KR101209912B1

KR101209912B1 - 콜라겐의 분리 방법 및 이에 의해 분리된 콜라겐

Info

Publication number: KR101209912B1
Application number: KR1020090118562A
Authority: KR
Inventors: 이남혁; 김영호; 김현경; 최인욱
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2009-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2012-12-10
Anticipated expiration: 2029-12-02
Also published as: KR20110062001A

Abstract

본 발명은 콜라겐의 분리 방법 및 이에 의해 분리된 콜라겐에 관한 것으로, 구체적으로는, 본 발명의 콜라겐 분리 방법은 산성 용매를 가하고 초음파 처리하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출 단계를 포함한다.

본 발명의 분리 방법에 의해 콜라겐의 가수분해물이 아닌 콜라겐 자체를 분리할 수 있으며, 단시간에 고수율로 콜라겐의 분리가 가능하며, 적은 양의 산을 사용하므로 환경친화적이면서도 마린 콜라겐을 저비용으로 분리할 수 있다.

마린 콜라겐, 초음파, 산성 용매

Description

콜라겐의 분리 방법 및 이에 의해 분리된 콜라겐 {Method of isolation of collagen and collagen isolated by thereof}

본 발명은 콜라겐의 분리 방법 및 이에 의해 분리된 콜라겐에 대한 것으로, 구체적으로는, 콜라겐의 분리 수율이 높고 단시간에 분리가 가능하며, 적은 양의 산을 사용하므로 환경친화적이면서도 마린 콜라겐을 저비용으로 분리할 수 있는 콜라겐의 분리 방법 및 이로 인해 분리된 콜라겐에 대한 것이다.

콜라겐은 피부, 혈관, 치아 등 거의 모든 조직에 포함되어 있는 섬유상의 단백질로서 신체를 구성하는 단백질의 약 30% 를 점유하고 있다. 인체의 콜라겐은 약 40 % 는 피부에 존재하며, 20 % 는 뼈, 연골에 포함되어 있고, 그 외 혈관, 내장 등 신체 어느 곳이든 광범위하게 분포하고 있다. 이러한 콜라겐은 젤라틴 등의 형태로 식용으로 이용되어 왔으며, 섭취된 콜라겐은 소화관 내에서 소화효소에 의해 분해되어 대부분 아미노산의 형태로 흡수되는데, 면역기능을 향상시키고 세포의 재생작용을 촉진시켜 관절을 튼튼하게 해주며 피부의 신진대사 활성화 및 보습력 유 지를 통하여 피부미용에 탁월한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 주로 가축의 가죽과 뼈, 소의 무릎관절 등에서 추출하거나 특수한 목적을 위하여 인간의 콜라겐을 필요로 할 경우에는 사체 또는 태반조직으로부터 추출하여 생산하고 있다. 그러나 최근 BSE의 발생 등 동물성 콜라겐에 대한 인식이 나빠지고 있으며, 어류의 피부, 비늘 등에서 추출한 마린 콜라겐의 가치가 증대하고 있다.

마린 콜라겐은 가축의 피부 콜라겐과 비교하여 융점이 낮은 I형 콜라겐으로 주로 산을 이용하여 추출하는 바, 산에 의한 환경오염 등이 문제가 되고 있다.

상기의 문제점을 해결하고자 본 발명의 목적은 콜라겐의 분리 수율이 높고 단시간에 분리가 가능하며, 적은 양의 산을 사용하므로 환경친화적이면서도 저비용으로 콜라겐을 분리할 수 있는 콜라겐의 분리 방법 및 이로 인해 분리된 콜라겐을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하고자 본 발명은,

산성 용매를 가하고 초음파 처리하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출 단계를 포함하는 콜라겐의 분리 방법을 제공한다.

상기 산성 용매는 아세트산일 수 있다.

상기 산성 용매는 0.01 내지 0.5 M 농도일 수 있다.

상기 산성 용매는 처리되는 시료에 대하여 100 내지 300 중량부로 첨가될 수 있다.

상기 초음파 처리는 0.1 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다.

상기 초음파는 주파수가 20 kHz 인 것을 사용할 수 있다.

상기 초음파는 진폭(amplitude)이 20 내지 80 % 일 수 있다.

상기 초음파 처리는 0 내지 10 ℃에서 수행될 수 있다.

상기 콜라겐 분리 방법은 콜라겐 추출 단계 후에 얻어진 용액을 원심분리하여 상등액을 얻는 원심분리 단계; 및 상기 상등액에 염화나트륨(NaCl)을 가하여 침전시키고 침전물을 투석하는 분리 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

상기 콜라겐의 분리 방법에 의해 얻어진 콜라겐을 제공한다.

본 발명의 콜라겐 분리 방법은 콜라겐의 분리 수율이 높을 뿐만 아니라, 단시간내에 높은 수율로 콜라겐을 분리할 수 있다. 또한, 콜라겐의 분리시 적은 양의 산으로도 높은 수율로 콜라겐을 분리할 수 있어 사용하는 산의 양을 줄일 수 있으므로 환경친화적이라 할 수 있다.

본 발명의 콜라겐 분리 방법에 의하면 콜라겐의 가수분해물 형태가 아닌 고분자량의 콜라겐을 기본 구조를 그대로 유지하면서 추출할 수 있다.

본 발명의 콜라겐 분리 방법에 의하면 최근 그 가치가 증대하고 있는 마린 콜라겐을 분리할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 분리된 콜라겐은 화장품, 피부 외용제 또는 건강식품 등에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 당업자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 콜라겐(collagen) 분리 방법은 산성 용매를 가하고 초음파 처리하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출 단계를 포함한다. 상기 콜라겐 분리 방법은 산 성 용매의 존재하에서 초음파 처리를 하여 산을 적게 사용하면서도 고수율로 콜라겐을 분리할 수 있으며, 기존의 산처리 방법보다 단시간내에 원하는 수율로 콜라겐을 분리할 수 있다.

상기 방법에 의해 어류의 피부, 비늘 등 해양 생물로부터 유래되는 마린 콜라겐을 분리할 수 있다. 시료는 염용성 단백질을 제거하고 탈지하는 전처리 과정을 거친 후, -20 ℃이하의 온도에서 보관하면서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 해양 생물의 어피, 비늘을 세척하고 일정 크기로 세절한 후, 시료에 대하여 10 내지 30 중량부의 염화나트륨(NaCl)용액을 가하고 교반한 뒤, 5,000 내지 10,000 rpm에서 원심분리고 상등액을 제거하여 염용성 단백질을 제거할 수 있다. 이와 같은 과정은 4 ℃이하의 온도에서 수 회 반복할 수 있다. 탈지 과정은 상기 원심분리 후 얻어진 침전물을 정제수로 세척하고 에탄올을 가하여 24 시간 이상 교반하는 과정을 통해 수행될 수 있다.

상기 콜라겐 추출 단계는 상기 전처리 과정을 거친 해양생물 시료에 산성 용매를 가하는 과정을 거친다. 상기 산성 용매에 의해 콜라겐이 용해되어 추출된다.

상기 산성 용매는 염산 또는 아세트산을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 아세트산을 사용할 수 있다.

상기 산성 용매는 0.01 내지 0.5 M 농도로 첨가될 수 있다. 콜라겐은 물, 묽은 산, 묽은 알칼리에 용해되지 않는 것으로 알려져 있으나, 본 발명에서는 초음파 처리를 병행하므로 상기와 같은 저농도의 산으로 처리하는 경우에도 콜라겐의 추출이 가능하다. 산성 용매가 0.01 M 미만의 농도로 포함되는 경우 콜라겐의 추출 수율이 현저히 낮아지고 산성 용매가 0.5 M을 초과하여 포함되는 경우 콜라겐의 추출 수율의 증가는 미미하면서 산의 농도만 높아져 비효율적일뿐더러 후처리 비용이 증가되고 환경친화적이지 않으며 콜라겐이 분해되어 가수분해물의 형태로 부산물이 발생할 수 있다.

상기 산성 용매는 처리되는 시료에 대하여 100 내지 300 중량부로 첨가될 수 있다. 100 중량부 미만으로 첨가되는 경우 콜라겐의 추출 속도가 저하되며 콜라겐의 추출 수율이 현저히 저하되고 300 중량부를 초과하는 경우 추출 속도 및 추출 수율의 상승이 미미하여 비효율적이다.

상기 콜라겐 추출 단계는 상기 전처리 과정을 거친 시료에 산성 용매를 가한 후, 초음파 처리를 하는 단계이다. 산 가용성인 해양 생물로부터 유래되는 마린 콜라겐의 특성상 산성 용매를 가하지 않고 초음파 처리만 하는 경우 콜라겐 섬유의 구조적 변화를 일으키기 어려워 콜라겐의 분리를 위해서는 산성 용매가 반드시 필요하다. 본 발명에서는 산성 용매의 존재하에 초음파 처리를 병행하므로 최소 농도의 산성 용매하에서도 높은 수율로 콜라겐을 용출시킬 수 있다. 따라서, 콜라겐의 분리에 사용되는 산의 양을 현저히 감소시킬 수 있다.

상기 초음파 처리는 0 ℃ 내지 10 ℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 4 ℃에서 수행될 수 있다. 상기 온도 범위에서 콜라겐이 가수분해물 형태가 아닌 분 자량 30만 정도의 생체에서 기능하고 있는 콜라겐 형태 그대로 추출될 수 있다. 콜라겐은 분자량이 10만 정도의 폴리펩티드 사슬 3 개가 3중 나선구조를 이루며 이 사슬은 서로 수소결합으로 안정화되어 있고 가열하면 이들 소수 결합이 절단되어 랜덤 코일 상의 젤라틴으로 되어 물성이 변화할 수 있다. 0 ℃ 미만의 온도하에서 처리하는 경우 콜라겐의 분리가 미미할 수 있으며, 10 ℃를 초과하는 경우 콜라겐의 수소 결합이 절단되어 젤라틴으로 변형되거나 콜라겐이 아닌 콜라겐의 가수분해물 형태로 추출될 염려가 있다.

상기 초음파는 20 kHz 의 주파수에서 진폭(amplitude)이 20 내지 80 % 일 수 있다. 상기 주파수에서 상기의 진폭으로 낼 수 있는 초음파와 상응하는 정도라면 당업자가 임의로 주파수와 진폭을 변형시킬 수 있다. 상기 주파수 및 진폭 범위내에서 콜라겐의 분리 수율이 우수하며 콜라겐의 가수분해물이 아닌 생체내에서 기능하는 콜라겐 그대로를 얻을 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 콜라겐의 분리 수율의 상승이 미미하여 비효율적이다.

상기 초음파 처리는 0.1 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. 0.1 시간 미만으로 초음파 처리를 수행하는 경우 콜라겐의 분리 수율이 낮을 수 있으며, 24 시간을 초과하는 경우 콜라겐의 분리 수율은 상승하지 않으면서 처리 시간만 길어지는 단점이 있다.

본 발명의 콜라겐 분리 방법은 상기 콜라겐 추출 단계 후에 원심분리 단계; 및 분리 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 원심분리 단계는 상기 콜라겐 추출 단계 후에 얻어진 용액을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계이다. 추출 용액을 원심분리하여 상등액을 취함으로써 산성 용액에 용해되어 있는 콜라겐을 보다 고농도로 수득할 수 있다.

구체적으로, 추출 후 콜라겐이 용해되어 있는 용액을 5,000 내지 10,000 rpm 으로 5 내지 20 분간 원심분리하여 이의 상등액만을 취할 수 있다.

상기 분리 단계는 상기 원심분리 후 얻어진 상등액에 염화나트륨(NaCl)을 가하여 침전시키고 침전물을 투석하는 단계이다. 염화나트륨으로 상등액내에 용해되어 있는 콜라겐을 침전시키고 정제과정을 거쳐 순수한 콜라겐을 얻을 수 있다.

구체적으로, 상기 원심분리 후 얻어지는 상등액에 약 5 중량%가 되도록 염화나트륨을 가하여 콜라겐을 침전시키고 이를 정제수로 투석하여 콜라겐을 얻을 수 있으며, 이 때 얻어진 콜라겐은 동결건조하여 사용할 수 있다.

이하, 실시예와 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이는 본 발명의 설명을 위한 것일 뿐 이로 인해, 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.

< 준비예 > 시료의 전처리

시료는 (주)오성양어장으로부터 농어의 냉동어피 및 옥돔 어린(비늘)을 제공받아 사용하였다. 어피는 일부 안쪽에 잔존하는 농어근육과 비늘을 제거한 후 얼음물에 세척하여 불순물을 제거하였으며, 1.0 cm×1.0 cm의 크기로 세절하였다. 어피에 붙어있는 염용성 단백질을 완전히 제거하기 위하여 어피 중량에 대하여 20배의 0.5 M NaCl 용액을 가한 후 잘 교반하여, 6,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이와 같은 조작을 3회 반복하였으며, 모든 조작은 4 ℃이하에서 행하였다. 원심분리로 얻어진 침전물을 다시 4 ℃이하에서 보관한 정제수로 세척한 후, 침전물에 대하여 약 20 배 중량의 냉 에탄올을 첨가하여 4 ℃에서 24시간동안 교반하면서 탈지하여 이를 정제시료로 하였다. 정제시료는 -20 ℃이하에서 보관하면서 필요시 꺼내어 사용하였다. 한편 어린은 불순물을 제거한 후 수세하여 -20℃에 보관하면서 사용하였다.

< 실시예 1 내지 4> 초음파 처리에 의한 콜라겐의 분리

상기 준비예에서 준비된 시료에 약 200 배 중량의 0.01 내지 0.5 M 의 아세트산을 가한 후, 4 ℃에서 하기 표 1 의 조건으로 초음파 처리를 하였다. Pulse on/off 는 20 sec/20 sec 로 하였다. 초음파 처리 후 얻어진 점성의 용액을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 분리하고 상등액에 NaCl을 5 wt%가 되도록 첨가하여 백색침전을 얻었다. 상기 백색침전을 원심분리하고 정제수로 투석 후, 동결건조하여 콜라겐을 추출하였다.

구분		Amplitude (%)	아세트산 농도 (M)
실시예 1	실시예 1-1	20	0.01
	실시예 1-2		0.1
	실시예 1-3		0.5
실시예 2	실시예 2-1	40	0.01
	실시예 2-2		0.1
	실시예 2-3		0.5
실시예 3	실시예 3-1	60	0.01
	실시예 3-2		0.1
	실시예 3-3		0.5
실시예 4	실시예 4-1	80	0.01
	실시예 4-2		0.1
	실시예 4-3		0.5

< 비교예 1 내지 4> 산 가용성 콜라겐의 분리

시료 중량에 대하여 하기 표 2 의 조건으로 200 배량의 0~0.5 M 아세트산을 첨가하여 4 ℃에서 24시간 동안 교반하면서 추출하였다. 얻어진 점성의 용액을 6,000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 상등액을 분리하고 상등액에 NaCl을 5 wt%가 되도록 첨가하여 백색침전을 얻었다. 상기 백색침전을 원심분리하고 정제수로 투석 후, 동결건조를 하여 콜라겐을 추출하였다.

구분	아세트산 농도 (M)
비교예 1	0
비교예 2	0.01
비교예 3	0.1
비교예 4	0.5

< 실험예 1> 콜라겐 수율의 측정

상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 시료를 15,000×g에서 20분간 원심분리 하여 얻은 상등액을 Biuret법(Gornall, A, G.등, 1949)을 이용하여 단백질 함량을 측정하였다. 콜라겐 수율은 총 단백질 함량에 대한 초음파 처리 후 단백질 함량의 비로 다음과 같은 식에 의해서 산출하였다.

콜라겐 수율(%) = (상등액 중의 단백질 농도/총단백질 농도)×100

처리 시간에 따른 콜라겐 수율은 도 1 내지 도 5 에 나타내었다. 도 1 내지 4 는 실시예 1 내지 4 의 아세트산 농도에 따른 콜라겐의 수율을 나타내며, 도 5 는 비교예 1 내지 5 의 산 농도에 따른 콜라겐의 수율을 나타낸 것이다.

도 1 내지 4 에 의하면 초음파 처리를 함으로서 초음파 처리를 하지 않은 도 5 과 비교하여 콜라겐의 수율이 빠르게 증가하는 것으로 나타났다. 더욱이 Amplitude가 커짐에 따라서 증가하는 속도가 빠르게 나타났다. 도 5 에 의하면, 초음파 처리를 하지 않고 0.01 M 의 낮은 농도의 아세트산으로만 처리하는 경우에는 거의 콜라겐이 분리되지 않았으나, 도 1 에 의하면, 20 kHz에서 Amplitude 20 %의 초음파로 처리하였을 경우 0.01M 의 저농도 아세트산하에서도 콜라겐의 분리양이 증가하기 시작하였다. 또한, 도 2 내지 4 에 의하면 농도가 높아질수록 콜라겐의 증가폭도 더욱 크게 나타났으며, 같은 조건하에서 Amplitude가 높을수록 그 증가속도는 더욱 빠르게 나타났다. 따라서, 콜라겐의 분리능은 아세트산의 농도 및 초음파 Amplitude에 의존하여 증가하는 것으로 보인다.

< 실험예 2> 콜라겐의 최대 수율 측정

상기 실험예 1 과 같은 방법으로 콜라겐의 수율을 측정하고, 수율이 증가할 때 그 속도(k_i)를 다음의 식으로 산출하였다.

K_i = (n_t-n_o)

여기서, n_t: 초음파 처리 t 시간 후의 용해도

n_o:초음파 처리 전의 용해도

t:초음파 처리 시간

그 결과는 도 6 및 7에 나타내었다. 도 6 은 실시예 1 내지 4 의 산성 용매하에서 초음파로 처리한 경우 및 비교예 1 내지 4 의 산성 용매로만 처리한 경우의 콜라겐 최대 수율을 나타낸 것이다. 도 6 에서 각각의 기호는 0%(●), 20%(○), 40%(▼), 60%(▽) 및 80%(■) amplitude를 나타낸다. 도 7 은 콜라겐 수율의 증가 속도를 나타낸 것이다.

도 6 에 의하면, 아세트산의 농도가 증가할수록, 초음파의 amplitude가 증가할수록 콜라겐의 최대 수율도 높게 나타났으며, 아세트산의 농도가 0.1 M 일 때 최대 수율과 0.5 M 일 때 최대 수율은 유사하여 아세트산의 농도가 0.5 M 이상으로 증가하여도 최대 수율의 증가는 미미할 것이라는 것을 짐작할 수 있다. 또한, 아세트산을 첨가하지 않고 초음파 처리를 하는 경우에도 콜라겐의 분리는 거의 일어나지 않았다. 산성 용매로만 처리하는 비교예의 경우에도 아세트산의 농도가 증가함에 따라 최대 수율도 증가하였으나, 초음파 처리를 병행하는 경우보다 증가속도가 느렸다. 또한, 아세트산의 농도가 0 M 인 경우 콜라겐의 분리가 일어나지 않아 콜라겐의 분리에는 산이 필요함을 알 수 있었다

도 7 에 의하면, 콜라겐 수율의 증가 속도에 미치는 초음파의 Amplitude와 아세트산 농도와의 관계를 상세히 살펴본 결과 어떠한 조건하에 있어서도 직선관계를 나타내었으며 이들의 각각의 관계식은 다음과 같았다. 즉, 0.01 M에서의 아세트산과 Amplitude와의 관계식은 y = 0.0198x + 0.2296, 0.1 M 에서는 y = 0.0418x + 0.6832, 0.5 M 에서는 y = 0.044x + 1.2633을 나타내었다. 이 식에 의하면, 아세트산의 농도에 따라서 기울기가 다르게 나타났으며, 0.01 M 아세트산보다 0.1 M 이상에서 기울기가 증가하여, 0.1 M 이상의 아세트산 존재하에서 콜라겐의 분리가 빠르게 일어나는 것으로 나타났다. 또한, 0.1 M과 0.5 M 아세트산을 비교하면 기울기가 거의 유사하여 0.5 M 이상의 아세트산 농도에서는 아세트산의 농도가 콜라겐의 수율 증가 속도에 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다.

< 실험예 3> 분리된 콜라겐의 SDS - PAGE pattern

상기 실시예 및 비교예에 의해 얻어진 콜라겐의 subunit 조성을 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 검토하였다. SDS-PAGE는 Lammli법(Lammli, V.K. 등 ,1970)에 의하여 7.5% slab gel을 이용하여 수행하였다. 상기 실시예 및 비교예에서 분리된 콜라겐 시료에 8 M urea, 2 % mercaptoethanol, 2% SDS와 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가하여 용해하고, 100 ℃에서 2분간 가열하였다. Fixing과 staining은 Neuhoff(Neuhoff V. 등 1988)의 방법에 의해 Coomassie brillant blue를 이용하여 실시하였다. Amplitude 20% 의 초음파로 처리한 실시예 1 및 amplitude 60% 로 처리하여 얻은 실시예 3 의 결과는 도 8 에 나타내었으며, 아세트산의 농도를 달리하여 처리한 비교예 2 내지 4 의 결과는 도 9 에 나타내었다.

도 8 에 의하면, 0.01 M 아세트산의 존재하에서 20 % amplitude 초음파로 처리한 경우 3시간 후에 콜라겐에 상당하는 성분이 관찰되기 시작하였으며, 초음파 처리 시간이 길어질수록 α1, α2 ,β 및 chain이 확실히 관찰되었다. 이와 같은 경향은 아세트산의 농도가 높아지면서 더욱 뚜렷해졌으며 콜라겐의 다량체로 추측되는 성분도 겔의 최상단에서 관찰되었다. Amplitude 60 %로 처리하는 경우 전체적인 경향은 Amplitude 20 %로 처리라는 경우와 같았다. 그러나, 산성 용매 농도의 증가와 초음파 처리 시간이 길어질수록 콜라겐의 분해산물로 추정되는 성분이 관찰되기 시작하였다. 특히 0.5 M 아세트산 하에서 초음파 처리를 24시간 동안 한 경우 콜라겐의 주요 subunit인 α1 및 β chain의 감소가 일어났으며, 이와 함께 겔의 background가 염색되는 불특정의 펩타이드가 생성되는 것으로 관찰되었다.

도 9 에 의하면, 산성 용매만으로 처리하여 분리한 콜라겐의 subunit 조성을 검토한 결과 0.01 M 아세트산하에서는 반응 6시간 후에 콜라겐에 상당하는 α1 및 β chain이 관찰되기 시작하였으며, 24시간 후에는 이들과 함께 α2 및 chain이 관찰되었다. 이와 같은 현상은 아세트산 농도가 높아지면서 더욱 현저히 관찰되기 시작하였으며 반응시간이 지남에 따라 양적으로도 α1, α2 ,β 및 chain이 증가하는 것으로 관찰되었다.

결과적으로, 산성 용매하에서 초음파 처리를 하는 경우 콜라겐에 상당하는 α1, α2 ,β 및 chain이 더 빠르게 증가하여 산성 용매하에서 초음파 처리를 하는 경우 단시간내에 콜라겐의 분리가 일어나는 것으로 나타났다.

< 실험예 4> 콜라겐 분리 시간의 측정

도 5 에 의하면, 0.5 M 아세트산을 첨가하여 콜라겐을 분리하는 경우 약 24 시간 동안 처리하는 경우 전 콜라겐 함량의 약 20% 가 분리된다. 따라서, 처리 시간을 비교하기 위하여 0.5 M 아세트산의 존재하에서 24 시간 콜라겐을 추출하였을 때의 수율과 같은 수율이 될 때까지 아세트산의 존재하에 초음파로 처리하였을 경우 걸리는 시간을 측정하여 그 결과를 도 10 에 나타내었다.

도 10 에 의하면, 0.01 M 아세트산-40 % Amplitude에서는 24시간이 소요되었으나, 0.01 M 아세트산-80 % Amplitude에서는 12시간으로 단축되었다. 또한, 0.1 M 아세트산-40 % Amplitude에서는 12시간, 0.1 M 아세트산-80 % Amplitude에서는 8시간 소요되었으며, 0.5 M 아세트산-40 % Amplitude에서는 8시간, 0.5 M 아세트산-80 % Amplitude에서는 1.5시간 밖에 소요되지 않았다.

결과적으로, 0.01 M 의 소량의 산을 이용하는 경우에도 초음파 처리를 병행하는 경우 0.5 M 아세트산으로 처리하는 것과 동일한 수율을 얻을 수 있었으며, 같은 산성 용매 농도(0.5 M)하에서 초음파 처리를 병행하는 경우(80% amplitude) 처리 시간이 1.5시간 밖에 소요되지 않아 16 배의 시간이 단축되는 것으로 나타났다.

이상의 결과로부터 어피로부터 콜라겐을 분리시 산과 초음파를 병행하는 경우 저농도의 산으로도 동일한 수율을 얻을 수 있어 환경 친화적이며 분리 공정의 신속화도 이루어질 수 있을 것으로 기대된다.

< 실험예 5> 콜라겐의 확인

실시예에서 산성 용매하에서 초음파 처리를 병행하여 분리한 콜라겐이 콜라겐의 형태로 분리되었는지 또는 젤라틴의 형태로 분리된 것인지를 확인하기 위하여 pepsin(1:10,000. Yakuri pure chem., co.. ltd., Japan)에 의한 콜라겐의 소화력을 검토하였다. 콜라겐의 특성은 그 구조가 매우 견고하여 일반적인 소화효소로는 분해가 일어나지 않으며 Collagenase로 분해가 일어나는 것으로 알려져 있다. 그러나 콜라겐이 열에 의해서 젤라틴화가 되면 소화효소로 분해가 일어난다. 따라서, 이와 같은 특성을 이용하여 초음파에 의해서 분리된 콜라겐을 pepsin 처리하여 소화가 일어나면 젤라틴의 형태로 분리된 것이며, 소화가 일어나지 않으면 콜라겐의 형태로 분리되었다고 판단할 수 있다. 콜라겐 농도를 1 mg/ml로 조절한 후 100 ℃에서 5분간 가열하여 젤라틴화하였다. 콜라겐 및 젤라틴의 농도에 대하여 0.5 % pepsin을 첨가하여 10 ℃에서 0?30분간 처리한 후 각각의 시료에 8 M SDS, 2 % mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가하여 100 ℃에서 2분간 가열하여 효소활성을 정지시켰다. 그런 다음 SDS-PAGE(Lammli법)에 의해서 소화 패턴을 분석하였다. 이 때, 콜라겐 표준물질은 Acid soluble Collagen(TypeⅠ, from white rabbit skin., Sigma, USA.)을 사용하였다. 그 결과는 도 11 과 같다. 도 11 에서, No 1 은 기준이 되는 TYPE I 의 콜라겐이며, No 2 는 0.01 M 의 아세트산에서 80% amplitude로 12 시간 초음파 처리하여 분리한 콜라겐이며, No 3, 4, 5 는 이를 펩신으로 처리한 결과이다. No 6 은 No 2 의 콜라겐을 100 ℃로 열처리하여 젤라틴화한 것이며, No 7, 8, 9 는 상기 젤라틴을 펩신으로 처리한 것을 분석한 결과이다. 도 11 에서 각 No. 가 의미하는 바는 다음과 같다:

S: molecular weight marker

No. 1: I type collagen(acid soluble)

No. 2: Collagen of fish skin Isolated by sonication with acetic acid.

No. 3,4,5: Collagen treated with pepsin for 10, 20 and 30 mim.

No. 6: Gelatin obtained from collagen(No. 2) by heating at 100℃.

No. 7,8,9: Gelatin(No.6) treated with pepsin for 10, 20 and 30 mim.

도 11 에 의하면, 산성용매하에서 초음파에 의해서 분리된 콜라겐(No. 2)은 펩신 처리를 하여도 콜라겐의 주요 성분인 α 및 β chain의 변화가 일어나지 않았다(No. 3, 4 및 5). 그러나 콜라겐을 열처리하여 젤라틴화(No. 6) 시킨 후 Pepsin 처리를 하면 콜라겐의 주요 성분인 α 및 β chain이 완전히 소실, 저분자 성분이 증가하는 것으로 관찰되었다(No. 7, 8 및 9). 따라서, 이상의 결과로부터 초음파에 의해서 분리된 성분은 젤라틴 또는 콜라겐의 가수분해물이 아닌 콜라겐인 것으로 확인되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 콜라겐 분리 방법은 저농도의 산성 용매 존재하에서도 고농도의 산성 용매 존재하에서 얻을 수 있는 것과 같은 수율로 콜라겐을 분리할 수 있어 환경친화적이며, 단시간 내에 고수율로 콜라겐을 분리할 수 있어 효율적이다.

또한, 본 발명의 분리 방법에 의해 콜라겐의 가수분해물이 아닌 분자량 30만 이상의 콜라겐으로 추출됨을 알 수 있다.

도 1 내지 도 4 는 실시예 1 내지 4 의 방법으로 콜라겐을 분리하는 경우 콜라겐의 분리 수율을 나타낸 것이다.

도 5 는 비교예 1 내지 4 의 방법으로 분리하는 경우 콜라겐의 분리 수율을 나타낸 것이다.

도 6 은 실시예 1 내지 4 의 방법으로 분리하는 경우 콜라겐의 최대 수율을 나타낸 것이다.

도 7 은 비교예 1 내지 4 의 방법으로 분리하는 경우 콜라겐의 최대 수율을 나타낸 것이다.

도 8 은 실시예 1 및 3 의 방법으로 콜라겐을 분리하는 경우 분리된 콜라겐의 SDS-PAGE pattern 을 나타낸 것이다.

도 9 는 비교예 2 내지 4 의 방법으로 콜라겐을 분리하는 경우 분리된 콜라겐의 SDS-PAGE pattern 을 나타낸 것이다.

도 10 은 0.5M 아세트산으로 24 시간 처리하는 것과 동일한 수율을 나타낼 때까지

산성 용매의 존재하에서 초음파 처리를 한 경우 걸리는 시간을 나타낸 것이다.

도 11 은 분리된 콜라겐과 콜라겐을 젤라틴화 시킨 경우 소화력을 평가하여 나타낸 것이다.

Claims

해양생물 시료에 산성 용매를 가하고 초음파 처리하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출 단계를 포함하고,

상기 초음파 처리가 0 내지 10 ℃에서 수행되고,

상기 초음파의 주파수가 20 kHz이고, 상기 초음파의 진폭(amplitude)이 20 내지 80 % 인 것을 특징으로 하는 마린 콜라겐의 분리 방법.
제1항에 있어서,

상기 산성 용매가 아세트산인 것을 특징으로 하는 마린 콜라겐의 분리 방법.
제1항에 있어서,

상기 산성 용매가 0.01 내지 0.5 M 농도인 것을 특징으로 하는 마린 콜라겐의 분리 방법.
제1항에 있어서,

상기 산성 용매가 처리되는 시료에 대하여 100 내지 300 중량부로 첨가되는 것을 특징으로 하는 마린 콜라겐의 분리 방법.
제1항에 있어서,

상기 초음파 처리가 0.1 내지 24 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 마린 콜라겐의 분리 방법.
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제1항에 있어서,

상기 콜라겐 추출 단계 후에 얻어진 용액을 원심분리하여 상등액을 얻는 원심분리 단계; 및 상기 상등액에 염화나트륨(NaCl)을 가하여 침전시키고 침전물을 투석하는 분리 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마린 콜라겐의 분리 방법.
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