CN104379593A - 粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法 - Google Patents

粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题是提供从一种原料即水母中分别分级提取粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，该粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法的特征在于，具有蛋白质分离工序(A)和分级工序(B)，所述蛋白质分离工序(A)：通过将下述混合物进行固液分离而得到固体成分，该混合物是将粉碎水母而成的含水粉碎物进行固液分离而得的液体成分与碳原子数为1～4的水溶性醇以碳原子数为1～4的水溶性醇的浓度相对于整体至少成为50容量％的方式混合而得到的，所述分级工序(B)：通过将上述蛋白质分离工序(A)中得到的固体成分与醇浓度为10～40质量％的碳原子数为1～4的水溶性醇水溶液混合，接着进行固液分离，从而固液分级成含粘蛋白的液体成分和含胶原蛋白的固体成分。

Description

粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法
技术领域
本发明涉及粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，更详细而言，涉及能够从一种原料即水母中分别有效地分级提取粘蛋白和胶原蛋白的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法。
背景技术
以往，专利文献1中公开了“一种水生物的有用物质的提取方法，其特征在于，具备将水生物粉碎·切碎成碎片并使酶从上述水生物中游离的第1工序，使上述酶作用于该碎片中的蛋白质而将上述碎片分解成液体物质的第2工序，以及从上述液体物质中提取有用物质的第3工序。”。该专利文献1中记载的水生物包括水母(参照专利文献1的[0027]～[0038]段)。另外，例示了该专利文献1中提取的有用物质为“碱性蛋白酶、胶原蛋白等”(参照专利文献1的[0020]段)，但作为有用物质没有例示“粘蛋白”。
专利文献2中，公开了一种粘蛋白型糖蛋白，其特征在于，具有包含3～2000次由特定的8个氨基酸序列构成的重复单元的重复结构，在该结构中的1个以上的氨基酸残基上键合有由1个以上的单糖构成的糖链(参照专利文献2的权利要求1)。根据该专利文献2，该粘蛋白型糖蛋白可以利用如下的方法制造，所述方法包括将水母的固体部分切断的工序、用盐溶液提取所切断的水母的工序、通过离心分离和透析从提取物中分离粗粘蛋白的工序、以及将粘蛋白型糖蛋白进行精制的工序。粘蛋白型糖蛋白的具体制造方法可以通过如下方式得到，即，用水使切断水母而得的碎片溶胀，对溶胀的碎片用浓度低的食盐水溶液进行振荡提取，向得到的提取液投入3倍量的乙醇而得到凝胶状的沉淀物，将含有沉淀物的物质进行离心分离而分离出沉淀物，分离将沉淀物溶解于水而生成的上清液，将该上清液通过透析处理进行精制，再冷冻干燥(参照专利文献2的[0088]段)。该专利文献2中，公开了得到粘蛋白型糖蛋白的方法，但完全未发现公开胶原蛋白及其制造方法。
专利文献3中，公开了“一种从水母类中回收胶原蛋白的方法，其特征在于，具有将水母类冷冻的冷冻工序，为了将水母类自身具有的内源性酶活化而引发水母类的分解反应，将上述冷冻的水母类解冻的解冻工序，为了使水母类具有的胶原蛋白以未变性的状态溶化而生成含有上述未变性的胶原蛋白的中性盐溶液，将上述解冻的水母类搅拌的搅拌工序，从上述中性盐溶液中回收上述未变性的胶原蛋白的回收工序。”(参照专利文献3的权利要求)。但专利文献3中没有关于粘蛋白的分离回收的记载。
专利文献4中，公开了“一种从水母类中回收胶原蛋白的方法，其特征在于，为了使水母类自身具有的内源性酶活化而引发水母类的分解反应，并使水母类具有的胶原蛋白以未变性的状态溶化而生成含有上述未变性的胶原蛋白的中性盐溶液，具有将水母类在规定的低温下储藏的低温储藏工序和从上述中性盐溶液中回收上述未变性的胶原蛋白的回收工序”(参照专利文献4的权利要求1)。专利文献4中公开的胶原蛋白回收方法基于“水母在低温储藏时溶化胶原蛋白的酶发挥作用”这一发现(参照专利文献4的[0019]段)。公开了低温储藏时的低温“优选为-2℃～25℃的温度范围”(参照专利文献4的[0021]段)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2001－178492号公报
专利文献2:国际公开公报WO2007/020889号公报
专利文献3:日本特开2007－051191号公报
专利文献4:日本特开2008－31106号公报
发明内容
本发明要解决的课题在于提供从一种原料即水母中分级提取粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法。
用于解决上述课题的方式如下：
(1)一种粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其特征在于，具有蛋白质分离工序(A)和分级工序(B)，
上述蛋白质分离工序(A)：将下述混合物进行固液分离而得到固体成分，上述混合物是将粉碎水母而成的含水粉碎物进行固液分离而得的液体成分与碳原子数为1～4的水溶性醇以碳原子数为1～4的水溶性醇的浓度相对于整体至少成为50容量％的方式混合而得到的，
上述分级工序(B)：通过将上述蛋白质分离工序(A)中得到的固体成分与醇浓度为10～40质量％的碳原子数为1～4的水溶性醇水溶液混合，接着进行固液分离，从而固液分级成含粘蛋白的液体成分和含胶原蛋白的固体成分，
(2)根据上述(1)所述的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其特征在于，将用碳原子数为1～4的水溶性醇和/或水清洗上述蛋白质分离工序(A)中的通过固液分离而得的固体成分而成的清洗固体成分作为上述蛋白质分离工序(A)中得到的固体成分，供于上述分级工序(B)，
(3)根据上述(2)所述的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，上述碳原子数为1～4的水溶性醇和/或水以相对于上述蛋白质分离工序(A)中的通过固液分离而得的固体成分的质量为1～4倍质量的比例与上述固体成分混合。
根据本发明，能够提供能够从水母中分别分级提取粘蛋白和胶原蛋白的方法。根据本发明，能够提供能够以比以往更多的粘蛋白提取量从水母中分离出粘蛋白的分级提取粘蛋白和胶原蛋白的方法。
附图说明
图1是表示本发明的分级提取方法的一个例子的工序流程图。
具体实施方式
本发明中的“水母”是属于刺胞动物门的水母。作为这样的水母，可举出海月水母、红色水母、水螅水母、越前水母、灯水母、海蜇、波布水母等。优选的水母是确认了对人体安全的水母，是已经供于食用的海月水母、海蜇、越前水母等。
提供给本发明的方法中的水母的形态没有特别限制，例如可以使用生的水母、冷冻水母、干燥水母、盐渍水母等。
用本发明的方法分离出的粘蛋白具有重复单元结构，该重复单元结构包含3次以上的由下述式(I)(序列编号1)表示的氨基酸序列构成的重复单元。
Val－Xaa－Glu－Thr－Thr－Ala－Pro   (I)
(式(I)中，Xaa为Val或者Ile。)
粘蛋白是分子量不定的高分子化合物。对于上述单元的重复次数，即使是利用以属于同种的水母为原料的本发明的方法得到的粘蛋白，也根据各个分子而不同。凝胶过滤分析的结果是利用作为本发明方法的一个例子的具体方法得到的粘蛋白的分子量使用氨基酸序列解析中得到的数平均修正凝胶过滤的解析时为10～1400kDa，因此若与后述的糖链的结构一起研究，则预测利用本发明的方法得到的分子量(重复次数为3～700次左右)的3倍左右的大小的高分子也存在于自然界，由于不认为该粘蛋白的物性、功能大幅变化，所以本发明中的粘蛋白的重复次数为约3～2000次左右，优选为3～700次。在此，假设在全部苏氨酸(Thr)残基上键合糖链，且糖链部分为最典型的－GalNac－Gal，则例如分子量为约4.5kDa时，上述单元的重复次数为约3次，分子量为约750kDa时，上述单元的重复次数为约40次。应予说明，本说明书中由分子量计算重复次数时，只要没有特殊说明就采用相同的假定。
上述重复单元可以直接键合，另外，也可以介由连接键键合。上述连接键没有特别限制，作为上述连接键的具体例，可举出利用了半胱氨酸的S－S键。
利用本发明的方法得到的粘蛋白除包含上述重复结构之外，还可以包含对其作为粘蛋白的功能(例如，粘性、抗菌性、保湿性等)没有影响的程度的其它氨基酸。并且，重复结构中的重复单元有时发生转变。即，来自红色水母的粘蛋白的重复单元为VEXXAAPV，这是由式(I)表示的重复单元仅1个氨基酸发生转变而成的。因此，利用本发明的方法分离出的粘蛋白还包含因缺失存在于重复结构N末端的1个或者数个氨基酸而其结果是重复单元发生转变的粘蛋白，这样重复单元发生转变的粘蛋白中优选的粘蛋白是缺失存在于重复结构N末端的Val的粘蛋白。
另外，本发明中的粘蛋白有时是在上述重复结构的1个以上、尤其是1～5个的氨基酸残基上键合由1个以上、尤其是1～5个的单糖构成的糖链。糖链键合的氨基酸残基的种类没有特别限定，但优选在苏氨酸残基(Thr)上键合糖链。例如，对于利用本发明的方法分离出的粘蛋白而言，有时糖链键合的氨基酸残基整体的98％～100％为苏氨酸(Thr)。另外，如上所述，由于粘蛋白型糖蛋白的性质是分子量不定的高分子化合物，所以糖链键合的氨基酸残基的数目根据各个分子而不同。然而，预测在上述重复结构中的2个苏氨酸残基几乎全部键合了糖链。因此，利用本发明的方法分离出的粘蛋白中的键合糖链的数目根据上述单元的重复次数而不同。
构成糖链的单糖是在一般的粘蛋白中发现的单糖，例如，可例示N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸、阿拉伯糖、岩藻糖等，大多数情况下是由N-乙酰半乳糖胺和/或半乳糖构成的糖链，具体而言，在上述重复单元中的苏氨酸残基(Thr)上键合N-乙酰半乳糖胺和半乳糖而形成Thr-GalNAc-Gal的结构，或者，仅键合N-乙酰半乳糖胺而形成Thr-GalNAc的结构。例如，这样的粘蛋白可以由下述式(II)表示。
(式(II)中，□为GalNAc，○为Gal。由○表示Gal可以缺失。
另外糖链通常由1～10个、尤其是1～8个、进一步为1～5个的单糖以直链状或者支链状连接。由于粘蛋白具有分子量不定这样的特质，所以粘蛋白所含的糖链的数目、种类、结构、大小等根据各个粘蛋白而不同，另外，一个粘蛋白所含的糖链也各自不同。例如，若比较从某海月水母分离出的粘蛋白与从其它海月水母分离出的粘蛋白，则肽链的重复部分完全相同，但仅构成糖链的糖的种类及其成分比相互不同。应予说明，认为这样糖链不同但肽链的重复部分相同的粘蛋白在包含海月水母或者红色水母在内的自然界中以发挥相同功能的形态存在。认为这2种水母中的粘蛋白的作用没有大的差异，因此推测糖链结构不改变粘蛋白的主要性质，而是发挥微调节特异性的作用。因此，糖链部分不同但具有肽链的重复结构的粘蛋白包含在利用本发明的方法分离出的粘蛋白的范围内。
利用本发明的方法分离出的胶原蛋白具有甘氨酸占总氨基酸量的约1/3的氨基酸组成。因此，通过对利用本发明的方法分离得到的物质中所含的甘氨酸的量进行定量，能够将该物质作为胶原蛋白进行定量。利用本发明的方法分离的胶原蛋白与以往公知的胶原蛋白同样具有羟脯氨酸和羟赖氨酸作为特有的氨基酸。从水母提取的胶原蛋白具有与由α1α2α3异三聚体形成的哺乳动物的V型胶原蛋白类似的结构，其特长之一是与其他种类的胶原蛋白比较，糖含量多，与羟脯氨酸比较羟赖氨酸量多。
本发明的分级提取方法中，具有如下工序：
蛋白质分离工序(A)(以下，有时将该蛋白质分离工序(A)简称为工序(A))，将下述混合物进行固液分离而得到固体成分，上述混合物是将粉碎水母而成的含水粉碎物进行固液分离而得的液体成分与碳原子数为1～4的水溶性醇以碳原子数为1～4的水溶性醇的浓度相对于整体至少成为50容量％的方式混合而得到的，
分离工序(B)(以下，有时将该蛋白质分离工序(B)简称为工序(B))，通过将上述蛋白质分离工序(A)中得到的固体成分与醇浓度为10～40质量％的碳原子数为1～4的水溶性醇水溶液混合，接着进行固液分离，从而固液分离成含粘蛋白的液体成分和含胶原蛋白的固体成分。
本发明的工序(A)中，首先通过将水母粉碎而得到含水粉碎物。粉碎的水母可以是在海洋采集的水母，另外也可以是在海洋采集后冷冻保存的冷冻水母。冷冻水母优选解冻后供于本发明的方法。
无论如何作为原料的水母优选水洗，分离成固体物和液体。作为分离成固体物和液体的装置，例如可举出离心分离机、网式过滤器、滤水器、脱水机作为优选例。
水母的固体物利用粉碎装置例如剪刀、均质机、搅拌机、粉碎机被粉碎而成含水粉碎物。含水粉碎物可以是粉碎形成的粒子的集合体、粉碎形成的丝状或者长方形的碎片的集合体、粉碎形成的5mm～1cm四方左右且形状不特定的碎片的集合体等中的任一种。
工序(A)中，获得将上述含水粉碎物搅拌接着进行固液分离而得的液体成分。含水粉碎物可以静置，但优选进行搅拌。静置时静置时间通常为1～24小时。优选将该混合物静置或者搅拌时的混合物的温度维持在0～25℃。通过将该混合物静置，优选进行搅拌而使水母中的水溶性成分溶解于溶液中。作为将该混合物进行固液分离的方式，可举出离心分离装置、过滤装置、压榨装置等。
工序(A)中，将固液分离而得的液体成分与碳原子数为1～4的水溶性醇以碳原子数为1～4的水溶性醇的浓度相对于整体至少成为50容量％、优选成为60容量％～80容量％的方式进行混合。
作为碳原子数为1～4的水溶性醇，可举出碳原子数为1～4的一元烷基醇，具体而言可举出甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等烷基醇。其中，优选乙醇和丙醇。从对人体的毒性这样的观点考虑，与甲醇相比更优选乙醇或丙醇。
对于上述液体成分与水溶性醇的混合比例，如果液体成分和水溶性醇的混合液中的水溶性醇的浓度低于50容量％，则粘蛋白不移到固体成分中而是留在液体成分中，无法实现本发明的课题。
若更详细叙述，则能够提示如下的实验事实。
通过以上述液体成分和水溶性醇的混合液中的水溶性醇的浓度成为20容量％的方式混合上述液体成分和水溶性醇而生成的沉淀物以胶原蛋白为主成分，然而其沉淀物并非是原来的液体成分中的胶原蛋白的全部，固液分离后的液体成分(有时称为第1液体成分)中含有残留的胶原蛋白和粘蛋白。因此，以例如水溶性醇的浓度成为20容量％的方式混合液体成分和水溶性醇后进行固液分离时，无法高效地分离胶原蛋白和粘蛋白。
通过以水溶性醇的浓度成为30容量％的方式混合上述第1液体成分和水溶性醇而生成的沉淀物与上述液体成分同样地以胶原蛋白为主成分，然而其沉淀物并非是第1液体成分中所含的胶原蛋白的全部，固液分离后的液体成分(有时称为第2液体成分)中含有残留的胶原蛋白和粘蛋白。因此，例如以水溶性醇的浓度成为30容量％的方式混合第1液体成分和水溶性醇后进行固液分离时，无法高效地分离胶原蛋白和粘蛋白。
通过以水溶性醇的浓度成为40容量％的方式混合上述第2液体成分和水溶性醇而生成的沉淀物中含有多种肽，因此，可知该第2液体成分中几乎不含胶原蛋白。固液分离后的液体成分(有时称为第3液体成分)中含有粘蛋白。因此，例如以水溶性醇的浓度成为40容量％的方式混合第2液体成分和水溶性醇后进行固液分离时，无法得到胶原蛋白和粘蛋白作为沉淀物，无法高效分离它们。
通过以水溶性醇的浓度成为50容量％的方式混合上述第3液体成分和水溶性醇而生成的沉淀物中含有粘蛋白。因此，可知该第3液体成分中几乎不含胶原蛋白。
由这些实验事实可知，如果将由水母的含水粉碎物通过固液分离而得到的液体成分和水溶性醇以水溶性醇相对于上述液体成分和上述水溶性醇的混合物整体的浓度至少成为50容量％的方式进行混合，则胶原蛋白和粘蛋白沉淀，通过收集所得到的固体成分，能够高效地分离胶原蛋白和粘蛋白。
这样的实验事实是通过使用水溶性醇例如乙醇和丙醇由本申请发明人首次发现的。对于在乙醇和丙醇中观察到的现象，在与乙醇和丙醇同族且近缘的醇即碳原子数为1～4的低级醇中也观察到相同的现象。
本发明基于这样的实验事实。
应予说明，若分离成将由水母的含水粉碎物通过固液分离而得到的液体成分和水溶性醇以水溶性醇相对于上述液体成分和上述水溶性醇的混合物整体的浓度低于50容量％的方式混合而生成的沉淀物和滤液，则沉淀物中含有胶原蛋白，滤液中含有粘蛋白，所以也考虑过通过向滤液以水溶性醇的浓度成为50容量％以上的方式添加水溶性醇而使粘蛋白沉淀，但该想法中，为了提取上述滤液中所含的胶原蛋白必须重复用水溶性醇提取上述滤液中的胶原蛋白的操作，很繁琐，另外上述沉淀物中含有胶原蛋白和肽类，需要从该沉淀物中除去上述肽类的工序使得胶原蛋白获取的效率变差。
液体成分和上述水溶性醇的混合通常优选在0～25℃的温度范围内进行。如果在上述温度范围内的温度进行混合，则不会对粘蛋白和胶原蛋白造成影响，因而优选。混合时间通常为1～48小时，优选为12～24小时。
该工序(A)中，在上述混合后，将混合物固液分离，由此得到固体成分。作为进行固液分离的装置，可举出离心分离装置、过滤装置、压榨装置等。
能够将通过固液分离而生成的固体成分供于接下来的工序(B)，由于固体成分中含有盐、脂质等杂质，所以为了除去它们，并且为了使固体成分中所含的醇浓度恒定，优选进行清洗处理。有时将进行该清洗处理的工序称为清洗工序(A1)。
清洗工序(A1)可以通过如下方式进行，即，将上述蛋白质分离工序(A)中的通过固液分离而得的固体成分与从经济性考虑相对于该固体成分的质量为1～4倍质量的碳原子数为1～4的水溶性醇水溶液混合。
作为上述水溶性醇，可举出碳原子数为1～4的一元烷基醇，具体而言可举出甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等烷基醇。其中，优选乙醇和丙醇。
固体成分和上述水溶性醇的混合物可以静置但为了有效进行清洗优选进行搅拌。另外将混合物持续静置的时间或者搅拌的时间即清洗时间通常为1小时以内，静置或者搅拌时的温度通常为0～25℃。进行清洗操作时的温度通常为0～25℃。如果在上述温度范围内的温度进行清洗操作，则不会对粘蛋白和胶原蛋白造成影响，因而优选。
将上述混合物静置或者混合搅拌后，进行固液分离操作。作为固液分离装置，可举出离心分离装置、过滤装置、压榨装置等。
该清洗工序(A1)中，固体成分和特定浓度的水溶性醇的混合操作及其后的固液分离操作可以为1次，另外也可以进行多次。作为决定重复清洗次数的标准，当固体成分的质量变化为5％以下时停止清洗操作，移至下一个工序。
由于该清洗工序(A1)中得到的固体成分含有比进行清洗处理前的固体成分所含的盐分的量少的量的盐分，所以为了将通过该清洗工序(A1)得到的固体成分与未进行清洗处理的固体成分在语言上相区别，有时将其称为“清洗固体成分”。
本发明中，将经过上述工序(A1)得到的清洗固体成分或者未实施上述工序(A1)的固体成分供于工序(B)。
工序(B)中，将上述蛋白质分离工序(A)中得到的固体成分(清洗固体成分或者未经清洗工序(A1)的固体成分)与醇浓度为10～40质量％的碳原子数为1～4的水溶性醇水溶液混合，接着进行固液分离，从而分离成含粘蛋白的液体成分和含胶原蛋白的固体成分。
作为上述水溶性醇，可举出甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等一元烷基醇。其中，优选乙醇和丙醇。
本发明中，如果与固体成分混合的上述水溶性醇的醇浓度为10质量％～40质量％，则通过其后的固液分离操作生成的固体成分中含有胶原蛋白，液体成分中含有粘蛋白。另外，如果将醇浓度高于40质量％的水溶性醇水溶液添加混合到固体成分中，则通过混合而产生的固体成分中胶原蛋白以外的肽的含量极少而以高纯度含有胶原蛋白。
该工序(B)中，工序(A)中得到的上述固体成分与上述水溶性醇的混合操作通过通常在0～25℃的温度下、通常搅拌1小时以内来进行。如果在上述温度范围内的温度进行混合，则不会对粘蛋白和胶原蛋白造成影响，因而优选。
混合操作结束后进行固液分离操作，得到含有粘蛋白的含粘蛋白液体成分和含有胶原蛋白的含胶原蛋白固体成分。
可以通过对含粘蛋白的液体成分进行公知的精制操作例如离子交换色谱和干燥操作例如冷冻干燥而分离出粘蛋白。含粘蛋白的液体成分中所含的粘蛋白或者分离出的粘蛋白可以通过对其进行氨基酸分析，由含有由式(I)(序列编号1)表示的氨基酸来鉴定。
可以对含胶原蛋白的固体成分进行公知的精制操作例如离子交换色谱和干燥操作例如冷冻干燥分离出胶原蛋白。胶原蛋白可以通过氨基酸分析对Gly的含量进行定量来鉴定。
实施例
以下，通过对为例示而非限定的实施例进行说明能够更好地理解本发明。
(实施例1)
用下述的方法从海月水母(Aurelia aurita)得到粘蛋白和胶原蛋白。
1)将冷藏状态的水母个体水洗，用网式过滤器分离成固体物和液体。
2)将分离的固体物用粉碎机切碎。将切碎而得的切碎片作为试样。
3)将2)中得到的试样与水填充至提取搅拌槽中，在4℃进行搅拌提取。
4)将3)中的通过搅拌提取而得的水溶液保持在4℃以10000G离心分离10分钟，得到液体成分。
5)向4)中得到的液体成分中，以异丙醇浓度成为70容量％的方式投入异丙醇，产生凝胶状的沉淀物。
6)边将含有5)中得到的凝胶状的沉淀物的液体维持在4℃边搅拌一晚后，保持在4℃以10000G离心分离10分钟，得到固体成分。
7)加入相对于6)中得到的固体成分质量为3倍质量的60质量％浓度的异丙醇水溶液。
8)将7)中生成的混合物在4℃搅拌5分钟后，保持在4℃以10000G离心分离10分钟，得到固体成分。
9)对8)中得到的固体成分再次进行7)和8)的清洗操作。
如上操作，结束蛋白质分离工序(A)。
10)加入相对于上述9)中得到的固体成分质量为3倍质量的25质量％浓度的异丙醇水溶液。
11)将10)中得到的溶液在4℃搅拌5分钟后，保持在4℃以10000G离心分离10分钟，得到固体成分。
12)对11)中得到的固体成分再进行2次10)和11)的操作，分离成固体成分和液体成分。
13)对12)中得到的液体成分进行透析处理和冷冻干燥，得到最终的固体成分(L)。另外使12)中得到的固体成分悬浮于水中后进行透析处理和冷冻干燥，得到最终的固体成分(S)。
如下利用自动氨基酸分析仪对这些固体成分(L)和固体成分(S)进行构成氨基酸分析，结果固体成分(L)为粘蛋白，固体成分(S)为胶原蛋白。
将上述固体物(L)和固体物(S)分别用上述的离子交换色谱精制，将透析过的试样(约12微克)移至水解管，用离心蒸发器干燥，加入到装有恒沸点盐酸(5.7N)的外管中进行减压封管。用气相法在110℃进行20小时水解。
将密封的外管打开，将水解管的内容物同样地干燥，使干燥的水解物溶解于100微升0.02N盐酸中。水解物的氨基酸分析使用(株)日立制作所制的高速氨基酸分析仪L-8500A。用(株)日立制作所规定的特殊氨基酸分析法并采用离子交换柱使水解物中的氨基酸用5种缓冲液分离。分离的氨基酸利用柱后法与茚三酮反应后用双波长的可见光检测。氨基糖和通常的氨基酸利用570nm的色谱，另外，脯氨酸利用440nm的色谱，以将标准氨基酸混合物和葡萄糖胺、半乳糖胺进行2纳摩尔分析而得的值为基础进行定量。
将氨基酸组成分析的结果示于表1。如表1的氨基酸浓度比所示，判明得到的粘蛋白的肽部的组成是苏氨酸(Thr)：谷氨酸(Glu)：脯氨酸(Pro)：丙氨酸(Ala)：缬氨酸(Val)+异亮氨酸(Ile)：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)分别按15％的误差计为2:1:1:2:2:2，能够确认是高纯度的粘蛋白。
另外，得到的胶原蛋白的肽部的组成中，甘氨酸(Gly)的浓度比率占全部氨基酸的约1/3，能够确认是高纯度的胶原蛋白。
表2中示出得到的粘蛋白和胶原蛋白的收率。
[表1]
(实施例2)
用下述的方法从海月水母(Aurelia aurita)得到粘蛋白和胶原蛋白。
1)将冷藏状态的水母个体水洗，用网式过滤器分离成固体物和液体。
2)将分离的固体物用粉碎机切碎。将切碎而得的切碎片作为试样。
3)将2)中得到的试样和水填充到提取搅拌槽中，在4℃进行搅拌提取。
4)将3)中的通过搅拌提取而得到的水溶液保持在4℃以10000G离心分离10分钟，得到液体成分。
5)向4)中得到的液体成分中，以乙醇浓度成为70容量％投入乙醇，生成凝胶状的沉淀物。
6)边将含有5)中得到的凝胶状的沉淀物的液体维持在4℃边搅拌一晚后，保持在4℃以10000G离心分离10分钟，得到固体成分。
7)加入相对于6)中得到的固体成分质量为3倍质量的60质量％浓度的乙醇水溶液。
8)将7)中生成的混合物在4℃搅拌5分钟后，保持在4℃以10000G离心分离10分钟，得到固体成分。
9)对8)中得到的固体成分再次进行7)和8)的清洗操作。
如上操作，结束蛋白质分离工序(A)。
10)加入相对于上述9)中得到的固体成分质量为3倍质量的25质量％浓度的乙醇水溶液。
11)将10)中得到的溶液在4℃搅拌5分钟后，保持在4℃以10000G离心分离10分钟，得到固体成分。
12)对11)中得到的固体成分再进行2次10)和11)的操作，分离成固体成分和液体成分。
13)对12)中得到的液体成分进行透析处理和冷冻干燥，得到最终的固体成分(L)。另外使12)中得到的固体成分悬浮于水中后进行透析处理和冷冻干燥，得到最终的固体成分(S)。
表2中示出了得到的粘蛋白和胶原蛋白的收率。
(比较例1)
向通过进行与实施例2的1)～4)同样的操作而得的液体成分中，以乙醇浓度成为50容量％的方式投入乙醇，生成凝胶状的沉淀物。使用含有该凝胶状的沉淀物的含有液，通过进行与实施例1的6)～13)同样的操作，得到最终的固体成分(L)和固体成分(S)。
表2中示出了得到的粘蛋白和胶原蛋白的收率。
(实施例3)
向通过进行与实施例2的1)～4)同样的操作而得的液体成分中，以乙醇浓度成为60容量％的方式投入乙醇，生成凝胶状的沉淀物。使用含有该凝胶状的沉淀物的液体，通过进行与实施例1的6)～13)同样的操作，得到最终的固体成分(L)和固体成分(S)。
表2中示出了得到的粘蛋白和胶原蛋白的收率。
(比较例2)
向实施例2的10)工序中的固体成分中，以相对于该固体成分为60质量％的浓度的方式加入异丙醇进行混合，除此之外，与实施例2同样地进行操作，得到最终的固体成分(L)和固体成分(S)。
表2中示出了得到的粘蛋白和胶原蛋白的收率。
[表2]
收率(％) 实施例1 实施例2 实施例3 比较例1 比较例2
水母原料(湿重) 100 100 100 100 100
粘蛋白 0.015 0.018 0.015 0.001 0.000
胶原蛋白 0.140 0.195 0.195 0.089 0.190
由实施例1～3与比较例1和2的结果可知，在本发明中，高效地分级提取了粘蛋白和胶原蛋白。
(比较例3)
向实施例2的10)工序中的固体成分中，加入相对于该固体成分为3倍质量的水，除此之外，与上述实施例2同样地实施，对作为最终工序的12)中得到的液体成分进行透析处理和冷冻干燥，得到最终的固体成分(Lc)。另外使12)中得到的固体成分悬浮于水中后进行透析处理和冷冻干燥，得到最终的固体成分(Sc)。表3中示出了得到的粘蛋白和胶原蛋白的收率。
与上述实施例1同样地利用自动氨基酸分析仪对上述最终的固体成分(Lc)和(Sc)进行构成氨基酸分析。
将氨基酸组成分析的结果示于表4。如表4的氨基酸浓度比所示，作为固体成分(Lc)得到的粘蛋白的肽部的组成与作为理论值的苏氨酸(Thr)：谷氨酸(Glu)：脯氨酸(Pro)：丙氨酸(Ala)：缬氨酸(Val)+异亮氨酸(Ile)：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)为2∶1∶1∶2∶2∶2相距甚远，另外，由于来自胶原蛋白的甘氨酸(Gly)的浓度比率高，所以能够确认粘蛋白的纯度低。
[表3]
收率(％) 比较例3
水母原料(湿重) 100
粘蛋白 0.040
胶原蛋白 0.036
[表4]
峰名 浓度(nmol) 浓度比
Asp 1
Thr 0.6 0.55
Ser 0.6
Glu 1.1 1.1
Pro 1 1
Gly 3.6 3.59
Ala 1.1 1.14
Gys 0
Val 0.5 0.49
Met 0.1
Ile 0.3
Leu 0.4
Tyr 0.1
Phe 0.1
Lys 0.5
His 0
Arg 0.6
Total 11.6
GlcNH2 0.1
GalNH2 0.1
(参考例)
向实施例1的通过工序4)得到的液体成分中以乙醇浓度成为20容量％的方式添加乙醇，将通过添加混合而产生的沉淀物进行固液分离并采集沉淀物和液体成分(称为第1液体成分)。对该沉淀物与实施例1同样地进行自动氨基酸分析，结果表5所示的主成分以表5所示的收量获得。
向上述第1液体成分中以乙醇浓度成为30容量％的方式添加乙醇，将通过添加混合而产生的沉淀物进行固液分离并采集沉淀物和液体成分(称为第2液体成分)。对该沉淀物与实施例1同样地进行自动氨基酸分析，结果表5所示的主成分以表5所示的收量获得。
向上述第2液体成分中以乙醇浓度成为40容量％的方式添加乙醇，将通过添加混合而产生的沉淀物进行固液分离并采集沉淀物和液体成分(称为第3液体成分)。对该沉淀物与实施例1同样地进行自动氨基酸分析，结果表5所示的主成分以表5所示的收量获得。
向上述第3液体成分中以乙醇浓度成为50容量％的方式添加乙醇，将通过添加混合而产生的沉淀物进行固液分离并采集沉淀物和液体成分(称为第4液体成分)。对该沉淀物与实施例1同样地进行自动氨基酸分析，结果表5所示的主成分以表5所示的收量获得。
向上述第4液体成分中以乙醇浓度成为60容量％的方式添加乙醇，将通过添加混合而产生的沉淀物进行固液分离并采集沉淀物和液体成分(称为第5液体成分)。对该沉淀物与实施例1同样地进行自动氨基酸分析，结果表5所示的主成分以表5所示的收量获得。
向上述第5液体成分中以乙醇浓度成为70容量％的方式添加乙醇，将通过添加混合而产生的沉淀物进行固液分离并采集沉淀物和液体成分(称为第5液体成分)。对该沉淀物与实施例1同样地进行自动氨基酸分析，结果表5所示的主成分以表5所示的收量获得。
另外，使用丙醇代替乙醇进行与上述同样的试验，得到与表5所示的数据显示相同的趋势的结果。
[表5]
乙醇浓度(容量％) 收量(mg) 主成分
20 3108.1 胶原蛋白
30 308.5 胶原蛋白
40 518.1 多种肽
50 2918.0 粘蛋白
60 190.4 粘蛋白
70 55.2 粘蛋白
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供从水母中有效地分级提取粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法。利用本发明的方法得到的粘蛋白和胶原蛋白在医药品、化妆品、食品、农业等领域中有用。另外，粘蛋白和胶原蛋白能够用于试剂的原料及产品。

Claims (3)

1.一种粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其特征在于，具有蛋白质分离工序(A)和分级工序(B)，
所述蛋白质分离工序(A)：将下述混合物进行固液分离而得到固体成分，所述混合物是将粉碎水母而成的含水粉碎物进行固液分离而得的液体成分与碳原子数为1～4的水溶性醇以碳原子数为1～4的水溶性醇的浓度相对于整体至少成为50容量％的方式混合而得到的，
所述分级工序(B)：通过将所述蛋白质分离工序(A)中得到的固体成分与醇浓度为10～40质量％的碳原子数为1～4的水溶性醇水溶液混合，接着进行固液分离，从而固液分级成含粘蛋白的液体成分和含胶原蛋白的固体成分。
2.根据权利要求1所述的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其特征在于，将用碳原子数为1～4的水溶性醇和/或水清洗所述蛋白质分离工序(A)中的通过固液分离而得的固体成分而成的清洗固体成分作为所述蛋白质分离工序(A)中得到的固体成分，供于所述分级工序(B)。
3.根据权利要求2所述的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其中，所述碳原子数为1～4的水溶性醇和/或水以相对于所述蛋白质分离工序(A)中的通过固液分离而得的固体成分的质量为1～4倍质量的比例与所述固体成分混合。
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