CN115093471A - 一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，属于功能性成分提取的技术领域。所述方法包括前处理、一次脱脂脱色、提取、二次脱色和后处理。本发明采用的无水乙醇和活性炭双重脱脂脱色的方法操作简易，成本较低，且有效提高了脱色率，安全无毒绿色环保，便于工业中大规模生产，具有应用价值；乙醇溶液提取醇溶蛋白，对蛋白的提取率高，且无毒环保、成本较低；采用超声‑旋蒸‑盐析法，不仅可以减少盐析损耗，提高产率，还有效缩短提取时间，提高生产效率。本发明的原料为酒糟，将酿酒废弃物转化提取，提高了酒糟的附加值，且酒糟来源广泛，并且具有很好的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于功能性成分提取的技术领域，具体涉及一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法。
背景技术
醇溶蛋白是谷物中的一种贮藏蛋白，在高粱和小麦蛋白中比例较高，占高粱总蛋白的77%～82%，小麦总蛋白的50%～60%。由于醇溶蛋白具有抑菌性、疏水性、广泛的交联性等特性高粱酒糟中提取的醇溶蛋白具有较高的工业应用潜力。目前醇溶蛋白已经广泛运用在食品保鲜、包装材料，并且2020年中国药典第四部以及批准玉米醇溶蛋白用于药用辅料和药物包材。
白酒酒糟是白酒行业主要副产物。每生产1t白酒，约产生3~4t的鲜酒糟，我国是白酒生产大国，2020年全国白酒行酒糟产量达2000~3000万t。酒糟水分高、酸度高、含稻壳量多，易腐败变质，污染环境。目前主要以废弃物形式处理，如燃烧或用作饲料，管理难度大且附加值极低。因此为了解决酒糟堆积所带来的资源浪费和环境污染问题，针对酒糟高附加值再利用的研究必不可少。
目前已经有从酒糟提取蛋白质的研究，例如公开号为CN113817035A的中国专利公开了一种从白酒酒槽中分级提取高粱谷蛋白的方法，包括如下步骤：1)将冷冻酒槽解冻后，依次进行干燥、粉碎、过筛、除脂、脉冲电场破壁和除糖处理；2)在步骤1)所得物中分别提取高粱清蛋白和高粱球蛋白、高粱醇溶蛋白、高粱谷蛋白；3)利用超滤和凝胶色谱法对所述高粱谷蛋白进行纯化，完成提取。虽然该方法具有新型非热、无害、环保的特点，但是该方法价格贵，提取方法复杂，提取出的醇溶蛋白不能用于食品加工，提纯和凝胶法耗时长。又如公开号为CN107208122A的中国专利公开了全酒糟及其它生物质的提取物及其提取方法，虽然本发明提供了新的改进的方法，允许在有成本效益的商业规模下有效捕获生物质(例如全酒糟或稀酒糟)中的有价值的活性成分。本发明还提供具有独特性质(例如营养价值和增强的生物利用度)的活性成分的新组合物。但是该专利利用核苷酸酶提取酒糟中生物活性成分，多次萃取获得的玉米醇溶蛋白纯度低，且实验材料贵。因此，急需一种绿色、简便、降低成本、可用于工业化生产的白酒工业副产物中醇溶蛋白的提取技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种绿色、简便、成本低的从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将白酒酒糟烘干至恒定重量，筛除糠壳，并粉碎至粉末状；
S2.一次脱脂脱色：粉末状酒糟中加入无水乙醇，50～60℃下浸提0.5～2h，对浸提液进行抽滤；
S3.提取：抽滤后的酒糟中加入质量百分比浓度为70～90%的乙醇，在20～60℃的温度下超声萃取26～36min，萃取剂抽滤后得到醇溶蛋白提取液；
S4.二次脱色：步骤S3中获得的醇溶蛋白提取液中加入活性炭，50～80℃的温度下超声处理0.5～2h，抽滤后得到二次脱色的醇溶蛋白提取液；
S5.后处理：将二次脱色的醇溶蛋白提取液进行旋蒸，旋蒸后所得固体加入70%的乙醇溶解，再加入氯化钠溶液进行盐析，盐析后在-20℃温度下静止12～24h后进行离心，所得沉淀为醇溶蛋白。
进一步地，所述的白酒酒糟为浓香型白酒酒糟。
进一步地，所述步骤S1中采用1～4目的筛网去除糠壳。
进一步地，所述步骤S2中粉末状酒糟和无水乙醇的料液比为1:8～12。
进一步地，所述步骤S3中抽滤后的酒糟与乙醇溶液的料液比为1:6～12。
进一步地，步骤S4中所述醇溶蛋白提取液中活性炭的含量为0.1～3%，活性炭的颗粒粒径为4～200目。
进一步地，步骤S5中所述氯化钠溶液的质量百分含量为0.6～1.2%。
进一步地，步骤S5中所述离心的条件为：转速4000～12000r/min，离心8～15min。
上述的方法制备的醇溶蛋白。
本发明方法中：
1、现有的纯化蛋白质的主要方式有超滤、凝胶色谱法等，经过实验验证，两种方法操作复杂、操作时间长、成本高且纯化效果不佳不能用于工业化生产；脱色方法是采用凹凸棒粘土与硅藻土粘土复配物为复合脱色剂进行振荡吸附脱色，待吸附脱色完成后离心分离出复合脱色剂，而本发明采用的无水乙醇和活性炭双重脱脂脱色的方法操作简易，成本较低，且有效提高了脱色率，安全无毒绿色环保，便于工业中大规模生产，具有应用价值。
2、本发明采用无水乙醇脱脂脱色的原理为：醇溶蛋白不溶于无水乙醇，色素等脂溶性分子易溶于无水乙醇，可有效运用于醇溶蛋白的脱脂脱色过程。在50～60℃下温热60分钟脱脂脱色效果最佳。无水乙醇无毒，并可反复回收利用，工业成本降低，且不会对环境造成污染，安全绿色环保。
3、本发明选用4～200目的颗粒状活性炭进一步去除色素。由于活性炭比表面积大，吸附能力强，且呈颗粒状，更易过滤。其在70～80℃，30～40分钟的脱色能力最佳，其脱色率为：81.03％。且活性炭可回收重复使用，成本降低，不会对环境造成污染。
4、采用70～90%乙醇溶液提取蛋白。相较于现有工艺中蛋白提取过程中使用的叔丁醇、正己烷等有毒有机提取剂，醇溶蛋白易溶于70%乙醇溶液，对蛋白的提取率高，且无毒环保、成本较低，可大规模生产。
5、本发明采用了氯化钠溶液盐析的方法沉淀提取蛋白。现有工艺中会采用DTT和SDS提取蛋白，但DTT和SDS会使蛋白质变性，影响后续工艺，且两者的浓度过高易对人的身体造成损害。本发明使用氯化钠溶液盐析可降低醇溶蛋白的溶解度，蛋白质凝聚而从溶液中析出，并且可复原，不会造成蛋白结构的破坏；且氯化钠溶液无毒，成本低，对人体没有危害。蛋白质溶液用氯化钠溶液盐析后在-20℃下放置后，再离心后可以完全将醇溶蛋白和液体分开，有效提高了析出率。
本发明具有以下优点：本发明公开的一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，先采用无水乙醇和活性炭对白酒的酒糟进行双重脱脂脱色，再用乙醇溶液提取醇溶蛋白、最后采用超声-旋蒸-盐析法纯化醇溶蛋白，将酿酒废弃物酒糟转化为醇溶蛋白，提取的醇溶蛋白可以广泛应用于医药生产、食品加工和产品保鲜。本发明采用的无水乙醇和活性炭双重脱脂脱色的方法操作简易，成本较低，且有效提高了脱色率，安全无毒绿色环保，便于工业中大规模生产，具有应用价值；乙醇溶液提取醇溶蛋白，对蛋白的提取率高，且无毒环保、成本较低；采用超声-旋蒸-盐析法，不仅可以减少盐析损耗，提高产率，还有效缩短提取时间，提高生产效率。本发明的原料为酒糟，将酿酒废弃物转化提取，提高了酒糟的附加值，且酒糟来源广泛，并且具有很好的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为实验例1中活性炭的A-t图。
图2为采用BCA法测定蛋白含量时绘制的标准曲线图。
图3为采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量时绘制的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将浓香型白酒酒糟烘干至恒定重量，1目的筛网去除糠壳，并粉碎至粉末状；
S2.一次脱脂脱色：粉末状酒糟中加入无水乙醇，粉末状酒糟和无水乙醇的料液比为1:8，50℃下浸提0.5h，对浸提液进行抽滤；
S3.提取：抽滤后的酒糟中加入质量百分比浓度为70%的乙醇，酒糟与乙醇溶液的料液比为1:6，在20℃的温度下超声萃取26min，萃取剂抽滤后得到醇溶蛋白提取液；
S4.二次脱色：步骤S3中获得的醇溶蛋白提取液中加入活性炭，所述醇溶蛋白提取液中活性炭的含量为0.1%，活性炭的颗粒粒径为4目，50℃的温度下超声处理0.5h，抽滤后得到二次脱色的醇溶蛋白提取液；
S5.后处理：将二次脱色的醇溶蛋白提取液进行旋蒸，旋蒸后所得固体加入70%的乙醇溶解，再加入质量百分含量为0.6%的氯化钠溶液进行盐析，盐析后在-20℃温度下静止12h后进行离心，所述离心的条件为：转速4000r/min，离心8min，所得沉淀为醇溶蛋白。
实施例2：一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将浓香型白酒酒糟烘干至恒定重量，4目的筛网去除糠壳，并粉碎至粉末状；
S2.一次脱脂脱色：粉末状酒糟中加入无水乙醇，粉末状酒糟和无水乙醇的料液比为1:12，60℃下浸提2h，对浸提液进行抽滤；
S3.提取：抽滤后的酒糟中加入质量百分比浓度为90%的乙醇，酒糟与乙醇溶液的料液比为1:12，在60℃的温度下超声萃取36min，萃取剂抽滤后得到醇溶蛋白提取液；
S4.二次脱色：步骤S3中获得的醇溶蛋白提取液中加入活性炭，所述醇溶蛋白提取液中活性炭的含量为3%，活性炭的颗粒粒径为200目，80℃的温度下超声处理2h，抽滤后得到二次脱色的醇溶蛋白提取液；
S5.后处理：将二次脱色的醇溶蛋白提取液进行旋蒸，旋蒸后所得固体加入70%的乙醇溶解，再加入质量百分含量为1.2%的氯化钠溶液进行盐析，盐析后在-20℃温度下静止24h后进行离心，所述离心的条件为：转速12000r/min，离心15min，所得沉淀为醇溶蛋白。
实施例3：一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将浓香型白酒酒糟烘干至恒定重量，3目的筛网去除糠壳，并粉碎至粉末状；
S2.一次脱脂脱色：粉末状酒糟中加入无水乙醇，粉末状酒糟和无水乙醇的料液比为1:10，56℃下浸提1.5h，对浸提液进行抽滤；
S3.提取：抽滤后的酒糟中加入质量百分比浓度为80%的乙醇，酒糟与乙醇溶液的料液比为1:9，在45℃的温度下超声萃取32min，萃取剂抽滤后得到醇溶蛋白提取液；
S4.二次脱色：步骤S3中获得的醇溶蛋白提取液中加入活性炭，所述醇溶蛋白提取液中活性炭的含量为2%，活性炭的颗粒粒径为100目，65℃的温度下超声处理1h，抽滤后得到二次脱色的醇溶蛋白提取液；
S5.后处理：将二次脱色的醇溶蛋白提取液进行旋蒸，旋蒸后所得固体加入70%的乙醇溶解，再加入质量百分含量为1%的氯化钠溶液进行盐析，盐析后在-20℃温度下静止18h后进行离心，所述离心的条件为：转速8000r/min，离心12min，所得沉淀为醇溶蛋白。
以下通过实验说明本发明的有益效果：
1、主要试剂：
浓香型白酒酒糟来自泸州老窖股份有限公司，晒干后置于常温下保存备用；
去离子水取自EDI系统；
无水乙醇购买于江苏杰锐化工有限公司；
氯化钠购买于济南腾博化工有限公司；
BCA，考马斯亮蓝试剂盒购买于索莱宝公司；
活性炭购买于鑫森炭业股份有限公司。
2、主要仪器：
超声波仪器购买于上海声彦超声波仪器有限公司；
离心机购买于长沙英泰仪器有限公司；
抽滤泵购买于苏铂公司。
3、实验方法：
实验例1：一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将浓香型白酒酒糟烘干至恒定重量，1目的筛网去除糠壳，并用粉碎机多次粉碎至粉末状；
S2.一次脱脂脱色：称量100g酒糟粉末一料液比为1:10的比例加入无水乙醇，50℃下浸提30min，对浸提液进行抽滤得滤饼，测得此时的脱色率为43.1%；
S3.提取：抽滤后的酒糟中加入质量百分比浓度为70%的乙醇，酒糟与乙醇溶液的料液比为1:10，在50℃的温度下超声萃取30min，萃取剂抽滤后得到醇溶蛋白提取液；
S4.二次脱色：步骤S3中获得的醇溶蛋白提取液中加入活性炭，料液比为1000；1，活性炭的颗粒粒径为10-24目，80℃的温度下超声处理40min，活性炭的A-t图如图1所示，抽滤后得到二次脱色的醇溶蛋白提取液，测得此时脱色率为81.03%；
S5.后处理：将二次脱色的醇溶蛋白提取液进行旋蒸，旋蒸后所得固体加入5ml70%的乙醇溶解，再加入质量百分含量为1%的氯化钠溶液1:1进行盐析，盐析后在-20℃温度下静止24h后进行离心，所述离心的条件为：转速4000r/min，离心10min，所得沉淀为醇溶蛋白。
实验例2：一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将浓香型白酒酒糟烘干至恒定重量，1目的筛网去除糠壳，并用粉碎机多次粉碎至粉末状；
S2.一次脱脂脱色：称量100g酒糟粉末一料液比为1:8的比例加入无水乙醇，50℃下浸提60min，对浸提液进行抽滤得滤饼；
S3.提取：抽滤后的酒糟中加入质量百分比浓度为70%的乙醇，酒糟与乙醇溶液的料液比为1:8，在50℃的温度下超声萃取26min，萃取剂抽滤后得到醇溶蛋白提取液；
S4.二次脱色：步骤S3中获得的醇溶蛋白提取液中加入活性炭，料液比为1000:1，活性炭的颗粒粒径为200目，60℃的温度下超声处理60min，抽滤后得到二次脱色的醇溶蛋白提取液；
S5.后处理：将二次脱色的醇溶蛋白提取液进行旋蒸，旋蒸后所得固体加入5ml70%的乙醇溶解，再加入质量百分含量为1%的氯化钠溶液1:1进行盐析，盐析后在-20℃温度下静止12h后进行离心，所述离心的条件为：转速4000r/min，离心10min，所得沉淀为醇溶蛋白。
实验例3：一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，它包括以下步骤：
S1.前处理：将浓香型白酒酒糟烘干至恒定重量，1目的筛网去除糠壳，并用粉碎机多次粉碎至粉末状；
S2.一次脱脂脱色：称量100g酒糟粉末一料液比为1:12的比例加入无水乙醇，50℃下浸提60min，对浸提液进行抽滤得滤饼；
S3.提取：抽滤后的酒糟中加入质量百分比浓度为70%的乙醇，酒糟与乙醇溶液的料液比为1:12，在60℃的温度下超声萃取30min，萃取剂抽滤后得到醇溶蛋白提取液；
S4.二次脱色：步骤S3中获得的醇溶蛋白提取液中加入活性炭，料液比为1000:1，活性炭的颗粒粒径为200目，60℃的温度下超声处理60min，抽滤后得到二次脱色的醇溶蛋白提取液；
S5.后处理：将二次脱色的醇溶蛋白提取液进行旋蒸，旋蒸后所得固体加入5ml70%的乙醇溶解，再加入质量百分含量为1%的氯化钠溶液1:1.2进行盐析，盐析后在-20℃温度下静止24h后进行离心，所述离心的条件为：转速4000r/min，离心10min，所得沉淀为醇溶蛋白。
（1）醇溶蛋白含量测定：
A、BCA测定法：
配置BCA工作液。
标准蛋白样品的制备：取10uL蛋白标准品（5mg/ml BSA）用70%乙醇稀释至100uL，使终浓度为0.5mg/mL。
待测样品的制备：取实验例1已提取干燥的醇溶蛋白样品10mg溶于20mL70%乙醇溶液中，使终浓度为0.5mg/mL。
将稀释后标准品（0.5mg/mL BSA）按0,1,2,4,8,12,16,20uL分别加到酶标板中，加标准品稀释波将所有标准品补足到20uL。
加适当体积待测样品到酶标板中，加标准品稀释液到20uL。
各孔加入200uL BCA工作液，轻轻用加样枪吹打混匀(注意不要弄出气泡影响读数)37℃放置30-60分钟。
冷却到室温后，用酶标仪测定562nm波长处的吸光度，并记录下来如表1所示，绘制标准曲线如图2所示。
表1：562nm波长处样品的吸光度值
根据标准曲线计算出待测样品中的蛋白浓度为80.07%。
B、考马斯亮蓝G-250测定法：
备好考马斯亮蓝G-250染液试剂，按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
标准蛋白样品的制备：取10uL蛋白标准品（5mg/ml BSA）用70%乙醇稀释至100uL，使终浓度为0.5mg/mL。
待测样品的制备：取已提取干燥的醇溶蛋白样品10mg溶于20mL70%乙醇溶液中，使终浓度为0.5mg/mL。
将稀释后标准品（0.5mg/mL BSA）按0,1,2,4,8,12,16,20uL分别加到酶标板中，加标准品稀释波将所有标准品补足到20uL。
加适当体积待测样品到酶标板中，加标准品稀释液到20uL。
各孔加入200uL稀释后的考马斯亮蓝染液，轻轻用加样枪吹打混匀(注意不要弄出气泡影响读数)室温放置5-30分钟。
冷却到室温后，用酶标仪测定595nm波长处的吸光度，并记录下来如表2所示，绘制标准曲线如图3所示。
表2：595nm波长处样品的吸光度值
根据标准曲线计算出待测样品中的蛋白含量为82.03%。
（2）实验结果：
由蛋白含量测定A、B得：平均蛋白含量为：81.05%，最终得到的醇溶蛋白提取率为：19.8％。
采用相同的方法测定实验例2和实验例3，最终得到的实验例2的醇溶蛋白提取率为17.3%，最终得到的实验例3的醇溶蛋白提取率为20.1%。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 前处理：将白酒酒糟烘干至恒定重量，筛除糠壳，并粉碎至粉末状；
S2. 一次脱脂脱色：粉末状酒糟中加入无水乙醇，50～60℃下浸提0.5～2h，对浸提液进行抽滤；
S3. 提取：抽滤后的酒糟中加入质量百分比浓度为70～90%的乙醇，在20～60℃的温度下超声萃取26～36min，萃取剂抽滤后得到醇溶蛋白提取液；
S4. 二次脱色：步骤S3中获得的醇溶蛋白提取液中加入活性炭，50～80℃的温度下超声处理0.5～2h，抽滤后得到二次脱色的醇溶蛋白提取液；
S5. 后处理：将二次脱色的醇溶蛋白提取液进行旋蒸，旋蒸后所得固体加入70%的乙醇溶解，再加入氯化钠溶液进行盐析，盐析后在-20℃温度下静止12～24h后进行离心，所得沉淀为醇溶蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，所述的白酒酒糟为浓香型白酒酒糟。
3.根据权利要求1所述的一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S1中采用1～4目的筛网去除糠壳。
4.根据权利要求1所述的一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S2中粉末状酒糟和无水乙醇的料液比为1:8～12。
5.根据权利要求1所述的一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S3中抽滤后的酒糟与乙醇溶液的料液比为1:6～12。
6.根据权利要求1所述的一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，步骤S4中所述醇溶蛋白提取液中活性炭的含量为0.1～3%，活性炭的颗粒粒径为4～200目。
7.根据权利要求1所述的一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，步骤S5中所述氯化钠溶液的质量百分含量为0.6～1.2%。
8.根据权利要求1所述的一种从白酒酒糟中提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，步骤S5中所述离心的条件为：转速4000～12000r/min，离心8～15min。
9.采用权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的醇溶蛋白。
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