DE3852116T2

DE3852116T2 - Herstellung von Proteinen in aktiver Form.

Info

Publication number: DE3852116T2
Application number: DE3852116T
Authority: DE
Inventors: Malcolm Roy Brandon Ma Brandon; Joseph John Patroni Jo Patroni
Original assignee: Southern Cross Biotech Pty Ltd
Current assignee: Southern Cross Biotech Pty Ltd
Priority date: 1987-06-15
Filing date: 1988-06-14
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2008-06-15
Also published as: JPS6447389A; US4992531A; CN88103725A; DK322188D0; CN1032425C; ATE114156T1; ZA884212B; KR0126767B1; AU1763288A; CA1305284C; NO882635D0; ES2065911T3; DE3852116D1; DK322188A; IE881815L; IE66334B1; NZ225032A; NO882635L; AU609824B2; KR900000380A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Protein in biologisch aktiver oder nativer Form.
Die rekombinante DNA-Technologie stellt potentiell sehr wertvolle Mittel zur Synthese von Mengen erwünschter eukaryontischer (normalerweise Säugetier-)Proteine, wie Hormone, Interferone und Enzyme, zur Verfügung. Obgleich es relativ einfach ist, Organismen, wie Bakterien, zur Gewinnung des gewünschten Proteins zu manipulieren, scheidet der Wirtsorganismus das überschüssige Proteinprodukt möglicherweise in das Kulturmedium ab. Deshalb ist normalerweise eine physikalische oder chemische Lyse der Organismen (z. B. der Bakterien), gefolgt von der mechanischen Isolierung des unlöslichen gewünschten Proteins, erforderlich. Die Solubilisierung des unlöslichen Proteins gemäß dem Stand der Technik wird dann weitergeführt mit hohen Konzentrationen an Denaturierungsmitteln, wie wäßrigem Harnstoff oder Guanidin-Hydrochlorid (Internationale Patentanmeldung WO 83/04418). Somit wurde die Solubilisierung mit durch ein mehrstufiges Verfahren erhaltenen, relativ reinen Formen des erwünschten Proteins durchgeführt. Diese Verfahren sind kapitalintensiv und sollten bei der industriellen Anwendung am besten vermieden werden.
Die US-A-4462940 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von menschlichen B-interferon ähnlichen Polypeptiden aus transformierten Bakterienzellen. Diese Zellen werden konzentriert und getrennt, und die erhaltene Zellpaste wird durch das anionische Tensid SDS solubilisiert.
Hjelmeland, L.M. und Chrambach, A., "Sulubilisation of functional membrane proteins", Methods in Enzymology, Band 104, Seiten 305-318 beschreiben Verfahren zur Solubilisierung von funktionellen Membranproteinen. Dort werden die für die Solubilisierung von Membranproteinen nützlichen Detergentien sowie die die Auswahl der Detergentien beeinflussenden Faktoren diskutiert. Die Verwendung von kationischen Tensiden zur Solubilisierung von Membranproteinen wird nicht offenbart.
Die GB-A-2001326 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Glykoproteinen aus einem Paramyxovirus, wobei das Virus zur selektiven Solubilisierung der Glykoproteinkomponenten mit einem kationischen Detergens behandelt wird. Die Glykoproteinkomponenten werden nach konventionellen Methoden von den restlichen intakten subviralen Partikeln getrennt und können dann in Impfstoffen verwendet werden.
In der EP-A-226448 beschreiben die Anmelder ein überaus vorteilhaftes, wenn auch mehrstufiges, wirtschaftliches Verfahren zur Gewinnung von Proteinen in löslicher Form aus einer unlöslichen Proteinquelle unter Verwendung eines kationischen Tensids. Während dieses Verfahren die effiziente Gewinnung von Proteinen in löslicher Form ermöglicht, ist die eigentliche Gewinnung von aktivem Protein jedoch begrenzt. So liegt z. B. die Gesamtausbeute normalerweise unter 50% Bedeutende Verluste können beim Sammeln von Wirtszellen, bei deren Lyse sowie bei der Konzentration der dadurch freigewordenen Proteinaggregate durch physikalische Konzentrationsverfahren, einschließlich Differentialzentrifugierung, auftreten.
Folglich ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine oder mehrere der sich auf das bekannte Verfahren beziehenden Schwierigkeiten zu überwinden oder wenigstens zu verringern.
Die vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren zur Gewinnung von Protein in solubilisierter Form aus Wirtszellen vor, welches umfaßt:
Bereitstellung von Wirtszellen, die ein unlösliches, durch Synthese oder Expression hergestelltes Protein enthalten;
Bereitstellung wenigstens eines kationischen Tensids; und
Behandlung der Wirtszellen mit wenigstens einem der genannten kationischen Tenside in einer Menge, die ausreichend ist, um die Lyse der Wirtszelle und die anschließende Solubilisierung des unlöslichen Proteins zur Bildung eines solubilisierten Proteins zu bewirken, worin das genannte kationische Tensid ein Kation enthält, das aus der Gruppe der Cetyl-Trimethylammmonium-Kationen, Cetylpyridinium-Kationen, Tetradecyl- Trimethylammonium-Kationen, Dodecyl Trimethylammonium Kationen, der gemischten n-Alkyl-Dimethyl-Benzyl-Ammonium- Kationen sowie der N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3,-Tetramethylbutyl)-Phenoxy]Ethoxy]Ethyl]-benzolmethanaminium- Kationen ausgewählt ist.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren zur Gewinnung von Proteinen die Bereitstellung einer Fermentationsbrühe, die Wirtszellen mit durch Synthese oder Expression hergestelltem Protein enthält, sowie die Isolierung der Wirtszellen daraus. Die Isolierung kann nach jedem geeigneten Verfahren vorgenommen werden. Dies kann durch Flotation, Zentrifugierung, Filtration oder Ultrafiltration geschehen.
Zur Vereinfachung der Lyse kann bei einer bevorzugten Ausführung die Wirtszelle vorbehandelt werden, um die Zelle abzutöten oder die Zellmembran zu schwächen.
Die Lösung des Produktes kann entweder durch Differentialzentrifugierung, durch Differentialpräzipitation, durch Chromatographie oder durch Filtration gereinigt werden. Dadurch werden Verunreinigungen, wie unlösliche unerwünschte Schmutzstoffe, unerwünschte Zelltrümmer und andere unerwünschte Makromoleküle entfernt.
Die Menge des wenigstens einen kationischen Tensids übersteigt vorzugsweise die kritische Mizellenkonzentration.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere anwendbar bei der Solubilisierung und Gewinnung von biologisch wichtigen, durch Mikroorganismen und eukaryontische Zellinien synthetisierten Proteinen, die durch rekombinante DNA-Technologie modifiziert worden sind. Das gewünschte Protein kann einen durch einen Vektor transformierten oder transfizierten Inklusionskörper (Einschlußkörper) in einer Wirtszelle enthalten und eine Genkodierung für ein Protein haben.
Das Protein, das gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen werden kann, kann aus monomeren oder polymeren intrazellulären Proteinen ausgewählt werden, wie man sie in zellulären Inklusionskörpern und zytoplasmischen Aggregaten findet. Die Inklusionskörper können aus biologisch wichtigen Polypeptiden und Peptiden, wie Wachstumshormonen vom Schwein, Schaf und Rind, Interferonen, Immunogenen und Lymphokinen oder heterogenen oder homogenen Polymeren ausgewählt werden.
Vorzugsweise ist das wenigstens eine kationische Tensid in einer Menge von ungefähr 2,5 bis 50% Gewicht/Volumen, insbesondere von 2,5 bis 20% Gewicht/Volumen vorhanden. Die Obergrenze des Tensidgehalts kann variieren und kann durch die Löslichkeit des ausgewählten Tensids beschränkt sein.
Es wurde gefunden, daß es möglich ist, Aggregate von erwünschten Proteinen, die in ganzen Zellen produziert wurden und darin enthalten sind, einschließlich Inklusionskörpern, durch Behandlung der Zelle und ihrer Komponenten mit einem kationischen Tensid in Wasser zu solubiliseren, entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit eines polaren organischen Lösungsmittels. Dieses Verfahren kann schnell sein (5-60 Min.), und die Gewinnung des solubilisierten Proteins kann in sehr einfacher Weise optimal erfolgen. Lediglich kleine Mengen kostengünstiger Reagenzien sind erforderlich, die ohne weiteres verfügbar sind und wiederaufbereitet werden können. So kann z. B. der Großteil des Solubilisierungsmittels Wasser sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch bei einem Verfahren zur Gewinnung von zellulären Proteinen angewendet werden, bei dem Wirtszellen, die das erwünschte Protein einschließen, wenigstens ein kationisches Tensid sowie wenigstens ein polares organisches Lösungsmittel bereitgestellt werden; bei dem die Zelle mit einem Gemisch aus ungefähr 5 bis 70% Volumen/Volumen wenigstens eines polaren Lösungsmittels sowie wenigstens eines kationischen Tensids in einer Menge, die ausreicht, um die Lyse der Zelle und Proteinsolubiliserung ohne wesentliche Änderung der nativen Struktur des Proteins zu bewirken, behandelt wird; worauf das solubiliserte Protein von dem erhaltenen Gemisch abgetrennt wird.
Das Protein kann in einer ein polares organisches Lösungsmittel und geeignete Puffersalze enthaltenden wäßrigen Lösung gehalten werden. Vorzugsweise wird der pH-Wert der Lösung optimiert, um die Löslichkeit des Proteins und die Stabilität der Lösung zu gewährleisten. Die Anwesenheit eines polaren organischen Lösungsmittels, wie z. B. Acetonitril oder Essigsäure, vorzugsweise in einer Konzentration von 5 bis 70%, verändert die Wechselwirkung zwischen dem unlöslichen Protein und dem wäßrigen Lösungsmittel, wobei die Löslichkeit der hydrophoben Bereiche des Proteins begünstigt wird. Die Konzentration des organischen Lösungsmittels liegt vorzugsweise bei 10 bis 20%.
Der Einbau eines kationischen Tensids, z. B. einer quaternären Ammoniumverbindung, in einer die kritische Mizellenkonzentration übersteigenden Konzentration, die ausreichend ist, um die assoziativen Kräfte der Zellwand und der Kräfte innerhalb des Proteinaggregates zu überwinden, fördert die Lyse der Zellen sowie die Segregation, das Aufbrechen sowie die Solubilisierung der Bestandteile des Inklusionskörpers.
Das Verfahren kann bei jeder beliebigen Temperatur über dem Gefrierpunkt der Lösung durchgeführt werden. Bevorzugt wird eine Temperatur zwischen etwa 4 und 25ºC.
Die Zugabe einer wäßrigen Lösung eines geeigneten Tensids zu einem getrockneten Pulver einer von den Wirtszellen stammenden wäßrigen Aufschlämmung ist ebenfalls ein wünschenswertes und effizientes Mittel zur Solubilisierung von zellulären Proteinen. Die Zugabe wenigstens eines kationischen Tensids ist bei Konzentrationen über der kritischen Mizellenkonzentration und innerhalb der Grenzen seiner Löslichkeit und der Wirtschaftlichkeit wünschenswert.
Im Gegensatz zu einem Teil des Standes der Technik können die Proteine in einer milden, fast neutralen Umgebung solubilisiert werden. Ferner werden nur niedrige Konzentrationen des Solubiliserungsmittels benötigt, und diese können leicht entfernt werden. Aufgrund der chemischen Beschaffenheit des Solubilisierungsmittels ist das Gewinnungsverfahren mit späteren Verfahrensschritten kompatibel, im Gegensatz zu den schwierigen Solubilisierungsbehandlungen gereinigter Inklusionskörper nach dem Stand der Technik. Das Solubilisierungsmittel stellte sich als kompatibel mit anderen, bei der Verarbeitung von Proteinaggregaten vorkommenden Bestandteilen heraus, z. B. Dithiothreit, Mercaptoethanol, Glutathion, Cystein, Cystin, Dimethylsulfon, Harnstoff, Thioharnstoff, Natrium- und Kaliumhydroxid, Boraten oder Mineralsäuren.
Der Umfang der Erfindung umfaßt die Verwendung von allen geeigneten kationischen Stickstoff- bzw. Phosphortensiden mit Einfach- oder Mehrfachketten, mit verschiedenen Kopfgruppen, Gegenionen sowie verzweigten oder derivatisierten Kohlenstoffketten.
Wo der Begriff Halogenid erscheint, versteht es sich, daß die Auswahl der Halogenidionen lediglich illustrativer Natur ist; die Identität des Anions ist in diesem Fall unkritisch. So kann z. B. das Halogenid durch andere Anionen ersetzt werden, wie Sulfonate, z. B. p-Toluolsulfonate.
Vorzugsweise ist das kationische Tensid ein Cetyl-Trimethyl- Ammoniumbromid oder ein Cetyl-Pyridiniumchlorid.
Vorzugsweise ist das ausgewählte kationische Tensid ein solches, das im Bereich des ultravioletten Spektrums, in dem eine maximale Polypeptidadsorption besteht, nicht absorbiert, z. B. Cetyl-Trimethyl-Ammoniumbromid.
Die Erfindung bringt bedeutende wirtschaftliche Vorteile bei Reinigungssystemen im großem Umfang.
Das so gebildete flüssige Produkt enthält das gewünschte Protein in löslicher Form. Wo der Verunreinigungsgrad höher als erforderlich ist, können herkömmliche Reinigungsverfahren angewendet werden. Hier sind chromatographische Verfahren besonders brauchbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch den weiteren Schritt der Trennung des solubiliserten Proteins von der erhaltenen rohen Lösung enthalten.
Die Trennstufe kann eine Differentialelution des solubilisierten Proteins durch eine chromatographische Säule, Dialyse, Ultrafiltration, Differentialpräzipitation oder ligandenspezifische Isolierung umfassen. Die chromatographische Säule kann eine Hochleistungs-Flüssigchromatographiesäule (HPLC), wahlweise eine Phasenumkehr-Hochleistungs-Flüssigchromatographiesäule (RR-HPLC) sein. Eine unter der Handelsbezeichnung TSK-GEL (LC) von Toyo Soda Manufacturing Co. Ltd. (Japan) vertriebene Säule sowie die von Beckman Instruments Inc. (Kalifornien, U.S.A.) erhältliche Ultrapore RPSC haben sich als geeignet erwiesen. Aufgrund der Beschaffenheit des Solubilisierungsmittels kann die Trennstufe unter Verwendung anderer bekannter Chromatographieformen durchgeführt werden, einschießlich der Molekularsieb-Chromatographie, z. B. der Gelfiltrationschromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie, der Chromatographie der hydrophoben Wechselwirkung sowie der ligandenspezifischen Chromatographie. Das chromatographische Eluierungsmittel ist vorzugsweise eine wäßrige Lösung eines kationischen, anionischen oder zwitterionischen Tensids. Eine verdünnte Lösung kann verwendet werden. Das kationische, anionische oder zwitterionische Tensid kann in Mengen von etwa 0,25% Gewicht/Volumen bis etwa 2,0% Gewicht/Volumen, vorzugsweise 0,4% Gewicht/Volumen vorhanden sein.
Es versteht sich, daß die chromatographische Trennung auch zur Reinigung des Proteinproduktes dienen kann.
Es versteht sich, daß das erfindungsgemäße Verfahren in einem Verfahren zur Analyse einer Polypeptidprobe verwendet werden kann, wobei die zu testende Probe einem Verfahren zu ihrer Gewinnung unterworfen wird. Die Ergebnisse können eine quantitative Analyse der Zusammensetzung der Polypeptidprobe liefern.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden lediglich anhand von Beispielen erläutert, wobei auffolgende nicht-einschränkende Beispiele sowie auf die begleitenden Daten Bezug genommen wird.

Beispiel 1

Es wurde ein Versuch mit einer Fermentationsflüssigkeit durchgeführt, die transformierte E.coli-Zellen mit Inklusionskörpern enthielt. Die E.coli-Zellen enthielten ein vom Plasmid pMG939 stammendes 1-190AA-Methionin-Schweinewachstumshormon. Die Zellen wurden unter Anwendung von Ultrafiltrationstechniken konzentriert sowie zweimal mit einer wäßrigen Lösung aus Triton X-100 (0,5%) und EDTA (10 mM) und zweimal mit wäßriger EDTA (5mM) gewaschen.
Die Zellen wurden mit wäßrigem Cetyl-Trimethylammoniumbromid (20% Gewicht/Volumen) behandelt, was auch die Lyse der Zellen bewirkte. Die Behandlung fand in einem Reagenzglas statt, wobei das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das Gemisch wurde in einer Beckman Microfuge II zentrifugiert (13000 U/min., 10 Min.), um einen klaren überstand und ein unlösliches Pellet zu bilden. Ein kleiner Anteil des Pellets wurde in L.R. White-Harz eingebracht und eingebettet, und der Blockabschnitt wird zum Vergleich mit dem unbehandelten Material durch Elektronenmikroskopie unterteilt.
Die Ergebnisse zeigten im deutlichen Unterschied zu dem unbehandelten Material, daß nach dem Solubilisierungsverfahren keine Inklusionskörper zu sehen waren.

Beispiel 2

Es wurde ein Versuch mit transformierten E.coli-Zellen durchgeführt, welche die vom Plasmid pMG936 stammende, durch Expression hergestellte Variante des 4-190AA-Schweinewachstumshormons enthielten. Die Zellen wurden aus der Fermentationsanlage genommen und durch Zentrifugieren (9000 g, 5 Min.) konzentriert. Ein Teil des Naßzellenpellets (50 mg) wurde mit N- Lauroyl-N-Methyltaurin-Natriumsalz (3 ml von 13% Gewicht/Volumen) sowie Dithiothreit (3% Gewicht/Volumen) in 0,1 M TRIZMA (pH 10,0), 0,01 M ETDTA kräftig gerührt (1 h). Das Gemisch wurde sodann durch Zentrifugieren geklärt (50000 g, 10 Min.). Eine Immuno-Dot-Blot-Analyse des klaren Überstandes unter Verwendung von Nitrocellulosepapier sowie eines monoklonalen Antikörpers zum Schweinewachstumshormon bestätigte die Anwesenheit und die Solubilisierung in eine Lösung des ursprünglich in der Zelle enthaltenen, durch Expression hergestellten Wachstumshormons. Dieses Beispiel war nicht erfindungsgemäß.

Beispiel 3

Es wurde ein Beispiel mit E.coli-Zellen durchgeführt, die Inklusionskörper mit dem vom Plasmid pMG939 stammenden 1-190AA Methionin-Schweinewachstumshorm enthielten. Die Zellen wurden aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugieren isoliert (9000g, 5 Min.). Ein Teil des nassen Pellets (50 g) wurde sodann in einem Reagenzglas bei 25ºC und in Anwesenheit von 2% (Gewicht/Volumen) Mercaptoethanol mit einer wäßrigen Lösung eines der unten aufgeführten Tenside (3,0 ml von 10 bis 20% in 0,1M TRIZMA, pH 10,0) kräftig gerührt (1h). Wie schön bei früheren Versuchen fand eine beträchtliche Solubilisierung der ursprünglich in den Zellen enthaltenen Inklusionskörper statt.
a) Cetyl-Pyridiniumchlorid.
b) Tetradecyl-Trimethylammoniumbromid.
c) Dodecyl-Trimethylammoniumbromid.
d) gemischtes n-Alkyl-Dimethyl-Benzyl-Ammoniumchlorid (50% C-14, 40% C-12, 10% C-16).
e) N, N-Dimethyl-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3- Tetramethylbutyl)-Phenoxy]Ethoxy]Ethyl]benzolmethanaminiumchlorid.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Protein in löslicher Form aus Wirtszellen, welches umfaßt:

Bereitstellung von Wirtszellen, die ein unlösliches, durch Synthese oder Expression hergestelltes Protein enthalten;

Bereitstellung wenigstens eines kationischen Tensids; und

Behandlung der Wirtszellen mit wenigstens einem der genannten kationischen Tenside in einer Menge, die ausreichend ist, um die Lyse der Wirtszelle und die anschließende Solubilisierung des unlöslichen Proteins zur Bildung eines solubilisierten Proteins zu bewirken, worin das genannte kationische Tensid ein Kation enthält, das aus der Gruppe der Cetyl-Trimethylammonium-Kationen, Cetylpyridinium-Kationen, Tetradecyl- Trimethylammonium-Kationen, Dodecyl-Trimethylammonium- Kationen, der gemischten n-Alkyl-Dimethyl-Benzyl-Ammonium- Kationen sowie der N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3,-Tetramethylbutyl)-Phenoxy]Ethoxy]Ethyl]-benzolmethanaminium- Kationen ausgewählt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das unlösliche, durch Synthese oder Expression hergestellte Protein aus der Gruppe der Wachstumshormone, Interferone, Immunogene und Lymphokine ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das genannte, wenigstens eine kationische Tensid in einer Menge von ungefähr 2,5-50% Gewicht/Volumen vorhanden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das kationische Tensid Cetyl-Trimethylammoniumbromid ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das wenigstens eine kationische Tensid in einer die Mizellenkonzentratin übersteigenden Menge vorhanden ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin die Stufe der Trennung des solubilisierten Proteins umfaßt, wonach die Trennstufe aus der Gruppe, bestehend aus der Differentialelution des solubilisierten Proteins durch eine chromatographische Säule, durch Dialyse, durch Ultrafiltration und Differentialpräzipitation, ausgewählt ist.