KR102562374B1 - 콜라겐 추출을 위한 해파리 전처리 방법 및 이를 이용한 해파리 콜라겐 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜라겐 추출을 위한 해파리 전처리 방법; 상기 전처리 방법을 이용하는 해파리 콜라겐 추출 방법; 및 상기 추출 방법으로 추출된 해파리 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 해파리 전처리 방법을 통해 해파리의 수분을 최소화하여 콜라겐 추출 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 생산비용을 절감하고 대량생산을 용이하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 추출 방법으로 추출된 해파리 콜라겐은 미백 활성, 염증 억제 활성 및 콜라겐 분해효소 MMP-1 억제 활성을 나타내는바, 상기 해파리 콜라겐을 포함하는 조성물은 피부 상태 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

콜라겐 추출을 위한 해파리 전처리 방법 및 이를 이용한 해파리 콜라겐 추출 방법 {A Jellyfish Pretreatment Method for Collagen Extraction and a Method of Extracting Jellyfish Collagen by Using the Same}

본 발명은 콜라겐 추출을 위한 해파리 전처리 방법; 상기 전처리 방법을 이용하는 해파리 콜라겐 추출 방법; 및 상기 추출 방법으로 추출된 해파리 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

고령화 시대를 맞이하여 건강식품 시장 규모는 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 특히, 중장년층을 중심으로 미용, 안티에이징, 건강유지 관리에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이중 콜라겐은 안티에이징에 대한 대명사로 취급되고 있다. 현재 콜라겐은 섭취하는 콜라겐과 화장품용 콜라겐으로 크게 나뉘고 있으며, 섭취용으로는 콜라겐 펩타이드를 활용한 젤리, 분말, 음료, 캡슐 등이 있으며, 화장품으로는 펩타이드 및 콜라겐을 활용한 고급 화장수, 비누, 고급 크림류 등이 시중에 유통되고 있다. 국내 콜라겐(원료) 소비량은 연간 3,000톤으로 약 3,000억원에 이르고 있으며, 이와 관련된 제품의 시장규모는 8,000억원이 넘을 것으로 추산되고 있다. 그러나 콜라겐 원료의 대부분은 외국으로부터 수입에 의존하고 있으며, 특히 고급 화장품 및 의약품으로 활용되고 있는 콜라겐 고유의 구조를 지니고 있는 고분자 콜라겐은 수입에 의존하고 있는 실정이다.

한편, 해파리에는 콜라겐이 포함되어 있어 콜라겐을 추출할 수 있는 소재로 사용되고 있으며, 해파리 콜라겐은 다른 동물성 콜라겐과는 다른 독특한 특성을 가지고있다. 축산물 및 어류 유래의 콜라겐은 경질조직을 형성하고 있고, 주로 껍질에 가장 많이 분포되어 있으며, 뼈 및 비늘 등에도 포함되어 있다. 이 콜라겐은 대부분 I형 콜라겐인 것으로 알려져 있으며, 산가용성 콜라겐인 것으로 보고되고 있다. 반면 해파리 콜라겐은 연질 조직을 형성하는 주요 단백질로서 II형 또는 IV형인 것으로 알려져 있다. I형 콜라겐과 해파리 유래 II형 콜라겐은 모두 섬유성 콜라겐이나, 분자량에 있어서 각각 30만과 40만 달톤으로 약 10만 달톤의 분자량 차이가 있다. 해파리 콜라겐의 생리활성은 I형 콜라겐과 비교하였을 때 보습력이 우수하고, 장벽(barrier) 강화에 의한 피부 보호, 수분 증발 억제 및 노화방지 효과가 우수한 것으로 알려져 있다.

해파리는 평균적으로 약 95∼99%가 수분이며, 약 1∼2%가 콜라겐인 것으로 알려져 있으나, 해파리는 내인성 효소가 포함되어 있어 사후 자가분해가 급격히 일어난다. 이러한 문제를 해결하기 위해 산(acid)을 이용한 추출법, 방사선 조사를 이용한 추출법 등 해파리로부터 콜라겐을 추출하는 방법에 대한 연구가 보고되고 있으나, 추출 효율성이 떨어지거나 생산 시설 및 비용 문제로 인해 실질적으로 사용하기 어렵다는 단점이 있어, 추출 효율이 높고 생산비용이 절감되며 해파리의 수분을 최소화하여 순도 높은 해파리 콜라겐을 추출할 수 있는 방법에 대한 개발이 필요한 실정이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 콜라겐 추출을 위한 해파리 전처리 기술이 해파리의 수분을 최소화하여 콜라겐 추출 효율을 높이고 생산비용을 감소시켜 용이하게 해파리 콜라겐을 대량생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-2080138호 대한민국 공개특허 제10-2018-0058875호

본 발명의 목적은 해파리를 명반(KAl(SO₄)_2·12H₂O) 및 프로테아제 억제제로 처리하는 단계를 포함하는 해파리 전처리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 전처리 방법에 의해 전처리된 해파리에 산성용매를 가하여 초음파를 처리하는 단계를 포함하는 해파리 콜라겐 추출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 해파리 콜라겐 추출 방법에 의해 추출된 해파리 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 해파리를 명반(KAl(SO₄)_2·12H₂O) 및 프로테아제 억제제로 처리하는 단계를 포함하는 해파리 전처리 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "해파리"는 몸의 구조나 생식선 등의 위치에 따라 크게 자포동물문(Cnidaria)과 유즐동물문(Ctenophora)으로 분류되는 동물로, 일반적으로 반구형, 원반형, 종형, 돔형 등의 삿갓형태의 한천질로 된 우산의 밑 변두리에 다수의 촉수가 늘어져 있는 형태를 가지고 있다. 촉수에는 독침을 가진 세포가 있고, 몸의 대부분이 수분으로 이루어져있다. 국내 연안에 서식하는　해파리로는 기수식용해파리(Rhopilema esculentum), 보름달물해파리(Aurelia aurita), 무희나선꼬리해파리　(Spirocodou saltatrix), 관사르스해파리　(Sarsia Tubulosa), 오이빗해파리　(Beroe cucumis), 평면해파리(Aequorea coerulescene), 커튼원양해파리(Chrysaora pacifica), 네잎백합해파리(Liriope tetraphylla), 야광원양해파리(Pelagia noctiluca), 가지해파리(Rathkea octopunctata)　등이 있으며, 본 발명에서 사용되는 해파리의 종류는 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 프로테아제 억제제는 에틸렌다이아민 또는 피로인산나트륨(sodium pyrophosphate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 명반 및 프로테아제 억제제로 처리하는 단계는 해파리를 명반 및 프로테아제 억제제로 침지하는 단계를 포함한다. 본 발명에서 상기 침지는 8 내지 24시간, 구체적으로 12시간 내지 24시간인 하룻밤일 수 있다.

본 발명에서 해파리를 명반 및 프로테아제 억제제로 처리하기 전, 해파리를 프로테아제 억제제로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 해파리를 명반 및 프로테아제 억제제로 처리한 후, 해파리를 회수하여 염화나트륨 및 명반으로 염장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 염장시킨 해파리를 세척한 후 알코올을 처리하여 해파리 조직을 탈수시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 알코올 처리 후, 알코올을 증발시키는 건조 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 해파리 전처리 방법으로 해파리를 전처리 하는 단계; 및 전처리된 해파리에 산성용매를 가하여 초음파를 처리하는 단계를 포함하는 해파리 콜라겐 추출 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "해파리"는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "콜라겐"은 동물의 결합조직, 뼈, 힘줄, 피부, 연골, 혈관 등을 구성하는 섬유상 구조단백질이다. 기본적 구조단위는 트로포콜라겐 (tropocollagen)으로 분자량 약 10만의 3개의 폴리펩타이드로 이루어지는 3중 나선구조를 갖고 있는 것을 말하며, 폴리펩티드 사슬 3 개가 서로 수소결합으로 안정화되어 있으나, 가열하면 이들 소수 결합이 절단되어 무작위 코일 상의 젤라틴으로 되어 물성이 변화할 수 있다.

본 발명의 용어 "초음파 처리"는 초음파 에너지가 목적대상의 입자를 진동시켜서 대상을 파괴하거나 비활성화 시키는 것으로, 생화학에서는 세포막을 파괴하여 세포 내용물이 배출되도록 하는 목적으로 주로 사용되며, 가청주파영역(약 20kHz 이하)보다 높은 진동수의 음파를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 산성용매는 염산 또는 아세트산을 사용할 수 있고, 구체적으로 아세트산을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 산성용매는 0.1M 내지 1M의 아세트산일 수 있고, 구체적으로 0.5 M일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 초음파의 주파수는 15 내지 25kHz, 구체적으로 20kHz일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 초음파의 진폭은 20 내지 80%, 구체적으로 60%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 주파수에서 상기의 진폭으로 낼 수 있는 초음파와 상응하는 정도라면 당업자가 임의로 주파수와 진폭을 변형시킬 수 있다. 상기 주파수 및 진폭 범위내에서 콜라겐의 분리 수율이 우수하며 콜라겐의 가수분해물이 아닌 생체내에서 기능하는 콜라겐 그대로를 얻을 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 콜라겐의 분리 수율의 상승이 미미하여 비효율적이다.

본 발명에서 상기 초음파 처리는 1 내지 24 시간 동안 수행될 수 있으며, 구체적으로 3 내지 4시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 해파리 콜라겐 추출 방법은 초음파 처리 단계 후 수득한 용액을 여과하여 여과액에 에탄올 첨가하는 단계; 및 상기 에탄올 첨가 1 내지 24시간 후, 콜라겐 층을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

기존의 해파리 콜라겐 추출 방법에서는 별도의 해파리 전처리 과정 없이 해파리의 척수 및 내장을 제거하고 수세하여 냉동한 뒤, 필요에 따라 이를 해동하여 초음파 처리한다. 초음파 처리 시에는 해파리 무게에 대하여 4배량의 0.5M 아세트산을 첨가하여 초음파 추출액을 수득한 후, 최종농도가 50%가 되도록 알코올을 첨가하여 콜라겐 침전물을 수득한다. 이렇게 전처리 단계가 없는 기존의 해파리 콜라겐 추출 방법을 사용하는 경우, 해파리 중량대비 4배의 추출용매가 들어갈 수 있는 대용량의 탱크가 필요하고, 최종농도 50%의 알코올 농도를 맞추기 위해 다량의 알코올이 필요한바 시설 및 재료를 구비하기 위한 경제적 부담이 크다. 뿐만 아니라, 해파리 전처리 단계 없이는 해파리의 단백질 함량이 0.7%밖에 되지 않기 때문에, 해파리 총 볼륨 대비 0.08%의 콜라겐만 수득할 수 있어 처리량 대비 수율이 극히 낮다. 또한, 전처리 과정 없이 해파리를 동결 저장 후 해동하는 과정에서, 해파리의 내인성 프로테아제에 의해 해파리 형체가 보이지 않을 정도로 분해가 일어나 해파리로부터 콜라겐 추출이 불가능하다. 즉, 본 발명에 따른 해파리 콜라겐 추출 방법은 해파리 전처리 단계 및 초음파 처리 단계를 통해 위와 같은 기존의 문제점을 해결하여, 해파리의 수분을 최소화함으로써 콜라겐 추출 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 생산비용을 절감시키고 대량생산을 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 보름달물해파리의 내장 및 촉수를 제거하고, 0.001 내지 1%의 에틸렌다이아민(ethylenediamine)을 첨가하여 세척하였다. 세척한 해파리에 0.3 내지 0.5%의 명반(KAl(SO₄)_2·12H₂O) 및 0.001 내지 1% 에틸렌다이아민 용액을 해파리 중량에 대하여 같은 양으로 첨가하여 하룻밤 동안 침지시켰다. 해파리를 명반(KAl(SO₄)_2·12H₂O)으로 침지시키면 해파리의 조직이 고정되면서 해파리의 탄력이 유지된다. 침지시킨 해파리를 회수한 후 간단히 수세하였다. 10 내지 15% 염화나트륨(NaCl)과 명반의 비율이 100 : 4가 되도록 혼합한 후, 본 용액을 해파리 중량의 3배로 해파리에 처리하여 1일 동안 염장시켰다. 염장이 끝나면 해파리의 조직은 유지되면서 수분만 빠져나오게 되며, 염장이 완료된 해파리를 회수한 후 간단히 수세하였다. 이어서, 회수한 해파리에 처음에는 50% 에탄올을 2배 첨가하여 탈수하였으며, 최종적으로는 100%의 알코올을 2배 사용하여 1일 동안 탈수시켰다. 마지막으로, 햇빛이 들지 않는 선선한(20℃이하) 장소에서 1일 동안 알코올을 증발시켜 해파리를 건조시켰다. 건조시킨 해파리는 포장하여 냉동고에 보관하였다. 이렇게 전처리가 완료된 해파리에 10배량(W/W)의 0.5M 아세트산을 첨가한 후, 초음파(Frequency: 20 kHz, Amplitude: 60%, Pulse on/off: free, Time: 3 ~ 4 hr, Temperature: 4℃)를 처리하여 추출물을 수득하였다. 이렇게 수득한 추출물을 여과하고, 여과액에 에탄올의 최종농도 50%가 되도록 에탄올을 첨가하여 2 내지 12시간 동안 방치하였다. 방치한 결과, 에탄올을 첨가한 여과액은 뮤신-알코올-콜라겐 층으로 분리되었으며, 뮤신과 알코을층을 제거하여 콜라겐 층만 분리하였다. 콜라겐을 저온에서 냉풍건조시킨 후, 0.5M 시트르산을 첨가하여 1% 콜라겐 용액을 제조하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 해파리 콜라겐 추출 방법에 의해 추출된 해파리 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "해파리" 및 "콜라겐"은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 용어 "개선"은 본 발명에 따른 해파리 콜라겐을 사용하여 피부 상태가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지, 자외선으로부터의 피부 보호, 피부 염증 억제 또는 피부 탄력 유지를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "피부 미백"은 피부에 멜라닌 세포가 증가하고 그로 인해 피부에 멜라닌 색소가 과도하게 침착되는 것을 방지하거나, 기존에 침착된 멜라닌 색소를 엷게 하는 기능을 일컫는다. 이에 따라, 과도한 멜라닌 색소의 침착으로 생기는 기미나 주근깨의 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 용어 "주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부 진피층의 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관한다.

본 발명의 용어 "피부 노화 방지"는 시간이 흐름에 따라 신체의 생리적 변화가 발생하여 나타나는 자연적 노화인 연대학적 노화(내인성 노화)와 햇빛에 노출되는 부위에서 발생하는 광노화(광인성 노화)를 예방 또는 지연시키는 것 모두를 의미한다. 피부 노화를 억제하기 위해서는 피부를 외부의 유해환경으로부터 보호해야 함은 물론 피부세포를 활성화시켜 콜라겐, 엘라스틴 등의 생체 합성 단백질의 합성을 촉진함으로써 주름의 형성을 최대한 억제시켜야 한다.

구체적으로, 본 발명의 피부 노화는 UV-B 자외선으로부터 야기되는 광노화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 햇빛에 포함된 280nm 내지 40nm 파장의 빛에 의하여 피부 세포의 광노화가 진행될 수 있다. 그 중에서도 특히 280nm 내지 320nm 범위의 파장을 갖는 UV-B와 같은 자외선의 조사에 의하여 피부나 섬유의 손상이 발생할 수 있으며 피부가 까맣게 타는 그을음 현상이 발생할 수 있다. UV-B가 조사되면 피부 세포 내의 활성 산소(예: H₂O₂) 및 자유 라디칼의 축적이 촉진되며, 라디칼에 의해 세포 내 신호전달 체계를 자극하여 DNA, 단백질, 지질과 같은 생체 분자에 산화적 스트레스를 유발할 수 있고, 이로 인하여 피부 조직의 손상이 발생될 수 있다. 피부 세포의 산화적 스트레스가 증가하면, 표피의 각질세포나 진피의 섬유아세포에 자극이 발생하고 일련의 세포 내 신호 전달 과정을 거쳐 콜라겐 분해효소인 MMP(matrix metalloproteinase)와 같은 유전자의 발현이 증가될 수 있고, 피부의 주요 구성성분으로 진피의 90%를 차지하며 피부에 강도, 장력을 부여해 외부 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하는 콜라겐(collagen)의 감소가 유발되어, 이에 따라 피부의 노화나 주름이 형성될 수 있다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 티로시나아제의 활성 저해에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 상기 피부 상태 개선은 COX-2 또는 MMP-1의 발현 억제에 의한 것일 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 해파리 전처리 방법에 의해 전처리된 해파리에 산성용매를 가하여 초음파를 처리하는 단계를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 해파리 전처리 방법을 통해 해파리의 수분을 최소화하여 콜라겐 추출 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 생산비용을 절감하고 대량생산을 용이하게 할 수 있다.

본 발명에 따른 추출 방법으로 추출된 해파리 콜라겐은 미백 활성, 염증 억제 활성 및 콜라겐 분해효소 MMP-1 억제 활성을 나타내는바, 상기 해파리 콜라겐을 포함하는 조성물은 피부 상태 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 추출 방법으로 추출한 해파리 콜라겐의 티로시나아제 활성 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 추출 방법으로 추출한 해파리 콜라겐의 COX-2 발현 억제 정도를 나타낸 웨스턴 블랏 결과 및 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 추출 방법으로 추출한 해파리 콜라겐의 MMP-1 발현 억제 정도를 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 해파리 콜라겐 추출

1. 재료

본 실험에서 사용한 해파리는 보름달물해파리로, 해안에서 직접 채취하였다. 채취한 해파리를 내장 및 촉수를 제거하고 10kg씩 비닐봉지에 넣어 밀봉하여 운반한 후, -20℃의 냉동고에서 보관하였다.

2. 해파리 전처리 단계

내장 및 촉수를 제거한 해파리에 0.001 내지 1%의 에틸렌다이아민(ethylenediamine)을 첨가하여 세척하였다. 세척한 해파리에 0.3 내지 0.5%의 명반(KAl(SO₄)_2·12H₂O)을 포함하는 0.001 내지 1% 에틸렌다이아민 용액을 해파리 중량에 대하여 같은 양으로 첨가하여 하룻밤 동안 침지시켰다. 침지시킨 해파리를 회수한 후 간단히 수세하였다. 10 내지 15% 염화나트륨(NaCl)과 명반의 비율이 100 : 4가 되도록 혼합한 후, 본 용액을 해파리 중량의 3배를 첨가하여 1일 동안 염장시켰다. 염장이 끝나면 해파리의 조직은 유지되면서 수분만 빠져나오게 되며, 염장이 완료된 해파리를 회수한 후 간단히 수세하였다. 이어서, 회수한 해파리에 1차적으로 50% 에탄올을 2배 첨가하여 탈수하였으며, 최종적으로는 100%의 에탄올을 2배 첨가하여 1일 동안 탈수시켰다. 마지막으로, 햇빛이 들지 않는 선선한(20℃ 이하) 장소에서 1일 동안 알코올을 증발시켜 해파리를 건조시켰다. 건조시킨 해파리는 포장하여 냉동고에 보관하였다.

3. 초음파 처리에 의한 해파리 콜라겐 추출

전처리한 해파리에 10배량(W/W)의 0.5M 아세트산을 첨가한 후, 초음파를 처리하여 추출물을 수득하였다. 이때, 초음파 처리 조건은 아래 표와 같다.

초음파 처리 조건

Frequency	20 kHz
Amplitude	60%
Pulse on/off	Free
Time	3 ~ 4 hr
Temperature	4℃

이렇게 수득한 추출물을 여과하고, 여과액에 에탄올의 최종농도 50%가 되도록 에탄올을 첨가하여 2 내지 12시간 동안 방치하였다. 방치한 결과, 에탄올을 첨가한 여과액은 뮤신-알코올-콜라겐 층으로 분리되었으며, 뮤신과 알코을층을 제거하여 콜라겐 층만 분리하였다. 콜라겐을 저온에서 냉풍건조시킨 후, 0.5M 시트르산을 첨가하여 1% 콜라겐 용액을 제조하였다.

실험예 1: 해파리 전처리 단계 전과 후의 일반성분 분석

시료의 수분함량, 조단백질함량, 조지방함량 및 회분함량은 A.O.A.C법에 따라 각각 105℃ 상압건조법, semi-microKjeldahl법, Soxhlet법 및 건식 회화법으로 측정하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 해파리 전처리 과정을 통해 해파리의 수분 함량은 감소시키면서 단백질 함량은 대폭 증가시킬 수 있었다.

해파리 전처리 전과 후의 일반성분 분석

성분	함량 (%)
	전처리 전	전처리 후
수분 (moisture)	96.7 ± 0.45	79.8 ± 0.27
조단백질 (crude protein)	0.7 ± 0.05	6.6 ± 0.56
조지방 (crude fat)	0.1 ± 0.03	0.4 ± 0.02
회분 (crude ash)	1.9 ± 0.04	10.8 ± 0.7
탄수화물 (carbohydrate)	0.6 ± 0.03	2.4 ± 0.06

실험예 2: 추출한 해파리 콜라겐의 미백 활성 확인

본 발명에 따른 해파리 콜라겐의 미백 활성을 확인하기 위해, 상기 해파리 콜라겐의 mushroom tyrosinase 활성 억제 효능을 확인하는 실험을 실시하였다. 0.02 mg/ml의 mushroom tyrosinase에 증류수(DW)와 실시예 1의 방법으로 추출된 해파리 콜라겐을 1:1:2의 비율로 넣고 상온에서 10분간 반응시켰다. 비교군으로는 해파리 콜라겐 대신 티로시나아제 활성 저해능을 갖는 것으로 알려진 비타민 C를 사용하였다. 상기 해파리 콜라겐 또는 비타민 C는 12.5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml 및 100 ug/ml로 사용하였다. 이어서, 티로시나아제의 기질로 활용되는 L-DOPA 1 mM을 반응액 중 콜라겐과 동일한 부피만큼 넣고 30분간 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 475 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 해파리 콜라겐을 12.5ug/ml 첨가하였을 때 positive control 100%에 대하여 약 40%까지 티로시나아제 활성을 저해하였으며, 그 이상의 첨가에서는 약 20%까지 빠르게 티로시나아제 활성을 저해하였다. 그러나, 비타민 C는 12.5ug/ml을 첨가하였을 때 약 60%까지 티로시나아제 활성을 저해하였다. 즉, 본 발명에 따른 방법으로 추출된 해파리 콜라겐이 비타민 C보다 티로시나아제 활성 저해 효과 및 피부 미백 활성이 더욱 우수함을 확인하였다.

실험예 3: 추출한 해파리 콜라겐의 염증 억제 효과 확인

본 발명에 따른 해파리 콜라겐의 염증 억제 효과를 확인하기 위해, 상기 해파리 콜라겐의 염증성 발현인자인 COX-2의 억제능을 확인하는 실험을 실시하였다. HDF 세포주를 100 mm 세포 배양 접시 면적의 70 내지 80%를 차지할 때까지 배양하였다. 실험에 FBS의 간섭을 제거하기 위하여 FBS가 들어가 있지 않은 배지로 기존 배지를 교환하였으며, 해파리 콜라겐을 1시간동안 배양한 세포에 처리하였다. 이어서, 태양광 유사 자외선을 26 kJ/cm²강도로 세포에 조사하여 24시간 배양시킨 후, cell lysis buffer를 활용하여 세포내 단백질을 회수하였으며, 웨스턴 블랏 시험법을 통하여 COX-2의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 해파리 콜라겐을 처리한 군에서는 자외선만 조사한 군에 비해 COX-2 발현이 감소함을 확인하였고, 특히 해파리 콜라겐을 40ug/ml 투여한 군에서는 COX-2 발현을 약 50%까지 억제하는 것으로 관찰되었다. 즉, 본 발명에 따른 방법으로 추출된 해파리 콜라겐은 염증성 발현인자인 COX-2의 발현을 억제하는 활성, 보다 구체적으로 자외선에 의한 염증발현을 억제하는 활성이 우수함을 확인하였다.

실험예 4: 추출한 해파리 콜라겐의 피부 탄력 유지 및 피부 노화 억제 효과 확인

본 발명에 따른 해파리 콜라겐의 피부 탄력 유지 또는 피부 노화 억제 효과를 확인하기 위해, 상기 해파리 콜라겐의 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 억제능을 확인하는 실험을 실시하였다. HDF 세포주를 100 mm 세포 배양 접시 면적의 70 내지 80%를 차지할 때까지 배양하였다. 실험에 FBS의 간섭을 제거하기 위하여 FBS가 들어가 있지 않은 배지로 기존 배지를 교환하였으며, 해파리 콜라겐을 1시간동안 배양한 세포에 처리하였다. 이어서, 태양광 유사 자외선을 26 kJ/cm²강도로 세포에 조사하여 24시간 배양시킨 후, cell lysis buffer를 활용하여 세포내 단백질을 회수하였으며, 웨스턴 블랏 시험법을 통하여 MMP-1의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 해파리 콜라겐을 처리한 군에서는 자외선만 조사한 군에 비해 MMP-1의 발현이 감소함을 확인하였고, 특히 해파리 콜라겐을 100ug/ml 투여한 군에서는 MMP-1의 발현이 크게 억제된 것으로 관찰되었다. 즉, 본 발명에 따른 방법으로 추출된 해파리 콜라겐은 피부내 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하는 활성이 우수하여, 피부 탄력 유지 또는 피부 노화 방지에 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (10)

1. 해파리를 프로테아제 억제제로 세척하는 단계,
   세척한 해파리를 명반(KAl(SO₄)₂·12H₂O) 및 프로테아제 억제제로 처리하는 단계,
   명반 및 프로테아제 억제제로 처리된 해파리를 회수하여 염화나트륨 및 명반으로 염장시키는 단계,
   염장시킨 해파리를 세척한 후 알코올을 처리하여 해파리 조직을 탈수시키는 단계, 및
   상기 알코올 처리 후, 알코올을 증발시키는 건조 단계를 포함하는, 해파리를 전처리하는 단계;
   상기 전처리된 해파리에 산성용매를 가하여, 주파수 15-25 kHz, 진폭 20-80% 조건의 초음파를 3~4시간 처리하는 단계;
   상기 초음파 처리 후 수득한 용액을 여과한 여과액에 에탄올 첨가하는 단계; 및
   상기 에탄올 첨가 후, 콜라겐을 분리하는 단계;
   를 포함하는 해파리 콜라겐 추출 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 프로테아제 억제제는 에틸렌다이아민(ethylenediamine)인, 해파리 콜라겐 추출 방법.
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