JPS58124721A - 脳下垂体前葉ホルモンの精製法 - Google Patents
脳下垂体前葉ホルモンの精製法Info
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- JPS58124721A JPS58124721A JP57150611A JP15061182A JPS58124721A JP S58124721 A JPS58124721 A JP S58124721A JP 57150611 A JP57150611 A JP 57150611A JP 15061182 A JP15061182 A JP 15061182A JP S58124721 A JPS58124721 A JP S58124721A
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/575—Hormones
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/854—Glands
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、タンパク質の精製（＝関する。さら４：靜し
くは、本発明は、脳下垂体前葉ホにモン、六とえは、生
長ホルモン１六はプロラクチンの精製４：関する。
くは、本発明は、脳下垂体前葉ホにモン、六とえは、生
長ホルモン１六はプロラクチンの精製４：関する。
脳１垂体前葉ホルモンは、を椎動物の脳下垂体の前葉、
すなわち、脳）垂体線部、から得らする。
すなわち、脳）垂体線部、から得らする。
ζ１らのホルモンはすべてタンパク質であり、（して生
物学的研究Ｃ：基づいて性腺刺激ホルモン１六は代謝ホ
ルモンとして分類）ることができる。
物学的研究Ｃ：基づいて性腺刺激ホルモン１六は代謝ホ
ルモンとして分類）ることができる。
こｎらのホルモンには、生長ホルモンとプロラクチンが
包含８する。
包含８する。
生長ホルモンは、を椎動物の脳）垂体前ｆｉ（：、！つ
て生産さする同化タンパク質である。（ｎらの分子量は
ほぼ２２．０００ダルトンである。ζ１らのホルモンは
、組織の生長を促進し、（してタンパク質の代謝ならび
４：脂肪、炭水化物お１び無８１ｍ質の代謝め他の相の
軸輪に参加する。異なる種の動物中で生産さする生長ホ
ルモンは、誘！！さする抗原、等電点、Ｎ−末端および
Ｃ−末端アミノ酸残基、お１びアミノ酸＆ｇ成が質化す
る。生長ホルモンは６般６二ｓ％異性があり、すなわち
、１つの種からの生長ホルモンは他の種（＝おいて不活
性である。
て生産さする同化タンパク質である。（ｎらの分子量は
ほぼ２２．０００ダルトンである。ζ１らのホルモンは
、組織の生長を促進し、（してタンパク質の代謝ならび
４：脂肪、炭水化物お１び無８１ｍ質の代謝め他の相の
軸輪に参加する。異なる種の動物中で生産さする生長ホ
ルモンは、誘！！さする抗原、等電点、Ｎ−末端および
Ｃ−末端アミノ酸残基、お１びアミノ酸＆ｇ成が質化す
る。生長ホルモンは６般６二ｓ％異性があり、すなわち
、１つの種からの生長ホルモンは他の種（＝おいて不活
性である。
種々の障害は、動物４：おける生長ホルモンの欠乏（二
帰因することがある。ヒトにおけるζｎらの障害のうち
第１のものは、）垂体性％ＩＩＪ−発育症である。生長
ホルモンの投与は％下垂体の欠乏を克服できる。さら檻
：、生長ホルモンは、胃腸管内の出血の処置、骨折の治
ゆの促進および挫傷や他の創傷の治ゆの加速≦二おいて
有用である。１次、生長ホルモンは、飼料の消費を増加
しないで肉および乳の生産を促進ブるため食物補助物質
として使用ノると角、家畜類を飼育することにおいて価
価がある。
帰因することがある。ヒトにおけるζｎらの障害のうち
第１のものは、）垂体性％ＩＩＪ−発育症である。生長
ホルモンの投与は％下垂体の欠乏を克服できる。さら檻
：、生長ホルモンは、胃腸管内の出血の処置、骨折の治
ゆの促進および挫傷や他の創傷の治ゆの加速≦二おいて
有用である。１次、生長ホルモンは、飼料の消費を増加
しないで肉および乳の生産を促進ブるため食物補助物質
として使用ノると角、家畜類を飼育することにおいて価
価がある。
生長ホルモンは、切除した脳）垂体組織から単＃ｌｌ！
！することに１す、得ることができる。たとえば。
！することに１す、得ることができる。たとえば。
Ｃ，Ｈ，Ｌｉ、Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、２１１．５５
（１９５４）参照。１次、生長ホルモンは、生長ホルモ
ンの生産を特定する組換えＤＮＡを含有する遺伝工学的
（＝得もｎｑ微生物から得ることができる。Ｐ、Ｈ。
（１９５４）参照。１次、生長ホルモンは、生長ホルモ
ンの生産を特定する組換えＤＮＡを含有する遺伝工学的
（＝得もｎｑ微生物から得ることができる。Ｐ、Ｈ。
８ａｅｂｕｒｇ、ｅｔ ａｌ、＋Ｎａｔｕｒｅ ２７６
＋７９５−７９８（１９７８）：Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒ
ｇ ｅｔ ａｌ、＋Ｎａｔｕｒｅ＋２７０．４８６−４
９４（１９７８）：Ｊ、Ａ、Ｍａｒｔｉｍｌ。
＋７９５−７９８（１９７８）：Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒ
ｇ ｅｔ ａｌ、＋Ｎａｔｕｒｅ＋２７０．４８６−４
９４（１９７８）：Ｊ、Ａ、Ｍａｒｔｉｍｌ。
５ｃｉｅｎｃｅ、２０５．６０２−６０７（１９７９）
参照。
参照。
ζ１らの方法の両省は、脳下垂体のホモジエネー計１次
は生物学的汚染物質を含有する発酵培地からの生水ホル
モンの分離を必要とブるりζ１らの汚染物質は、生長ホ
ルモンの特異的な生物′学的活性を減少ブる傾向があり
、また望ましくたい副作用、六とえは、不都合な免疫学
的応答を起こフことがある。
は生物学的汚染物質を含有する発酵培地からの生水ホル
モンの分離を必要とブるりζ１らの汚染物質は、生長ホ
ルモンの特異的な生物′学的活性を減少ブる傾向があり
、また望ましくたい副作用、六とえは、不都合な免疫学
的応答を起こフことがある。
プロラクチンは、催乳ホルモンとしても知ら１ており、
ヒツジおよびオワリの脳”Ｆ画体から単離さ１てきた。
ヒツジおよびオワリの脳”Ｆ画体から単離さ１てきた。
プロラクチンは、Ｎ−末端４：スレオ二ンをもつ単一の
ポリベグテド拳から成ゐタンパク質である。Ｃ−末端は
半分のシスチン要事で満たさ１ていて、分子の残部とジ
ャルンアイド結合を介してループを形成している。プロ
ラクチンは、哺乳動物における分娩−の乳汁分泌の誘発
、哺乳動物の腺の増殖、およびレウチン（ｌｅｕｔｉｎ
）細胞からのプロゲヌテロンの解放において役立つ。
ポリベグテド拳から成ゐタンパク質である。Ｃ−末端は
半分のシスチン要事で満たさ１ていて、分子の残部とジ
ャルンアイド結合を介してループを形成している。プロ
ラクチンは、哺乳動物における分娩−の乳汁分泌の誘発
、哺乳動物の腺の増殖、およびレウチン（ｌｅｕｔｉｎ
）細胞からのプロゲヌテロンの解放において役立つ。
本発明は、脳Ｊ垂体ホモジェネート１六は脳下垂体前葉
ホルモン生産微生物を含有する発酵培地から、汚染物質
を実質的（：含１ない、脳）垂体前葉ホルモン、ｆｃと
えは、生長ホルモン１六はプロラクチンを回収する方法
（二関する。ζ１は、ホルモン含有混合物をイオン交換
カラムに通ｉ！４させ。
ホルモン生産微生物を含有する発酵培地から、汚染物質
を実質的（：含１ない、脳）垂体前葉ホルモン、ｆｃと
えは、生長ホルモン１六はプロラクチンを回収する方法
（二関する。ζ１は、ホルモン含有混合物をイオン交換
カラムに通ｉ！４させ。
おして溶出液１等！集中カラムで分別すること仁１つて
遅成さｎる。溶出液の２ラクシヨンを、等蒐集中カラム
から１問題の特定のホルモンの等電ｐＨまた＃′ｉ（の
付近において集める。たとえば。
遅成さｎる。溶出液の２ラクシヨンを、等蒐集中カラム
から１問題の特定のホルモンの等電ｐＨまた＃′ｉ（の
付近において集める。たとえば。
ヒトの生長ホルモンは等蒐集中カラムからｐＨ４，９（
＝おいて集めらｊ、こｎに対してヒツジの生長ホルモン
は６．８の千の等電点じおいて集めらするであろう１等
電的に集中さｆ′Ｉたフラグジョンは、有利≦：、集め
、無菌水１：対して透析し、次いで得らｒ＋＋透析生成
物を凍結乾燥することができる。凍結乾燥し次生成物は
、ドテシル硫酸ナトリクムのゲル上の１気泳動分析、オ
ークテルロニー平板上の免疫拡散、１斤は両名によって
向足さｎる・実質的Ｉ：純粋た脳）垂体１１１：ＩＮホ
ルモンは、を椎動物の脳）垂体前葉から、塩を含有ブる
緩衝溶液中で脳）垂体なホモジエナイザーでブリつぶす
ととじ１つて、得ることかできる。
＝おいて集めらｊ、こｎに対してヒツジの生長ホルモン
は６．８の千の等電点じおいて集めらするであろう１等
電的に集中さｆ′Ｉたフラグジョンは、有利≦：、集め
、無菌水１：対して透析し、次いで得らｒ＋＋透析生成
物を凍結乾燥することができる。凍結乾燥し次生成物は
、ドテシル硫酸ナトリクムのゲル上の１気泳動分析、オ
ークテルロニー平板上の免疫拡散、１斤は両名によって
向足さｎる・実質的Ｉ：純粋た脳）垂体１１１：ＩＮホ
ルモンは、を椎動物の脳）垂体前葉から、塩を含有ブる
緩衝溶液中で脳）垂体なホモジエナイザーでブリつぶす
ととじ１つて、得ることかできる。
ホモジエナイザ−Ｉ：↓るすりつぶしは１組敗。
ｐＩ（お工びイオン強度がホルモンに悪影響をかほさな
い、イオン化性塩含有緩ｗｉ液中て実施する。
い、イオン化性塩含有緩ｗｉ液中て実施する。
緩衝液は、好１しくに、汚染性タンパク質を塩析するこ
とじエリ荒い分別を実施するために十分な堪を含有する
か、所望のホルモンを沈殿させるのに不十分な塩を含有
する。このような緩＠液の組ｂ！ｉ、Ｆｉ、広く案化す
ることができる。一般に、緩衝液は約７〜９の帥囲のｐ
Ｈと、０．１−１モルのＮ ａ Ｃｔ＋！ｌ沿に等しい
イオン強度を１１１する。六とえば、 Ｗａｌｌｉｍ
＠ｔ ａｌ、Ｊｉｏｅｈ＠ｍ、Ｊ、＋ １００ ：５９
３−５９９（１９６６）参照。
とじエリ荒い分別を実施するために十分な堪を含有する
か、所望のホルモンを沈殿させるのに不十分な塩を含有
する。このような緩＠液の組ｂ！ｉ、Ｆｉ、広く案化す
ることができる。一般に、緩衝液は約７〜９の帥囲のｐ
Ｈと、０．１−１モルのＮ ａ Ｃｔ＋！ｌ沿に等しい
イオン強度を１１１する。六とえば、 Ｗａｌｌｉｍ
＠ｔ ａｌ、Ｊｉｏｅｈ＠ｍ、Ｊ、＋ １００ ：５９
３−５９９（１９６６）参照。
脳）垂体前葉をホモジエナイザーでブリつぶし穴径、得
らするホモジエネートを緩衝溶液に対して透析する。こ
の緩衝溶液は、前述の緩衝液に類似するが、高度にイオ
ン化性の塩を含有しない。
らするホモジエネートを緩衝溶液に対して透析する。こ
の緩衝溶液は、前述の緩衝液に類似するが、高度にイオ
ン化性の塩を含有しない。
この透析は、ホモジエネートのイオン強度を低）させる
なめＣ：笑施フる。イオノの除去は、引き続いて接触ブ
るイオン交換クロマトグラフィーの物質へのイオンの妨
害を紡ぎ、（して高いイオン強度の溶液とホルモンとの
接触から生ずる悪影響を回避ブる。
なめＣ：笑施フる。イオノの除去は、引き続いて接触ブ
るイオン交換クロマトグラフィーの物質へのイオンの妨
害を紡ぎ、（して高いイオン強度の溶液とホルモンとの
接触から生ずる悪影響を回避ブる。
透析が完結し次とき、生長ホルモンを含有する透析し六
２ラクションを、イオン交換グロ！トグラ２イー（：エ
リさらに精製する。普通の１１１４製法は、不純物のホ
ルモン含有溶液がカラムＣ二結合ブるＣと４：頼る＠
Ｍ＠ｔｈｏｄｌ ｉｎ Ｅｎｚ７ｍｏ 乃ｌＬ二ち１
・ＸＸＩＩ＋Ｓ＠ｅｔｉｏｎ４．Ｅｄ、Ｗ、Ｂ、 Ｊａ
ｋｏｂ）’、Ａｅａｄ＠ｒｎｉｅＰｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、
（１９７１）参照。溶液の不純物は。
２ラクションを、イオン交換グロ！トグラ２イー（：エ
リさらに精製する。普通の１１１４製法は、不純物のホ
ルモン含有溶液がカラムＣ二結合ブるＣと４：頼る＠
Ｍ＠ｔｈｏｄｌ ｉｎ Ｅｎｚ７ｍｏ 乃ｌＬ二ち１
・ＸＸＩＩ＋Ｓ＠ｅｔｉｏｎ４．Ｅｄ、Ｗ、Ｂ、 Ｊａ
ｋｏｂ）’、Ａｅａｄ＠ｒｎｉｅＰｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、
（１９７１）参照。溶液の不純物は。
カラＪ−管通過し、ヤして溶出液中に集めらｎる。
カラＡを失活し、ヤシて結合し六ホルモンを集める追加
の工程を一般６二必要とする。たいていのホルモンと異
なり、脳１垂体前葉ホルモン、たとえは、生長ホルモン
１六はグロラクテンは結合しないで隙イオン交換カラＪ
−を通過ブることが、今や発見ａｒ六、この性質のため
、脳）垂体前葉ホルモン含有混合物を隙イオン交換カラ
ムで連続的にｎｍ−することができる。所望のホルモン
はカラム管通遍し、−力不純物の実質的部分は後（二残
り。
の工程を一般６二必要とする。たいていのホルモンと異
なり、脳１垂体前葉ホルモン、たとえは、生長ホルモン
１六はグロラクテンは結合しないで隙イオン交換カラＪ
−を通過ブることが、今や発見ａｒ六、この性質のため
、脳）垂体前葉ホルモン含有混合物を隙イオン交換カラ
ムで連続的にｎｍ−することができる。所望のホルモン
はカラム管通遍し、−力不純物の実質的部分は後（二残
り。
カフ五内ζ：捕捉さする。この１うな手順は、カラムの
一定の失活および（ｎからのホルモンの取り出しを必要
としない、七の代わり、陰イオン交換精製は妨害さｎな
い状塾を続けることかでき、カラムの不純物を＆持する
各量Ｃ二１ってのみ制限さｊる。この容量Ｃ：到遇した
とき、カラムを失活し、不純物を溶−シ、（シて手ｌ１
ｉｌｔ−再び更新ブることかできる。
一定の失活および（ｎからのホルモンの取り出しを必要
としない、七の代わり、陰イオン交換精製は妨害さｎな
い状塾を続けることかでき、カラムの不純物を＆持する
各量Ｃ二１ってのみ制限さｊる。この容量Ｃ：到遇した
とき、カラムを失活し、不純物を溶−シ、（シて手ｌ１
ｉｌｔ−再び更新ブることかできる。
陰イオン交換物質、六とえは、ジエテルアイノ七ルロー
ヌ（六とえば、 Ｗｈａｔｍａｎ ＣｈｅｍｉａａｌＳ
＠ｐａｒａｔｉｏｎｓ、 Ｉｎｅ、＋ Ｃ１１ｆｔｏｎ
、Ｎ、Ｊ、かも入手できるＤＥ−５２）は、本発明の方
法４：おいて適当であゐことがわかつ六。陰イオン交換
カラムを通して透析Ｐ１１を溶離ブる六めに使用ノる緩
ｌ１ｉｉ液は、ボモジエナイザーの緩衝液（ニ一般ｃ二
類傷ｔＬが、塩分は好１しくは実質的に減少姑ｒている
―ホ毫ジエネートの透析Ｗｉを活性化陰イオン交接カラ
ムに通過させ、ヤして脳１重体小Ａモンを溶出液中４：
集める。次いで、この溶出ｐＩＩｌを１分子量のカット
オフが約１０，０００である限外濾過膜を用いる限外ｐ
通ｇ：エリ、濃ｍ′する。
ヌ（六とえば、 Ｗｈａｔｍａｎ ＣｈｅｍｉａａｌＳ
＠ｐａｒａｔｉｏｎｓ、 Ｉｎｅ、＋ Ｃ１１ｆｔｏｎ
、Ｎ、Ｊ、かも入手できるＤＥ−５２）は、本発明の方
法４：おいて適当であゐことがわかつ六。陰イオン交換
カラムを通して透析Ｐ１１を溶離ブる六めに使用ノる緩
ｌ１ｉｉ液は、ボモジエナイザーの緩衝液（ニ一般ｃ二
類傷ｔＬが、塩分は好１しくは実質的に減少姑ｒている
―ホ毫ジエネートの透析Ｗｉを活性化陰イオン交接カラ
ムに通過させ、ヤして脳１重体小Ａモンを溶出液中４：
集める。次いで、この溶出ｐＩＩｌを１分子量のカット
オフが約１０，０００である限外濾過膜を用いる限外ｐ
通ｇ：エリ、濃ｍ′する。
陳外ｐ過の手順は脳１垂体前集ホルモン含儒泗叡のイオ
ン強度を増加するので、５ａｓａｎたＦ沿を無菌水（ニ
ガして透析して、イオン強度を減少ブる。
ン強度を増加するので、５ａｓａｎたＦ沿を無菌水（ニ
ガして透析して、イオン強度を減少ブる。
得ら１六ホルモン含有透析生成物は２等電集中ｂ Ｃ１
ｓｏｅ、１ｅｅｔｒｉｅ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｐｒｏｅ
ｅｓｓ） （：１すａらＣ二組！１！する。この方法
において、電気化学的にｎ発しｆＣｐＨの勾配を、一定
温度５：おいて。
ｓｏｅ、１ｅｅｔｒｉｅ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｐｒｏｅ
ｅｓｓ） （：１すａらＣ二組！１！する。この方法
において、電気化学的にｎ発しｆＣｐＨの勾配を、一定
温度５：おいて。
垂ｌカラＬ内の陽極と陰極との間ζ：発生させる。
この１うな勾配は１両性電解質として知らｎ７’ｔ、種
々の電荷とｐＩ（をもつアミノ酸の低分子量ポリオ−に
よって構成さｊる。このポリマーは、陽極と陰極との間
の電位差（：応答して、ｐＨの勾配を確立する。種々の
ｐＨｌ１！囲の両性電解質混合物は商業的に入手ブるこ
とができ（六とえは、ＬＫＢ。
々の電荷とｐＩ（をもつアミノ酸の低分子量ポリオ−に
よって構成さｊる。このポリマーは、陽極と陰極との間
の電位差（：応答して、ｐＨの勾配を確立する。種々の
ｐＨｌ１！囲の両性電解質混合物は商業的に入手ブるこ
とができ（六とえは、ＬＫＢ。
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから）、そして用いる特定の
ｐＨの岬囲は問題のタンパク質の等電点（二依存する。
ｐＨの岬囲は問題のタンパク質の等電点（二依存する。
ｐＨの勾配は、有利にはスクロースの密度の勾配の１ｉ
１１ｉ！ｆｌ内で安定化する。カラムへ加えらｆ′Ｉｆ
ｃタンパク質の混合物は、ヤ１らの等電もしくは１集中
１の点のｐＨに到達ブる１で、陽極１には陰極に向かっ
て移動）る。Ｏ，０１ｐＥ単位程度６：ｌトさく異なる
タンパク質の分離を、この技術により過酸できる。本発
明の方法は、ＬＫＢ ４４０＋ｄ分離用等電集中カラＪ
−（ＬＫＢ 、 Ｒｏｃｋｖｉ ｌ ｌｅ、ＭＤから入
手できる）を利用で色る。
１１ｉ！ｆｌ内で安定化する。カラムへ加えらｆ′Ｉｆ
ｃタンパク質の混合物は、ヤ１らの等電もしくは１集中
１の点のｐＨに到達ブる１で、陽極１には陰極に向かっ
て移動）る。Ｏ，０１ｐＥ単位程度６：ｌトさく異なる
タンパク質の分離を、この技術により過酸できる。本発
明の方法は、ＬＫＢ ４４０＋ｄ分離用等電集中カラＪ
−（ＬＫＢ 、 Ｒｏｃｋｖｉ ｌ ｌｅ、ＭＤから入
手できる）を利用で色る。
タンパク質成分がカラムから溶離さｎるとき。
−ｔ ｒｒらの成分の吸収を紫外分光分析Ａ （２
８０８０ ｎｒｎ） （： Ｌり測定ブる。ｐＨは溶出沿の連続す
る１、０−のフラクシヨンについて測定する１次いで、
問題の特定の脳１垂体前葉ホルモンの等電点の約０．３
ｐＨ単位内、好１しくは約０．１ｐＨ卑位内のフラクシ
冒ン含プールして、活性フラクシ四ンｔ′形成する。種
々の脳）垂体ホルモンの等電点ｔｌｌＩに記載する。
８０８０ ｎｒｎ） （： Ｌり測定ブる。ｐＨは溶出沿の連続す
る１、０−のフラクシヨンについて測定する１次いで、
問題の特定の脳１垂体前葉ホルモンの等電点の約０．３
ｐＨ単位内、好１しくは約０．１ｐＨ卑位内のフラクシ
冒ン含プールして、活性フラクシ四ンｔ′形成する。種
々の脳）垂体ホルモンの等電点ｔｌｌＩに記載する。
等電点的に集中させた物質は種々の不純物、六とえは、
両性電解質、スクロースおｔび尿素を含有することがあ
るので、プールし六フラクシ冒ンは好１しくは無菌水に
刻して透析し、ヤして乾燥して、六とえは、凍結乾燥し
て、精製さｎ次脳下垂体ホルモン物質を得る。
両性電解質、スクロースおｔび尿素を含有することがあ
るので、プールし六フラクシ冒ンは好１しくは無菌水に
刻して透析し、ヤして乾燥して、六とえは、凍結乾燥し
て、精製さｎ次脳下垂体ホルモン物質を得る。
別法として、プールし大フラクションは、分子量が１０
．０００以上の化合物を保持する竜ファデクス（Ｓ＠ｐ
ｈａｄ＠ｘ ）カラムｃ：１り精製ブることができる。
．０００以上の化合物を保持する竜ファデクス（Ｓ＠ｐ
ｈａｄ＠ｘ ）カラムｃ：１り精製ブることができる。
次いで、カラム＆：保搗さ１六物質は、取り出し、乾燥
することができる。精製さｎ７をタンパク質の同一性は
、ドデシル硫酸ナトリフ１のゲル上の試薬の電気泳動（
Ｗｅｈ＠ｒ＋ Ｋ、 、ｓｔ ａｌ、 ｅＪ−Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、２２４．４４０６（１９６Ｂ）参Ｒ）なら
びζ：オークブルロニー平板（Ｇａｒマ・ｙ＋Ｊ−８−
・ｔａｌ−＋ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇ）’ Ｖｏｌ−ＩＩＬＷ、Ａ、Ｉ３ｅｎｊ
ａｍｉｎ、Ｉｎｃ、＋Ｍａｓｓａｃｈｕｓ＠ｔｔｓ（１
９７７） Ｐｐ、３１３−３２１ ）参照）Ｃ：１って
確認することができる。
することができる。精製さｎ７をタンパク質の同一性は
、ドデシル硫酸ナトリフ１のゲル上の試薬の電気泳動（
Ｗｅｈ＠ｒ＋ Ｋ、 、ｓｔ ａｌ、 ｅＪ−Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、２２４．４４０６（１９６Ｂ）参Ｒ）なら
びζ：オークブルロニー平板（Ｇａｒマ・ｙ＋Ｊ−８−
・ｔａｌ−＋ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇ）’ Ｖｏｌ−ＩＩＬＷ、Ａ、Ｉ３ｅｎｊ
ａｍｉｎ、Ｉｎｃ、＋Ｍａｓｓａｃｈｕｓ＠ｔｔｓ（１
９７７） Ｐｐ、３１３−３２１ ）参照）Ｃ：１って
確認することができる。
本発明の方法は、微生物（：よって生産−ａｎる脳１重
体罰葉ホルモンを精製する六め（：用いること４できる
。生重さｆ１六ホルモンが細胞内（二ととする以外、！
Ｉ！質的≦：同じ手順に従う。この１うな場合Ｉ：おい
て、ホモジエナイザ−（：ぶるブリつぶしの間、細胞を
溶解して、ホルモンを解放することができる。
体罰葉ホルモンを精製する六め（：用いること４できる
。生重さｆ１六ホルモンが細胞内（二ととする以外、！
Ｉ！質的≦：同じ手順に従う。この１うな場合Ｉ：おい
て、ホモジエナイザ−（：ぶるブリつぶしの間、細胞を
溶解して、ホルモンを解放することができる。
次の寮施例に１す、本発明をさら４：説明する。
東 施 例 工
脳１垂体から得らｆ１７’ｔクシの
生長ホルモンの精製
５０のウシの脳下垂体、１さ１０１ ｆ、を、ホウ酸塩
−ＨＣｊ午の０．２５モルのＮａＣＡ、ｐＨ８，７、ｌ
１１１１ＷｌｌＤ２００ｍ１ｃ用いてビｈテス（Ｖｉｒ
ｔｉｓ）４５ホモジエナイザ−６：１すすりつぶした１
次いで、このホモジエネートを水浴中で３−関か！１ぜ
六。引き続いて、このホモジエネートをプールい（８゜
１，１、■）＊ゎ分、器ア、。ＯＯｒｐ。、２おいて１
５分間遍ＩｃＪ分離し、上澄み液をデカントした。
−ＨＣｊ午の０．２５モルのＮａＣＡ、ｐＨ８，７、ｌ
１１１１ＷｌｌＤ２００ｍ１ｃ用いてビｈテス（Ｖｉｒ
ｔｉｓ）４５ホモジエナイザ−６：１すすりつぶした１
次いで、このホモジエネートを水浴中で３−関か！１ぜ
六。引き続いて、このホモジエネートをプールい（８゜
１，１、■）＊ゎ分、器ア、。ＯＯｒｐ。、２おいて１
５分間遍ＩｃＪ分離し、上澄み液をデカントした。
デカントした上澄み液を、ＮａＣＡ を含有しない、ホ
ウ酸塩−ＨＣｊ含儒含有溶涼、ｐ Ｈ８，７４二対して
透析し良、りいで、透析生成物をＤＥＡＥ−５２カラム
（３０ｍＸ７個）６：通し次。ＤＥＡＥ力■ ラムを通過するＢＧ）ｌを集め、アミコン（Ａｍｉｅｏ
ｎ ）装置で限外濾過して濃縮し、次いで分離用等電集
中カラ１（ｐＨ＃凱 ６．０−８．０ ） ４二人１大
、４０鮪間後、カラムからの溶離を開始し、ｐＨ６８４
ｍおいて２ラクシヨンを集め、プールし、無１ｉ Ｈ，
０≦二対して透析し虎。このＢＧＨ含＊＊Ｗを、アミ■ コン（Ａｍ１ｃｏｎ ） ＠雪で再び限外−過しな、純
粋なりＧＨの収量は、はぼ８５１１Ｆで６つな。
ウ酸塩−ＨＣｊ含儒含有溶涼、ｐ Ｈ８，７４二対して
透析し良、りいで、透析生成物をＤＥＡＥ−５２カラム
（３０ｍＸ７個）６：通し次。ＤＥＡＥ力■ ラムを通過するＢＧ）ｌを集め、アミコン（Ａｍｉｅｏ
ｎ ）装置で限外濾過して濃縮し、次いで分離用等電集
中カラ１（ｐＨ＃凱 ６．０−８．０ ） ４二人１大
、４０鮪間後、カラムからの溶離を開始し、ｐＨ６８４
ｍおいて２ラクシヨンを集め、プールし、無１ｉ Ｈ，
０≦二対して透析し虎。このＢＧＨ含＊＊Ｗを、アミ■ コン（Ａｍ１ｃｏｎ ） ＠雪で再び限外−過しな、純
粋なりＧＨの収量は、はぼ８５１１Ｆで６つな。
精製子扉の各１穆（二おいて、ＳＤＳゲル電気泳動、オ
ークチｈロニー免疫測定およびパイオーラド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）タンパク質分析を１！施して、得らする生成
物の純度を監穎した。
ークチｈロニー免疫測定およびパイオーラド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）タンパク質分析を１！施して、得らする生成
物の純度を監穎した。
実 施 例 ＩＩ
遺伝的じ質性し六Ｅ、Ｃｏ１１から
得らｆ′ｌ六ヒトの生長ホルモンの精製ヒトの生長ホル
モンを生産できる遺伝的に変性し７ｔＥ、Ｃｏ１１
細胞を、欧州特許公開ｇ１００２，０１４１′ｋＪ（Ｂ
ａｘｔｅｒ ｅｔａｌ） ４二記１１１！８ｆ′Ｉてい
る方法１：従ってつくる。Ｅ、Ｃｏ１１ 細胞を発酵
培地中で培養し、セシてリゾチームで細胞を溶解するこ
とに１リヒ［の生長ホルモンを解ｍ″する。次いで得ら
ｎ次混台物を、ホウ酸塩−ＨＣｔ、ｐＨ８，７の緩衝溶
沿中の０．２５モルのＮａＣｔの２００−で緩ＩＩブる
。
モンを生産できる遺伝的に変性し７ｔＥ、Ｃｏ１１
細胞を、欧州特許公開ｇ１００２，０１４１′ｋＪ（Ｂ
ａｘｔｅｒ ｅｔａｌ） ４二記１１１！８ｆ′Ｉてい
る方法１：従ってつくる。Ｅ、Ｃｏ１１ 細胞を発酵
培地中で培養し、セシてリゾチームで細胞を溶解するこ
とに１リヒ［の生長ホルモンを解ｍ″する。次いで得ら
ｎ次混台物を、ホウ酸塩−ＨＣｔ、ｐＨ８，７の緩衝溶
沿中の０．２５モルのＮａＣｔの２００−で緩ＩＩブる
。
得らｆ′ｌ六混合物を、水浴中で３町間かき１ぜる。
ホモジエネートを引龜統いてンルバル（５ｏｒｖａＦ’
）遠心分離器で５００ Ｏｒｐｍにおいて１５分間遠、
ＣＪ分離し、上澄液をデカントする。
）遠心分離器で５００ Ｏｒｐｍにおいて１５分間遠、
ＣＪ分離し、上澄液をデカントする。
デカントし穴上澄み沿を、Ｎ轟Ｃｔを含１ないホウ酸塩
−ＨＣｔ、ｐＨ８，７の緩ａ液を含ＴＩする緩衝Ｗ！Ｊ
沿に対して透析する。久いで、透析生成物をＤＥＪＥ−
５２カラム（３０ｍｘ）ｃＩＩＩ） Ｃ通−ｊ、Ｄ次い
で分離用等電集中カラム（ｐｕｌ！囲、６０〜Ｂ、０）
に入ｊる。４０１ｊ＋間後、カラムからの溶離を開始し
、ｐ Ｈ４，９ζ：おける２ラクシ目ンを集め、プール
し、無菌）１２０４：対して透析する。生長ホ■ ルモン含有溶液をアミコン（Ａｍ１ｅｏｎ ）ｌｉｆｌ
で再び鐵外テ遇して、純粋なヒトの生畏ホルモンを得る
。
−ＨＣｔ、ｐＨ８，７の緩ａ液を含ＴＩする緩衝Ｗ！Ｊ
沿に対して透析する。久いで、透析生成物をＤＥＪＥ−
５２カラム（３０ｍｘ）ｃＩＩＩ） Ｃ通−ｊ、Ｄ次い
で分離用等電集中カラム（ｐｕｌ！囲、６０〜Ｂ、０）
に入ｊる。４０１ｊ＋間後、カラムからの溶離を開始し
、ｐ Ｈ４，９ζ：おける２ラクシ目ンを集め、プール
し、無菌）１２０４：対して透析する。生長ホ■ ルモン含有溶液をアミコン（Ａｍ１ｅｏｎ ）ｌｉｆｌ
で再び鐵外テ遇して、純粋なヒトの生畏ホルモンを得る
。
精製手響の各工程シニおいて、８０Ｓ−ゲル電気泳動、
オークテルロ−免疫測定お１びバイオ−ラド（Ｂｌｏ−
Ｒａｄ） タンパク質分析を５ｊｉ！施して、得らする
生成物の純度を監視する。
オークテルロ−免疫測定お１びバイオ−ラド（Ｂｌｏ−
Ｒａｄ） タンパク質分析を５ｊｉ！施して、得らする
生成物の純度を監視する。
表 １
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１１脳１垂体前葉ホｈ毫ン含有混合物を陰イオン交換
カラムにおいて緩衝ｍｔｅｉで溶離し％溶出液を等蒐集
中カラムにおいて分離し、ヤして脳）垂体前葉ホルモン
の等電点１７’ｔｔｌｊヤの付近（：おいて集めらｎた
フラクションｖｔ４１１持することからなる。 脳１垂体前葉ホルモンの精製法。 （２１脳１垂体前葉ホルモンの等電点１次は（の付近に
おいて集めら１次フラクションを、無菌水で透析し１次
いで凍結乾燥する４ＩｉＦ許請求の範囲第１項記載の方
法。 ＋ｓ＋ ｎ Ｉｆ Ｌ 次脳下垂体ホルモンは生長ホル
モンである特許請求の範囲第１１ｆｔは２項記戦の方法
。 （４）精製した生長ホルモンはクシ、ヒト、ブタ、ヒツ
ジ、ラット１ｆｔ＃′ｉオ９シからの生長ホルモンであ
る肴許ｆｌ求の範囲第１１六は２項記載の方法。 （５１精製した脳１垂体前葉ホルモン社ウシ、ヒト、ブ
タ、ヒツジ、ラット１穴はオウレからＯプロラクチンで
ある特許請求の範囲ｍｌ’！六は２項記載の方法。 （６）脳ｔｍ体前葉ホル毫ン含有混合物は、約７〜９の
ｌ１１１２ｔｌのｐＨお１び０．１〜１モルのＮａＣＡ
溶液に等しいイオン強度を有する緩＠ｆｌｊｆＩＩ中で
脳）重体をホモジエナイザーですりつぶすこと６二よっ
て得る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （７）緩衝液はホウ酸塩−ＨＣｌ 中の０．２５モルの
ＮａＣｊであり、（シて約８．７のｐＩ（を＊’する特
許請求の爬囲第５項記載の方法。 ｔｅｌ ｐ Ｈ７〜９を有するホウ酸塩−ＨＣ２緩衝溶
液を使用して、陰イオン交換カラムにおいて脳１垂体前
葉小ルモンさ１混合物を溶離ブる特許請求のＳＳ第１項
記載の方法。 （９）緩ＩＩ溶沿の溶離液はｐＨ約８．７會有ブる特許
請求のＳＳ第８項記載の方法。 ＩＱホルモン含有ホモジエネートのイオン強度を透析（
：１り低１し、透析生成物を陰イオン交換クロ１トゲラ
フのカラムに通ブこと６：１つて楕製し。 溶出液を約１０，０００ の分子量のカットオフの限
外濾過膜で限外枦遇すること（二より濃縮し、限外Ｐ遇
沿を無菌水に刻して透析することによって（のイオン強
度を低重し、透析した限外−過液を分離し、ヤして等電
点１ｆｆｔｉ−１の付近において集めらｒ＋六フラクシ
ョンを保持する、ことからなる脳″Ｆｆ１体前葉ホル毫
ンの精製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US341216 | 1982-01-21 | ||
| US06/341,216 US4371462A (en) | 1982-01-21 | 1982-01-21 | Method for purification of anterior pituitary hormones |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58124721A true JPS58124721A (ja) | 1983-07-25 |
Family
ID=23336681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57150611A Pending JPS58124721A (ja) | 1982-01-21 | 1982-08-30 | 脳下垂体前葉ホルモンの精製法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4371462A (ja) |
| EP (1) | EP0085220A3 (ja) |
| JP (1) | JPS58124721A (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| US4612367A (en) * | 1985-04-08 | 1986-09-16 | Eli Lilly And Company | Process for purifying growth hormone-like materials |
| JPH0720986B2 (ja) * | 1985-10-07 | 1995-03-08 | 日本ケミカルリサ−チ株式会社 | 生理活性物質の製造法 |
| PL270368A1 (en) * | 1987-01-30 | 1988-10-13 | Int Minerals & Chem Corp | Method for recovery of somatotropins from diluted water solutions |
| GB8821656D0 (en) * | 1988-09-15 | 1988-10-12 | Health Lab Service Board | Pharmaceutical compositions for eliciting immunostimulant effect |
| EP0583980A1 (en) * | 1992-08-20 | 1994-02-23 | Eli Lilly And Company | Method for generating monoclonal antibodies from rabbits |
| EP1687421B1 (en) * | 2003-09-30 | 2018-06-27 | Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. | A process for producing exogenous protein in the milk of transgenic mammals and a process for purifying proteins therefrom |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3098792A (en) * | 1961-03-31 | 1963-07-23 | Merck & Co Inc | Process for preparing product having enhanced lactogenic activity |
| DK104191C (da) * | 1962-09-21 | 1966-04-18 | Organon Nv | Fremgangsmåde til fremstilling af fedtmobiliserende stoffer. |
| US3265579A (en) * | 1964-01-08 | 1966-08-09 | Upjohn Co | Process for purification of bovine growth hormone |
| US3503950A (en) * | 1968-06-25 | 1970-03-31 | Univ California | Lipolytic peptide and process for production |
| US3651231A (en) * | 1969-09-10 | 1972-03-21 | Upjohn Co | Process for preparing lactogenic factor |
| US4198338A (en) * | 1978-03-13 | 1980-04-15 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying thienamycin |
| JPS5630925A (en) * | 1979-08-21 | 1981-03-28 | Sumitomo Chem Co Ltd | Purification of human growth hormone |
-
1982
- 1982-01-21 US US06/341,216 patent/US4371462A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-07-15 EP EP82303729A patent/EP0085220A3/en not_active Withdrawn
- 1982-08-30 JP JP57150611A patent/JPS58124721A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4371462A (en) | 1983-02-01 |
| EP0085220A3 (en) | 1983-11-23 |
| EP0085220A2 (en) | 1983-08-10 |
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