4所示。由表4的胺基酸濃度比可知，固體成分(Lc)黏蛋白的胜肽組成偏離理論值蘇胺酸(Thr)：谷胺酸(Glu)：脯胺酸(Pro)：丙胺酸(Ala)：纈胺酸(Val)+異亮胺酸(Ile)：N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)=2：1：1：2：2：2，此外，證明膠原蛋白的(Gly)濃度比例高，黏蛋白的濃度低。
加入乙醇至實施例1之程序4)所獲得的液體成分，使乙醇濃度達20體積%，將添加混合所生成的沉澱物經固液分離，以收集沉澱物與液體成分(稱為第1液體成分)。將此沉澱物利用與實施例1相同的方法，以自動胺基酸分析，表5顯示主成分之收量。
加入乙醇至第1液體成分中，使乙醇的濃度達30體積%，將添加混合所生成的沉澱物經固液分離，以收集沉澱物與液體成分(稱為第2液體成分)。將此沉澱物利用與實施例1相同的方法，以自動胺基酸分析，表5顯示主成分之收量。
加入乙醇至第2液體成分中，使乙醇的濃度達40體積%，將
添加混合所生成的沉澱物經固液分離，以收集沉澱物與液體成分(稱為第3液體成分)。將此沉澱物利用與實施例1相同的方法，以自動胺基酸分析，表5顯示主成分之收量。
加入乙醇至第3液體成分中，使乙醇的濃度達50體積%，將添加混合所生成的沉澱物經固液分離，以收集沉澱物與液體成分(稱為第4液體成分)。將此沉澱物利用與實施例1相同的方法，以自動胺基酸分析，表5顯示主成分之收量。
加入乙醇至第4液體成分中，使乙醇的濃度達60體積%，將添加混合所生成的沉澱物經固液分離，以收集沉澱物與液體成分(稱為第5液體成分)。將此沉澱物利用與實施例1相同的方法，以自動胺基酸分析，表5顯示主成分之收量。
加入乙醇至第5液體成分中，使乙醇的濃度達70體積%，將添加混合所生成的沉澱物經固液分離，以收集沉澱物與液體成分(稱為第5液體成分)。將此沉澱物利用與實施例1相同的方法，以自動胺基酸分析，表5顯示主成分之收量。
此外，以丙醇取代乙醇，進行與上述相同的試驗，獲得與表5相同傾向的結果。
本發明提供一種可由水母有效地分別萃取黏蛋白與膠原蛋白的分別萃取方法。以本發明方法所獲得的黏蛋白與膠原蛋白可應用於醫藥品、化妝品、食品、農業等領域。此外，黏蛋白與膠原蛋白可作為藥物的原料及製品。
Claims (5)
- 一種黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，其特徵在於包括：將水母破碎形成含水破碎物，經固液分離獲得液體成分，將液體成分與碳數1-4水溶性醇類混合，使碳數1-4之水溶性醇類的濃度至少佔整體的50體積%，混合所獲得的混合物經固液分離獲得固體成分之蛋白質分離步驟(A)；以及由上述蛋白質分離步驟(A)所獲得的固體成分與10-40質量%醇類濃度之碳數1-4水溶性醇類水溶液混合，接著經固液分離固液劃分成含黏蛋白的液體成分與含膠原蛋白的固體成分的劃分步驟(B)。
- 如申請專利範圍第1項所述之黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，其中該蛋白質分離步驟(A)利用固液分離獲得之固體成分，利用碳數1-4水溶性醇類或水清洗該固體成分獲得之洗淨固體成分作為上述蛋白分離步驟(A)的固體成分，提供至該劃分步驟(B)。
- 如申請專利範圍第1項所述之黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，其中該蛋白質分離步驟(A)利用固液分離獲得之固體成分，利用碳數1-4水溶性醇類及水清洗該固體成分獲得之洗淨固體成分作為上述蛋白分離步驟(A)的固體成分，提供至該劃分步驟(B)。
- 如申請專利範圍第2或3項所述之黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，其中該碳數1-4水溶性醇類或水對於該蛋白質分離步驟(A)中固液分離所獲得之固體成分的質量比為 1-4倍，並與該固體成分混合。
- 如申請專利範圍第2或3項所述之黏蛋白及膠原蛋白的分別萃取方法，其中該碳數1-4水溶性醇類及水對於該蛋白質分離步驟(A)中固液分離所獲得之固體成分的質量比為1-4倍，並與該固體成分混合。
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