CN88103725A - 活性态蛋白质之生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物活性或自然形态蛋白质的制备及其回收方法。该方法包括提供一种含有一种合成或直接获得蛋白质的宿主细胞来源;并应用至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂,并且其用量足以产生加溶效果,来处理该种宿主细胞。
Description
本发明涉及一种生物活性或自然形态蛋白质的制备方法。
重组体DNA(脱氧核糖核酸)技术为合成大量需要的真核生物(通常是哺乳动物)蛋白质提供了极有潜力和价值的手段,这些蛋白质例如有激素、干扰素和酶。虽然已经证明操纵诸如细菌类的有机体来制备所需的蛋白质是比较简易的,但宿主机体可能不把过度生成的蛋白质产物分泌到该培养基中。因此通常就必须使该等有机体(例如细菌)产生物理或化学溶胞作用,随后是以机械法离析出不溶性的目的蛋白质。在已有技术中,然后是采用高浓度的变性剂来进行该不溶性蛋白质的加溶,例如用尿素或盐酸胍的水溶液(国际专利申请WP83/04418)。因此,加溶作用一直是使用得自一种多步骤方法的较纯净形态的目的蛋白质来进行。实施这些方法的投资额高,工业上实施时最好能避免使用此法。
在我们共同提出申请的澳大利亚专利申请66874/86中,申请人描述了应用一种阳离子表面活性剂从一种不溶性蛋白质源中回收一种可溶性形态蛋白质的非常有利、尽管是多步骤但很经济的方法。然而这个方法虽可以有效地回收可溶性形态的蛋白质,活性蛋白质的最后回收率受到限制。例如,其总回收率通常是低于50%。在宿主细胞的收集,它们的溶胞作用以及蛋白质聚集物的提浓中会带来相当大损耗,因此出现了通过物理提浓,包括差速离心在内的方法。
因此,本发明的目的是之一就是要克服或至少是减轻在已有技术中存的的一个或更多个困难。
第一个方案是提供一种回收蛋白质的方法,该方法包括提供一个包 含有一种合成的或直接获得的蛋白质的宿主细胞来源;以及至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂来源;并且应用至少一种该等阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂,以足以产生加溶效应的量,去处理该等宿主细胞。
该种回收蛋白质的方法最好包括提供一种发酵液,其中包括含有一种合成的或直接获得的蛋白质的宿主细胞,并且从其中离析出该等宿主细胞。该离析步骤可以应用任何适当的方法来进行。可以应用浮选、离心、过滤或超滤法。
对于许多种宿主细胞,该阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂还可以具有使这些细胞溶胞的作用。但是,在不能发生这种作用的场合,最好再有一个机械或化学的溶胞步骤。在这种情况下,这种处理是施加于浓缩的、比较不纯的全细胞溶胞产物。
在一个位选的方案中,该宿主细胞可以受到预处理以杀死该细胞或使细胞膜变弱,以便于进行溶胞作用。
在一个优选方案中,按本发明的该回收方法进一步包括以下的同时进行的步骤:
将该等宿主细胞进行溶胞,以形成一种全细胞溶胞产物。
对于如此形成的产物溶液可以应用差速离心、分步沉淀、色谱或过滤法进行提纯。这样将可除掉诸如不溶性的不希望的污染物、不希望的细胞碎片和其他不希望的大分子物质等杂质。
关于该至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的用量,要求超过它们的临界胶束浓度。
本发明特别适用于由微生物和真核生物细胞系列所合成并经重组体DNA技术改性的具生物重要性的蛋白质的加溶与回收。所需的该种蛋白质可包括在一个宿主细胞中的一种内含体,该宿主细胞可以由一个包括该蛋白质的一个基因密码的一种向量所转换或转染。
按本发明可以回收的蛋白质可以选自于单体式和聚合物式细胞内蛋白质,例如在细胞内含体和细胞质聚集物中所存在的蛋白质。该等内含体可以选自具生物重要性的多肽和肽,包括猪、牛、羊生长激素、干扰素、免疫原以及淋巴细胞活素,或者它们的非均质或均质聚合物。
该至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的优选含量是约2.5-50%(重量/体积),最好是2.5-20%(重量/体积)。表面活性剂含量的上限可以变化,并且由所选表面活性剂的溶解度所限。
业已发现,有可能对包括内含体在内的全细胞所制成并含有的目的蛋白质聚集体进行加溶,方法是用一种表面活性剂在水中的溶液处理该细胞及其组分,可以有或没有一种极性有机溶剂存在,或者只用单独的该极性水质溶剂。这个过程可以很快(5-60分钟),并且很容易回收该加溶的蛋白质并达到最优化的效果。只需用少量廉价并且易于得到的药剂,并且可以循环使用。例如,该加溶剂的主体部分可以是水。
按本发明的一项优选方案是提供一种回收细胞蛋白质的方法,该方法包括提供一种包含有该目的蛋白质的宿主细胞源、至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的来源以及至少一种极性有机溶剂的来源;应用由约5-70%(体积/体积)的至少一种极性有机溶剂与至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂并且其量足以产生细胞溶胞作用和蛋白质加溶作用,同时对于该蛋白质结构骨架无显著改变的混合物来处理该细胞;然后从所得的混合物中分离出该加溶的蛋白质。
该蛋白质可以保存在包括一种极性有机溶剂和适当缓冲盐的水基溶液中。最好使该溶液的pH在最优化数值,以保证蛋白质的溶解度及该溶液的稳定性。一种极性有机溶剂,例如乙腈或乙酸的存在,并且较宜浓度在5-70%,则能改变该不溶性蛋白质与该水基溶剂之间的相互作用,从而有利于该蛋白质疏水部分的溶解。该有机溶剂的浓度在10-20%则更好。
此外,加入一种阳离子表面活性剂,例如一种季铵化合物,并且其含量是超过其临界胶束浓度同时是足以克服该细胞壁的缔合力以及在该蛋白质聚集体内部的缔合力,则会带来很大好处,并能促进该细胞的溶胞作用以及该内含体成分的离析、瓦解以及加溶。
该方法可以在高于该溶液结冰点的任何适当温度实施。最适宜的温度是在约4-25℃范围。
按本发明的另一实施方案,将一种适宜表面活性剂的水基溶液加入该宿主细胞的干粉末或水基浆状液中,也是一种有用并且有效的细胞蛋白质加溶方法。该项至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的加入量是要高于其临界胶束浓度,并且在其溶解度和经济性许可限度之内。
与已有技术不同,该蛋白质可以加溶于温和、接近中性的环境中。此外,该种加溶剂只需要很低浓度,并且这些加溶剂很容易除掉。由于该加溶剂的化学本质,该回收方法可与其后的加工步骤相兼容,这与已有技术中对于提纯的内含体采用苛刻的加溶处理是完全不同的。已发现该种加溶剂与蛋白质聚集体加工所遇到的其他成分是具相溶性的。例如,二硫苏糖醇、巯基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、二甲砜、尿素、硫脲、氢氧化钠及氢氧化钾、硼酸盐或无机酸。
本发明的范围包括使用一切适用的单链和多链、含氮或含磷并具有不同头基团、反离子以及支链或衍生碳链的表面活性剂。
该项至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂,在避免相反电荷的表面活性剂组合在一起的条件下最好是选自于:
卤化十六烷基三甲基铵,例如溴化物
卤化十六烷基吡啶鎓,例如氯化物
卤化十四烷基三甲基铵,例如溴化物
卤化十二烷基三甲基铵,例如溴化物
按本发明可以回收的蛋白质可以选自于单体式和聚合物式细胞内蛋白质,例如在细胞内含体和细胞质聚集物中所存在的蛋白质。该等内含体可以选自具生物重要性的多肽和肽,包括猪、牛、羊生长激素、干扰素、免疫原以及淋巴细胞活素,或者它们的非均质或均质聚合物。
该至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的优选含量是约2.5-50%(重量/体积),最好是2.5-20%(重量/体积)。表面活性剂含量的上限可以变化,并且由所选表面活性剂的溶解度所限。
业已发现,有可能对包括内含体在内的全细胞所制成并含有的目的蛋白质聚集体进行加溶,方法是用一种表面活性剂在水中的溶液处理该细胞及其组分,可以有或没有一种极性有机溶剂存在,或者只用单独的该极性水质溶剂。这个过程可以很快(5-60分钟),并且很容易回收该加溶的蛋白质并达到最优化的效果。只需用少量廉价并且易于得到的药剂,并且可以循环使用。例如,该加溶剂的主体部分可以是水。
按本发明的一项优选方案是提供一种回收细胞蛋白质的方法,该方法包括提供一种包含有该目的蛋白质的宿主细胞源、至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的来源以及至少一种极性有机溶剂的来源;应用由约5-70%(体积/体积)的至少一种极性有机溶剂与至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂并且其量足以产生细胞溶胞作用和蛋白质加溶作用,同时对于该蛋白质结构骨架无显著改变的混合物来处理该细胞;然后从所得的混合物中分离出该加溶的蛋白质。
该蛋白质可以保存在包括一种极性有机溶剂和适当缓冲盐的水基溶液中。最好使该溶液的pH在最优化数值,以保证蛋白质的溶解度及该溶液的稳定性。一种极性有机溶剂,例如乙腈或乙酸的存在,并且较宜浓度在5-70%,则能改变该不溶性蛋白质与该水基溶剂之间的相互作用,从而有利于该蛋白质疏水部分的溶解。该有机溶剂的浓度在10-20%则更好。谱柱(RP-HPLC)。由Toyo Soda Manufacturing Co.Ltd(日本)以商品名TSK-GEL(LC)出售的一种色谱柱,或者由Beckman Instruments Inc.(美国,California州)出售的Ultrapore RPSC,都是适用的。由于该种加溶剂的特性,该分离步骤可以应用其他已知的色谱形式来实施,包括分子筛式的色谱技术,例如凝胶过滤色谱,或离子交换色谱,疏水交互作用色谱以及配位体特性色谱。该种色谱洗脱剂最好是一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的水溶液。可以用稀溶液。该种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的含量可以在约0.25-2.0%(重量/体积)范围,更好是0.4%(重量/体积)。
不言自明,该种色谱分离技术也有对该蛋白质产品的提纯作用。
不言自明,按本发明的该种方法可以用作为分析多肽样品的一种方法,其中是将准备测试的样品进行回收处理。其结果可以提供对该多肽样品的组成的定量分析。
本发明的实施方案是由下列的非限定性实例及其附图来阐明。
实例1
应用含有带内含体的经转化埃希氏大肠杆菌细胞的发酵液进行实验。该种埃希氏大肠杆菌细胞含有从一种pMG939质粒所衍生的1-190AA蛋氨酸-猪生长激素。这些细胞应用超滤技术提浓,用Triton X-100(0.5%)和乙二胺四乙酸(10mM)水溶液洗二次,再用乙二胺四乙酸(5mM)水溶液洗二次。
将这些细胞用溴化十六烷基三甲基铵水溶液(20%重量/体积)处理,在处理时亦发生细胞的溶胞作用。处理是在试管中进行,在室温将该混合物搅拌1小时。用Beckman Microluge Ⅱ离心机将该混合物离心分离(13000rpm,10分钟),得到透明上清液和不溶性粒状物。将一部分粒状物包埋在L.R.White树脂中,并将该种块状物切成切片,应用电子显微镜技术与未处理过的物料进行对比。
所得结果是与未处理过物料呈鲜明对照,经过该种加溶处理后,已看不到内含体。
实例2
应用含有从pMG936质粒所衍生的4-190AA猪生长激素的直接获得品种的经转化埃希氏大肠杆菌进行实验。从发酵设备中收集这些细胞,用离心法提浓(9000倍重力,5分钟)。将一部分湿的细胞粒(50mg)与N-月桂酰基-N-甲基牛磺酸钠盐(3ml,12%(重量/体积))和二硫苏糖醇(3%(重量/体积))在0.1M TRIZMA(pH=10.0)、0.01M乙二胺四乙酸中的混合物剧烈搅拌(1小时)。然后用离心法将该混合物澄清(50,000倍重力,10分钟)。应用硝化纤维素纸和一种对猪生长激素的单无性系抗体对该透明上清液进行免疫一小点斑点分析,证实了最初含在细胞内的直接获得生长激素经加溶而存在于溶液中。
实例3
此实例的实施是应用带有包括从pMG939质粒所衍生的1-190AA蛋氨酸一猪生长激素的内含体的埃希氏大肠杆菌。应用离心法(9000倍重力,5分钟)从发酵液中离析出细胞。将这些湿粒状物的一部分(50mg)与如下所列表面活性剂之一的水溶液(3.0ml,在0.1M TRIZMA中10-20%,pH=10.0),在25℃,在2%(体积/体积)巯基乙醇存在下,在一个试管中剧烈搅拌(1小时)。与前述实验的情况相似,最初含在该细胞中的内含体发生相当多量的加溶作用。
(a)氯化十六烷基吡啶鎓
(b)溴化十四烷基三甲基铵
(c)溴化十二烷基三甲基铵
(d)氯化混合正烷基二甲基苄基铵(50%C14,40%C12,10%C16)
(e)氯化N,N-二甲基-N-〔2-〔2-〔4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基〕乙氧基〕乙基〕苯基甲基铵
(f)氧化十二烷基二甲基胺
(g)α-(N-甲基-月桂酰氨基)乙酸钠盐
(h)N-月桂酰基-N-甲基牛磺酸钠盐
(i)N-月桂基-亚氨基二丙酸钠盐
(j)3-(N,N-二甲基月桂基氨)丙基磺酸钠盐。
最后,不讲自明的是,在不背离本发明在此处所概述的精神实质条件下,还可以作出各种其他修改和/或变动。
Claims (10)
1、回收蛋白质的一种方法,该方法包括提供一种含有一种合成或直接获得蛋白质的宿主细胞来源;并应用至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂,并且其用量足以产生加溶效果,来处理该种宿主细胞。
2、按权利要求1的一种方法,包括如下的基本步骤:提供一种发酵液,其中包括含有一种合成或直接获得的蛋白质的宿主细胞;并且从其中离析出该种宿主细胞。
3、按权利要求2的一种方法,包括如下的基本步骤:将该种宿主细胞进行溶胞处理以形成一种全细胞溶胞产物。
4、按权利要求1的一种方法,其中该种合成或直接获得蛋白质包括单体或聚合的细胞内蛋白质。
5、按权利要求4的一种方法,其中该单体或聚合物细胞内蛋白质包括选自于生长激素、干扰素、免疫原、淋巴细胞活素或它们的非均质或均质聚合物。
6、按权利要求5的一种方法,其中该项至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的含量约为单位体积中2.5-50%(重量)。
7、按权利要求6的一种方法,其中该种表面活性剂是一种阳离子表面活性剂,该阳离子表面活性剂包括选自如下的一种阳离子:
十六烷基三甲基铵阳离子,
十六烷基吡啶鎓阳离子,
十四烷基三甲基铵阳离子,
十二烷基三甲基铵阳离子,
混合正构烷基二甲基苄基铵阳离子,
N,N-二甲基-N-〔2-〔2-〔4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基〕乙氧基〕乙基〕苯甲基铵阳离子。
氧化十二烷基二甲基胺,
α-(N-甲基-月桂酰氨基)乙酸钠盐,
N-月桂酰基-N-甲基牛磺酸钠盐,
N-月桂基-亚氨基二丙酸钠盐,
3-(N,N-二甲基月桂基氨)丙基磺酸钠盐。
8、按权利要求7的一种方法,其中该阳离子表面活性剂是溴化十六烷基三甲基铵。
9、按权利要求8的一种方法,其中该项至少一种阳离子表面活性剂的含量是超过其临界胶束浓度。
10、按权利要求6的一种方法,包括下一个步骤,即从所得的该粗制溶液中分离出该种加溶的蛋白质,其中该分离步骤是选自于:该加溶的蛋白质通过一个色谱柱的分步洗脱、渗析、超滤、分步沉淀或配位体特性离析。
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