DE69924719T2

DE69924719T2 - Verfahren zur isolierung und modifizierung von molkeproteinen

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Publication number: DE69924719T2
Application number: DE69924719T
Authority: DE
Inventors: Jouko Savolainen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-04-29
Filing date: 1999-04-28
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2019-04-29
Also published as: ATE292894T1; FI107116B; FI980945A0; US6797810B1; EP1076489B1; AU749685B2; WO1999055170A1; EP1076489A1; FI980945A; DE69924719D1; NZ507646A; AU3712399A; DK1076489T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Proteinen, insbesondere von Molke oder Soja, und zur Modifikation der isolierten Proteine durch Inkontaktbringen der Proteine, insbesondere Molke oder Soja oder ein Konzentrat davon, mit einem Reagenz, welches Sulfitionen bildet, um die Proteine zu sulfonieren.
Im Vergleich mit anderen Proteinen sind Molkeproteine, besser in ihrem Nährwert, insbesondere in ihrem Lysin- und Methioningehalt. Eine Aufbereitung von Molkeproteinen für den menschlichen Verbrauch und funktionelle Nahrungsmittelprodukte würde den Aufbereitungswert von Molke vergrößern und folglich die Rentabilität der Käseherstellung erhöhen. Obwohl Molkeproteine zur Verwendung als Rohmaterial für Nahrungsmittelstoffe gut geeignet sind, sind die größten Hindernisse für ihre Verwendung die Kostspieligkeit der Gewinnungsprozesse und der fraktionierten Isolierungsprozesse sowie variierende und schlechte funktionelle Eigenschaften von Proteinkonzentraten und Isolaten, wie z.B. schlechte Löslichkeits-, Emulgier-, Gelier- und Schäumeigenschaften.
Die Isolierung von Molkeproteinen wird durch ihre gute Löslichkeit erschwert, welche bei pH-Werten von 2 bis 9 nicht durch eine Veränderung des pH beeinflusst werden kann, während die Proteine in ihrer nativen Form sind. Proteine können mit vier Hauptverfahren isoliert werden: 1. Denaturierung durch Hitze und Fällung, 2. Ultrafiltration, 3. Ionenaustausch, und 4. Chemische Modifikation und Fällung.
Das bekannteste Verfahren zur Isolierung von Molkeproteinen ist Denaturierung durch Hitze zusammen mit einer Verringerung des pH zum Sauren. Mit diesem Verfahren kommt ein Protein zu Stande, welches nahezu all seine funktionellen Haupteigenschaften verloren hat. Dieses Protein wird hauptsächlich bei verschiedenen Aufstrichen, z.B. Schmelzkäse, als Teil- oder Vollersatz für Käse verwendet [Hill et al., Can. Int. Food Sci. Technol. J. 15 (1982) 155–160].
Heutzutage werden Molkeproteine hauptsächlich als Proteinkonzentrat unter Verwendung von Ultrafiltration und Trocknen oder als Proteinisolat unter Verwendung von Ionenaustauschadsorptionstechniken und Trocken isoliert. Beide Verfahren ermöglichen eine Isolierung von funktionellen Proteinen. Der entscheidende Faktor bei einer Wahl zwischen diesen Herstellungsverfahren ist die Funktionalität des wiedergewonnenen Produkts und dessen Produktionskosten.
Jedoch gibt es große Schwankungen in Zusammensetzung, Funktionalität und sensorischen Eigenschaften unter Proteinkonzentraten, welche mit den oben beschriebenen Verfahren hergestellt sind, weshalb die Industrie ihre Verwendung vermeidet. Die Schwankungen sind bedingt durch variierende Zusammensetzungen der verwendeten Molke und Unterschiede in den Vorbehandlungs-, Produktions- und Bearbeitungsbedingungen.
Selbst bei Proteinisolaten gibt es Schwankungen unterschiedlicher Eigenschaften infolge der oben beschriebenen Faktoren. Das bei ihrer Herstellung verwendete Ionenaustauschadsorptionsverfahren gleicht die Schwankungen etwas aus und führt schließlich zu einem Produkt, welches sich von der Zusammensetzung des mittels Ultrafiltration erhaltenen Proteinkonzentrats unterscheidet. Es wurde festgestellt, dass die Isolate im Hinblick auf das Protein und den Fettgehalt sowie die Löslichkeit, das Aufschäumen und die Stabilität des Proteins, ein Ausbleiben einer Proteindenaturierung und -aggregation sowie Geschmack deutlich bessere Qualitätseigen schaften und funktionelle Eigenschaften haben, als die Konzentrate. Der relativ hohe Lactose- und Mineralgehalt sowie der schwache Geschmack der Konzentrate sind Faktoren, welche ihre Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie limitieren. Die Verwendbarkeit von Molkeproteinisolaten ist trotz ihrer guten Eigenschaften durch hohe Produktionskosten infolge des Herstellungsverfahrens limitiert.
Es ist auch weithin bekannt, dass durch ein Verändern der Proteinstruktur durch eine chemische Reaktion die räumliche Struktur/Konformation, Ladung und Hydrophobie des Moleküls und folglich sogar einige andere Eigenschaften des Proteins, wie z.B. dessen Löslichkeit, Viskosität, Aufschäumen und Emulgierbarkeit, beeinflusst werden können.
Das zweckmäßigste und einfachste chemische Verfahren zum Modifizieren der Struktur des Proteinmoleküls ist die Sulfonierung, insbesondere Thiosulfonierung, d.d. S-Sulfonierung, was durch oxidative Sulfitoylse erreicht wird. Dadurch werden die Schwefelbrücken, d.h. Disulfidbindungen, zwischen Aminosäureketten des Proteins gespalten, was durch Zugabe von Sulfitionen erreicht wird, was wiederum eine Oxidationsreduktionsreaktion anstößt, bei welcher ein Schwefel zu Sulfonat oxidiert und der andere zu einer anderen Sulfhydrylgruppe reduziert wird.
Durch Zugabe eines weiteren Oxidationsfaktors werden die freien Sulfhydrylgruppen zu Disulfidbindungen reoxidiert, welche wiederum weiter reagieren bis alle Sulfhydrylgruppen sulfoniert oder ein anderer Reaktionsfaktor limitierend wird. Das Prinzip der oxidativen Sulfitolyse wird durch folgende Gleichungen beschrieben: 2RS-SR + 2HSO₃ ^– ↔ 2RS-SO₃ ^– + 2RSH 2RSH + Oxidationsmittel → RS-SR + 2H-Oxidationsmittel RS-SR + 2HSO₃ ^– + Oxidationsmittel → 2RS-SO₃ ^– + 2H- Oxidationsmittel (Totalreaktion)
Hierbei steht RS-SR für ein Proteinmolekül, welches aus zwei Aminosäureketten R besteht, so dass S-S die Disulfidbindung zwischen den beiden Aminosäureketten ist. Sie verbindet die Aminosäureketten und trägt dazu bei, diese in einer bestimmten Position festzuhalten. Die modifizierten Proteinmoleküle können durch Erniedrigen des pH vom pH der Sulfitolysereaktion auf einen pH von 3–5 gefällt werden.
Gemäß der Veröffentlichung Kella, N. K. D., et al., J. Agr. Food Chem. 37 (1989) 1203–1210, wird eine oxidative Sulfitolyse zur Modifikation von Molkeproteinisolatmolekülen verwendet, um die funktionellen Eigenschaften der Proteine, wie z.B. Löslichkeit, Viskosität, Aufschäumen und Stabilität zu beeinflussen. Der die Eigenschaft beeinflussende Faktor war eine Reduktion der Anzahl der Disulfidbindungen, verglichen mit deren ursprünglicher Anzahl. Einhergehend mit der kleiner werdenden Menge der Disulfidbindungen wurden gewisse Eigenschaften entweder verbessert oder verschlechtert. Unter anderem sank die Löslichkeit bereits bei einer Spaltung von 25% der Disulfidbindungen unter 5%, während sich auch die minimale Löslichkeit der Löslichkeits-pH-Kurve veränderte.
Bei der Modifikationsreaktion waren die Konzentrationen: Proteinisolate 1,0%, Sulfit 0,1 M, Harnstoff 4 M und der pH war 7,0 und die Temperatur 25°C. Als Oxidationsmittel wurde durch die Lösung geblasener Sauerstoff verwendet und als Katalysator wurde in einer Konzentration von 800 mM gelöstes CuSO₄ verwendet. In unterschiedlichem Ausmaß modifizierte Proteinisolate wurden durch Fällung mit Ammoniumsulfat isoliert, welches in einer solchen Menge zur Lösung zugegeben wurde, dass es eine zu 50% gesättigte Lösung ausbildete. Die veränderten Löslichkeitseigenschaften wurden bei der Proteinisolierung nicht ausgenutzt.
In der Veröffentlichung Gonzales, J. M., Damodaran, S., J. Food Sci. 55: 6 (1990) 1559–1563, wurde oxidative Sulfitolyse verwendet, um Proteine in roher Süßmolke zu isolieren, in welcher die Proteinkonzentration ungefähr 0,6% war, bei nahezu ähnlichen experimentellen Bedingungen wie oben; pH-Wert 7,0, Sulfitkonzentration 0,1 M, Temperatur 25°C, Sauerstoff als Oxidationsmittel und das Cu²⁺-Ion von CuCO₃ als Katalysator, in diesem Fall jedoch als in eine Glassäule gepackte feste Kugeln. Das Sulfitolyseprodukt wurde durch Rezirkulieren in der mit den vorgenannten Kugeln gepackten Säule zu einem Sulfonatderivat oxidiert. Dann wurden die verbleibenden Kugeln vom flüssigen Reaktionsgemisch durch Zentrifugieren entfernt. Die Autoren zeigten, dass bei den obigen Bedingungen durch bloße Sulfitolyse, d.h. durch Zugabe von 0,1 M Sulfit, nur etwa 0,4 Mol der Disulfid- und Sulfhydrylgruppen in Bezug auf 43000 g Mol Protein in 30 Minuten sulfoniert wurden und es wurde angenommen, dass selbst das auf dem natürlichen Redoxpotential der Molke beruht. Beim Oxidieren mit Sauerstoff unter Verwendung eines Katalysators unter entsprechenden Bedingungen wurden ungefähr 1,5 Mol der Disulfid- und Sulfhydrylgruppen in 3 Minuten und etwa 2,3 Mol in 30 Minuten sulfoniert. Die sulfonierten und mit Kupfer chelierten Proteine wurden durch Fällung bei pH 4,5 als funktionsfähige Proteine isoliert. Jedoch musste vor der Fällung aus der Lösung der im sulfonierten Molkeprotein chelierte Kupfer mit einer EDTA-Behandlung entfernt werden.
Das obige Verfahren war ein komplizierter Arbeitsvorgang im Labormaßstab mit nicht konzentriertem Molkeprotein. Hier konnte das Reaktionsbeschleunigungspotential einer erhöhten Temperatur nicht ausgenutzt werden, weil die Löslichkeit des Sauerstoffs und folglich dessen Konzentration in der Lösung abnehmen, so dass das der reaktionslimitierende Faktor wird. Außerdem limitiert die Anwesenheit vieler Elektrolyten die Löslichkeit des Sauerstoffs weiter und folglich auch die Sauerstoffkonzentration.
Oxidative Sulfitolyse [Kella, N. K. D., et al., J. Agr. Food Chem. 37 (1989) 1203–1210] wurde verwendet, um Sojaproteine, z.B. Glycinin, in kleinere Untereinheiten zu fraktionieren. Glycinin ist aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt, welche wiederum aus zwei Polypeptiden gebildet sind. Die Polypeptide sind miteinander durch eine Disulfidbindung verknüpft, so dass durch eine Spaltung von Disulfidbindungen durch oxidative Sulfitolyse das Protein in kleinere Teile geteilt werden kann, was wiederum die funktionellen Eigenschaften, wie z.B. die Emulsions-, Gelier- und Schäumeigenschaften, beeinflusst, wie in Petrucelli, S., and Anón, M. C., J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 2001–2006, gezeigt wurde.
Sulfitolyse wurde sogar zur Modifikation von Struktur und Konformation eines biologisch aktiven Sojaproteins, des Trypsininhibitors, verwendet, um die Aktivität dieses Proteins zu zerstören, welches den Verdauungsprozessen beim Menschen abträglich ist. Der Trypsininhibitor kann durch Erwärmen inaktiviert werden, obwohl ein Erwärmen für eine Stunde bei 75°C oder ein Erwärmen für 10 Minuten bei 100°C nur etwa 80% des Inhibitors inaktiviert. Ein weiteres Erwärmen erniedrigt den Nährwert des Proteins. Ein Erwärmen von 700 g Sojamehl für eine Stunde in 2,1 Liter 0,5 M Trispuffer, pH 8,5 mit 4,78 g Na₂SO₃ (0,03 Mol) zerstörte die Trypsininhibitoraktivität vollständig. Sulfitrückstände wurden mittels einer dreitägigen Dialyse entfernt. Als Alternative zum Entfernen von Sulfit wurde empfohlen, Proteine am isoelektrischen Punkt bei pH 4,5 zu fällen, ein Verfahren, welches zur Fällung von Sojaisolaten bei der industriellen Herstellung verwendet wird. Bei diesem Vorgehen wird ein Auswaschen des bei der weiter unten dargestellten Reaktion freigesetzten Sulfits in Verbindung mit der Proteinisolierung ausgenutzt.
Die Modifikation der Struktur/Konformation des Trypsininhibitors wurde als auf der durch Sulfit verursachten Spaltung der Disulfitgruppen gemäß der folgenden Gleichung beruhend erklärt: P – S-S – P' + SO₃ ^2– ↔ P – S^– + P' – S – SO₃ ^–.
Danach reagiert das gebildete S-Sulfonat mit einer weiteren Sulfhydrylgruppe, welche bereits vorhanden ist oder bei der gleichen Sulfitolyse gebildet wird, und bildet damit eine neue Disulfidgruppe an einer anderen Stelle des Moleküls. Gleichzeitig wird Sulfit von der S-Sulfonatgruppe gemäß der folgenden Gleichung freigesetzt: P' – S – SO₃ + P – S^– ↔ P' – S – S – P + SO₃ ^–.
Der Gesamteffekt ist die Bildung einer neuen Disulfidgruppe und die Freisetzung nahezu des ganzen Sulfits [Friedman, M., und Gumbmann, M. R., J. Food Sci. 51 (1986) 1239–1241].
Die obigen, auf oxidativer Sulfitolyse basierenden Anwendungen waren entweder nicht darauf ausgelegt, die durch Isolierung gestellten Probleme zu lösen, sondern waren vielmehr darauf ausgelegt bestimmte Eigenschaften von Molke- und Sojaproteinen zu modifizieren, oder eine Verwendung der gewonnenen Lösung ist im Produktionsmaßstab so schwierig anzuwenden, dass sie nicht brauchbar war. Das gleiche gilt für die Verwendung der Sulfitolyse zur Inaktivierung biologisch aktiver Proteine oder zur Modifikation der molekularen Struktur von Soja.
Gemäß dem Patent FI 96 266 "Method for Isolation of Whey Proteins", und der Patentanmeldung FI 944 110 , "Method and Device for Isolation of Whey Proteins", wurden ein Verfahren und ein Prozess entwickelt, mit dem gedanklichen Ziel, Molke-proteine so einfach, zweckmäßig und wirtschaftlich wie möglich zu isolieren und zu fraktionieren und weitestgehend funktionsfähige Proteine herzustellen, deren funktionelle Eigenschaften, z.B. Emulgierbarkeit, Gelierbarkeit und Schäumen enthalten. Die Produkte sind für den menschlichen Verzehr geeignet.
Gemäß der obigen finnischen Erfindung werden Molkeproteine vor Verwendung 4- bis 16-fach konzentriert, so dass ihr Proteingehalt 2 bis 7% Gewicht/Volumen ist. Oxidative Sulfitolyse wird erreicht durch Zugabe einer solchen Menge an Sulfit zum Molkeproteinkonzentrat, dass das Verhältnis von gespaltenen sulfonierten Disulfidbindungen zur ursprünglichen Anzahl von Disulfidbindungen reguliert werden kann.
Eine Oxidation wird nach der Sulfitolyse unter Verwendung einer geeigneten chemischen Zusammensetzung ausgeführt, welche zufriedenstellend für eine Verwendung bei Nahrungsmittelstoffen und kontrollierbar ist, beispielsweise CaO₂, um ein Verwenden von Sauerstoff und eines Katalysators, was mühsam ist, und die damit verbundenen Beschränkungen zu vermeiden. Die Reaktionstemperatur beträgt 30–55°C und der pH der Reaktion ist 5,0–8,5.
Die einmal sulfonierten Molkeproteine können durch Erniedrigen des pH auf 2,5–5,5 gefällt werden. Durch Erniedrigen des pH auf unterschiedliche pH-Niveaus können unterschiedlich zusammengesetzte Fraktionen des Molkeproteins gefällt werden, welche unterschiedliche Anteile an Hauptmolkeprotein, α-Lactalbumin, BSA (Bovine serum albumin) und β-Lactoglobulin haben.
Die bei der oxidativen Sulfitolyse gebildeten S-Sulfongruppen, welche bei der Fällung in saurer Umgebung freigesetzt werden, sowie das restliche Sulfit werden zu Schwefeldioxid umgesetzt, welches mit einem geeigneter, sterilen Gas ausgeblasen und durch Neutralisieren für eine Wiederverwendung rückgewonnen wird.
Die gefällte Proteinfraktion wird durch Mikrofiltration abgetrennt und danach mittels Ultrafiltration konzentriert und gewaschen. Als eine Folge erhält man ein Proteinfraktionskonzentrat, welches einen bestimmten Protein-, Lactose- und Salzgehalt hat. Die Proteine in löslicher Fraktion werden mittels Ultrafiltration konzentriert und gewaschen, um das gewünschte Proteinfraktionskonzentrat rückzugewinnen.
Obwohl bei den oben beschriebenen finnischen Erfindungen die Isolierung von Molkeproteinen in unterschiedlichen Fraktionen vereinfacht wurde und die Isolierung erstmalig in einem größeren Umfang durchgeführt wurde als zuvor wirtschaftlich machbar war, hat der Isolierungsprozess als Ganzes noch immer viele Schritte, welche die Prozesszeit verlängern und die Bearbeitung erschweren, was folglich Kosten verursacht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Modifikation von Molkeproteinen durch Sulfonierung zu vereinfachen und den Fraktioniervorgang und die weitere Aufbereitung der Fraktionen zu beschleunigen. Das wird, wie in den angefügten Patentansprüchen beschrieben, erreicht.
Der vorliegende Erfinder hat erkannt, dass beim Modifizieren von Molkeproteinen die Sulfitolyse als solche eine ausreichende Spaltung von Disulfidbindungen hervorbringt, was folglich eine Oxidation unnötig macht, um die Konformation der Proteinmoleküle zu verändern und diese unter sauren Bedingun gen zu fällen. Ein Weglassen der Oxidation vereinfacht und beschleunigt den Prozess und macht ihn wirtschaftlich profitabler. Falls die Sulfitolysetemperatur für Molkeproteine auf ungefähr 40–65°C eingestellt wird, wird die Reaktion zusammen mit einem Verschieben des Reaktionsgleichgewichts in Richtung der sulfonierten Produkte, was die Menge an benötigtem Sulfit reduziert, beschleunigt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird aus wirtschaftlichen Gründen Molkeproteinkonzentrat verwendet, welches einen Proteingehalt von 9–12 Gew.%, hat.
Gemäß der Erfindung werden eine Modifikation von Molkeproteinen, eine Spaltung von Disulfidbindungen und eine Modifikation der Konformation durch Sulfitolyse erreicht, bei welcher das Sulfition spezifisch mit einem Schwefel der Disulfidbindung reagiert und ein S-Sulfonatderivat bildet. Der andere Schwefel wird zu einer Sulfhydrylgruppe reduziert. Die Sulfite sind löslich und sind Nahrungsmittel unbedenkliches Natriumsulfit, Natriumhydrogensulfit und Natriummetabisulfit. Unter Reaktionsbedingungen bilden alle die oben genannten hauptsächlich Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfit. Die funktionellen und anderen Eigenschaften der Endprodukte können durch eine Sulfitolyse beim Produktionsprozess beeinflusst werden, indem das Verhältnis der Menge des Sulfits zur Menge der im Protein vorhandenen Disulfidbindungen festgelegt wird. Bei der Sulfitolyse von Molkeproteinen ist die Menge an Sulfit 0,02–0,20 M, vorzugsweise 0,05–0,10 M.
Vom Standpunkt einer pH-basierten Fällung brauchen die mittels Sulfitolyse sulfonierten Molke- oder Sojaproteine nicht oxidiert werden, was ein fortgesetztes Sulfonieren zum Sulfonieren aller bei der Sulfitolyse freigesetzten Sulfhydrylgruppen unnötig macht. Die oxidative Sulfitolyse, d.h. Sulfitolyse und Oxidation, ist ein brauchbares Verfahren, wenn die Situation und die Umstände ein Sulfonieren beider Schwefelatome der gespaltenen Disulfidbindungen erfordern.
Um das erfundene Verfahren zu optimieren, müssen auch eine geeignete Reaktionstemperatur, ein geeigneter pH-Wert, bei der Fällung verwendete pH-Werte, die zum Verändern des pH-Werts verwendeten Säuren und Basen, andere Reagenzien und geeignete Vorgänge und Verfahren festgelegt werden, um Produkte mit gewünschten Eigenschaften zu erhalten, welche Proteinkonzentrate oder sprühgetrocknete Pulver sein können.
Gemäß der Erfindung ist die Temperatur der Sulfitolyse 40–65°C. Die Sulfitolyse läuft bei pH 5,5–8,0, vorzugsweise bei 6,0–7,0, ab. Die Reaktionszeit ist 10–50 Minuten, vorzugsweise 20–40 Minuten.
Mit den oben genannten Faktoren können funktionelle Eigenschaften der modifizierten Proteine und Fraktionen und mit dem pH-Wert bei der Fällung die Anzahl der Fraktionen und ihre Zusammensetzung betreffend den α-Lactalbumin-, BSA- und β-Lactoglobulingehalt beeinflusst werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die Proteine im Molkeproteinkonzentrat zuerst durch Sulfitolyse modifiziert und dann wird ein bestimmter Teil der Molkeproteine bei saurem pH gefällt. Die Fällung findet bei pH 1,5–5,5, bevorzugt bei pH 4,0–5,0, und bei einer ausreichend hohen Temperatur, vorzugsweise bei 40–65°C, vorzugsweise bei 50–60°C, statt.
Bei der Fällung oder einem separat geführten Vorgang, dessen pH deutlich auf der sauren Seite liegt, pH 1,5–4,5, werden die bei der Sulfitolyse gebildeten Sulfongruppen und das von der Sulfitolyse verbleibende Sulfit als Schwefeldioxid freigesetzt, welches durch Ausblasen, bevorzugt mit sterilem Gas, steriler Luft oder deren Gemisch mit Stickstoff zu einem Aufnahmebehälter überführt wird, wo es als Gemisch aus Natriumsulfit und Natriumhydrolgensulfit rückgewonnen wird und bei einer späteren Sulfitolyse verwendet werden kann. Das freigesetzte Schwefeldioxid kann folglich wiederverwendet werden, ein Punkt, durch welchen das besagte Rohmaterial eingespart wird, während der Prozess die Umgebung nicht mit Schwefeldioxidemissionen belastet.
Selbst der pH der unfraktioniert zurückgebliebenen Molkeproteine wird zu sauren Werten erniedrigt, bei welchen die Sulfongruppen und verbleibendes Sulfit als Schwefeldioxid freigesetzt werden können, welches wie oben beschrieben ausgeblasen wird.
Falls gewünscht, kann der Fällung ein Fraktionieren nachfolgen, bei welchem das Präzipitat, d.h. das gefällte Protein, vom löslichen Protein mittels eines geeigneten Verfahrens getrennt wird, wobei Mikrofiltration oder Zentrifugieren bevorzugt wird. Falls das Ziel ein modifiziertes Gesamtprotein ist, wird die Trennung weggelassen.
Falls gewünscht, werden die Fraktionen beim pH der Fällung oder in der Nähe desselben mittels Ultrafiltration gewaschen und konzentriert. Vorzugsweise bedeutet Waschen Diafiltration, bei welcher gereinigtes Wasser zu der zu waschenden Lösung oder Suspension hinzugefügt wird und dasselbe wird nach Mischen abgefiltert, so dass niedermolekulare Verbindungen, wie Salze oder Lactose mit dem Filtrat entfernt werden. Der Vorgang kann fortgesetzt werden, bis die gewünschte Zusammensetzung der vorliegenden Fraktion bezüglich Protein-, Lactose- und Salzgehalt erreicht ist.
Der Grad der Modifikation zeigt die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen an. Bei sauren Bedingungen, bei pH 1,5– 4,5, werden die bei der Sulfitolyse gebildeten Sulfongruppen freigesetzt, so dass von der gespaltenen Disulfidgruppe zwei Sulfhydrylgruppen verbleiben. Das modifizierte Gesamtproteinkonzentrat oder die Proteinfraktionskonzentrate oder das davon erhaltene getrocknete Pulver, welche beim Endprodukt verwendet werden, können derart sein, dass die freigesetzten Sulfhydrylgruppen als funktionelle Eigenschaften in vielerlei Hinsicht besser als zuvor genutzt werden können, wie z.B. Emulgierbarkeit, Gelierbarkeit, Schäumen und Hydrolysierbarkeit/Verdaubarkeit.
Freie Sulfhydrylgruppen führen bei geeigneten Bedingungen leicht zu einer Spaltung von Disulfidgruppen, so dass die gebildeten Sulfhydrylgruppen mit anderen vorhandenen Sulfhydrylgruppen neue Disulfidgruppen bilden, was zur Bildung von Proteinnetzen führt, welche in einer Suspension um Wassertropfen eine emulgierende Proteinmembran oder im Schaum das gleiche um eine Luftblase oder ein geeignetes starkes Netz zur Gelbildung bilden.
Die Sulfhydrylgruppen können mit einem Oxidationsmittel, vorzugsweise Sauerstoff, Dehydroascorbinsäure oder allgemein mit Nahrungsmittel unbedenklichen Oxidationsmitteln für Disulfidbindungen, vorzugsweise bei pH 4,5–8,5, vorzugsweise bei pH 6,5–7,5, bei einer Temperatur von 45–75°C, vorzugsweise 50–70°C, durch kräftiges Mischen der Suspension oder der Lösung oxidiert werden, so dass Disulfidbindungen nicht mit denselben Sulfhydrylgruppen wie in der ursprünglichen Konformation des Proteins gebildet werden. Das Endprodukt, d.h. das modifizierte Protein oder Proteinfraktionskonzentrat oder das entsprechende Pulver hat einen höheren pH als das vorangehend beschriebene Produkt, es hat weniger freie Sulfhydrylgruppen und es hat funktionelle Eigenschaften, wie z.B. Dispergierbarkeit, Emulgierbarkeit, Gelierbarkeit und Hydroly sierbarkeit/Verdaubarkeit, entsprechend dem Grad der Modifikation.
Das von den S-Sulfongruppen und Sulfit freigesetzte Schwefeldioxid, welches nicht durch Ausblasen entfernt werden konnte, wandelt sich bei einer pH Erhöhung zu Sulfit um und oxidiert im Reaktor zu Sulfat, wenn Sauerstoff eingeblasen und bei pH 4–7, vorzugsweise bei pH 5–6, und bei einer Temperatur von 45–65°C, vorzugsweise 50–60°C, kräftig gemischt wird. Dabei handelt es sich um eine Oxidation einer kleinen Menge Sulfit, ungefähr 0,01%, zu Sulfat.
Nach einer Ausgestaltung der Erfindung wird die Modifikation, Fraktionierung, Isolierung und eine sonstige Behandlung von Molkeproteinen mit folgenden Schritten erreicht: Molkeproteine werden mittels Ultrafiltration konzentriert, die konzentrierten Proteine werden mittels Sulfitolyse in Struktur/Konformation modifiziert, ein Teil der modifizierten Proteine wird durch Erniedrigen des pH gefällt, bei sauerem pH von Sulfongruppen und Sulfit gebildetes Schwefeldioxid wird aus dem Reaktor ausgeblasen und als Sulfit für eine weitere Sulfitolyse rückgewonnen, die gefällten Proteine werden von löslichen Proteinen mittels Mikrofiltration getrennt, die gefällten Proteine sowie das modifizierten Gesamtprotein werden mittels Ultrafiltration beim pH-Wert der Fällung oder allgemein bei einem saueren pH gewaschen und konzentriert, das Filtrat der Mikrofiltration wird beim pH der Fällung oder darüber gewaschen und konzentriert, alternativ werden die freien Sulfhydrylgruppen des gefällten Proteinkonzentrats, des modifizierten Gesamtproteinkonzentrats und des löslichen Proteinkonzentrats in einer neuen Ordnung zu Disulfidgruppen oxidiert; zusätzlich Waschen und Konzentrieren aller Proteinkonzentrate mittels Ultrafiltration und Gewinnung der Endprodukte als Konzentrate oder getrocknete Pulver.
Ein Konzentrieren der Molke beginnt mittels Mikrofiltration, bei welcher Kaseinpartikel, welche vorhanden sein können, zusammen mit einer Verringerung der Menge der Phospholipoproteine und Bakterien entfernt werden. Als ein Ergebnis der Mikrofiltration wird die Ultrafiltration vereinfacht. Das erhaltene Mikrofiltrationsfiltrat wird durch 6000–30000 D Membranen ultrafiltriert, um die Proteinkonzentration von ursprünglich 0,6% auf 9–12% Proteingehalt zu erhöhen. Ein bevorzugter Proteingehalt des Konzentrats ist 10–11%.
Die Molkeproteinstruktur wird mittels Sulfitolyse modifiziert, bei welcher der gewünschte Teil der Disulfidbindungen gespalten und der gewünschte Grad der Modifikation bezüglich der ursprünglichen Menge an Disulfidbindungen erhalten wird. Bei dieser Ausgestaltung wird eine Sulfitolyse von Molkeproteinen folgendermaßen erreicht:
Die Menge an benötigtem Molkeproteinkonzentrat, bei welchem der Proteingehalt z.B. 10% ist, wird in den Reaktor eingeführt, welcher mit einer effizienten Mischvorrichtung zuzüglich einer Steuerung und einer Einstellvorrichtung für Temperatur und pH ausgestattet ist. Das Konzentrat wird auf eine Temperatur von 40–65°C, vorzugsweise 50–60°C, gebracht. Die Wahl der Temperatur wird unter anderem durch die gewünschte Reaktionsgeschwindigkeit, die verwendeten Chemikalien und die für das isolierte Protein gewünschten funktionellen und weiteren Eigenschaften bestimmt. Zum Proteinkonzentrat wird bei konstanter Temperatur Sulfit entweder als NaH-SO₃, Na₂S₂O₅ oder als Na₂SO₃, 0,02–0,2 M, z.B. 0,05–0,1 M, zugegeben und das Gemisch wird kräftig gerührt. Die Menge an zuzugebendem Sulfit hängt unter anderem von der Proteinkonzentration und dem Grad der gewünschten Sulfitolyse ab. Der pH wird auf 5,5–8, vorzugsweise 6–7, z.B. 6,5, eingestellt. Beim Einstellen des pH werden Nahrungsmittel unbedenkliche Säuren und Basen verwendet, z.B. HCl und NaOH. Die Behandlungszeit der Proteine mit Sulfit ist 10–50 Minuten, vorzugsweise 20–40 Minuten. Die Zeit wird bestimmt durch die Summe der oben genannten Faktoren, um den gewünschten Grad der Modifikation zu erreichen.
Nachdem die gewünschte Modifikation erreicht wurde, werden die Proteine durch Erniedrigen des pH auf 1,5–5,5, vorzugsweise auf 4,0–5,0, gefällt. Der bei der Fällung verwendete pH hängt hauptsächlich von der gewünschten Proteinzusammensetzung für die Fraktionen und etwas vom Grad der Modifikation der Proteine ab.
Die zur Fällung verwendete Zeit ist 10–40 Minuten, z.B. 20–30 Minuten. In einem bestimmten Grad modifizierte Proteine können ungefällt bleiben, falls ein modifiziertes Gesamtprotein gewünscht wird; hier wird der pH direkt zu einem ausreichend niedrigen pH-Wert von 1,5–4,5 erniedrigt, um die Sulfongruppen und überschüssiges Sulfit als Schwefeldioxid freizusetzen, welches mit steriler Luft oder einem Gemisch aus Luft und Stickstoff zu einem Aufnahmebehälter als Gemisch aus Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfit für weitere Sulfitolysen ausgeblasen wird.
Die gefällten Proteine werden von den löslichen mittels Mikrofiltration getrennt. Die gebildeten Fraktionen werden separat bearbeitet.
Von den fraktionierten Proteinen, was der gefällten und der löslichen Fraktion gleichkommt, werden Sulfongruppen und überschüssiges Sulfit bei saurem pH als Schwefeldioxid freigesetzt und wie oben beschrieben aus dem Reaktionsgemisch ausgeblasen.
Die gewonnenen Fraktionen werden gewaschen, um den Salz- und Lactosegehalt zu verringern, und bei einem sauren pH, z.B. bei pH 4,5, bis zum gewünschten Proteingehalt und Lactose- und Salzgehalt konzentriert.
Falls gewünscht, wird der pH einer Fraktion auf 5,5–7,5, z.B. pH 6,5 erhöht, wird sterile Luft eingeblasen, so dass infolge des Mischens die freien Sulfhydrylgruppen Disulfidbindungen an Stellen des Proteinmoleküls bilden, welche sich von den ursprünglichen unterscheiden. Die vorliegende Fraktion kann vor der pH Erhöhung oder danach oder in beiden Phasen gewaschen und konzentriert werden.
Die wie oben beschrieben hergestellten gewaschenen Konzentrate werden auf die benötigte Proteinkonzentration gebracht und sind fertig für eine weitere Verwendung. Die Konzentrate können sogar als Pulver getrocknet werden, welche als solche zur weiteren Verwendung verwendet werden.
Durch alle wichtigen Parameter der Sulfitolyse, d.h. die Proteinkonzentration des Proteinkonzentrats, die Menge an Sulfit, die Reaktionszeit und der pH der Reaktion in verschiedenen Phasen, zuzüglich der in verschiedenen Phasen verwendeten Reaktionszeiten kann die Implementierung verschiedener Teilreaktionen des Isolierungsprozesses sowie das Endergebnis des Prozesses als Ganzes beeinflusst werden, d.h. die Menge an Protein, ihre Zusammensetzung und ihre in den zu isolierenden Fraktionen gewünschten Eigenschaften.
Die folgenden Beispiele erläutern die oben beschriebene Erfindung.
Beispiel 1 (außerhalb des Umfangs der Ansprüche)
Zur Herstellung von Molkeproteinkonzentrat wurde bei der Herstellung von Edamerkäse gebildete frische Molke verwendet. Ihre Proteinkonzentration war 0,6%, welche durch Multiplizie ren des nach dem Verfahren nach Kjeldahl bestimmten Proteinstickstoffs mit der Konstante 6,83 erhalten wurde. Die Molke wurde zuerst durch 0,45 μm Membranfilter unter Verwendung einer Millipore Pellicon Laborausrüstung mikrofiltriert. Das mittels Mikrofiltration erhaltene Filtrat wurde unter Verwendung derselben Ausrüstung durch Filtern durch 10000 D Ultrasfiltrationsmembranen konzentriert, so dass der Proteingehalt des Konzentrats zwischen 8% und 12% variierte.
Zur Modifikation und zum Fraktionieren wurden 0,5 Liter Molkekonzentrat, bei welchem die Konzentration 8,5% Gewicht/Volumen war, in ein 1,0 Liter Becherglas überführt. Der Becher wurde in ein Wasserbad mit Temperaturregulierung gestellt und die Inhalte wurden mittels eines effizienten Mischers gerührt. Die Temperatur des Konzentrats wurde auf 45°C eingestellt.
Die Sulfitolyse wurde durch Zugabe von 2,4 Gramm Na₂S₂Ο₅ (Natriummetabisulfit) zum Proteinkonzentrat eingeleitet und der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde gerührt und die Reaktion wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Danach wurden die modifizierten Proteine durch Erniedrigen des pH auf 4,8 durch Zugabe von HCl zum Gemisch teilweise gefällt. Das das Präzipitat umfassende Gemisch wurde für weitere 15 Minuten gerührt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren in einer Sorvall RC-5B Zentrifuge bei 10000 Upm für 30 Minuten entfernt. Die gefällten Proteine wurden gut abgetrennt, wobei der lösliche Anteil klar blieb. Vom löslichen Anteil, d.h. Überstand, wurde die Proteinkonzentration bestimmt. Durch Abziehen des Proteingehalts des Überstands von der Proteinkonzentration des ursprünglichen Proteinkonzentrats kann, unter Berücksichtigung der Verdünnung beim Aufbereiten, die Proteinverteilung in den gefällten und löslichen Anteilen im Verhältnis zum Gesamtprotein berechnet werden. In diesem Fall war die Menge des gefällten Proteins 21% und die des löslichen Proteins entsprechend 79%.
Beispiel 2
Zur Modifikation und zum Fraktionieren wurden 0,5 Liter Molkeproteinkonzentrat, welches wie oben beschrieben mittels Filtration konzentriert wurde, und bei welchem die Konzentration 10,5% war, in ein 1,0 Liter Becherglas überführt. Die Temperatur des Konzentrats wurde auf 50°C eingestellt und es wurde kräftig gerührt. Die Sulfitolyse wurde durch Zugabe von 2,4 g Natriummetabisulfit zum Proteinkonzentrat eingeleitet und der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde weiter gerührt und die Reaktion wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Danach wurden die modifizierten Proteine durch Erniedrigen des pH auf 5,3 durch Zugabe von HCl zum Gemisch teilweise gefällt. Das das Präzipitat umfassende Gemisch wurde für weitere 15 Minuten gerührt. Das Präzipitat wurde entfernt durch Zentrifugieren bei 10000 Upm für 30 Minuten. Die Menge des gefällten Proteins war 16% und die des löslichen Proteins entsprechend 84%.
Beispiel 3
Zur Modifikation und zum Fraktionieren wurden 0,5 Liter Molkeproteinkonzentrat des vorangehenden Beispiels, bei welchem die Konzentration 10,5% war, in ein 1,0 Liter Becherglas überführt. Die Temperatur des Konzentrats wurde auf 55°C eingestellt und es wurde kräftig gerührt. Die Sulfitolyse wurde durch Zugabe von 2,4 g Natriummetabisulfit zum Proteinkonzentrat eingeleitet und der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde ständig gerührt und die Reaktion wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Danach wurden die modifizierten Proteine durch Erniedrigen des pH auf 4,8 durch Zuga be von HCl zum Gemisch teilweise gefällt. Das das Präzipitat umfassende Gemisch wurde für weitere 15 Minuten gerührt. Das Präzipitat wurde entfernt durch Zentrifugieren bei 10000 Upm für 30 Minuten. Die Menge des gefällten Proteins war 26% und die des löslichen Proteins entsprechend 74%.
Beispiel 4
Zur Modifikation und zum Fraktionieren wurden 0,45 Liter Molkeproteinkonzentrat, bei welchem die Konzentration 9,0% war, in ein 1,0 Liter Becherglas überführt. Das Molkeproteinkonzentrat wurde aus einem 16%igen Konzentrat verdünnt, welches industriell mittels Diafiltration hergestellt wurde, und welches vor Verdünnen durch eine 0,45 μm Membran unter Verwendung einer Minipore Prostak Ausrüstung zum Entfernen jeglicher Kaseinpartikel und zum Reduzieren von Lipoproteinen, mikrofiltriert wurde. Die Temperatur des Konzentrats wurde auf 55°C eingestellt und es wurde kräftig gerührt.
Die Sulfitolyse wurde durch Zugabe von 3,25 g Natriummetabisulfit zum Proteinkonzentrat eingeleitet und der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde ständig gerührt und die Reaktion wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Danach wurden die modifizierten Proteine durch Erniedrigen des pH zuerst auf 5,3 und dann auf 4,8 durch Zugabe von HCl zum Gemisch teilweise gefällt. Das das Präzipitat umfassende Gemisch wurde nach Verringerung des pH für weitere 15 Minuten gerührt bevor eine Probe entnommen wurde. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugieren bei 10000 Upm für 30 Minuten entfernt. Die Menge des gefällten Proteins bei pH 5,3 war 39% und die des löslichen Proteins 61%. Entsprechende Zahlen bei pH 4,8 waren 46% und 54%.
Eine Gelelektrophorese zeigte, dass der bei pH 5,3 fraktionierte lösliche Anteil noch immer etwas BSA (bovine serum al- bumin) zusammen mit β-Lactoglobulin hatte, wohingegen bei pH 4,8 kein BSA und nur β-Lactoglobulin zurückblieb.
Beispiel 5 (außerhalb des Umfangs der Ansprüche)
Zur Modifikation und zum Fraktionieren wurden 0,5 Liter Molkekonzentrat, bei welchem die Konzentration 8,57% war, in ein 1,0 Liter Becherglas überführt. Die Temperatur des Konzentrats wurde auf 60°C eingestellt und es wurde kräftig gerührt. Sulfitolyse wurde durch Zugabe von 4,8 g Natriummetabisulfit zum Proteinkonzentrat eingeleitet und der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde gerührt und die Reaktion wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Danach wurden die modifizierten Proteine durch Erniedrigen des pH auf 4,5 durch Zugabe von HCl zum Gemisch teilweise gefällt. Das das Präzipitat umfassende Gemisch wurde für weitere 15 Minuten gerührt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren bei 10000 Upm für 30 Minuten entfernt. Die Menge des gefällten Proteins war 66% und die des löslichen Proteins entsprechend 34%.
Beispiel 6
In einen 15 Liter Reaktor, welcher mit einer Rührvorrichtung, einer Einstelleinrichtungen für Temperatur und pH sowie mit einer Möglichkeit zur Gaszufuhr im Boden des Reaktors ausgestattet war, wurden 9,0 Liter Molkeproteinkonzentrat zur Modifikation des Molkeproteins überführt, welches mit einer Laborausrüstung mikrofiltiert und mittels Ultrafiltration konzentriert wurde, und bei welchem die Konzentration 11,1% war. Die Temperatur des Konzentrats wurde auf 55°C eingestellt und es wurde kräftig gerührt.
Die Sulfitolyse wurde durch Zugabe von 63 g Natriummetabisulfit zum Proteinkonzentrat eingeleitet und der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde gerührt und die Reaktion wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Danach wurde der pH des modifizierten Proteinkonzentrats durch Zugabe von HCl unter Rühren auf pH 2,0 erniedrigt, wobei bei diesem pH der Hauptteil der Sulfite als Teil der Gleichgewichtsreaktion als Schwefeldioxid freigesetzt, und die an der durch den Grad der Modifikation bestimmten Anzahl von Disulfidbindungen gebildeten S-Sulfonatgruppen werden auch als Schwefeldioxid freigesetzt. Das Rühren wurde für 15 Minuten fortgesetzt. Zum Entfernen von Schwefeldioxid wurde unter kräftigem Rühren für ungefähr eine Stunde sterile Luft mit 3 Litern/Minute in den Reaktor geblasen, dessen Ergebnis ein Entfernen von Schwefeldioxid und Wasserdampf war. Die Schwefeldioxid enthaltende Luft wurde zu einem Aufnahmegefäß geleitet, wo es bei pH 7,0 in Wasser gelöst und zu einem Gemisch aus Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfit neutralisiert wurde. Danach wurde der pH des modifizierten Proteinkonzentrats auf 5,0 erhöht und jegliche kleine Menge an Sulfat, welche selbst nach Ausblasen des Schwefeldioxids verbleiben kann, wurde wie oben beschrieben durch Blasen von steriler Luft in den Reaktor zu Sulfat oxidiert, während etwa 30 Minuten lang gerührt wurde.
Danach wurde das modifizierte Proteinkonzentrat mittels Diafiltration durch 10000 D Ultrafiltrationsmembranen unter Verwendung von 3 Volumen Wasser gewaschen, und mit diesem Vorgang wurde der Lactose- und Salzgehalt auf 1/3 reduziert. Das erhaltene modifizierte Proteinkonzentrat ist in seiner Zusammensetzung ähnlich dem ursprünglichen, jedoch haben sich dessen funktionelle Eigenschaften verändert, z.B. dessen Hydrolysierbarkeit durch Pepsin (Rate der Hydrolyse) 2,2-fach in Bezug zum ursprünglichen Konzentrat in 3 Stunden.
Beispiel 7
7,0 Liter des im Beispiel 4 beschriebenen 9,0%igen Molkeproteinkonzentrats wurden gemäß Beispiel 6 zum Modifizieren und Fraktionieren in den Reaktor überführt. Die Temperatur des Konzentrats wurde auf 55°C eingestellt und es wurde kräftig gerührt.
Die Sulfitolyse wurde durch Zugabe von 32 g Natriummetabisulfit zum Proteinkonzentrat eingeleitet und der pH wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde gerührt und die Reaktion wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Danach wurden die modifizierten Proteine im Proteinkonzentrat durch Erniedrigen des pH auf 4,5 durch Zugabe von HCl teilweise gefällt. Das Gemisch mit dem Präzipitat wurde für weitere 15 Minuten gerührt, um das gefällte und lösliche Protein ins Gleichgewicht zu bringen. Die gefällten Proteine wurden nach Fällung mittels Filtern durch 0,45 μm Mikrofiltrationsmembranen abgetrennt und mit einem Volumen Wasser gewaschen. Das Filtrat wurde rückgewonnen und als erstes Waschwasser für das durch Mikrofiltration erhaltene Filtrat, d.h. das lösliche Protein, verwendet.
Der pH des Präzipitats wurde mit HCl auf 2,0 erniedrigt und das freigesetzte Schwefeldioxid wurde ausgeblasen; danach wurde der pH auf 5,0 erhöht und das Gemisch wieder geblasen, um die kleine Menge an verbleibenden Sulfit, wie im Beispiel 6 beschrieben wurde, zu Sulfat zu oxidieren. Schließlich wurde diese Fraktion mittels Ultrafiltration gewaschen, um den Lactose- und Salzgehalt zu reduzieren und auf eine Proteinkonzentration von 10% konzentriert.
Vom löslichen Anteil wurden Sulfit- und S-Sulfongruppen entfernt, wie oben für den gefällten Anteil beschrieben wurde. Danach wurde der pH auf 4,5 erhöht und das Gemisch wurde mittels Ultrafiltration zuerst mit Waschwasser der Mikrofiltra tion und dann zweifach mit Wasser gewaschen und wurde auf eine Proteinkonzentration von 15% konzentriert.
Beispiel 8
Zur Modifikation von Sojaprotein wurden 70 g Isolat mit 1,0 Liter Wasser in einem 2 Liter Becherglas gemischt. Der Proteingehalt des Sojaisolats war ungefähr 85%. Die Temperatur der Suspension wurde auf 70°C eingestellt und es wurde kräftig gerührt.
Durch Zugabe von 9,5 g Natriummetabisulfit zur Isolatsuspension wurde die Sulfitolyse eingeleitet und der pH wurde mit NaOH auf 6,5 eingestellt. Die Reaktionszeit war 30 Minuten, wobei die Suspension während der ganzen Zeit kräftig gerührt wurde.
Nach der Modifikation wurde der pH der Suspension auf 4,5 erniedrigt, was eine Fällung der Sojaproteine verursachte. Das Präzipitat wurde bei 10000 Upm für 30 Minuten zentrifugiert, wodurch das Proteinpräzipitat am Boden des Röhrchens verblieb, und Salze, z.B. Sulfit und etwas Protein (ungefähr 5%), wurden in der klaren Wasserschicht, d.h. dem Überstand, zurückgelassen. Mit zwei Waschgängen wurde die Menge der Salze signifikant erniedrigt, wobei diese Waschgänge nur Reste von Protein enthielten. Nach dem Waschen wurde der pH auf 2,5 erniedrigt und bei diesem Wert für 15 Minuten gehalten, während gemischt wurde.
Der pH wurde wieder auf 4,5 erhöht, wo das Präzipitat ein weiteres Mal gewaschen wurde und der pH des wie in der ursprünglichen Konzentration gelösten Proteins wurde auf 6,0 erhöht. Das war das Endprodukt, für welches die Trypsininhibitoraktivität und zusätzlich die Größenverteilung der Proteinmoleküle mittels Gelelektrophorese bestimmt wurde. Die Trypsonininhibitoraktivität wurde mit einem in Kakade, M. L., Rackis, J. J., McGhee, J. E., and Puski, G., Cereal Chem. 51 (1974) 376–382 beschriebenen Verfahren bestimmt.
Gemäß der Ergebnisse dieser Bestimmungen hat das Sojaproteinisolat seine (anze Trypsininhibitoraktivität verloren, wohingegen das zum Vergleich verwendete ursprüngliche Proteinisolat in der konzentriertesten und zweit konzentriertesten Probe in der Verdünnungsreihe nach diesem Verfahren aktiv war; die dritt konzentrierteste Probe hatte eine nachweisbare Aktivität. Eine Gelelektrophorese zeigte bei einem Vergleich der Proteinmolekülverteilung des ursprünglichen Sojaisolats mit der des modifizierten Isolats eine deutliche Zunahme von Proteinen mit kleinerem Molekulargewicht, d.h. Teilproteine von größeren Proteinen, im modifizierten Isolat.

Claims

Verfahren zur Modifikation und Isolation von Molkeproteinen, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein Molkeproteinkonzentrat mit 9–12 Gew.% Protein mit 0,02–0,2 M Sulfit in der Form NaHSO₃, Na₂S₂O₅ oder Na₂SO₃ für 10–50 min bei 40–65°C und einem pH von 5,5–8,0 in Kontakt gebracht wird, um das Protein ohne Oxidationsmittel zu verwenden zu sulfonieren, und b) das derart sulfonierte Protein bei einem pH von 1,5–5,5 gefällt wird, und c) das sulfonierte Protein oder das gefällte und/oder lösliche sulfonierte Protein zurückgewonnen und wahlweise weiterverarbeitet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Molkekonzentrat in Kontakt mit dem Sulfitionen bildenden Reagenz gebracht wird, um das Protein bei einer Temperatur zwischen 50–60°C zu sulfonieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei (a) der pH auf 6–7 eingestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass im Stadium (a) die Kontaktzeit 20–40 min beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass beim Sulfonieren im Stadium (a) Sulfit in einer Konzentration zwischen 0,05–0,10 M verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad der Sulfonierung des Proteins durch Verändern der Reaktionsbedingungen und der Menge der verwendeten Reagenzien beeinflusst wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die sulfonierten Proteine als Fraktionen unterschiedlicher Zusammensetzung durch Einstellen des pH gefällt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die sulfonierten Proteine durch Absenken des pH auf 4,0–5,0 gefällt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass von den sulfonierten Proteinen oder von den gefällten und/oder löslichen sulfonierten Proteinen die Sulfongruppen entfernt werden und aus der gleichen Lösung die Sulfite durch Absenken des pH auf ungefähr 1,5–4 entfernt werden, wobei beide als Schwefeldioxid freigesetzt werden und freie Sulfhydrylgruppen im Protein gebildet werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das verbleibende Sulfat zu Sulfat oxidiert wird, indem bei einem pH von 4–7 Luft in das Gemisch geblasen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt c) Disulfidgruppen aus den frei Sulfhydrylgruppen gebildet werden, indem bei einem pH von 4,5–8,5 und einer Temperatur von 45–75°C Luft in das Proteingemisch geblasen wird.