JPH0774232B2 - 界面活性剤を用いたタンパク質の新規な精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定の界面活性剤を用
いることを特徴とするタンパク質の精製法に関し、詳し
くは一定濃度の有機溶媒を含む水溶液中でタンパク質と
特定の界面活性剤の複合体を製造し、水に不溶性のこの
複合体を有機溶媒に溶かして、トリアルキルアミンをと
接触させて複合体から水層にタンパク質を抽出して該タ
ンパク質を精製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来の初期段階におけるタンパク質の精
製法としては、分別沈澱法や二層分離法等の通常の方法
の他にカラムクロマトグラフィー法や膜分離法等による
分離精製の各種の方法が用いられている。一方、有機溶
媒中で酵素反応を行うことや、酵素の反応特性を変える
ことを目的として、酵素表面を界面活性剤等の両親媒性
物質で修飾する方法がこれまでにいつくか開発されてい
る。

【０００３】本発明者らは、各種のタンパク質のうち、
水に不溶性で数種の有機溶媒に溶解し、有機溶媒中でも
活性を保持するリパーゼについて界面活性剤との複合体
を形成させるための条件を検討した。まず、使用する界
面活性剤について検討し、界面活性剤の中でも、特にジ
ドデシルグルコシルグルタメイトはその原料が、糖，脂
肪酸およびアミノ酸であり、これらから構成される界面
活性剤の合成が非常に簡易であるために、安価で大量に
供給することが可能であることに着目した。この界面活
性剤を用いて、特定のタンパク質を簡易、かつ安価に精
製できるようになれば、界面活性剤の応用範囲はさらに
広まることが期待できる。

【０００４】しかしながら、これまでに界面活性剤、特
にジドデシルグルコシルグルタメイトを用いた特定のタ
ンパク質の精製法については全く報告されていない。以
下において、ジドデシルグルコシルグルタメイトのこと
を界面活性剤と略称することがある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、これまでのタンパク質の精製法の原理とは全く異な
った原理に基づいたタンパク質の新規な精製法を開発す
るために、可能な限り簡単で安価な方法を開発すべく鋭
意検討した。まず、テトラヒドロフランを含む水溶液中
で、タンパク質を界面活性剤で処理し、水に不溶性の複
合体を調製した。この複合体をジクロロメタンなどの有
機溶媒に溶解し、緩衝液とトリエチルアミンを添加して
激しく攪拌すると、複合体を構成しているタンパク質が
水層に抽出されてくることを見出した。このようにし
て、界面活性剤を用いることにより、簡易で安価に特定
のタンパク質を精製することができることを知見して本
発明を完成した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はテト
ラヒドロフラン，アセトンおよびエチルアルコールのう
ちのいずれかの有機溶媒を３０〜７０％の濃度で含む水
溶液中でジドデシルグルコシルグルタメイトとタンパク
質とを反応させて得た複合体をベンゼン，クロロホル
ム，ジクロロメタン，ジクロロエタンおよびラウリルア
ルコールのうちから選ばれた少なくとも１種の有機溶媒
に溶解し、緩衝液を添加した後、トリアルキルアミンを
加えて攪拌してタンパク質を抽出することを特徴とする
タンパク質の精製法に関する。

【０００７】本発明が適用されるタンパク質には制限が
なく、各種のタンパク質、例えばリパーゼ，ホスホリラ
ーゼ，アルブミン，トリプシンインヒビターなどの酵素
やタンパク質の阻害剤などが挙げられる。また、該タン
パク質と反応させる界面活性剤としては、ジドデシルグ
ルコシルグルタメイトを用いる。

【０００８】次に、水溶液中で界面活性剤とタンパク質
とを反応させる場合に用いる有機溶媒としては、テトラ
ヒドロフラン，アセトンやエチルアルコールなどのアル
コール類が好適である。特に、酵素タンパクの活性を保
持した状態で得る場合には、テトラヒドロフランが好適
である。しかし、酵素タンパクの安定性が高い場合や単
にタンパク質の精製を行う場合には、他の有機溶媒も十
分に使用できる。

【０００９】界面活性剤とタンパク質を反応させて複合
体を得るための条件については、精製を目的とするタン
パク質に適切な有機溶媒を含んだ水溶液に界面活性剤と
タンパク質を１〜４：１の割合で溶かし、０℃〜室温
（酵素の場合は低温、例えば２〜５℃が好ましい）で激
しく攪拌することが好ましい。

【００１０】次に、複合体からタンパク質を抽出し、精
製するために、該複合体をトリアルキルアミンと接触さ
せるが、トリアルキルアミンとしてはトリメチルアミ
ン，トリエチルアミンなどが好適に用いられる。その
他、後述する有機溶媒をアルカリ性に傾ける作用を有す
るものであれば使用することができる。ここで、トリア
ルキルアミンは有機溶媒に通常0.５〜５％、好ましくは
１〜２％濃度で溶解して用いられる。複合体とトリアル
キルアミンの接触は、有機溶媒中で行われるが、このと
きに用いられる有機溶媒としては制限がなく、例えばベ
ンゼン，クロロホルム，ジクロロメタン，ジクロロエタ
ン，ラウリルアルコールなどが挙げられる。

【００１１】複合体とトリアルキルアミンとの接触の条
件は、まず、複合体を有機溶媒に完全に溶かす。次に、
トリス−塩酸緩衝液などの通常用いられる緩衝液を加え
た後に、トリアルキルアミンを添加する。トリアルキル
アミンを添加することにより、有機溶媒中の複合体が破
壊され、タンパク質が緩衝液に抽出してくる。

【００１２】

【実施例】以下に、実施例により本発明を詳しく説明す
る。 実施例１ 既知の６種類のタンパク質の混合体をモデル系として用
いた。すなわち、ホスホリラーゼｂ，ウシ血清アルブミ
ン，オボアルブミン，カルボニックアンヒドラーゼ，ダ
イズトリプシンインヒビターおよびα−ラクトアルブミ
ンが各々６４μｇ，８３μｇ，１４７μｇ，８３μｇ，
８０μｇおよび１２１μｇ含まれる水溶液を調製した。
このタンパク質混合体に2.９ｍｇのジドデシルグルコシ
ルグルタメイトのテトラヒドロフラン溶液を加えて混合
し、テトラヒドロフランの濃度を一定にして全溶液量が
３００μｌになるように調整した後、４℃で激しく１６
時間攪拌した。その後、溶液をエバポレーターで除去
し、得られた沈澱に水を加え、沈澱を洗浄して未反応の
タンパク質を除いた。更にもう一度、沈澱を洗浄した
後、一晩沈澱を凍結乾燥した。このようにして得られた
界面活性剤とタンパク質の複合体の粉末は、使用するま
で４℃で保存した。

【００１３】ジドデシルグルコシルグルタメイトとタン
パク質との複合体の粉末を有機溶媒のジクロロメタンに
溶かし、緩衝液（0.２Ｍ，Tris-HCl緩衝液、pH7.５）を
添加した後、最後にトリエチルアミン（１％濃度）を加
えて激しく攪拌した。その後１０分間、１5,０００rpm
で遠心した後、水層を分離して複合体から抽出されてく
るタンパク質を回収した。

【００１４】このようにして、界面活性剤を用いて精製
されるタンパク質は、複合体を調製するときの水溶液中
のテトラヒドロフランの濃度に依存して図１のように変
化した。図中、ａはホスホリラーゼｂ、ｂはウシ血清ア
ルブミン、ｃはオボアルブミン、ｄはカルボニックアン
ヒドラーゼ、ｅはダイズトリプシンインヒビター、ｆは
α−ラクトアルブミンをそれぞれ示す。テトラヒドロフ
ラン濃度が３３％の場合には、ホスホリラーゼｂ以外の
５種類のタンパク質が複合体から再抽出されてくるが、
テトラヒドロフラン濃度が６７％になると、ウシ血清ア
ルブミン，ダイズトリプシンインヒビターおよびα−ラ
クトアルブミンの３種類のタンパク質が特異的に抽出さ
れてきた。

【００１５】６７％のテトラヒドロフラン濃度の溶液中
で、界面活性剤とタンパク質の複合体を調製し、その複
合体からタンパク質を回収した場合、α−ラクトアルブ
ミンに関しては、約６０％が回収された。

【００１６】次に、界面活性剤とタンパク質の複合体を
調製する際の溶液中のテトラヒドロフラン濃度を６７％
に設定したときの複合体形成の経時的変化を調べた。そ
の結果、界面活性剤とタンパク質を混合、攪拌して１６
時間後には、全タンパク質の回収率は４２％に達し、そ
れ以降は増加しなかった。また、混合後８時間でも最終
収率の約９０％の複合体が形成されていた。

【００１７】また、タンパク質と反応させて複合体を形
成させるときの界面活性剤の量を変えて複合体形成に与
える影響を調べたところ、界面活性剤の量をタンパク質
の４倍以上にしてもタンパク質の回収率に変化はなかっ
た。一方、界面活性剤の量がタンパク質と等量の場合に
は、界面活性剤が４倍量のときの７０％の回収率に相当
した。これらの結果から、界面活性剤とタンパク質の複
合体を形成する効率に影響を与えるものは、溶液中のテ
トラヒドロフラン濃度のみで、複合体の調製時間や界面
活性剤とタンパク質の量比等は、タンパク質の回収率に
は影響を与えるが、タンパク質と界面活性剤との相互作
用には影響を与えないことがわかった。

【００１８】界面活性剤とタンパク質の複合体から効率
よくタンパク質を抽出するときの有機溶媒を検討した。
ベンゼン，クロロホルム，ジクロロメタン，ジクロロエ
タンおよびラウリルアルコールの各溶液に複合体を溶か
し、複合体からのタンパク質の抽出を行ったところ、い
ずれの溶媒でもトリエチルアミン添加前ではタンパク質
は複合体から遊離しなかった。しかし、１％のトリエチ
ルアミンを添加すると、いずれの有機溶媒からもタンパ
ク質が抽出された。特に、ジクロロメタンを有機溶媒層
に用いたときが最も抽出効率が高かった。結果を第１表
に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】ジクロロメタンと緩衝液を用いて、複合体
からタンパク質を抽出する際のジクロロメタン層に含ま
れるトリエチルアミンの濃度は１〜２％のときが最もタ
ンパク質の抽出効率が良かった。

【００２１】実施例２ 市販のリパーゼＰ（商品名、天野製薬製）、リパーゼＡ
（商品名、天野製薬製）、リパーゼＰＮ（商品名、和光
純薬製）およびブタ膵臓リパーゼタイプII（商品名、シ
グマ社製）の各粉末１００ｍｇを含む水溶液２ｍｌと、
界面活性剤（ジドデシルグルコシルグルタメイト）４０
０ｍｇを含むテトラヒドロフラン溶液４ｍｌを混合し、
４℃で１６時間激しく攪拌して複合体を調製した。次い
で、この複合体から実施例１と同様にしてタンパク質の
再抽出を行った。そのときのタンパク質の精製率と収率
を第２表に示す。表から明らかなように、各種リパーゼ
の失活は認められず、いずれも６〜６４倍に精製でき
た。

【００２２】

【表２】

【００２３】実施例３ リパーゼＰ（商品名、天野製薬製）について実施例２と
同様にして精製を行い、得られた精製タンパク質を電気
泳動法で特定したところ、精製されたタンパク質は主と
してリパーゼＰであることが確認できた（図２参照）。

【００２４】

【発明の効果】本発明の方法は、タンパク質の精製が、
界面活性剤との複合体の調製工程と複合体からのタンパ
ク質の再抽出工程という二つの主な工程から構成されて
いるため、操作法が簡単であり、しかも特別な器具を必
要としないで比較的短時間で精製ができる等の利点を有
する。さらに、他のタンパク質の精製法とは全く異なる
原理に基づいているため、本発明の方法は既知の他の精
製法との併用がより効果的であると期待される。

【００２５】本発明の方法では、タンパク質の精製の効
率は、界面活性剤と複合体を調製するときのテトラヒド
ロフラン濃度に依存しているので、精製を目的とするタ
ンパク質に対して最も効率よく複合体を調製できるよう
にテトラヒドロフラン濃度を検討すれば、各種のタンパ
ク質の精製が可能になると考えられる。本発明の方法で
は、タンパク質を界面活性剤で被覆した状態で分離、精
製を進めることから、タンパク質の変性は生じ難いと考
えられる。このため、本発明の方法は、各種の酵素の精
製への応用が可能である。本発明の方法では、特定のタ
ンパク質を精製するために必要な全ての材料を安価に、
また、大量に入手することが可能である。このため、ス
ケールアップして大量のタンパク質を精製することが容
易であると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ジドデシルグルコシルグルタメイトを用いて
複合体を調製する溶液のテトラヒドロフラン濃度を３３
％（Ａ），５０％（Ｂ）および６７％（Ｃ）にしたとき
に複合体から再抽出されてくるタンパク質のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動図である。なお、（Ｄ）は複
合体の調製用に用いた６種類のタンパク質の混合体であ
る。

【図２】 実施例３によるリパーゼＰの精製を示し、精
製前（Ａ）および精製後（Ｂ）のＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動図である。なお、ゲル側面の数値は分子
量マーカーの位置を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 テトラヒドロフラン，アセトンおよびエ
   チルアルコールのうちのいずれかの有機溶媒を３０〜７
   ０％の濃度で含む水溶液中でジドデシルグルコシルグル
   タメイトとタンパク質とを反応させて得た複合体をベン
   ゼン，クロロホルム，ジクロロメタン，ジクロロエタン
   およびラウリルアルコールのうちから選ばれた少なくと
   も１種の有機溶媒に溶解し、緩衝液を添加した後、トリ
   アルキルアミンを加えて攪拌してタンパク質を抽出する
   ことを特徴とするタンパク質の精製法。
2. 【請求項２】 タンパク質が酵素である請求項１記載の
   精製法。
3. 【請求項３】 トリアルキルアミンがトリメチルアミン
   またはトリエチルアミンである請求項１記載の精製法。