CN1153603C - 添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物物质分离纯化领域，特别涉及一种添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，该方法通过添加醛酮酯到阳离子型表面活性剂中形成阳离子-醛酮酯混合反胶团相，从而提高反胶团相对生物物质萃取率，并在很宽的pH范围和不同离子强度下显著提高反胶团相对生物物质的反萃率，显著降低反胶团相达到反萃平衡的时间，其突出优点还在于反胶团相可以循环使用。

Description

添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法

本发明属于生物物质分离纯化领域，特别涉及一种添加醛酮酯到阳离子型反胶团相中形成阳离子-醛酮酯混合反胶团相，从而提高反胶团相对生物物质等生物物质萃取率和反萃率的添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法。

反胶团相是表面活性剂在有机溶剂中形成的分子聚集体，其中的微水池能溶解蛋白质等生物活性物质。通过调节水相pH值、离子强度等条件，可以选择性地萃取目标蛋白质。理论上，反胶团相法萃取蛋白质仅需要通过萃取和反萃过程，即可实现蛋白质的浓缩纯化，其操作步骤简单，与传统的蛋白质分离技术如盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析等相比，具有处理量大、选择性好和可连续操作等优点，特别适用于生物产品的大规模分离纯化，因其有可能大幅度降低生物产品的生产成本。但是反胶团相法萃取蛋白质至今未能实现工业化，原因很多，其中之一是该方法的反萃过程十分困难。

影响蛋白质在水相和反胶团相间分配的因素很多，如水相pH值、离子强度和盐的种类，有机相表面活性剂的类型、浓度、助表面活性剂的使用与否、用量多少和溶剂的种类，萃取过程的温度和压力等。其中最重要的是水相的pH值和离子强度。当使用阳离子型表面活性剂形成反胶团相时，水相pH值高于蛋白质的等电点pI，有利于蛋白质的萃取；当使用阴离子型表面活性剂形成反胶团相时，水相pH值低于蛋白质的等电点pI，有利于蛋白质的萃取。当水相离子强度较低时，有利于蛋白质的萃取；而水相离子强度较高时，不利于蛋白质的萃取。

众所周知，因为存在很高的传质界面阻力，蛋白质的反萃即蛋白质从反胶团相到反萃水相的转移十分困难。一般认为，在不利于萃取的条件下进行反萃，蛋白质应该实现完全反萃。但是，蛋白质的反萃似乎并非一个平衡过程，即使在很高的离子强度和完全不利于萃取的pH条件下，蛋白质的反萃也不能完全实现，甚至反萃率很低或完全不发生反萃。

近年来，许多研究人员进行了新的尝试，提出一系列提高反胶团法蛋白质反萃率的新方法。这些新方法是：1)Ermin(Prikl Biokhim Kikrobiol，1988，24，42-49)和Woll(Biotechnol.Prog.，1989，5，57-62)等人尝试加入第二种溶剂破坏反胶团相，从而释放反胶团相中的蛋白质；2)Dekker(Chem.Eng.J.，1991，46，B69-74)等人通过先增加反萃温度然后离心的方法分离出多余的水相，浓缩蛋白质于分离出的水相；3)Carison(Biotechnol.Prog.1992，8，85-90)等人添加10％到50％的异丙醇到反萃水相，实现蛋白质的反萃；4)Leser(Chimia，1990，44，270-282)加入硅胶吸收水分，从而使蛋白质与有机相分离；5)Gupta(Biotechnol.Bioeng.，1994，44，830-836)通过分子筛使反胶团相脱水，实现蛋白质与有机相的分离；6)Hayes(Biotechnol.Bioeng.，1998，59(5)，557-566)加入少量的助表面活性剂到W/O微乳液，实现蛋白质的反萃；7)Jarudilokkul(Biotechnol.Bioeng.，1999，62(5)，593-601)通过添加带有相反电荷的表面活性剂，在低盐和温和的pH条件下实现了蛋白质的反萃。

以上几种方法虽然能够从反胶团相分离出蛋白质，但仅添加异丙醇和加入相反电荷表面活性剂的方法易于实现工业化大生产，其他几种仅有学术研究价值。而添加异丙醇的方法的缺点是反胶团相二次萃取蛋白质的能力急剧下降，导致有机相不能循环使用；添加带相反电荷表面活性剂的缺点是完全破坏反胶团相，有机相失去萃取蛋白质的能力。因此，反胶团相萃取蛋白质的反萃问题并未根本解决。

本发明的目的是针对反胶团相萃取蛋白质等生物物质的过程反萃困难的问题，而提供一种可同时提高阳离子型反胶团相对蛋白质等生物物质的萃取率和反萃率的萃取方法，在很宽的pH范围和不同离子强度下能显著提高反胶团相对生物物质的反萃率，显著降低反胶团相达到反萃平衡的时间，并且反胶团相能够循环使用。

本发明的实施方案如下：

本发明提供的添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其工艺步骤如下：

1.配制由阳离子型表面活性剂、助表面活性剂、醛酮酯有机物、水和有机溶剂组成的阳离子-醛酮酯混合反胶团相；

所述阳离子-醛酮酯混合反胶团相的配制如下：首先称取或移取一定量的阳离子型表面活性剂，并向其中依次加入助表面活性剂、醛酮酯有机物、水和有机溶剂，混合均匀，振荡后静置，至阳离子型表面活性剂和醛酮酯有机物完全溶解，再加入有机溶剂定容，即制得阳离子-醛酮酯混合反胶团相；

所配制的阳离子-醛酮酯混合反胶团相与所加入的助表面活性剂的体积比为100∶0.10-20；

所配制的阳离子-醛酮酯混合反胶团相与所加入的醛酮酯物质的体积比为100∶0.5-20；

所配制的阳离子-醛酮酯混合反胶团相与所加入的水的体积比为100∶0.5-3；

所配制的阳离子-醛酮酯混合反胶团相中，阳离子型表面活性剂所占的浓度为10毫摩尔-200毫摩尔/升；

2.将阳离子-醛酮酯混合反胶团相与萃取水相按1∶1-1∶50的比例混合，进行萃取；

3.将阳离子-醛酮酯混合反胶团相与反萃水相按1∶1-50∶1的比例混合，进行反萃；

所述醛酮酯为醛RCHO、酮RR′CO、酯RCOOR′；

所述醛RCHO、酮RR′CO、酯RCOOR′中的烷基可为直链或支链；

所述烷基R、R′为1个碳至15个碳原子的烷基；

所述阳离子型表面活性剂为三烷基甲基季铵盐、二烷基二甲基季铵盐、烷基三甲基季铵盐；

所述的助表面活性剂为烷基醇类物质；

所述的有机溶剂为单一液态烷烃或混合液态烷烃。

本发明的方法，在单一阳离子型反胶团相中添加醛酮酯有机物形成阳离子-醛酮酯混合反胶团相，将产生两方面的作用：一是增加反胶团相的大小，阳离子表面活性剂带一定的正电荷，是一种路易斯酸，而醛酮酯的极性头具有孤对电子，是一种路易斯碱，醛酮酯极性头在反胶团相内壁的出现降低了阳离子表面活性剂极性头间的相互斥力，从而反胶团相变大，能够容纳更大的生物物质分子，具有比单一反胶团相更大的萃取能力；二是降低反胶团相的界面阻力，有利于生物物质进出反胶团相，从而在较高的离子强度和不利于生物物质萃取的pH值条件下提高生物物质的反萃率。

另外，具有疏水尾的醛酮酯有机物在水相的溶解度较少，大部分溶解于有机溶剂，萃取过程的损失较少，有利于反胶团相的循环使用。如果反胶团相因为醛酮酯溶解于水相降低对生物物质的反萃率，可以在有机相中添加少量醛酮酯。

适用于本发明方法分离的生物物质包括蛋白质、酶、氨基酸和核酸等。

本发明可以显著地增加反胶团相对生物物质的萃取率，同时在很宽的pH范围和不同离子强度下能显著提高反胶团相对生物物质的反萃率，显著降低反胶团相达到反萃平衡的时间，其突出优点还在于反胶团相能够循环使用。

下面结合附图及实施例进一步描述本发明：

附图1为单一反胶团相和阳离子-醛酮酯混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相pH值的变化而变化的示意图；

附图2为CTAB-醛酮酯混合反胶团相萃取BSA的萃取率随醛酮酯添加量的变化而变化的示意图；

附图3为CTAB-正庚醛混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH值的变化而变化(反萃水相含1.0mol/L的KBr)的示意图；

附图4为CTAB-正庚醛混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间的变化而变化(反萃水相含1.0mol/L的KBr，pH＝4.3)的示意图；

附图5为CTAB-正庚醛混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化(反萃水相pH＝4.3)的示意图；

附图6为CTAB-酮酯混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH值的变化而变化(反萃水相含1.0mol/L的KBr)的示意图；

附图7为CTAB-酮酯混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间的变化(1.0mol/L的KBr，pH＝4.3)而变化的示意图；

附图8为CTAB-酮酯混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化的示意图；

其中：—■—为十六烷基三甲基溴化铵(缩写为CTAB)

      —●—为CTAB+正庚醛

      —▲—为CTAB+甲基异丁基酮

      ——为CTAB+乙酸丁酯

实施例1：用本发明的方法萃取BSA：

本实施例中，阳离子表面活性剂选用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，分析纯)；助表面活性剂选用正己醇；醛酮酯分别选用甲基异丁基酮、正庚醛、乙酸丁酯；有机溶剂选用石油醚；水采用蒸馏水；

萃取水相为含0.10摩尔/升的氯化钾和1.0毫克/毫升的牛血清白蛋白(BSA)的不同pH的缓冲液(在pH值为3-6范围，使用0.05摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；在pH值为6-8范围，使用0.05摩尔/升的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液；pH值为8-11范围使用0.05摩尔/升的硼砂-盐酸缓冲液)；

其具体工艺步骤如下：

1.分别配制CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相、CTAB-正庚醛混合反胶团相、CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相和单一CTAB反胶团相：

以配制100毫升CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相为例，其配制过程如下：称取1.822克CTAB，并向其中依次加入20毫升正己醇(助表面活性剂)、5毫升的甲基异丁基酮、50毫升的石油醚和1.2毫升的蒸馏水，振荡静置，至CTAB和甲基异丁基酮完全溶解，加入石油醚定容至100毫升，混合均匀，从而制得100毫升的CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相；

采用与配制CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相相同的配制过程分别配制100毫升CTAB-正庚醛混合反胶团相和100毫升CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相；

单一CTAB反胶团相的配制过程除不加醛酮酯有机物外，与上述混合反胶团相的配制过程相同；

CTAB-正庚醛混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的20％，正庚醛的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；

CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相体积的20％，甲基异丁基酮的体积占CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；

CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相体积的20％，乙酸丁酯的体积占CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；

单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积1.2％，其余为石油醚；

2.萃取BSA的过程如下；向盛有等体积萃取水相的5个三角瓶中分别加入等体积的CTAB-正庚醛混合反胶团相，CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相，CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，在室温(18摄氏度)下，150次/分钟振荡20分钟，3500rpm离心分相，即完成萃取。

用紫外法测定有机相蛋白质的含量，Brandford方法测定水相的蛋白质含量，其结果如图1所示，图1中，—■—为单一CTAB反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相pH值的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正庚醛混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相pH值的变化而变化的曲线；—▲—为CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相pH值变化而变化的曲线；——为CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相萃取BSA的萃取率随萃取水相pH值变化而变化的曲线；由图1可知，在很宽的pH值下，CTAB-醛酮酯混合反胶团相对BSA的萃取率比单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率显著提高。

实施例2：用本发明的方法萃取BSA：

本实施例所选用的阳离子表面活性剂、助表面活性剂、醛酮酯和水均与实施例1相同，选用正己烷为有机溶剂；萃取水相的pH值为7.0。

1.分别配制具有不同醛酮酯体积百分比的CTAB-正庚醛混合反胶团相、CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相、CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相；配制方法同实施例1，得到的CTAB-醛酮酯混合反胶团相中，CTAB的浓度均为200毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-醛酮酯混合反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积均占CTAB-醛酮酯混合反胶团相体积的3.0％，在CTAB-正庚醛混合反胶团相、CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相、CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相中，其醛酮酯的体积分别占CTAB-醛酮酯混合反胶团相体积的1％、2％、3％、4％和5％，其余均为正己烷；

2.萃取过程同实施例1；其萃取结果见附图2，图2中，—●—为CTAB-正庚醛混合反胶团相萃取BSA的萃取率随正庚醛添加量的变化而变化的曲线；—▲—为CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相萃取BSA的萃取率随甲基异丁基酮添加量的变化而变化的曲线；——为CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相萃取BSA的萃取率随乙酸丁酯添加量的变化而变化的曲线；由图2可知，在pH值为7.0时，CTAB-正庚醛混合反胶团相、CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相和CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相对BSA的萃取率比单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率明显提高，而且，其萃取率随醛酮酯有机物添加量的增加而提高。

实施例3：用本发明的方法萃取并反萃BSA：

本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含1.0摩尔/升的溴化钾的不同pH值的缓冲液；

1.分别配制CTAB-正庚醛混合反胶团相和单一CTAB反胶团相；配制方法同实施例1，得到的CTAB-正庚醛混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的20％，正庚醛占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积均占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的为1.2％，其余为石油醚；在单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；

2.萃取过程同实施例1；

3.反萃过程如下：向50毫升三角瓶中加入等体积的反萃水相和含1.0毫克/毫升的BSA的有机相，250次/分钟振荡一小时，4000rpm离心分相，完成其反萃；Brandford方法测定反萃水相的蛋白质含量，其结果见附图3，图3中，—■—为单一CTAB反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH值的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正庚醛混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH的变化而变化的曲线；从图3可知，当反萃水相含1.0摩尔/升的溴化钾时，CTAB-正庚醛混合反胶团相在很宽的pH范围内对BSA的反萃率比单一CTAB反胶团相对BSA的反萃率高。

实施例4：用本发明的方法萃取并反萃BSA：

本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含1.0摩尔/升的氯化钾的pH＝4.30的缓冲液；

1.分别配制CTAB-正庚醛混合反胶团相和单一CTAB反胶团相；配制方法同实施例1，得到的CTAB-正庚醛混合反胶团相中，其CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的20％，正庚醛的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的3.0％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；

2.萃取过程同实施例1；

3.反萃过程同实施例3，采用不同的反萃时间，其结果见附图4，图4中，—■—为单一CTAB反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正庚醛混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间的变化而变化的曲线；从图4可知，当反萃水相含1.0摩尔/升的氯化钾时，CTAB-正庚醛混合反胶团相能显著降低CTAB体系达到反萃平衡的时间，而单一CTAB反胶团相需要较长的时间才能达到反萃平衡；经过相同混合时间，混合反胶团相的蛋白质转移率高于单一反胶团相的蛋白质转移率。

实施例5：用本发明的方法萃取并反萃BSA：

本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含不同浓度的溴化钾、pH值为4.30的缓冲液；

1.分别配制CTAB-正庚醛混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的CTAB-正庚醛混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的20％，正庚醛的体积均占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积占CTAB-正庚醛混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；

2.萃取过程同实施例1；

3.反萃过程同实施例3，其结果见附图5，图5中，—■—为单一CTAB反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化的曲线；—●—为CTAB-正庚醛混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相离子强度的变化而变化的曲线；从图5可知，当反萃水相pH值为4.30，含不同浓度的溴化钾时，CTAB-正庚醛混合反胶团相较单一CTAB反胶团相的反萃率高。

实施例6：用本发明的方法萃取并反萃BSA：

本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含1.0摩尔/升的氯化钾的、pH值为4.30的缓冲液；

1.配制CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相、CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相和CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相中，CTAB的浓度均为50毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-醛酮酯混合反胶团相体积的20％，甲基异丁基酮的体积占CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相体积的2.0％，乙酸丁酯的体积占CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相体积的4％，蒸馏水的体积均占CTAB-醛酮酯混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；

2.萃取过程同实施例1；

3.反萃过程同实施例3，采用不同的反萃时间，其结果见附图6，图6中，—■—为单一CTAB反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH值的变化而变化的曲线；▲—为CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH值的变化而变化的曲线；——为CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相pH值的变化而变化的曲线；从图6可知，CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相、CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相较单一反胶团相的对BSA的反萃率高。

实施例7：用本发明的方法萃取并反萃BSA：

本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相含有1.0mg/ml的溴化钾、pH值为4.30的缓冲液；

1.配制CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相、CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相和CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相中，CTAB的浓度均为50毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-酮酯混合反胶团相体积的20％，甲基异丁基酮的体积占CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相体积的2.0％，乙酸丁酯的体积占CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积均占CTAB-酮酯混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；

2.萃取过程同实施例1；

3.反萃过程同实施例3，其结果见附图7，图7中，—■—为单—CTAB反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间的变化而变化的曲线；▲—为CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间的变化而变化的曲线；——为CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃时间的变化而变化的曲线；从图7可知，当反萃水相含1.0mol/L溴化钾，pH值为4.30的缓冲液时，CTAB-CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相、CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相能显著降低CTAB体系达到反萃平衡的时间，而单一CTAB反胶团相需要较长的时间才能达到反萃平衡；经过相同混合时间，混合反胶团相的蛋白质转移率高于单一反胶团相的蛋白质转移率。

实施例8：用本发明的方法萃取并反萃BSA：

本实施例中，萃取水相同实施例1，pH值为9.10；反萃水相为含不同浓度的溴化钾、pH值为4.30的缓冲液；

1.分别配制CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相、CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相和单一CTAB反胶团相，配制方法同实施例1，得到的两种CTAB-混合反胶团相中，CTAB的浓度均为50毫摩尔/升，正己醇的体积均占CTAB-醛酮酯混合反胶团相体积的20％，甲基异丁基酮、乙酸丁酯的体积分别占CTAB-醛酮酯混合反胶团相体积的2.0％，蒸馏水的体积均占CTAB-醛酮酯混合反胶团相体积的1.2％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的2.0％，其余为石油醚；

2.萃取过程同实施例1；

3.反萃过程同实施例3，其结果见附图8，图8中，—■—为单一CTAB反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相的离子强度的变化而变化的曲线；▲—为CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相的离子强度的变化而变化的曲线；——为CTAB-乙酸丁酯混合反胶团相反萃BSA的反萃率随反萃水相的离子强度的变化而变化的曲线；从图8可知，当反萃水相pH值为4.30，含不同浓度的溴化钾时，甲基异丁基酮的添加能显著提高CTAB体系对BSA的反萃率。

实施例9：用本发明的方法萃取BSA：

本实施例中，萃取水相同实施例1；

1.配制CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相，配制方法同实施例1，得到的CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相中，CTAB的浓度为10亳摩尔/升，正丁醇的体积占CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相体积的0.5％，甲基异丁基酮体积占CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相体积的2％，其余为石油醚；

2.萃取过程同实施例1；

其实验结果表明，CTAB-甲基异丁基酮混合反胶团相对BSA的萃取率比单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率高。

本实施例，也可采用三甲基烷基(C₁₀-C₁₆)氯化铵或三甲基烷基(C₁₇-C₂₀)氯化铵，配置三甲基烷基(C₁₀-C₁₆)氯化铵-甲基异丁基酮混合反胶团相或三甲基烷基(C₁₇-C₂₀)氯化铵-甲基异丁基酮混合反胶团相，其对BSA的萃取率也高于单一三甲基烷基(C₁₀-C₁₆)氯化铵相或单一三甲基烷基(C₁₇-C₂₀)氯化铵反胶团相对BSA的萃取率。

本实施例也可采用正辛醛、十五醛、甲基己基甲酮、乙酸戊酯或乙酸异戊酯，配置CTAB-正辛醛混合反胶团相、CTAB-十五醛混合反胶团相、CTAB-甲基己基甲酮混合反胶团相、CTAB-乙酸戊酯混合反胶团相或CTAB-乙酸异戊酯混合反胶团相，其对BSA的萃取率也高于单一CTAB反胶团相对BSA的萃取率。

实施例10：用本发明的方法萃取BSA：

本实施例中，萃取水相同实施例1，

1.分别配制二烷基二甲基氯化铵-甲基丁基酮混合反胶团相和单一CTAB反胶团相；配制方法同实施例1，得到的二烷基二甲基氯化铵-甲基丁基酮混合反胶团相中，二烷基二甲基氯化铵的浓度为100毫摩尔/升，正辛醇的体积占二烷基二甲基氯化铵-甲基丁基酮混合反胶团相体积的10％，甲基丁基酮的体积占二烷基二甲基氯化铵-甲基丁基酮混合反胶团相体积的20％，蒸馏水的体积占二烷基二甲基氯化铵-甲基丁基酮混合反胶团相体积的1.0％，其余为石油醚；单一CTAB反胶团相中，CTAB的浓度为100毫摩尔/升，正辛醇的体积占单一CTAB反胶团相体积的5％，蒸馏水的体积占单一CTAB反胶团相体积的0.5％，其余为石油醚；

2.萃取过程同实施例1；

3.反萃过程同实施例3，反胶团相与反萃水相的体积比为50∶1；

其实验结果表明，甲基丁基酮的添加能显著提高二烷基二甲基氯化铵反胶团相对BSA的反萃率。

本实施例，也可采用氯化甲基三辛铵或氯化甲基三正十二铵，配制氯化甲基三辛铵-乙酸戊酯混合反胶团相或氯化甲基三正十二铵-乙酸戊酯混合反胶团相，其对BSA的萃取率也高于单一氯化甲基三辛铵相或单一氯化甲基三正十二铵反胶团相对BSA的萃取率。

实施例11：用本发明的方法萃取α-淀粉酶：

本实施例中，萃取水相为含0.10摩尔/升的氯化钾和1.0毫克/毫升的α-淀粉酶(AM)的不同pH的缓冲液；

1)配制Aliquat 336(三烷基甲基氯化铵)-甲基异丁基酮混合反胶团相和单一Aliquat 336反胶团相，配制方法同实施例1，得到的Aliquat 336(三烷基甲基氯化铵)-甲基异丁基酮混合反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占混合反胶团相体积的0.5％，甲基异丁基酮的体积占混合反胶团相体积的2％，蒸馏水的体积占混合反胶团相体积的0.5％，其余为石油醚；单一Aliquat 336反胶团相中，CTAB的浓度为50毫摩尔/升，正己醇的体积占单一Aliquat 336反胶团相体积的0.5％，蒸馏水的体积占单一Aliquat 336反胶团相体积的0.5％，其余为石油醚。2)萃取过程同实施例l，萃取水相与反胶团相的体积比为50∶1；

其实验结果表明，Aliquat 336-甲基异丁基酮混合反胶团相对α-淀粉酶的萃取率比单一Aliquat 336反胶团相对α-淀粉酶的萃取率高。

本实施例，也可采用氯化甲基三辛铵或氯化甲基三正十二铵，配制氯化甲基三辛铵-乙酸戊酯混合反胶团相或氯化甲基三正十二铵-乙酸戊酯混合反胶团相，其对α-淀粉酶的萃取率也高于单一氯化甲基三辛铵相或单一氯化甲基三正十二铵反胶团相对α-淀粉酶的萃取率。

Claims (6)

1.一种添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其工艺步骤如下：

1)配制由阳离子型表面活性剂、助表面活性剂、醛酮酯有机物、水和有机溶剂组成的阳离子-醛酮酯混合反胶团相；

所述阳离子-醛酮酯混合反胶团相的配制如下：首先称取或移取一定量的阳离子型表面活性剂，并向其中依次加入助表面活性剂、醛酮酯有机物、水和有机溶剂，均匀混合，振荡后静置，至阳离子型表面活性剂和醛酮酯完全溶解，再加入有机溶剂定容，即制得阳离子-醛酮酯混合反胶团相；

所配制的阳离子-醛酮酯混合反胶团相与所加入的助表面活性剂的体积比为100∶0.10-20；

所配制的阳离子-醛酮酯混合反胶团相与所加入的醛酮酯物质的体积比为100∶0.5-20；

所配制的阳离子-醛酮酯混合反胶团相与所加入的水的体积比为100∶0.5-3；

阳离子型表面活性剂在所配制的阳离子-醛酮酯混合反胶团相中的浓度为10毫摩尔-200毫摩尔/升；

2)将阳离子-醛酮酯混合反胶团相与萃取水相按1∶1-1∶50的比例混合，进行萃取；

3)将阳离子-醛酮酯混合反胶团相与反萃水相按1∶1-50∶1的比例混合，进行反萃。

2.按权利要求1所述的添加醛酮酯萃取剂提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于：所述醛酮酯有机物为醛RCHO、酮RR′CO或酯RCOOR′。

3.按权利要求2所述的添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于：所述烷基R、R′为1个碳至15个碳原子的烷基。

4.按权利要求1所述的添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于：所述阳离子型表面活性剂为三烷基甲基季铵盐、二烷基二甲基季铵盐、烷基三甲基季铵盐。

5.按权利要求1所述的添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于：所述的助表面活性剂为烷基醇类。

6.按权利要求1所述的添加醛酮酯提高反胶团相对生物物质萃取率和反萃率的方法，其特征在于：所述的有机溶剂为单一液态烷烃或混合液态烷烃。

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