CN1132649C - 添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物物质分离纯化领域，特别涉及一种通过添加胺类萃取剂到阳离子型表面活性剂中形成阳离子-胺类混合反胶团相，从而提高反胶团相对生物物质的萃取率和反萃率的萃取方法，该方法在很宽的pH范围和不同离子强度下能显著提高反胶团相对生物物质的反萃率，显著降低反胶团相达到反萃平衡的时间，其突出优点是反胶团相能够循环使用，可提高反胶团相对生物物质的萃取和反萃能力。

Description

添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法
本发明属于生物物质分离纯化领域，特别涉及一种添加胺类萃取剂到阳离子型反胶团相中形成阳离子-胺类混合反胶团相，从而提高反胶团相对蛋白质等生物物质萃取率和反萃率的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法。
反胶团相是表面活性剂在有机溶剂中形成的分子聚集体，其中的微水池能溶解蛋白质等生物活性物质。通过调节水相pH值、离子强度等条件，可以选择性地萃取目标蛋白质。理论上，反胶团相法萃取蛋白质仅需要通过萃取和反萃过程，即可实现蛋白质的浓缩纯化，其操作步骤简单，与传统的蛋白质分离技术如盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析等相比，具有处理量大、选择性好和可连续操作等优点，特别适用于生物产品的大规模分离纯化，因其有可能大幅度降低生物产品的生产成本。但是反胶团相法萃取蛋白质至今未能实现工业化，原因很多，其中之一是该方法的反萃过程十分困难。
影响蛋白质在水相和反胶团相间分配的因素很多，如水相pH值、离子强度和盐的种类，有机相表面活性剂的类型、浓度、助表面活性剂的使用与否、用量多少和溶剂的种类，萃取过程的温度和压力等。其中最重要的是水相的pH值和离子强度。当使用阳离子型表面活性剂形成反胶团相时，水相pH值高于蛋白质的等电点pI，有利于蛋白质的萃取；当使用阴离子型表面活性剂形成反胶团相时，水相pH值低于蛋白质的等电点pI，有利于蛋白质的萃取。当水相离子强度较低时，有利于蛋白质的萃取；而水相离子强度较高时，不利于蛋白质的萃取。
众所周知，因为存在很高的传质界面阻力，蛋白质的反萃即蛋白质从反胶团相到反萃水相的转移十分困难。一般认为，在不利于萃取的条件下进行反萃，蛋白质应该实现完全反萃。但是，蛋白质的反萃似乎并非一个平衡过程，即使在很高的离子强度和完全不利于萃取的pH条件下，蛋白质的反萃也不能完全实现，甚至反萃率很低或完全不发生反萃。
近年来，许多研究人员进行了新的尝试，提出一系列提高反胶团相法蛋白质反萃率的新方法。这些新方法是：1)Ermin(Prikl Biokhim Kikrobiol，1988，24，42-49)和Woll(Biotechnol.Prog.，1989，5，57-62)等人尝试加入第二种溶剂破坏反胶团相，从而释放反胶团相中的蛋白质；2)Dekker(Chem.Eng.J.，1991，46，B69-74)等人通过先增加反萃温度然后离心的方法分离出多余的水相，浓缩蛋白质于分离出的水相；3)Carison(Biotechnol.Prog.1992，8，85-90)等人添加10％到50％的异丙醇到反萃水相，实现蛋白质的反萃；4)Leser(Chimia，1990，44，270-282)加入硅胶吸收水分，从而使蛋白质与有机相分离；5)Gupta(Biotechnol.Bioeng.，1994，44，830-836)通过分子筛使反胶团相脱水，实现蛋白质与有机相的分离；6)Hayes(Biotechnol.Bioeng.，1998，59(5)，557-566)加入少量的助表面活性剂到W/O微乳液，实现蛋白质的反萃；7)Jarudilokkul(Biotechnol.Bioeng.，1999，62(5)，593-601)通过添加带有相反电荷的表面活性剂，在低盐和温和的pH条件下实现了蛋白质的反萃。
以上几种方法虽然能够从反胶团相分离出蛋白质，但仅添加异丙醇和加入相反电荷表面活性剂的方法易于实现工业化大生产，其他几种仅有学术研究价值。而添加异丙醇的方法的缺点是反胶团相二次萃取蛋白质的能力急剧下降，导致有机相不能循环使用；添加带相反电荷表面活性剂的缺点是完全破坏反胶团相，有机相失去萃取蛋白质的能力。因此，反胶团相萃取蛋白质的反萃问题并未根本解决。
本发明的目的是针对反胶团相萃取蛋白质等生物物质过程反萃困难的问题，提供一种可同时提高反胶团相对蛋白质等生物物质的萃取率和反萃率的方法，该方法可在很宽的pH范围和不同离子强度下能显著提高反胶团相对蛋白质的反萃率，显著降低反胶团相达到反萃平衡的时间，而且反胶团相可以循环使用。
本发明的实施方案如下：
本发明提供的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其工艺步骤如下：
1.配制由阳离子型表面活性剂、助表面活性剂、胺类物质、水和有机溶剂组成的阳离子-胺类混合反胶团相；
所述阳离子-胺类混合反胶团相的配制如下：首先称取或移取一定量的阳离子型表面活性剂，并向其中依次加入助表面活性剂、胺类物质、水和有机溶剂，混合均匀，振荡后静置，至阳离子型表面活性剂和胺类物质完全溶解，再加入有机溶剂定容，即制得阳离子-胺类混合反胶团相；
所配制的阳离子-胺类混合反胶团相与所加入的助表面活性剂的体积比为100∶0.10-20；
所配制的阳离子-胺类混合反胶团相与所加入的胺类物质的体积比为100∶0.5-30；
所配制的阳离子-胺类混合反胶团相与所加入的水的体积比为100∶0.5-3；
阳离子型表面活性剂在所配制的阳离子-胺类混合反胶团相中的浓度为10毫摩尔-200毫摩尔/升；
2.将阳离子-胺类混合反胶团相与萃取水相按1∶1-1∶50的比例混合，进行萃取；
3.将阳离子-胺类混合反胶团相与反萃水相按1∶1-50∶1的比例混合，进行反萃；
所述胺类为伯胺RNH2、仲胺RR′NH、叔胺RR′R″N或酰胺RR′CONH2、RR′CONR″R
所述伯胺、仲胺、叔胺和酰胺中的烷基为直链或支链；
所述烷基R、R′、R″、R为5个碳至25个碳原子的烷基；
所述阳离子型表面活性剂为三烷基甲基季铵盐、二烷基二甲基季铵盐、烷基三甲基季铵盐；
所述的助表面活性剂为烷基醇类；
所述的有机溶剂为单一液态烷烃或混合液态烷烃。
本发明的方法，在单一阳离子型反胶团相中添加胺类物质形成阳离子-胺类混合反胶团相，将产生两方面的作用：一是增加反胶团相的大小，阳离子表面活性剂带一定的正电荷，是一种路易斯酸，而胺类的极性头具有孤对电子，是一种路易斯碱，胺类极性头在反胶团相内壁的出现降低了阳离子表面活性剂极性头间的相互斥力，从而反胶团相变大，能够容纳更大的蛋白质分子，具有较单一反胶团相更大的萃取能力；二是降低反胶团相的界面阻力，有利于生物物质进出反胶团相，从而在较高的离子强度和不利于生物物质萃取的pH值条件下提高生物物质的反萃率；
另外，具有疏水尾的有机胺类在水相的溶解度较少，绝大部分溶解于有机溶剂，萃取过程的损失很少，十分有利于反胶团相有机相的循环使用。如果反胶团相因为胺类溶解于水相降低对生物物质的反萃率，可以在有机相添加少量胺类。
适用于本发明方法分离的生物物质包括蛋白质、酶、氨基酸和核酸等。
本发明提供的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，可显著地增加反胶团相对生物物质的萃取率，同时在很宽的pH范围和不同离子强度下能显著提高反胶团相对生物物质的反萃率，能显著降低反胶团相达到反萃平衡的时间，极具应用前景，其突出优点还在于反胶团相可以循环使用。
下面结合附图及实施例进一步描述本发明：
附图1单一反胶团相和阳离子-胺类混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相pH值的变化而变化的示意图；
附图2阳离子-胺类混合混合反胶团相萃取BSA的萃取率随胺类添加量变化而变化的示意图；
附图3阳离子-胺类混合混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH值变化而变化(反萃水相含1.0mol/L的KBr)的示意图；
附图4阳离子-胺类混合混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH值变化而变化(反萃水相含1.0mol/L的KCl)示意图；
附图5阳离子-胺类混合混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间变化而变化(反萃水相含1.0mol/L的KBr)的示意图；
附图6阳离子-胺类混合混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间的变化而变化(反萃水相含1.0mol/L的KCl)的示意图；
附图7阳离子-胺类混合混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化(1.0mol/L的KBr，pH＝6.6)而变化的示意图；
附图8阳离子-胺类混合混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化(1.0mol/L的KBr，pH＝4.3)而变化的示意图；
附图9单一反胶团相和阳离子-酰胺混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相pH值的变化而变化的示意图；
其中：—■—为十六烷基三甲基溴化铵(缩写为CTAB)
      —●—为CTAB+正辛胺
      —▲—为CTAB+二正辛胺
      ——为CTAB+三正辛胺
      —◆—为CTAB+N1923
      —□—为CTAB+N，N-二乙醇月桂酰胺
实施例1：用本发明的方法萃取BSA：
本实施例中，阳离子表面活性剂选用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，分析纯)；助表面活性剂选用正己醇；胺类物质分别选用正辛胺(OA)、二正辛胺(BOA)、三正辛胺(TOA)、N1923(属仲碳伯胺，含19到23个碳原子)；有机溶剂选用石油醚；水采用蒸馏水；
萃取水相为含0.10摩尔/升的氯化钾和1.0毫克/毫升的牛血清白蛋白(BSA)的不同pH的缓冲液(在pH值为3-6范围，使用0.05摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；在pH值为6-8范围，使用0.05摩尔/升的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；pH值为8-11范围使用0.05摩尔/升的硼砂-盐酸缓冲液)；
其具体工艺步骤如下：
1.分别配制CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-二正辛胺混合反胶团相、CTAB-三正辛胺混合反胶团相、CTAB-N1923混合反胶团相和单一CTAB反胶团相：
以配制100毫升CTAB-正辛胺混合反胶团相为例，其配制过程如下：称取1.822克CTAB，并向其中依次加入20毫升正己醇(助表面活性剂)、5毫升的正辛胺、50毫升的石油醚和1.2毫升的蒸馏水，振荡静置，至CTAB和正辛胺完全溶解，加入石油醚定容至100毫升，混合均匀，从而制备得到100毫升的CTAB-正辛胺混合反胶团相；
采用与配制CTAB-正辛胺混合反胶团相相同的配制过程分别配制100毫升CTAB-二正辛胺混合反胶团相、100毫升CTAB-三正辛胺混合反胶团相、100毫升CTAB-N1923混合反胶团相；
单一CTAB反胶团相的配制过程除不加胺类物质外，与上述混合反胶团相的配制过程相同；
在CTAB-正辛胺混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的20％，正辛胺的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
CTAB-二正辛胺混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-二正辛胺混合反胶团相体积的20％，二正辛胺的体积占CTAB-二正辛胺混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-二正辛胺混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
CTAB-三正辛胺混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-三正辛胺混合反胶团相体积的20％，三正辛胺的体积占CTAB-三正辛胺混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-三正辛胺混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
CTAB-N1923混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-N1923混合反胶团相体积的20％，N1923的体积占CTAB-N1923混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-N1923混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积1.2％，其余为石油醚；
2.萃取BSA的过程如下；向盛有等体积萃取水相的5个三角瓶中分别加入等体积的CTAB-正辛胺混合反胶团相，CTAB-二正辛胺混合反胶团相，CTAB-三正辛胺混合反胶团相，CTAB-N1923混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，在室温(18摄氏度)下，150次/分钟振荡20分钟，3500rpm离心分相，即完成其萃取；
用紫外法测定有机相的蛋白质的含量，Brandford方法测定水相的蛋白质含量，其结果如图1所示，图1中，—■—为单一CTAB反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相的pH值的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正辛胺混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相的pH值的变化而变化的曲线；—▲—为CTAB-二正辛胺混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相的pH值的变化而变化的曲线；——为CTAB+三正辛胺混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相的pH值的变化而变化的曲线；—◆—为CTAB+N1923混合反胶团相对BSA的萃取随萃取水相的pH值的变化而变化的曲线；由图1可知，在很宽的pH值下，CTAB-胺类混合反胶团相对BSA的萃取率比单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率高，其中，CTAB-正辛胺混合反胶团相，CTAB-二正辛胺混合反胶团相，CTAB-三正辛胺混合反胶团相和CTAB-N1923混合反胶团相对BSA的萃取效果提高十分显著。
实施例2：用本发明的方法萃取BSA：
本实施例所选用的阳离子表面活性剂、助表面活性剂、胺类物质、有机溶剂水和萃取水均与实施例1相同；萃取水的pH值为6.0和7.0；
其具体工艺步骤如下：
1.分别配制具有不同胺类体积百分比的CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-二正辛胺混合反胶团相、CTAB-三正辛胺混合反胶团相、CTAB-N1923混合反胶团相和单一CTAB反胶团相；配制方法同实施例1，得到的四种CTAB-胺类混合反胶团相中，CTAB的浓度均为200毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的3.0％，在CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-二正辛胺混合反胶团相、CTAB-三正辛胺混合反胶团相中，其胺类的体积分别占CTAB-胺类混合反胶团相体积的1％、2％、3％、4％和5％，在CTAB-N1923混合反胶团相中，N1923的体积占CTAB-胺类混合反胶团相体积的1％、1.5％、2.0％和2.5％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中
2.萃取BSA的过程同实施例1，其萃取结果见附图2，图2中，—■—为单一CTAB反胶团相萃取BSA的萃取率；—●—为CTAB-正辛胺混合反胶团相萃取BSA的萃取率随胺类添加量的变化而变化的曲线；—▲—为CTAB-二正辛胺混合反胶团相萃取BSA的萃取率随胺类添加量的变化而变化的曲线；——为CTAB-三正辛胺混合反胶团相萃取BSA的萃取率随胺类添加量的变化而变化的曲线；—◆—为CTAB-N1923混合反胶团相萃取BSA的萃取率随胺类添加量的变化而变化的曲线；从图2可知，在pH值为6.0时，CTAB-正辛胺混合反胶团相和CTAB-二正辛胺混合反胶团相对BSA的萃取率比单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率高，而且，其萃取率随胺类物质添加量的增加而提高；CTAB-三辛胺混合反胶团相对BSA萃取率的提高作用较小；在pH值为7.0时，CTAB-N1923混合反胶团相对BSA的萃取率比单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率高，且萃取率随N1923添加量的增加而提高。
实施例3：用本发明的方法萃取并反萃BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含1.0摩尔/升的溴化钾的不同pH值的缓冲液；
1.分别配制CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-二正辛胺混合反胶团相、CTAB-三正辛胺混合反胶团相、CTAB-N1923混合反胶团相和单一CTAB反胶团相；配制方法同实施例1，得到的四种CTAB-胺类混合反胶团相，其中CTAB的浓度均为50毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的20％，正辛胺、二正辛胺、三正辛胺、N1923的体积分别占CTAB-胺类混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的为3.0％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；
3.反萃过程如下：向50毫升三角瓶中加入等体积的反萃水相和含1.0毫克/毫升的BSA的有机相，250次/分钟振荡一小时，4000rpm离心分相。Brandford方法测定反萃水相的蛋白质含量，其结果见附图3，图3中，—■—为单一CTAB反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正辛胺混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；—▲—为CTAB-二正辛胺混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；——为CTAB-三正辛胺混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；—◆—为CTAB-N1923混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；从图3可知，当反萃水相含1.0摩尔/升的溴化钾时，CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-二正辛胺混合反胶团相、CTAB-三正辛胺混合反胶团相和CTAB-N1923混合反胶团相在很宽的pH范围内对BSA的反萃率比单一CTAB反胶团相对BSA的反萃率高，尤其是CTAB-正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率高于90％。
实施例4：用本发明的方法萃取并反萃BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含1.0摩尔/升的氯化钾的不同pH值的缓冲液；
1.分别配制CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-二正辛胺混合反胶团相、CTAB-三正辛胺混合反胶团相、CTAB-N1923混合反胶团相和单一CTAB反胶团相；配制方法同实施例1，得到的四种CTAB-胺类混合反胶团相中，CTAB的浓度均为50毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的20％，正辛胺、二正辛胺、三正辛胺、N1923的体积分别占CTAB-胺类混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的3.0％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；
3.反萃过程同实施例3，其结果见附图4，图4中，—■—为单一阳离子(十六烷基三甲基溴化铵)反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；—▲—为CTAB-二正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；——为CTAB-三正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；—◆—为CTAB-N1923混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相的pH值的变化而变化的曲线；从图4可知，当反萃水相含1.0摩尔/升的氯化钾时，CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-二正辛胺混合反胶团相、CTAB-三正辛胺混合反胶团相和CTAB-N1923混合反胶团相在很宽的pH范围内对BSA的反萃率比单一CTAB反胶团相对BSA的反萃率高，尤其是CTAB-正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率高于90％。
实施例5：用本发明的方法萃取并反萃BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含1.0摩尔/升的溴化钾的、pH值为4.30的缓冲液；
1.分别配制CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-N1923混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的两种CTAB-胺类混合反胶团相中，CTAB的浓度均为50毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的20％，正辛胺和N1923的体积分别占CTAB-胺类混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；
3.反萃过程同实施例3，采用不同的反萃时间，其结果见附图5，图5中，—■—为单一CTAB反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相的反萃时间变化而变化的曲线；—●—为CTAB+正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相的反萃时间变化而变化的曲线；—◆—为CTAB+N1923混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相的反萃时间变化而变化的曲线；从图5可知，当反萃水相pH值为4.30，含1.0摩尔/升的溴化钾时，CTAB-正辛胺混合反胶团相和CTAB-N1923混合反胶团相能显著降低CTAB体系达到反萃平衡的时间，而单一CTAB反胶团相需要较长的时间才能达到反萃平衡；经过相同混合时间，混合反胶团相的蛋白质转移率高于单一反胶团相的蛋白质转移率。
实施例6：用本发明的方法萃取并反萃BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含1.0摩尔/升的氯化钾的、pH值为4.30的缓冲液；
1.配制CTAB-正辛胺混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的CTAB-正辛胺混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的20％，正辛胺的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；
3.反萃过程同实施例3，采用不同的反萃时间，其结果见附图6，图6中，—■—为单一CTAB反胶团相对BSA的反萃率随反萃时间的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃时间变化而变化的曲线；从图6可知，使用CTAB-正辛胺混合反胶团相，达到反萃平衡的时间大大降低，而使用单一CTAB反胶团相需要较长的反萃时间才能达到反萃平衡；经过相同混合时间，使用混合反胶团相，其蛋白质转移率高于使用单一反胶团相的蛋白质转移率。
实施例7：用本发明的方法萃取并反萃BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相含有不同浓度的溴化钾、pH值为6.60的缓冲液；
1.配制CTAB-正辛胺混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的CTAB-正辛胺混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的20％，正辛胺的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；反萃过程同实施例3，其结果见附图7，图7中，—■—为单一CTAB反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化的曲线；—●—为CTAB+正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化的曲线；从图7可知，当反萃水相含不同溴化钾浓度，pH值为6.60的缓冲液时，CTAB-正辛胺混合反胶团相的反萃率大于90％，而同样条件下单一CTAB反胶团相的反萃率几乎为零。
实施例8：用本发明的方法萃取并反萃BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含1.0摩尔/升的溴化钾的、pH值为4.30的缓冲液；
1.分别配制CTAB-正辛胺混合反胶团相、CTAB-N1923混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的两种CTAB-胺类混合反胶团相中，CTAB的浓度均为50毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-胺类混合反胶团相体积的20％，正辛胺和N1923的体积分别占CTAB-胺类混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积占CTAB-胺类混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占CTAB-正辛胺混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；
3.反萃过程同实施例3，其结果见附图8，图8中，—■—为单一CTAB反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正辛胺混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化的曲线；—◆—为CTAB-N1923混合反胶团相对BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化的曲线；从图8可知，当反萃水相pH值为4.30，含不同浓度的溴化钾时，正辛胺和N1923的添加能显著提高CTAB体系对BSA的反萃率。
实施例9：用本发明的方法萃取BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1；
1.配制CTAB-正己胺混合反胶团相，配制方法同实施例1，得到的CTAB-正己胺混合反胶团相中，CTAB的浓度为10毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正己胺混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-正己胺混合反胶团相体积的0.5％，正己胺体积占CTAB-正己胺混合反胶团相体积的2％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；
其实验结果表明，CTAB-正己胺混合反胶团相对BSA的萃取率比单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率高。
本实施例的阳离子型表面活性剂也可以采用三甲基烷基(C10-C16)氯化铵或三甲基烷基(C17-C20)氯化铵，用配制的三甲基烷基(C10-C16)氯化铵-正己胺混合反胶团相或三甲基烷基(C17-C20)氯化铵-正己胺混合反胶团相萃取BSA，其萃取率也高于单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率。
实施例10：用本发明的方法萃取BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1，反萃水相同实施例3；
1.分别配制二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵-二正己胺混合反胶团相和单一二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵反胶团相；配制方法同实施例1，得到的二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵-二正己胺混合反胶团相中，二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵的浓度为100毫摩尔/升，正己醇的体积占二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵-二正己胺混合反胶团相体积的10％，二正己胺的体积占二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵-二正己胺混合反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵-二正己胺混合反胶团相体积的1.0％，其余为石油醚；单一二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵反胶团相中，二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵的浓度为100毫摩尔/升，正己醇的体积占单一二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占单一二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵反胶团相体积的0.5％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；
3.反萃过程同实施例3，反胶团相与反萃水相的体积比为50∶1；
其实验结果表明，二正己胺的添加能显著提高二烷基(C10-C16)二甲基氯化铵反胶团相对BSA的萃取率。
本实施例的阳离子型表面活性剂也可以采用氯化二甲基二辛胺或氯化二甲基二烷基(C16-C20)铵，用配制的氯化二甲基二辛胺-二正己胺混合反胶团相或氯化二甲基二烷基(C16-C20)铵-二正己胺混合反胶团相萃取BSA，其对BSA的萃取率和反萃率也高于单一氯化二甲基二辛胺反胶团相和单一氯化二甲基二烷基(C16-C20)铵反胶团相对BSA的萃取率和反萃率。
本实施例也可以采用三正己胺或二异丁基正辛胺，用配制的氯化二甲基二正辛胺-三正己胺混合反胶团相或氯化二甲基二烷基(C16-C20)铵-二异丁基正辛胺混合反胶团相萃取BSA，其对BSA的萃取率和反萃率也高于单一氯化二甲基二正辛胺反胶团相和单一氯化二甲基二烷基(C16-C20)铵反胶团相对BSA的萃取率和反萃率。
实施例11：用本发明的方法萃取α-淀粉酶：
本实施例中，萃取水相为含0.10摩尔/升的氯化钾和1.0毫克/毫升的α-淀粉酶(AM)的不同pH的缓冲液；
1.配制Aliquat 336(三烷基(C8-C10)甲基氯化铵)-二正壬胺混合反胶团相和单一Aliquat 336反胶团相，配制方法同实施例1，得到的混合反胶团相中，Aliquat336的浓度为50毫摩尔/升，正丁醇的体积占混合反胶团相体积的0.5％，二正壬胺的体积占混合反胶团相体积的2％，蒸馏水的体积占混合反胶团相体积的0.5％，其余为石油醚；单一Aliquat 336反胶团相中，Aliquat 336的浓度为50毫摩尔/升，正丁醇的体积占单一Aliquat 336反胶团相体积的0.5％，蒸馏水的体积占单一Aliquat 336反胶团相体积的0.5％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1，萃取水相与反胶团相的体积比为50∶1；
其实验结果表明，Aliquat 336-二正壬胺混合反胶团相对α-淀粉酶的萃取率比单一Aliquat 336反胶团相对α-淀粉酶的萃取率高。
本实施例也可以采用氯化甲基三辛铵或氯化甲基三正十二铵，配制的氯化甲基三辛铵-二正壬胺混合反胶团相或氯化甲基三正十二铵-二正壬胺混合反胶团相萃取α-淀粉酶，其对α-淀粉酶的萃取率也高于单一氯化甲基三辛铵反胶团和单一氯化甲基三正十二铵反胶团相对α-淀粉酶的萃取率。
实施例12：用本发明的方法萃取BSA：
本实施例中，萃取水相同实施例1；
1.分别配制CTAB-(N，N-二乙醇)月桂酰胺混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的CTAB-(N，N-二乙醇)月桂酰胺混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-(N，N-二乙醇)月桂酰胺混合反胶团相体积的20％，N，N-二乙醇月桂酰胺的体积占CTAB-(N，N-二乙醇)月桂酰胺混合反胶团相体积的1.0％，蒸馏水的体积占CTAB-(N，N-二乙醇)月桂酰胺混合反胶团相体积的1.5％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB反胶团相的20％，蒸馏水的体积占CTAB反胶团相的1.2％，其余为石油醚；
2.萃取过程同实施例1；
其结果见附图9，图9中，—■—为单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率随萃取水相pH值的变化而变化的曲线，—□—为CTAB-(N，N-二乙醇)月桂酰胺混合反胶团相对BSA的萃取率随萃取水相pH值的变化而变化的曲线，从图9可知，在很宽的pH值范围内CTAB-(N，N-二乙醇)月桂酰胺混合反胶团相对BSA的萃取率比单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率高。
本实施例也可采用月桂酰胺，用配制的CTAB-月桂酰胺混合反胶团相萃取BSA，其对BSA的萃取率远远高于单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率。

Claims (8)

1.一种添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其工艺步骤如下：
1)配制由阳离子型表面活性剂、助表面活性剂、胺类物质、水和有机溶剂组成的阳离子-胺类混合反胶团相；
所述阳离子-胺类混合反胶团相的配制如下：首先称取或移取一定量的阳离子型表面活性剂，并向其中依次加入助表面活性剂、胺类物质、水和有机溶剂，均匀混合，振荡后静置，至阳离子型表面活性剂和胺类物质完全溶解，再加入有机溶剂定容，即制得阳离子-胺类混合反胶团相；
所配制的阳离子-胺类混合反胶团相与所加入的助表面活性剂的体积比为100∶0.10-20；
所配制的阳离子-胺类混合反胶团相与所加入的胺类物质的体积比为100∶0.5-30；
所配制的阳离子-胺类混合反胶团相与所加入的水的体积比为100∶0.5-3；
阳离子型表面活性剂在所配制的阳离子-胺类混合反胶团相中的浓度为10毫摩尔-200毫摩尔/升；
2)将阳离子-胺类混合反胶团相与萃取水相按1∶1-1∶50的比例混合，进行萃取；
3)将阳离子-胺类混合反胶团相与反萃水相按1∶1-50∶1的比例混合，进行反萃。
2.按权利要求1所述的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于，所述胺类为伯胺RNH2、仲胺RR′NH、叔胺RR′R″N或酰胺RR′CON H2、RR′CONR″R。
3.按权利要求3所述的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于，所述伯胺、仲胺、叔胺和酰胺中的烷基为直链或支链。
4.按权利要求3所述的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于，所述烷基R、R′、R″、R为5个碳至25个碳原子的烷基。
5.按权利要求2所述的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于，所述烷基R、R′、R″、R为5个碳至25个碳原子的烷基。
6.按权利要求1所述的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于，所述阳离子型表面活性剂为三烷基甲基季铵盐、二烷基二甲基季铵盐、烷基三甲基季铵盐。
7.按权利要求1所述的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于，所述的助表面活性剂为烷基醇类。
8.按权利要求1所述的添加胺类萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为单一液态烷烃或混合液态烷烃。
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