CN102965317A - 一种产牛磺酸菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产牛磺酸 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了一种产牛磺酸菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产牛磺酸，属于生物工程技术领域。本发明菌株首先将土壤经过沸水浴后稀释涂布，染色镜检获得有芽孢菌株，然后对筛选出的菌株采用一级发酵逐一摇瓶培养，发酵液中加入牛磺酸标准品作为内标，采用高效液相色谱法进行定性分析筛选，并对筛选菌株进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定，最终获得一株高产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。本发明同时公开一种采用该菌株生产牛磺酸的方法，采用本方法发酵72h牛磺酸产量为1g/L。

Description

一种产牛磺酸菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产牛磺酸

技术领域

一种产牛磺酸的枯草芽孢杆菌的筛选方法及应用该菌株生产牛磺酸，属于生物工程领域，特别是一株产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。

背景技术

牛磺酸(Taurine)是动物体内的一种含硫氨基酸，又称牛胆碱、牛胆素，其化学结构式为H₂N-CH₂-CH₂-SO₃H，化学名称为2-氨基乙磺酸。它广泛分布于生物体内各组织、器官，主要以游离状态存在于组织间液和细胞内液中，因最先从牛胆汁中分离出来而得名。1954年Stern和Moore首次在脑和脊髓中发现了牛磺酸。但长期以来一直被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物^[1]。1976年Hayes等首次报道用以酪蛋白为主要蛋白来源但缺乏牛磺酸的饲料喂猫，可引起猫的视网膜变性，若长时间缺乏，可使猫失明，从而引起了人们对牛磺酸营养作用的极大关注。研究发现，牛磺酸是调节机体正常生理活动的活性物质，具有维持正常视觉功能、维持机体渗透压平衡，调节细胞钙平衡，与细胞膜的流动性有关，降血糖、调节神经传导、参与内分泌活动、调节脂类消化与吸收、增加心脏收缩能力、提高机体免疫能力、增强细胞膜抗氧化能力、保护心肌细胞等广泛生物学作用。

牛磺酸在临床上已被广泛应用于心血管疾病、高胆固醇血症、眼部疾病、糖尿病、早老性痴呆和肝病等一系列疾病的治疗。在食品领域，牛磺酸的已经成为多种食品营养强化剂和添加剂的主要活性成分，作为食品添加剂，其可被添加到乳制品、饮料、豆制品等食品中。目前，世界上牛磺酸的年消耗量已超过1.5万吨/年，其中80％以上用作食品营养添加剂。我国生产的牛磺酸主要用于出口、医药以及食品，其中出口量约占90％，作为食品添加剂仅占6％，而美国仅在饮料食品中作营养强化剂一项消费就近每年1万吨。随着国内人民生活水平和健康意识的提高，牛磺酸作为营养保健品和强化食品添加剂将越来越受到人们的重视，市场需求趋旺，具有巨大的发展潜力和空间。

由于牛磺酸在天然生物中较分散、量少，从天然生物品中提取的量也很有限。所以目前牛磺酸的获取主要还是靠化工合成。如利用2-溴乙胺氢溴酸盐与Na₂SO₃，反应制备牛磺酸，虽然产率较高，但成本很高，难以实现工业化，而使用低成本的合成方法如2-氯乙胺盐酸盐与Na₂SO₃反应，则收率较低。目前，牛磺酸的生产厂家主要集中在日本、美国、欧洲等发达国家和地区，我国牛磺酸生产工艺陈旧、成本高、产量低，与欧美等发达国家还有很大差距。

早在1988年日本就有专利报道，可用发酵法制取牛磺酸，并同时报道了许多种类的微生物都能生产牛磺酸或其类似物。然而近几十年来，鲜有关于采用微生物发酵法生产牛磺酸的研究报道，仅在2009年Choi Y.J.等报道了采用代谢工程的方法在大肠杆菌中生产牛磺酸。

对采用微生物发酵法生产牛磺酸的研究尚处于初步阶段，仍没用一种可以利用微生物发酵直接生产牛磺酸的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛磺酸生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产牛磺酸。

本发明的技术方案：

1、一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法：

1)枯草芽孢杆菌的初步分离纯化

称取约0.2g土壤于20ml 0.85％无菌生理盐水中，将菌悬液在沸水中振荡加热10min后，迅速冷却至室温。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-8，取10^-6-10^-8稀释菌液涂布于营养肉汤平板上，30℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行结晶紫染色，显微镜下观察芽孢，将有芽孢菌株作为进一步筛选的枯草芽孢杆菌疑似菌株，编号保存；

2)产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选

将上述分离纯化得到的菌种接种于种子培养基中，然后转接到发酵培养基中，培养24h后离心收集发酵液，发酵液经高效液相方法中的内标法进行分析，使得牛磺酸标准品峰高增高的菌株即为产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。

2、根据权利要求1所述一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法，其筛选得到产牛磺酸的枯草芽孢杆菌的鉴定方法如下：

1)形态学鉴定

菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、芽孢染色；

2)生理生化鉴定

接触酶试验，V.P.及M.R.试验，明胶液化及淀粉水解，耐盐耐酸试验，硝酸盐还原试验；

3)16sRNA分子生物学鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组RNA，采用枯草芽孢杆菌16sRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化，连接至克隆载体pMD18T Vector，转化大肠杆菌JM109菌株，利用克隆载体的青霉素抗性筛选获得阳性转化子，并用通用引物对转化子进行质粒PCR鉴定。

阳性克隆测序所得16sRNA序列与GenBank数据库中枯草芽孢杆菌的核苷酸序列进行同源性分析，其与枯草芽孢杆菌的同源性高达99％，结合形态学、生理生化等实验结果将该阳性克隆鉴定为枯草芽孢杆菌，并命名为B.subtilis FMME059。

3、本发明公开的一种牛磺酸的生产方法，其特征是采用B.subtilis FMME059为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产牛磺酸；

1)种子培养：

种子培养基以g/L计：葡萄糖40，胰蛋白胨20，KH₂PO₄1.5，K₂HPO₄，0.5，MgSO₄·7H₂O0.5，生物素50，酵母膏5，尿素3，盐酸硫胺素10，初始PH 7.2-7.4；

培养条件：温度30℃、摇床转速200rpm条件下，培养18-20h；

2)液体发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖20，酵母粉15，尿素15，KH₂PO₄1.5，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.4，MnCl₂·4H₂O MgSO₄·7H₂O0.2，硫酸铵20，初始PH 7.2-7.4；

发酵条件：接种量10％，温度30℃、摇床转速200rpm条件下，发酵72h。

4、牛磺酸产量的测定

根据牛磺酸和2，4-二硝基氟苯(DNFB)进行衍生后在紫外360nm处有吸收峰，采用高效液相测定发酵液中的牛磺酸含量。

发酵液的预处理：取发酵液8000rpm离心10min，收集上清液，并加入15％的三氯乙酸沉淀发酵液中的蛋白(体积比1∶4)，静置1h，8000rpm离心10min，取上清液。

标准曲线的制作：以商品牛磺酸(Sigma公司)作为标准品，配制1000、800、600、400、200mg/L的标准溶液。

柱前衍生：精密量取上述不同浓度的标准品和处理过的发酵液各1mL，分别置于10mL棕色量瓶中，依次加入0.5mol/L的碳酸氢钠溶液1mL(取碳酸氢钠12g，用水溶解并稀释至250mL，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH 9.0)，1％的2，4二硝基氟苯乙腈溶液0.5mL，摇匀，置60℃水浴中避光加热1h后取出，放冷至室温，加磷酸盐缓冲液(pH 7.0，取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1mL，用水稀释至100mL，摇匀，即得)稀释至刻度，摇匀。用0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定牛磺酸的含量。

经过柱前衍生处理，标准品都稀释到原来的10倍，所以标准曲线的最终梯度为100、80、60、40、20mg/L。发酵液经过除蛋白和柱前衍生处理，相当于稀释了50倍。

色谱条件：

色谱柱：反相C18柱250mm×4.6mm，直径5μm

流动相：磷酸盐缓冲液(pH8)∶乙腈(色谱纯)∶水＝70∶20∶10

柱温：35℃；

检测波长：360nm；

进样量：20μL

流速：1mL/min。

标准曲线在20-100mg/L之间呈现良好的线性关系(图1)，回归方程：y＝2.875x-2.976，R²＝0.9990。据此得到72h稀释后牛磺酸产量的值，此值乘以稀释倍数得最终产量为1g/L，如图2。

附图说明

图1牛磺酸标准曲线

图2色谱检测结果，A 60mg/L牛磺酸，B 72h发酵液

具体实施方式

以下是枯草芽孢杆菌(B.subtilis FMME059)筛选、鉴定及发酵生产牛磺酸的实施例。

实施例1

称取约0.2g土壤于20mL 0.85％无菌生理盐水中，将菌悬液在沸水中振荡加热10min后，迅速冷却至室温。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-8，取10^-6-10^-8稀释菌液涂布于营养肉汤平板上，30℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行结晶紫染色，显微镜下观察芽孢，挑选芽孢杆菌进一步发酵复筛。发酵培养基30℃培养72h后离心收集发酵液，发酵液经高效液相色谱法分析，以牛磺酸作内标，使牛磺酸标准品峰高增高的菌株即为产牛磺酸菌株。

实施例2

对筛选的FMME 59菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见表1、2)，并按细菌基因组提取试剂盒提取方法提取基因组DNA，以P1和P2为正向和反向引物：

P1：5′-CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3′，

P2：5′-CGACTTCACCCCAATCATCTG-3′。

用PCR扩增16S rDNA基因，委托华大基因研究中心进行16S rDNA测序，得到本菌株部分16S rDNA序列(GenBank登录号：JX501915)后，在NCBI网站上用BLAST检素工具进行同源性比对分析。基于16S rDNA序列分析和生理生化特性鉴定，结合对该菌的生长和发酵特性研究，认为是枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus.subtilis FMME059。

表1 菌株(BN)与枯草芽孢杆菌菌落形态特征对比

表2 菌株(BN)生理生化鉴定结果

实施例3

菌株保藏于终浓度为15％的甘油管中，取200μL保藏菌液接入50mL种子培养基中进行种子培养，30℃，200rpm培养20h后，以10％的接种量接入50mL发酵培养基进行发酵培养。种子培养基以g/L计：葡萄糖40L，胰蛋白胨20，KH₂PO₄1.5，K₂HPO₄，05，MgSO₄·7H₂O0.5，生物素50，酵母膏5，尿素3，盐酸硫胺素10，初始pH 7.2-7.4；发酵培养基以g/L计：葡萄糖20，酵母粉15，尿素15，KH₂PO₄1.5，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.4，MnCl₂·4H₂O MgSO₄7H₂O0.2，硫酸铵20，初始pH 7.2-7.4。在30℃，200rpm条件下发酵72h，用HPLC测定发酵液中的牛磺酸的含量产量为1g/L。

Claims (3)

1.一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征为：

1)枯草芽孢杆菌的初步分离纯化

称取约0.2g土壤于20ml 0.85％无菌生理盐水中，将菌悬液在沸水中振荡加热10min后，迅速冷却至室温，稀释菌悬液涂布于营养肉汤平板上，30℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行结晶紫染色，显微镜下观察芽孢，将有芽孢菌株作为进一步筛选的枯草芽孢杆菌疑似菌株，编号保存；

2)产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选

将上述分离纯化得到的菌种接种于种子培养基中，然后转接到发酵培养基中，培养72h后离心收集发酵液，发酵液经过预处理后采用内标法经高效液相色谱进行定性分析，使得牛磺酸标准品峰高增高的菌株即为产牛磺酸的枯草芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述一种产牛磺酸枯草芽孢杆菌的筛选方法，其筛选得到产牛磺酸的枯草芽孢杆菌经形态学、生理生化及16sRNA分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌，并命名为Bacillus.subtilis FMME059。

3.一种牛磺酸的生产方法，其特征是采用B.subtilis FMME059为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产牛磺酸；

1)种子培养基以g/L计：葡萄糖40，胰蛋白胨20，KH₂PO₄1.5，K₂HPO₄，0.5，MgSO₄7H₂O0.5，生物素50，酵母膏5，尿素3，盐酸硫胺素10，初始pH 7.2-7.4；

培养条件：温度30℃、摇床转速200rpm条件下，培养18-20h；

2)液体发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖20，酵母粉15，尿素15，KH₂PO₄1.5，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.4，MnCl₂4H₂O MgSO₄·7H₂O0.2，硫酸铵20，初始PH 7.2-7.4；

发酵条件：接种量10％，温度30℃、摇床转速200rpm条件下，发酵72h。

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