CN1189475C - 分离和纯化促卵泡激素和黄体生成激素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从粗制HMG，优选地从尿提取物起始分离和纯化FSH和LH的特别简单和经济的新方法，包括以下步骤：选择性地在含水乙醇中去除粗制HMG所含的病毒；在DEAE型弱碱性阴离子树脂上离子交换层析；在含antraquinone衍生物作为配体的树脂上亲和层析；选择性地，在强碱性阴离子树脂上离子交换层析；由此得到的特别纯的并具有高特异活性的激素可以随后进行去除热源的步骤。
Description
发明领域
本发明涉及从粗制的人绝经期促性腺激素(HMG)，特别地从绝经或绝经后妇女的尿提取物起始分离和纯化促卵泡激素(FSH)和黄体生成激素(LH)的特别简单和经济的新方法。
现有技术
通常认为FSH和LH是促性腺激素或人可育性激素。这些原始生理学效应是促进在这样的生物过程中涉及的配子发生和/或类固醇合成的化合物，可从天然来源垂体、人和动物血浆以及绝经或绝经后妇女的尿中充裕地得到。FSH和LH以混合物的形式从这些天然来源提取，通常称为人绝经期促性腺激素(HMG)，HMG也可以作为粗提物从市场上得到；该混合物由约1∶1比例的FSH和LH结合其它尿蛋白组成。然而这些提取物的纯度水平低，这主要是由于其它蛋白的污染，所以不适合用于治疗目的在人体中施用。
在本领域内已开发了几种基本上基于离心、沉淀、层析和过滤技术从天然来源的产品起始纯化FSH和LH的方法，其目的是减少上述的蛋白污染。
美国专利号3,674,865描述了从尿提取物中纯化FSH；这一方法总共包括21个不同步骤，仍得到FSH和LH的混合物，FSH和LH比例在3∶1-6∶1之间变动。
美国专利号3,973,004(Derwent提取物)描述了通过用硫酸铵选择性沉淀从垂体中分离FSH，同时在美国专利4,115,375(权利要求书，美国专利摘要)中描述了用聚乙二醇作为沉淀剂。
然而，上述方法的缺点是最终得到的产品的特异活性和纯度不能令人满意。尤其是，蛋白污染的存在诱导过敏反应，因此上述激素只能通过特定的施用途经，如肌肉注射摄入，在应用中涉及相当多的困难。
最近，已建立一些使用免疫亲和层析和特异的单克隆抗体(欧洲专利EP 0 322 438；欧洲专利申请EPA 0 328 248，Derwent提取物)或重组DNA技术(国际专利申请WO85/01958)的纯化方法。尽管这些方法可以得到具高特异活性的产品，但是这些方法由于可能的污染而有严重问题，可能的污染来自病毒及宿主细胞中的异源蛋白和DNA残留物；因此来自这些方法的产品不得不得到认真纯化并在使用它们治疗之前得到测试以排除可能污染的存在。
因此，很明显需要一种方法，这种方法能得到高纯度和高特异活性的产品，并且没有上述的缺点。
发明概述
本发明的目的是从粗制的HMG起始分离和纯化FSH和LH的方法，这种方法能够得到具高纯度和高特异活性的这两种激素。上述方法包括以下步骤：
1)选择性地，在80-90％(体积/体积)乙醇水溶液中清除所述粗制HMG的所含病毒；
2)将在步骤(1)中得到的产物上样到含DEAE型弱碱性阴离子树脂的离子交换层析柱上，用含5-15％(体积/体积)乙醇和离子强度逐渐增加的0-70mM NaCl的10-50mM磷酸缓冲液(pH7.0-8.0)选择性地洗脱LH和FSH；
3)将在步骤(2)中得到的含LH或FSH的洗脱物上样到在惰性支持物上有由antraquinone衍生物组成的配体的亲和层析柱上，用碱性pH溶液(含有从0-3M KCl得到的逐渐增加的离子强度)选择性地洗脱污染蛋白和FSH或LH；
4)选择性地，将在步骤(3)中得到的FSH激素上样到含季铵基团的强碱性阴离子树脂离子交换层析柱上，在碱性PH下用具有逐渐增加的离子强度的0-400mM NaCl溶液选择性地洗脱污染蛋白和FSH。
另外，在上述步骤(3)或(4)中得到FSH和LH激素可以被去除热源并冻干或冷冻。
发明详述
根据本发明的方法的特征和优点将在以下详细描述中更好的报告。
通过在离子交换和亲和树脂上简单的提取和容易的纯化步骤，本发明的方法能得到具高特异活性和高纯度的FSH和LH，这样不需要进一步纯化处理，它们就能用于治疗施用给人体。这种方法特别简单经济，而且因为它主要在水性手段中进行，所以它也具有使用的有机溶剂数量非常有限的优点。
起始的粗制HMG优选地是从绝经或绝经后妇女的尿中得到的尿浓缩物；根据本发明优选的实施方式，所述的起始HMG具有低于10I.U./mg，更优选地在2到10I.U./mg之间变动的FSH特异活性和0.5-5I.U./mg的LH特异活性。
在本发明的方法的步骤(1)中，优选地在-20℃和5℃之间温度下，将粗制HMG悬浮于80-90％(体积/体积)乙醇水溶液中，放置1-4小时。
进行这种处理是为了清除粗制HMG的病毒水平，这对于纯化后在药学领域中的应用是必须的。
在本发明的方法的步骤(2)中，在0℃-8℃，优选地0℃-6℃下，将在步骤(1)中已选择性地清除了病毒水平的固体残留物溶于在5-50mM磷酸缓冲液中的5-15％(体积/体积)乙醇水溶液中，磷酸缓冲液优选地含有10-30mM磷酸钠，pH范围为7.3-7.6。
在0℃-8℃温度范围将这样得到的溶液上样到含DEAE型弱碱性阴离子树脂的离子交换层析柱上，优选地使用含5-50mM磷酸缓冲液(优选地含10-30mM磷酸钠，pH为7.3-7.6)的5-15％(体积/体积)乙醇水溶液作为条件缓冲液。上述防离子树脂优选地在纤维素基质上含叔胺基团，选择性地含季铵基团，更优选地是DEAE纤维素(例如DE52Whatman)。
当柱直径/长度比为0.3-0.6，蛋白总上样量为每毫升树脂20-50mg时，优选的流速范围是10-30ml/cm2·小时。
吸附在树脂上的LH激素优选地用在10-50mM磷酸盐缓冲液(优选地含10-30mM磷酸钠，pH7.3-7.6)中的5-15％(体积/体积)乙醇水溶液洗脱。上述导致只有LH得到回收的洗脱优选地在0-8℃温度下进行。
吸附在树脂上的FSH激素随后用在10-50mM磷酸缓冲液(优选地含10-30mM磷酸钠，pH7.3-7.6，含30-50mM NaCl)中的5-15％(体积/体积)乙醇水溶液洗脱。上述洗脱优选地在0-8℃温度下进行。在这一步骤中，乙醇在洗脱缓冲溶液中的存在起决定作用，因为它能使LH和FSH更好地分离，并使两种激素的回收产率更高。
在本发明的方法的步骤(3)中，通过含antraquinone衍生物，优选地Cibacron Blue(与惰性支持物，优选地琼脂糖共价连接)作为配体的亲和层析，优选地使用含Agarose Blue的亲和层析柱，对从步骤(2)得到的含LH和FSH的洗脱物分别进行进一步的纯化程序。
优选地将上述洗脱物酸化至pH5.5和7.5，并于0℃-8℃温度范围上样到上述柱子上，柱子事先在10-30mM醋酸缓冲液(优选地含醋酸钠，pH5.5-7.5)中平衡。
当柱直径/长度比为0.5-0.9，蛋白总上样量为每ml树脂5-15mg时，优选的流速范围为7-14ml/cm2·小时。
然后用一种或多种40-60mM甘氨酸-NaOH缓冲液(选择性地含0-3M浓度范围的KCl，具有逐渐增加的离子强度，将pH改变到8.5-10)选择性地洗脱吸附在柱子上的FSH或LH激素，从而与污染蛋白分开。
然后可以用本领域已知的方法对这样得到的激素进行浓缩并脱盐，用于随后的冷冻或冻干。
根据本发明的方法的优选实施方式，用本领域已知的方法将去盐的LH激素冻干并且随后可以去除热源。
根据步骤(4)，在步骤(3)中得到的FSH激素一旦去盐可得到进一步的纯化，纯化步骤通过在强碱性阴离子树脂上离子交换层析进行；这样的强碱性阴离子树脂在纤维素基质上含季铵基团，并选择性地与叔胺基团结合；纤维素基质优选的是DE53 Whatman。
FSH优选地通过在10-50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0-9.5)中透析平衡，并上样到利用同样缓冲液平衡的柱子上。
当柱直径/长度比为0.08-0.3，蛋白总上样量在每ml树脂0.5-10mg范围内时，优选的流速范围是20-40ml/cm2·小时。
最初用10-50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0-9.5，含一定浓度，优选地40-80mM NaCl)洗脱柱子，由此得到污染蛋白的洗脱。
随后用线性NaCl浓度梯度洗脱结合在树脂上的FSH激素，NaCl浓度梯度优选地在10-50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0-9.5)中含70-100mM至140-400mM NaCl。
这样得到的纯化FSH激素用本领域已知的方法超滤去盐，冷冻干燥并去除热源。
根据本发明优选的实施方案，在步骤(3)或(4)中得到的FSH和LH的去热源过程如下进行：纯化激素的冻干粉末在-15℃和0℃之间的温度下溶于含5-15％(重量/体积)乙酸铵的30-50％(体积/体积)乙醇水溶液中。
然后向此溶液加入3-8mM磷酸钠(tribasic sodium phosphate)和3-8mM乙酸钙；然后用氢氧化钠将pH值提高到8-10。离心后，在-20℃和0℃之间的温度下向得到的上清中加入1.5-2.5倍于每个上清体积的纯乙醇。根据本领域已知的方法，再一次离心后，重新将所得沉淀溶于水并透析。
最后，含纯化LH或FSH的溶液可以以溶液形式冷冻或根据本领域已知的方法冻干，这样可以保持激素活性不变以便于长期贮存。
用本发明的方法能够得到非常高纯度的FSH和LH，分别地，FSH具有超过6,000I.U./mg的特异活性，并且无LH活性；而LH具有超过500I.U./mg的特异活性。
以下报告的本发明的实施例是作为例证而不是为限制性目的。
实施例1：从粗制尿HMG纯化FSH
1.1
在含水乙醇中清除粗制HMG的病毒水平
除非有不同的说明，所有此后提及的操作都在0℃-6℃温度范围下进行。
在-10℃温度下，将200g从绝经或绝经后妇女的尿中得到的粗制HMG悬浮于10升乙醇/水混合物(85∶15，体积/体积)中。将这样得到的悬浮液保持在-10℃温度下，持续搅拌3小时，然后使用GS3Sorvall转子于7,000rpm离20分钟；去除上清后，回收沉淀。
1.2
在DE52上的离子交换层析
将步骤1.1中得到的沉淀溶于2升含20mM磷酸钠的10％乙醇溶液(pH7.3)中。使用GS3 Sorvall转子将这样得到的溶液于7,000rpm离心30分钟，并将得到的上清上样到DE52 Whatman离子交换柱(1995目录号4057910)上。所用的DE52 Whatman离子交换柱以二乙氨乙基纤维素为基础，直径为14cm，长为36cm，并已在含10％(体积/体积)乙醇的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)中平衡。在层析过程中，以3升/小时的速率洗脱柱子，以约700ml的级分收集洗脱物。
上样后，按以下顺序洗脱柱子：
a)10升含20mM磷酸钠的10％(体积/体积)乙醇(pH＝7.3)；
b)40升含20mM磷酸钠和40mM氯化钠的10％(体积/体积)乙醇(pH＝7.3)；
层析后，测定每个洗脱物组分于280nm的光密度(OD280)，以及LH和FSH活性。图1表示得到的层析谱，其中报告了洗脱物组分的LH和FSH特异活性(I.U./ml)和光密度。
这样的层析谱清楚地表明LH由缓冲溶液(a)洗脱，而FSH由含40mMNaCl的缓冲溶液(b)洗脱。特别地，如实施例2中所述收集含LH的组分6-20并进一步纯化；如下述收集含FSH的组分28-41并纯化。
1.3
通过在Agarose Blue上亲和层析纯化FSH
使用Agarose Blue 3 GA亲和树脂(Sigma化学公司，St.Louis，Mo，1995年目录号C1410)；在装入层析柱之前，用下列试剂洗该树脂：
10升在0.5％ Na2CO3中的2.5M KCl溶液，1小时；
10升0.5％ Na2CO3溶液，30分钟；
10升6M尿素溶液，2小时；
10升水，30分钟；
10升0.5％ Na2CO3溶液，30分钟；
10升水，30分钟；
10升50mM乙酸钠缓冲液(pH6.5)，30分钟；
10升20mM乙酸钠缓冲液(pH6.5)，30分钟；
将在20mM乙酸钠缓冲液(pH6.5)中平衡的树脂装入层析柱中得到直径11cm、高16cm的树脂基质。
将在步骤1.2中得到的含FSH的样品用1.7M乙酸调节pH到6.5，并上样到柱子中。
于1升/小时流速进行样品的上样和其进一步的洗脱。在向柱子上样期间回收的洗脱物被收集在单一组分中，而随后再收集约700ml的级份。
上样后，首先按以下顺序洗脱柱子：
1升20mM醋酸钠缓冲液，pH＝6.5；
5升50mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH＝10；
3升50mM甘氨酸-NaOH，0.2M KCl缓冲液，pH＝9；
然后用如下制备的在甘氨酸-NaOH缓冲液中的KCl线性梯度洗脱：
容器1)9升在50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中的0.3M KCl，pH＝9；
容器2)9升在50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中的2.5M KCl，pH＝9；
层析后，测定每个洗脱物组分在280nm的光密度值(OD280)和FSH特异活性(I.U./ml)。图2表示所得的层析谱。
在上样期间，FSH保留在柱子中而大部分污染蛋白在洗脱物中发现(未在图中表示)。仍然滞留在树脂上的一些污染蛋白首先用含0.3MKCl的缓冲液洗，在这些条件下没有观察到FSH的洗脱。
随后用KCl梯度洗脱(从组分14开始)，首先得到其它污染蛋白的清除(大约从组分15到组分20)；FSH的洗脱在更高的KCl浓度下出现，表现为对称峰(从组分22到组分29)。
之后，将组分23-28收集在一起；用1.7M乙酸将所得产物的pH调到7.5；然后产物本身可通过超滤浓缩和去盐，超滤时使用带AmiconPM10膜的Amicon过滤器。
1.4
在DE53上的离子交换层析
已事先如步骤1.3中所述得到浓缩并去盐的FSH样品逆着5升25mM Tris-HCl缓冲液(pH9.3)透析18小时；之后将样品上样到DE 53Whatman离子交换层析柱(1995目录号4058910)上；所用层析柱直径2cm，高18cm，并已用25mM Tris-HCl缓冲液(pH＝9.3)平衡。以100ml/小时的流速洗脱柱子，以约18ml的级分收集洗脱物。
上样后，首先用450ml含80mM NaCl的25mM Tris-HCl缓冲液(pH9.3)洗脱柱子，然后用如下制备的NaCl线性梯度洗脱：
容器1)600ml在25mM Tris-HCl缓冲液中的90mM NaCl，pH＝9.3；
容器2)600ml在25mM Tris-HCl缓冲液中的160mM NaCl，pH＝9.3；
图3表示了所得的层析谱，其中表示了每个洗脱物组分于280nm时的光密度(OD280)及FSH特异活性(I.U./ml)。
层析谱清楚地表明用含80mM NaCl的起始洗脱溶液洗导致一些污染蛋白的清除，而FSH仍保留在柱子上。相反，从组分30开始，用NaCl梯度可选择性地从污染蛋白中洗脱FSH。将组分31-40收集在一起，通过使用装有Amicon PM10膜的Amicon过滤器浓缩去盐，并最终得到冷冻干燥。
1.5
FSH的去热源作用
将109g在前述步骤中得到的冷冻干燥的FSH溶解于55ml含40％(体积/体积)乙醇和10％(重量/体积)乙酸铵的冷溶液中。通过冰盐浴，将溶液温度保持在约-10℃并持续进行磁力搅拌，同时向溶液中加入下列成分：
1.2ml 7.6％十二水合磷酸钠(tribasic sodium phosphate)水溶液；
1.4ml 4.9％乙酸钙水溶液。
用20％(重量/体积)NaOH将pH提高到约8.5，继续在约-10℃温度下持续搅拌溶液30分钟，然后在Sorvall SS34转子中于8,000rpm离心30分钟。去除沉淀，在冰盐浴中将收集的上清(57ml)冷却至约-10℃并进行搅拌。
加入114ml预冷至-20℃的95％(体积/体积)乙醇，然后将溶液于-20℃温度下持续搅拌约30分钟并放置12小时。
在0-4℃低温离心机中于8,000rpm离心30分钟，然后去除上清并将沉淀重新溶于80ml无热源的水中。将这样得到的溶液逆着10升无热源水透析，然后冷冻干燥。
图4表示含1.1mg/ml根据上述方法纯化的FSH的溶液的吸收光谱。用放射免疫方法，使用Serono FSH Maiclone试剂盒(目录号13101)测定这样纯化的FSH的活性，相当于6,870I.U./mg蛋白。根据含1mg/ml FSH的水溶液在277nm得到光密度0.62(在1cm光径的石英比色杯中)，计算纯化的FSH中的蛋白浓度。此折算率在制备过程中根据实验结果确定，即于277nm测定含有称重的事先冻干的无盐激素的溶液的吸光度。已证明在具4,000-10,000I.U./mg FSH特异活性的纯化激素样品中，此折算率比其它蛋白测定方法更可靠。低纯度组分(例如在步骤1.2中得到的那些)的蛋白浓度使用BCA ProteinAssevy Pierce(Pierce目录号23223和23224)，用牛血清白蛋白作为标准进行测定。
关于FSH纯化(如在步骤1.1-1.5中描述的进行纯化)的资料在表1中表示。
表1
| 组分 | 体积(ml) | 总蛋白(mg) | 总FSH(I.U.) | 总LH(I.U.) | FSH特异活性(I.U./mg) | FSH/LH比 |
| 来自步骤1.1的溶液 | 2,200 | 195,000 | 1,384,000 | 未测出 | 7.1 | 未测出 |
| 来自步骤1.2 DE52的FSH | 9,700 | 18,516 | 1,148,600 | 27,000 | 62 | 43 |
| 来自步骤1.3 AgaroseBlue的FSH | 170 | 229 | 961,300 | 13,850 | 4,198 | 69 |
| 来自步骤1.4 DE53的FSH | 92 | 125 | 788,230 | 2,513 | 6,306 | 313 |
| 步骤1.5去热源的FSH | 99 | 109 | 748,780 | 2,572 | 6,870 | 291 |
| 2个月(-20℃)后来自步骤1.5的FSH | 109 | 743,230 | 未测出 | 6,818 | 未测出 | |
| 4个月(-20℃)后来自步骤1.5的FSH | 109 | 741,640 | 未测出 | 6,804 | 未测出 |
表2表示在根据实施例1中所述的方法进行的进一步FSH纯化实验中得到的结果
表2
| 组分 | 体积(ml) | 总蛋白(mg) | 总FSH(I.U.) | 总LH(I.U.) | FSH特异活性(I.U./mg) | FSH/LH比 |
| 来自步骤1.1的溶液 | 2,200 | 205,000 | 1,050,000 | 未测出 | 6.1 | 未测出 |
| 来自步骤1.2 DE52的FSH | 9,700 | 19,800 | 1,012,000 | 21,360 | 51 | 47 |
| 来自步骤1.3 AgaroseBlue的FSH | 170 | 232 | 805,000 | 9,050 | 3,470 | 90 |
| 来自步骤1.4 DE53的FSH | 90 | 115 | 680,220 | 2,305 | 5,915 | 295 |
| 步骤1.5去热源的FSH | 87 | 97 | 631,620 | 2,110 | 6,511 | 299 |
| 2个月(-20℃)后来自步骤1.5的FSH | 97 | 630,450 | 未测出 | 6,499 | 未测出 | |
| 4个月(-20℃)后来自步骤1.5的FSH | 97 | 629,880 | 未测出 | 6,494 | 未测出 |
实施例2：从粗制尿HMG纯化LH
关于在含水乙醇中清除粗制HMG的病毒水平和在DE52上进行离子交换层析的步骤2.1和2.2，对于FSH和LH是相同的，如实施例1的1.1和1.2项中所述的进行。
2.3
通过在Agarose Blue上亲和层析纯化FSH
Agarose Blue 3 GA亲和树脂如1.3项中所述的得到制备。
然后将树脂在20mM乙酸钠缓冲液(pH＝6.5)中平衡，并装入层析柱中以得到直径11cm、高16cm的树脂基质。
将如1.2项中所述得到的含LH的样品用1.7M乙酸调节pH到6.5，并按1升/小时的流速上样到柱子上。将向柱子上样期间得到的洗脱物收集在单一组分中，随后再收集约600ml的级分。
上样后，首先按以下顺序洗脱柱子：
1升20mM乙酸钠缓冲液，pH＝6.5；
5升50mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH＝10；
2升50mM甘氨酸-NaOH，0.15M KCl缓冲液，pH＝9；
然后用如下制备的在甘氨酸-NaOH缓冲液中的KCl线性梯度洗脱：
容器1)8升在50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中的0.15M KCl，pH＝10；
2)8升在50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中的1.7M KCl，pH＝10。
层析后，测定每个组分在280nm的光密度值(OD280)和LH特异活性(I.U./ml)。
图5表示如上所述得到的洗脱层析谱。在向柱子上样期间，LH保留在柱子中而大部分污染蛋白在洗脱物中发现(未在图中表示)。在梯度洗脱之前通过用pH＝10的两种缓冲液进行冲洗将仍然滞留在树脂上的一些污染蛋白洗脱出来。
用KCl梯度洗脱LH：低KCl浓度导致其它污染蛋白的洗脱，而在高离子浓度时出现LH的洗脱。
然后将组分17-25收集在一起，用1.7M乙酸将pH值调节到7.5。然后通过在Amicon PM10膜上的超滤将溶液浓缩并去盐，并且最后冷冻干燥。
2.4
LH的去热源作用
将205g在前述步骤中得到的冷冻干燥的LH溶解于102ml含40％(体积/体积)乙醇和10％(重量/体积)乙酸铵的溶液中。通过冰盐浴，将溶液温度保持在约-10℃并持续进行磁力搅拌，同时向溶液中加入下列成分：
2.25ml 7.6％十二水合磷酸钠(tribasic sodium phosphate)水溶液；
2.7ml 7.6乙酸钙水溶液。
在用20％(重量/体积)NaOH将pH提高到约8.5之后，继续在约-10℃温度下持续搅拌溶液30分钟，然后在Sorvall SS34转子中于8,000rpm离心30分钟。去除沉淀，在冰盐浴中将收集的上清(107ml)保持在约-10℃温度下并进行搅拌。
加入214ml预冷至-20℃的95％(体积/体积)乙醇，并将溶液于-20℃温度下持续搅拌约30分钟并放置12小时。
在0-4℃低温离心机中于8,000rpm离心30分钟，然后去除上清并将沉淀重新溶解于125ml无热源的水中。将这样得到的溶液逆着10升无热源水透析，然后冷冻干燥。
图6表示含2.8mg/ml根据上述方法纯化的LH的水溶液的紫外光谱。用放射免疫方法，使用Serono LH Maiclone试剂盒(目录号13201)测定纯化的LH的特异活性，相当于521I.U./mg蛋白。用BCA ProteinAssay Pierce(Pierce目录号23223和23224)，使用牛血清白蛋白作为标准测定蛋白浓度。关于根据上述步骤进行的LH纯化的资料在表3中表示。
表3
| 组分 | 体积(ml) | 总蛋白(mg) | 总FSH(I.U.) | 总LH(I.U.) | LH特异活性(I.U./mg) | FSH/LH比 |
| 来自步骤1.1的溶液 | 2,200 | 195,000 | 1,384,000 | 未测出 | 来测出 | 未测出 |
| 来自步骤1.2 DE52的LH | 10,700 | 8,970 | 30,400 | 171,500 | 19 | 0.18 |
| 来自步骤2.3 AgaroseBlue的LH | 190 | 307 | 21,280 | 117,000 | 381 | 0.18 |
| 步骤2.4去热源的LH | 125 | 205 | 19,600 | 106,800 | 521 | 0.18 |
| 2个月(-20℃)后来自步骤2.4的LH | 205 | 未测出 | 106,400 | 519 | 未测出 | |
| 4个月(-20℃)后来自步骤2.4的LH | 205 | 未测出 | 105,400 | 514 | 未测出 |
表4表示在用实施例2中所述的方法进行的进一步LH纯化实验中得到的结果。
表4
| 组分 | 体积(ml) | 总蛋白(mg) | 总FSH(I.U.) | 总LH(I.U.) | LH特异活性(I.U./mg) | FSH/LH比 |
| 来自步骤1.1的溶液 | 2,200 | 205,000 | 1,250,000 | 未测出 | 未测出 | 未测出 |
| 来自步骤1.2 DE52的LH | 10,600 | 11,785 | 18,400 | 165,000 | 14 | 0.11 |
| 来自步骤2.3 AgaroseBlue的LH | 110 | 260 | 10,700 | 105,600 | 406 | 0.1 |
| 步骤2.4去热源的LH | 120 | 185 | 9,470 | 97,800 | 529 | 0.1 |
| 2个月(-20℃)后来自步骤2.4的LH | 185 | 未测出 | 96,800 | 523 | 未测出 | |
| 4个月(-20℃)后来自步骤2.4的LH | 185 | 未测出 | 96,450 | 521 | 未测出 |
Claims (20)
1.一种从粗制人绝经期促性腺激素起始分离和纯化促卵泡激素和黄体生成激素的方法，包括以下步骤：
1)将粗人绝经期促性腺激素上样到二乙基氨基乙基纤维素型弱碱性阴离子树脂的离子交换层析柱上，用5-15％v/v乙醇水溶液，其中含离子强度逐渐增加的0-70mM NaCl，10-50mM磷酸缓冲液，pH7.0-8.0，分别洗脱黄体生成激素和促卵泡激素；且
2)将在步骤(1)中得到的含黄体生成激素或促卵泡激素的洗脱物上样到含antraquinone衍生物作为配体的亲和层析柱上，用具有逐渐增加的离子强度的0-3M KCl碱性pH溶液从污染蛋白中洗脱促卵泡激素或黄体生成激素。
2.权利要求1所述的方法，其还包括在步骤1)之前于80-90％v/v乙醇水溶液中清除所述粗制人绝经期促性腺激素的病毒的步骤。
3.权利要求1所述的方法，其还包括步骤3)：将在步骤(2)中得到的促卵泡激素上样到含强碱性阴离子树脂的离子交换层析柱上，并用具有逐渐增加的离子强度的0-400mM NaCl溶液在碱性pH下从污染蛋白中洗脱促卵泡激素。
4.权利要求2所述的方法，其还包括步骤3)：将在步骤(2)中得到的促卵泡激素上样到含强碱性阴离子树脂的离子交换层析柱上，并用具有逐渐增加的离子强度的0-400mM NaCl溶液在碱性pH下从污染蛋白中洗脱促卵泡激素。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述粗制人绝经期促性腺激素来自绝经或绝经后妇女的尿液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用所述乙醇水溶液在-20℃-5℃温度下处理所述粗制人绝经期促性腺激素1-4小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述弱碱性阴离子树脂是二乙基氨基乙基纤维素。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述离子交换层析柱事先用含5-50mM磷酸缓冲液，pH7.3-7.6的5-15％v/v乙醇水溶液在0℃-8℃温度下平衡。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述离子交换层析柱事先用含5-50mM磷酸缓冲液，pH7.3-7.6的5-15％v/v乙醇水溶液在0℃-8℃温度下平衡。
10.根据权利要求1、7、8或9所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，用含10-30mM磷酸钠，pH7.3-7.6的5-15％v/v乙醇水溶液在0℃-8℃温度下从柱子上洗脱黄体生成激素。
11.根据权利要求1、7、8或9中所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，用含10-30mM磷酸钠和30-50mM氯化钠，pH7.3-7.6的5-15％v/v乙醇水溶液在0℃-8℃温度下从柱子上洗脱促卵泡激素。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述antraquinone衍生物是Cibacron Blue。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述亲和层析柱由Agarose Blue构成。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述亲和层析柱由Agarose Blue构成。
15.根据权利要求1、12、13或14所述的方法，其特征在于，所述亲和层析柱事先用10-30mM乙酸缓冲液，pH5.5-7.5，平衡。
16.根据权利要求1、12、13或14所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，用一种或多种含0-3M KCl的40-60mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH值由8.5-11改变，洗脱黄体生成激素或促卵泡激素。
17.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述强碱性阴离子树脂在纤维素基质上包含季铵基团。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述的离子交换层析柱事先用10-50mM Tris-HCl缓冲液，pH9.0-9.5，平衡。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述污染蛋白用含40-80mM NaCl，pH9.0-9.5，的10-50mMTris-HCl缓冲液洗脱，所述促卵泡激素用在10-50mM Tris-HCl缓冲液，pH9.0-9.5，中的浓度范围从70到400mM的NaCl梯度洗脱。
20.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、14、17或18的任意一项所述的方法，其特征在于，将在步骤(2)或(3)中得到的促卵泡激素或黄体生成激素冷冻干燥或冷冻，并去除热原。
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| CNB99101376XA CN1189475C (zh) | 1999-01-26 | 1999-01-26 | 分离和纯化促卵泡激素和黄体生成激素的方法 |
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| CNB99101376XA CN1189475C (zh) | 1999-01-26 | 1999-01-26 | 分离和纯化促卵泡激素和黄体生成激素的方法 |
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