JP3251545B2 - 精子運動能促進性高分子タンパク質 - Google Patents
精子運動能促進性高分子タンパク質Info
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- JP3251545B2 JP3251545B2 JP05492598A JP5492598A JP3251545B2 JP 3251545 B2 JP3251545 B2 JP 3251545B2 JP 05492598 A JP05492598 A JP 05492598A JP 5492598 A JP5492598 A JP 5492598A JP 3251545 B2 JP3251545 B2 JP 3251545B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、食肉処理場(畜
殺場)の廃棄物を入手源とするバッファローの血清／血
漿から単離される新規な精子運動能促進性高分子タンパ
ク質に関する。
殺場)の廃棄物を入手源とするバッファローの血清／血
漿から単離される新規な精子運動能促進性高分子タンパ
ク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】バッファローの血清から単離される精子
の前進運動能促進性タンパク質は、全ての人類における
大きな社会的問題である不妊症(精子の低運動能に起因
する不妊症)の治療に対して潜在的な有用性を有してい
る。本発明によって単離されたタンパク質も家畜、特に
インドを含む多くの国において経済的に非常に重要な搾
乳用動物であるバッファローの繁殖力の改良に関して潜
在的な有用性を有している。
の前進運動能促進性タンパク質は、全ての人類における
大きな社会的問題である不妊症(精子の低運動能に起因
する不妊症)の治療に対して潜在的な有用性を有してい
る。本発明によって単離されたタンパク質も家畜、特に
インドを含む多くの国において経済的に非常に重要な搾
乳用動物であるバッファローの繁殖力の改良に関して潜
在的な有用性を有している。
【０００３】ヒトの不妊症は当事者に個人的な不幸をも
たらすので大きな社会的問題である。一般的には、約１
５％のカップルが不妊症であると考えられている。概算
によれば、約２０００万組のインド人カップルが不妊症
である。従って、ヒトの不妊症は世界中では測り知れな
い規模での社会的問題となっている。男性の不妊の主要
な原因の１つは射精された精液中の精子の数は正常であ
るが精子の運動能が低いこと、あるいは射精された精液
中の精子の運動能は正常であるが精子の数が少ないこと
である。乏精液症の患者および精子無力症の患者の治療
法としてはいくつかの非常に複雑な補助生殖法[例え
ば、ＩＶＦ(体外受精)およびＩＣＳＩ(細胞質内への精
子注入)等]が知られているが、これらの治療法は多大な
費用が必要なだけでなく、成功率も非常に低い。
たらすので大きな社会的問題である。一般的には、約１
５％のカップルが不妊症であると考えられている。概算
によれば、約２０００万組のインド人カップルが不妊症
である。従って、ヒトの不妊症は世界中では測り知れな
い規模での社会的問題となっている。男性の不妊の主要
な原因の１つは射精された精液中の精子の数は正常であ
るが精子の運動能が低いこと、あるいは射精された精液
中の精子の運動能は正常であるが精子の数が少ないこと
である。乏精液症の患者および精子無力症の患者の治療
法としてはいくつかの非常に複雑な補助生殖法[例え
ば、ＩＶＦ(体外受精)およびＩＣＳＩ(細胞質内への精
子注入)等]が知られているが、これらの治療法は多大な
費用が必要なだけでなく、成功率も非常に低い。
【０００４】精子の低運動能に起因するヒトの不妊症の
問題の解決のために、精子の前進運動促進能を有するタ
ンパク質として知られているタンパク質を精液や血清か
ら単離する研究がなされている。例えば、次の文献参
照: １) モリタＺ．およびチャンＭ.Ｃ．、Ｊ．Ｒeprod．Ｆ
ertil．、第２４巻、第２４７頁〜第２５４頁(１９７１
年)、 ２) ホスキンスＤ.Ｄ．、ブラントＨ．およびアコット
Ｔ.Ｓ.、Ｆed．Ｐroc．、第３７巻、第２５３４頁〜第
２５４２頁(１９７８年)、 ３) モルトンＢ.Ｅ．、フレーザーＣ.Ｆ．およびアルバ
グリＬ．、Ｆertil．Ｓteril.、第３２巻、第９９頁〜
第１０６頁(１９７９年)、 ４) ブラウンＤ.Ｖ．およびゼンガーＰ.Ｌ．、Ｂiol．
Ｒeprod．、第２３巻、第２７１頁〜第２７５頁(１９８
０年)、および ５) マンダルＭ．、バネルジェーＳ．およびマジャルダ
ルＧ.Ｃ．、Ｂiol．Ｒeprod．第４１巻、第９８３頁〜
第９８９頁(１９８９年)。
問題の解決のために、精子の前進運動促進能を有するタ
ンパク質として知られているタンパク質を精液や血清か
ら単離する研究がなされている。例えば、次の文献参
照: １) モリタＺ．およびチャンＭ.Ｃ．、Ｊ．Ｒeprod．Ｆ
ertil．、第２４巻、第２４７頁〜第２５４頁(１９７１
年)、 ２) ホスキンスＤ.Ｄ．、ブラントＨ．およびアコット
Ｔ.Ｓ.、Ｆed．Ｐroc．、第３７巻、第２５３４頁〜第
２５４２頁(１９７８年)、 ３) モルトンＢ.Ｅ．、フレーザーＣ.Ｆ．およびアルバ
グリＬ．、Ｆertil．Ｓteril.、第３２巻、第９９頁〜
第１０６頁(１９７９年)、 ４) ブラウンＤ.Ｖ．およびゼンガーＰ.Ｌ．、Ｂiol．
Ｒeprod．、第２３巻、第２７１頁〜第２７５頁(１９８
０年)、および ５) マンダルＭ．、バネルジェーＳ．およびマジャルダ
ルＧ.Ｃ．、Ｂiol．Ｒeprod．第４１巻、第９８３頁〜
第９８９頁(１９８９年)。
【０００５】アコットＴ.Ｓ．とホスキンスＤ.Ｄ．は牛
の精液漿／副睾丸漿から糖タンパク質(３７kＤa)を部分
的に精製した(該糖タンパク質は牛の副睾丸頭の未熟精
子の体外での運動開始に必須である)[Ｊ．Ｂiol．Ｃhe
m．、第２５３巻、第６７４４頁〜第６７５０頁(１９７
８年)]。アケルロフらはヒトの血清が、ヒトの射精され
た精液中の精子の前進運動を活性化するタンパク質(約
２００kＤa)を含有することを報告している[アケルロフ
Ｅ．、フレドリックソンＢ．、グスタフソンＯ．、ルネ
ルＮ.Ｏ．、ニルンドＬ．、ローゼンボルクＬ．、スロ
ッテＨ．およびポウセッテＡ．、Ｉnt．Ｊ．Ａndro
l．、第１２巻、第１２４頁〜第１３０頁(１９８９
年)]。アケルロフとポウセッテはヒトの精子の運動能を
促進するこのタンパク質に関する特許を取得している
[ＷＯ ９０ １２０３２(１９９０年１０月１８日)参
照]。この精子運動能促進性タンパク質(約２００kＤa)
は５．１の等電点を有しており、アルブミン、アポリポ
タンパク質(Ａl)およびイムノグロブリンを含有する。
この精子運動能促進性タンパク質は精子運動能アッセイ
および不妊症の治療に有用である。アポリポタンパク質
とイムノグロブリンとの純粋な複合タンパク質(１８０
〜２５０kＤa)はヒトの血清から単離されている[米国特
許第５３０４４６４号(１９９４年４月１９日)および米
国特許第５４５３３５４号(１９９５年９月２６日)各明
細書参照]。この高分子タンパク質はアポリポタンパク
質(Ａl)およびイムノグロブリンと等モル量のアルブミ
ンも含有し、その等電点は５．１であり、また該タンパ
ク質は精子の運動能を刺激する。この複合タンパク質に
対しては抗体を発生させることができる。精子の不十分
な運動能に起因するヒトの不妊症は該タンパク質の投与
によって治療することができる。このタンパク質は診断
と治療の両面で利用可能である。しかしながら、このタ
ンパク質はヒトの血清から誘導されるためにかなり高価
なものとなる。
の精液漿／副睾丸漿から糖タンパク質(３７kＤa)を部分
的に精製した(該糖タンパク質は牛の副睾丸頭の未熟精
子の体外での運動開始に必須である)[Ｊ．Ｂiol．Ｃhe
m．、第２５３巻、第６７４４頁〜第６７５０頁(１９７
８年)]。アケルロフらはヒトの血清が、ヒトの射精され
た精液中の精子の前進運動を活性化するタンパク質(約
２００kＤa)を含有することを報告している[アケルロフ
Ｅ．、フレドリックソンＢ．、グスタフソンＯ．、ルネ
ルＮ.Ｏ．、ニルンドＬ．、ローゼンボルクＬ．、スロ
ッテＨ．およびポウセッテＡ．、Ｉnt．Ｊ．Ａndro
l．、第１２巻、第１２４頁〜第１３０頁(１９８９
年)]。アケルロフとポウセッテはヒトの精子の運動能を
促進するこのタンパク質に関する特許を取得している
[ＷＯ ９０ １２０３２(１９９０年１０月１８日)参
照]。この精子運動能促進性タンパク質(約２００kＤa)
は５．１の等電点を有しており、アルブミン、アポリポ
タンパク質(Ａl)およびイムノグロブリンを含有する。
この精子運動能促進性タンパク質は精子運動能アッセイ
および不妊症の治療に有用である。アポリポタンパク質
とイムノグロブリンとの純粋な複合タンパク質(１８０
〜２５０kＤa)はヒトの血清から単離されている[米国特
許第５３０４４６４号(１９９４年４月１９日)および米
国特許第５４５３３５４号(１９９５年９月２６日)各明
細書参照]。この高分子タンパク質はアポリポタンパク
質(Ａl)およびイムノグロブリンと等モル量のアルブミ
ンも含有し、その等電点は５．１であり、また該タンパ
ク質は精子の運動能を刺激する。この複合タンパク質に
対しては抗体を発生させることができる。精子の不十分
な運動能に起因するヒトの不妊症は該タンパク質の投与
によって治療することができる。このタンパク質は診断
と治療の両面で利用可能である。しかしながら、このタ
ンパク質はヒトの血清から誘導されるためにかなり高価
なものとなる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、精子の運
動能を効果的に促進する新規な高分子タンパク質を低コ
ストで提供するためになされたものである。
動能を効果的に促進する新規な高分子タンパク質を低コ
ストで提供するためになされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】即ちこの発明は、食肉処
理場の廃棄物を入手源とするバッファローの血清／血漿
から単離される６６kＤaの分子質量を有する精子運動能
促進性高分子タンパク質に関する。
理場の廃棄物を入手源とするバッファローの血清／血漿
から単離される６６kＤaの分子質量を有する精子運動能
促進性高分子タンパク質に関する。
【０００８】本発明による精子運動能促進性高分子タン
パク質は、特に世界中の全ての国々で大きな社会的問題
となっている精子の低運動能に起因するヒトの不妊症の
治療において潜在的な有用性を有している。精子の前進
運動能刺激ファクターとなる本発明による高分子タンパ
ク質の主要な利点は、従来のヒトの血清から誘導される
製品[ＷＯ ９０ １２０３２号(１９９０年１０月１８
日)、米国特許第５３０４４６４号(１９９４年４月１９
日)および米国特許第５４５３３５４号(１９９５年９月
２６日)各明細書参照]に比べて経済的に非常に有利な食
肉処理場からの廃棄物を入手源とすることである。ヒト
の血清から得られる従来のこの種の製品がヒト以外の種
の精子の運動能促進に効力があるかどうかについてのデ
ータは従来は全く得られていなかった。本発明品はバッ
ファロー、牛およびヤギを含む種々の種の精子の運動能
を活性化する。本発明品の別の利点は家畜、特に多くの
国々において経済的に非常に重要な搾乳動物であるバッ
ファローの繁殖の改良においても潜在的な有用性を有す
る。
パク質は、特に世界中の全ての国々で大きな社会的問題
となっている精子の低運動能に起因するヒトの不妊症の
治療において潜在的な有用性を有している。精子の前進
運動能刺激ファクターとなる本発明による高分子タンパ
ク質の主要な利点は、従来のヒトの血清から誘導される
製品[ＷＯ ９０ １２０３２号(１９９０年１０月１８
日)、米国特許第５３０４４６４号(１９９４年４月１９
日)および米国特許第５４５３３５４号(１９９５年９月
２６日)各明細書参照]に比べて経済的に非常に有利な食
肉処理場からの廃棄物を入手源とすることである。ヒト
の血清から得られる従来のこの種の製品がヒト以外の種
の精子の運動能促進に効力があるかどうかについてのデ
ータは従来は全く得られていなかった。本発明品はバッ
ファロー、牛およびヤギを含む種々の種の精子の運動能
を活性化する。本発明品の別の利点は家畜、特に多くの
国々において経済的に非常に重要な搾乳動物であるバッ
ファローの繁殖の改良においても潜在的な有用性を有す
る。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は新規な精子運動能促進性
高分子タンパク質および食肉処理場からの廃棄物を入手
源とするバッファローの血清／血漿から該タンパク質を
単離する方法を提供する。該単離法はバッファローの血
清／血漿を分画し、分画した血清／血漿からの精子運動
能促進性タンパク質を常套のクロマトグラフィー法およ
び電気泳動法によって精製する過程を含む。
高分子タンパク質および食肉処理場からの廃棄物を入手
源とするバッファローの血清／血漿から該タンパク質を
単離する方法を提供する。該単離法はバッファローの血
清／血漿を分画し、分画した血清／血漿からの精子運動
能促進性タンパク質を常套のクロマトグラフィー法およ
び電気泳動法によって精製する過程を含む。
【００１０】本発明には(a)バッファローの血清／血漿
からの新規な精子の前進運動能刺激性タンパク質の精製
と特性づけ(キャラクタライゼーション)および(b)バッ
ファローの血清／血漿からの精子運動能促進性タンパク
質の精製法が包含される。この精子運動能促進性ファク
ターは熱安定性タンパク質である。本発明は生物学的液
体から精子運動能促進性タンパク質を見掛けの均質性ま
で精製することを初めて可能にするものである。このタ
ンパク質は被検種(バッファロー、非去勢雄牛、ヤギ、
ラット、ハムスターおよびヒト)の全ての射精された精
液中の精子の前進運動能を活性化させる。このことは精
子の運動能の活性化能において種属特異性がないことを
示す。
からの新規な精子の前進運動能刺激性タンパク質の精製
と特性づけ(キャラクタライゼーション)および(b)バッ
ファローの血清／血漿からの精子運動能促進性タンパク
質の精製法が包含される。この精子運動能促進性ファク
ターは熱安定性タンパク質である。本発明は生物学的液
体から精子運動能促進性タンパク質を見掛けの均質性ま
で精製することを初めて可能にするものである。このタ
ンパク質は被検種(バッファロー、非去勢雄牛、ヤギ、
ラット、ハムスターおよびヒト)の全ての射精された精
液中の精子の前進運動能を活性化させる。このことは精
子の運動能の活性化能において種属特異性がないことを
示す。
【００１１】ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法、高性能液体クロマトグラフィーおよ
びセファデックスＧ−１００ゲル濾過法によって測定さ
れた上記の精子運動能促進性タンパク質の分子質量は６
６kＤaである。この促進性ファクターは精子の前進運動
能の活性化に関して高いタンパク質特異性と親和性を示
す。この精子運動能プロモーターは０．５μＭの濃度に
おいて精子の６０〜７０％が前進運動能を示すときにほ
ぼ最大の活性を示す。該タンパク質は精子細胞に迅速に
作用して精子の運動能を直ちに活性化する。該タンパク
質はコンカナバリンＡに対して高い親和性で結合する糖
タンパク質であって、等電点が約３．７の酸性タンパク
質であり、その活性はＭg2+に依存する。この精子運動
能促進性タンパク質はテオフィリンもしくは重炭酸塩の
使用またはこれらの併用の場合よりも精子運動能の活性
化において著しく高い効力を示す。このファクターによ
って誘発される精子運動能は重炭酸塩によって著しく安
定化される。アミノ酸分析によれば、該タンパク質はア
スパラギン酸、グルタミン酸およびロイシンを多く含有
する。
ドゲル電気泳動法、高性能液体クロマトグラフィーおよ
びセファデックスＧ−１００ゲル濾過法によって測定さ
れた上記の精子運動能促進性タンパク質の分子質量は６
６kＤaである。この促進性ファクターは精子の前進運動
能の活性化に関して高いタンパク質特異性と親和性を示
す。この精子運動能プロモーターは０．５μＭの濃度に
おいて精子の６０〜７０％が前進運動能を示すときにほ
ぼ最大の活性を示す。該タンパク質は精子細胞に迅速に
作用して精子の運動能を直ちに活性化する。該タンパク
質はコンカナバリンＡに対して高い親和性で結合する糖
タンパク質であって、等電点が約３．７の酸性タンパク
質であり、その活性はＭg2+に依存する。この精子運動
能促進性タンパク質はテオフィリンもしくは重炭酸塩の
使用またはこれらの併用の場合よりも精子運動能の活性
化において著しく高い効力を示す。このファクターによ
って誘発される精子運動能は重炭酸塩によって著しく安
定化される。アミノ酸分析によれば、該タンパク質はア
スパラギン酸、グルタミン酸およびロイシンを多く含有
する。
【００１２】このタンパク質分子の糖部分とタンパク質
部分はいずれもその生物学的活性にとって必須である。
この精子運動能促進性タンパク質の特異的レセプターは
精子に対するこのファクターの作用を仲介する精子表面
上に存在することが判明している。これは強い免疫原性
がある。バッファローに由来の精子運動能促進性タンパ
ク質に対する抗血清(ラビットの体内で発生)を用いる研
究によれば、該抗血清はヤギ、非去勢雄牛、雌牛および
ヒトの血清と交差反応することが明らかにされている。
このデータは精子運動能プロモーターまたはタンパク質
のような精子運動能プロモーターがその他の種の血清中
にも存在することを示唆するものである。この精子運動
能刺激性ファクターに対する抗体を用いることにより、
精子運動能プロモーターは肝臓に最も多く含まれている
が、睾丸と副睾丸にも存在することが判明した。本発明
による単離物は従来の文献に報告されているものとは明
確に異なる特性を示す新規な精子運動能促進性タンパク
質である。
部分はいずれもその生物学的活性にとって必須である。
この精子運動能促進性タンパク質の特異的レセプターは
精子に対するこのファクターの作用を仲介する精子表面
上に存在することが判明している。これは強い免疫原性
がある。バッファローに由来の精子運動能促進性タンパ
ク質に対する抗血清(ラビットの体内で発生)を用いる研
究によれば、該抗血清はヤギ、非去勢雄牛、雌牛および
ヒトの血清と交差反応することが明らかにされている。
このデータは精子運動能プロモーターまたはタンパク質
のような精子運動能プロモーターがその他の種の血清中
にも存在することを示唆するものである。この精子運動
能刺激性ファクターに対する抗体を用いることにより、
精子運動能プロモーターは肝臓に最も多く含まれている
が、睾丸と副睾丸にも存在することが判明した。本発明
による単離物は従来の文献に報告されているものとは明
確に異なる特性を示す新規な精子運動能促進性タンパク
質である。
【００１３】本発明には食肉処理場の廃棄物を入手源と
するバッファローの血液からの精子運動能促進性タンパ
ク質の単離法が包含される。活性な精子運動能促進性タ
ンパク質はヒトを含む被検種の全ての血清中に存在する
が、該ファクターの最も高濃度の入手源はバッファロー
の血液である[マンダルＭ．、バネルジェーＳ．および
マジャムダーＧ.Ｃ．、Ｂiol．Ｒeprod．、第４１巻、
第９８３頁〜第９８９頁(１９８９年)参照]。このファ
クターは血清または血漿から単離することができる。血
清／血漿は先ず第一に硫酸アンモニウムを用いる分画処
理に付す。精子運動能プロモーターは４０〜８０％の硫
酸アンモニウムの飽和によって沈降する。この精子運動
能促進性タンパク質の塩フラクションは樹脂、例えばカ
ルボキシメチルセルロース／セファデックス等および低
イオン性酸性緩衝液[例えば、１０mＭ酢酸ナトリウム(p
Ｈ５．６)]を用いるカチオン交換クロマトグラフィー処
理に付す。このファクターは樹脂カラムに結合するの
で、比較的高濃度の塩、例えば０．４ＭのＮaＣlによっ
て該カラムから溶離させることができるるこの精子運動
能促進性タンパク質は、樹脂に結合しないときにはジエ
チルアミノエチルセルロース／セファデックスおよび低
イオン性アルカリ性緩衝液[例えば、１０mＭＴris−Ｈ
ＣＬ(pＨ８．３)]を用いるアニオン交換クロマトグラフ
ィーによって精製することもできる。
するバッファローの血液からの精子運動能促進性タンパ
ク質の単離法が包含される。活性な精子運動能促進性タ
ンパク質はヒトを含む被検種の全ての血清中に存在する
が、該ファクターの最も高濃度の入手源はバッファロー
の血液である[マンダルＭ．、バネルジェーＳ．および
マジャムダーＧ.Ｃ．、Ｂiol．Ｒeprod．、第４１巻、
第９８３頁〜第９８９頁(１９８９年)参照]。このファ
クターは血清または血漿から単離することができる。血
清／血漿は先ず第一に硫酸アンモニウムを用いる分画処
理に付す。精子運動能プロモーターは４０〜８０％の硫
酸アンモニウムの飽和によって沈降する。この精子運動
能促進性タンパク質の塩フラクションは樹脂、例えばカ
ルボキシメチルセルロース／セファデックス等および低
イオン性酸性緩衝液[例えば、１０mＭ酢酸ナトリウム(p
Ｈ５．６)]を用いるカチオン交換クロマトグラフィー処
理に付す。このファクターは樹脂カラムに結合するの
で、比較的高濃度の塩、例えば０．４ＭのＮaＣlによっ
て該カラムから溶離させることができるるこの精子運動
能促進性タンパク質は、樹脂に結合しないときにはジエ
チルアミノエチルセルロース／セファデックスおよび低
イオン性アルカリ性緩衝液[例えば、１０mＭＴris−Ｈ
ＣＬ(pＨ８．３)]を用いるアニオン交換クロマトグラフ
ィーによって精製することもできる。
【００１４】イオン交換クロマトグラフィー処理によっ
て部分的に精製された精子運動能促進性タンパク質は不
溶性マトリックスとしてセファデックスを用いる分子篩
クロマトグラフィーまたは種々のpＨ(６．９〜７．５)
とイオン強度(５０〜１００mＭ)のリン酸塩緩衝液を用
いる高性能液体クロマトグラフィーによってさらに精製
する。この運動能プロモーターは不溶性ゲルマトリック
ス(例えば、アルミナゲル)を用いる吸着クロマトグラフ
ィーによっても十分に精製することができる。このファ
クターはゲルと結合するので、比較的高濃度の塩[例え
ば、１ＭのＴris−ＨＣl(pＨ７．４)]によって溶離させ
ることができる。さらにまた、この精子運動能促進性タ
ンパク質はポリバッファー交換体(ファーマシア製のＰ
ＢＥ９４樹脂)を用いる等電点クロマトグラフィーによ
っても十分に精製することができる。精子運動能促進性
タンパク質はコンカナバリンＡ−アガロースアフィニテ
ィーマトリックスカラムに結合するので、α−メチル−
Ｄ−マンノシドを用いて該カラムから溶離させることが
できる。
て部分的に精製された精子運動能促進性タンパク質は不
溶性マトリックスとしてセファデックスを用いる分子篩
クロマトグラフィーまたは種々のpＨ(６．９〜７．５)
とイオン強度(５０〜１００mＭ)のリン酸塩緩衝液を用
いる高性能液体クロマトグラフィーによってさらに精製
する。この運動能プロモーターは不溶性ゲルマトリック
ス(例えば、アルミナゲル)を用いる吸着クロマトグラフ
ィーによっても十分に精製することができる。このファ
クターはゲルと結合するので、比較的高濃度の塩[例え
ば、１ＭのＴris−ＨＣl(pＨ７．４)]によって溶離させ
ることができる。さらにまた、この精子運動能促進性タ
ンパク質はポリバッファー交換体(ファーマシア製のＰ
ＢＥ９４樹脂)を用いる等電点クロマトグラフィーによ
っても十分に精製することができる。精子運動能促進性
タンパク質はコンカナバリンＡ−アガロースアフィニテ
ィーマトリックスカラムに結合するので、α−メチル−
Ｄ−マンノシドを用いて該カラムから溶離させることが
できる。
【００１５】上記の精製法を適当に併用することによっ
て血清／血漿から精子運動能促進性タンパク質を約２０
〜３０％の回収率で約１００〜４００倍精製することが
できる。部分精製されたこのファクターは、ポリアクリ
ルアミドゲルの濃度変化(７〜１０％)を含む種々の電気
泳動条件下での天然のポリアクリルアミドゲルを用いる
電気泳動法によって見掛けの均質性まで精製することが
できる。このようにして得られる純粋な精子運動能促進
性タンパク質の精製度は約６００倍であり、その回収率
は約２０％である。血清／血漿１０mlから純粋な精子運
動能促進性タンパク質は約３〜４mg得られる。
て血清／血漿から精子運動能促進性タンパク質を約２０
〜３０％の回収率で約１００〜４００倍精製することが
できる。部分精製されたこのファクターは、ポリアクリ
ルアミドゲルの濃度変化(７〜１０％)を含む種々の電気
泳動条件下での天然のポリアクリルアミドゲルを用いる
電気泳動法によって見掛けの均質性まで精製することが
できる。このようにして得られる純粋な精子運動能促進
性タンパク質の精製度は約６００倍であり、その回収率
は約２０％である。血清／血漿１０mlから純粋な精子運
動能促進性タンパク質は約３〜４mg得られる。
【００１６】本発明は分子質量が６６kＤaで、精子の運
動能を活性化する実質上純粋な上記高分子タンパク質お
よび適当な賦形剤を含有する薬用製剤にも関する。適当
な賦形剤としては培地または他の塩溶液が例示される。
この薬用製剤は自体既知の方法によって調製される。本
発明によるこの薬用製剤は不妊症の治療に有効である。
動能を活性化する実質上純粋な上記高分子タンパク質お
よび適当な賦形剤を含有する薬用製剤にも関する。適当
な賦形剤としては培地または他の塩溶液が例示される。
この薬用製剤は自体既知の方法によって調製される。本
発明によるこの薬用製剤は不妊症の治療に有効である。
【００１７】
【実施例】精子の運動能のプロモーターの分離に関する
本発明方法を以下の２つの実施例によってさらに説明す
るが、本発明はこれらの実施例によって限定されるもの
ではない。実施例１ 地方の食肉処理場から入手したバッファローの血液試料
を５℃で一夜凝固させた。凝固血液を遠心分離処理(１
４０００gで１５分間)に付すことによって血清を得た。
この血清は、該血清１mlあたり約１８０ユニットの活性
な運動能促進性タンパク質を含有する(１ユニットの活
性な精子運動能促進性タンパク質は精子細胞の１０％の
前進運動を誘発する該ファクターの量で定義される)。
血清２００ml(タンパク質含有量:約１００mg／ml)を０
〜４０％、４０〜６０％および６０〜８０％の濃度の硫
酸アンモニウムを用いる分画処理に付した。各々の分画
過程においては、タンパク質懸濁液を遠心分離処理(１
８０００gで１５分間)に付し、沈降したタンパク質ペレ
ットを１０mＭのＴris−ＨＣl(pＨ８．３)に溶解させ、
上澄みには硫酸アンモニウムの固体を添加して飽和させ
た。フラクションは低温室(４℃)において変性リンゲル
液[ＲＰＳ培地:pＨ６．９(１１９mＭ ＮaＣl−５mＭ
ＫＣl−１．２mＭ ＭgＳＯ4−１０mＭ グルコースペ
ニシリン(５０ユニット／ml)−１６．３mＭ リン酸カリ
ウム緩衝液(pＨ６．９)]に対して徹底的に透析した。６
０〜８０％の硫酸アンモニウム溶液によって精子運動能
促進活性が約９０％のタンパク質が沈降した。
本発明方法を以下の２つの実施例によってさらに説明す
るが、本発明はこれらの実施例によって限定されるもの
ではない。実施例１ 地方の食肉処理場から入手したバッファローの血液試料
を５℃で一夜凝固させた。凝固血液を遠心分離処理(１
４０００gで１５分間)に付すことによって血清を得た。
この血清は、該血清１mlあたり約１８０ユニットの活性
な運動能促進性タンパク質を含有する(１ユニットの活
性な精子運動能促進性タンパク質は精子細胞の１０％の
前進運動を誘発する該ファクターの量で定義される)。
血清２００ml(タンパク質含有量:約１００mg／ml)を０
〜４０％、４０〜６０％および６０〜８０％の濃度の硫
酸アンモニウムを用いる分画処理に付した。各々の分画
過程においては、タンパク質懸濁液を遠心分離処理(１
８０００gで１５分間)に付し、沈降したタンパク質ペレ
ットを１０mＭのＴris−ＨＣl(pＨ８．３)に溶解させ、
上澄みには硫酸アンモニウムの固体を添加して飽和させ
た。フラクションは低温室(４℃)において変性リンゲル
液[ＲＰＳ培地:pＨ６．９(１１９mＭ ＮaＣl−５mＭ
ＫＣl−１．２mＭ ＭgＳＯ4−１０mＭ グルコースペ
ニシリン(５０ユニット／ml)−１６．３mＭ リン酸カリ
ウム緩衝液(pＨ６．９)]に対して徹底的に透析した。６
０〜８０％の硫酸アンモニウム溶液によって精子運動能
促進活性が約９０％のタンパク質が沈降した。
【００１８】(ＮＨ4)2ＳＯ4を用いる分画処理によって
得られた活性フラクションは、１０mＭ 酢酸ナトリウム
緩衝液(pＨ５．６)を用いてあらかじめ平衡化処理に付
したカルボキシメチル−セルロースカラム(１×３０cm)
を用いるイオン交換クロマトグラフィーによって精製し
た。試料を通過させたカラムは１０mＭ 酢酸ナトリウム
緩衝液(pＨ５．６)３０mlを用いて洗浄した。次いで、
ＮaＣlを０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍおよび１Ｍの濃
度で含有する１０mＭ 酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５．
６)３０mlを用いてカラムを溶離処理に順次付した。精
子運動能促進性タンパク質はカラム樹脂に結合し、活性
な該タンパク質の大部分は１０mＭ 酢酸ナトリウム−
０．２Ｍ ＮaＣl緩衝液(pＨ５．６)によって溶離され
た。得られた精子運動能促進性タンパク質はポリエチレ
ングリコール化合物を用いて濃縮させた後、低温室内に
おいて０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液(pＨ６．９)に対
して徹底的に透析した。これらの処理操作によって精子
運動能促進性タンパク質は約１００倍精製された。
得られた活性フラクションは、１０mＭ 酢酸ナトリウム
緩衝液(pＨ５．６)を用いてあらかじめ平衡化処理に付
したカルボキシメチル−セルロースカラム(１×３０cm)
を用いるイオン交換クロマトグラフィーによって精製し
た。試料を通過させたカラムは１０mＭ 酢酸ナトリウム
緩衝液(pＨ５．６)３０mlを用いて洗浄した。次いで、
ＮaＣlを０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍおよび１Ｍの濃
度で含有する１０mＭ 酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５．
６)３０mlを用いてカラムを溶離処理に順次付した。精
子運動能促進性タンパク質はカラム樹脂に結合し、活性
な該タンパク質の大部分は１０mＭ 酢酸ナトリウム−
０．２Ｍ ＮaＣl緩衝液(pＨ５．６)によって溶離され
た。得られた精子運動能促進性タンパク質はポリエチレ
ングリコール化合物を用いて濃縮させた後、低温室内に
おいて０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液(pＨ６．９)に対
して徹底的に透析した。これらの処理操作によって精子
運動能促進性タンパク質は約１００倍精製された。
【００１９】精子運動能促進性タンパク質は次いで高性
能液体クロマトグラフィー処理に付した。即ち、濃縮さ
れた該タンパク質は高性能液体クロマトグラフィー用ゲ
ル濾過カラム[ＬＫＢ Ｕltrofac、ＴＳＫ ３０００
ＳＷＧ(２１．５×６００mm)]上において、４７５Ｂ
データモジュール(ウォーターズ社製)を備えた分光光度
計(ウォーターズ社製、４８１ＬＣ)を用いて吸光度を２
８０nmに維持する条件下で処理した。移動相としては
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液(pＨ６．９)を使用した
(流速:２．２ml／min)。高性能液体クロマトグラフィー
処理は室温でおこない、活性フラクションは氷冷容器内
へ捕集した。
能液体クロマトグラフィー処理に付した。即ち、濃縮さ
れた該タンパク質は高性能液体クロマトグラフィー用ゲ
ル濾過カラム[ＬＫＢ Ｕltrofac、ＴＳＫ ３０００
ＳＷＧ(２１．５×６００mm)]上において、４７５Ｂ
データモジュール(ウォーターズ社製)を備えた分光光度
計(ウォーターズ社製、４８１ＬＣ)を用いて吸光度を２
８０nmに維持する条件下で処理した。移動相としては
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液(pＨ６．９)を使用した
(流速:２．２ml／min)。高性能液体クロマトグラフィー
処理は室温でおこない、活性フラクションは氷冷容器内
へ捕集した。
【００２０】精子運動能促進性タンパク質の保持時間は
４３．５分であり、その主要なピークは約６０％の活性
な精子運動能促進性血清タンパク質を示した。このタン
パク質は７．５％天然のポリアクリルアミドチューブを
用いるゲル電気泳動法[ラエンムリＵ.Ｋ．、ネイチャ
ー、第２２７巻、第６８０頁〜第６８５頁(１９７０年)
参照]によってさらに精製した。試料を適用する前に、
ゲルはあらかじめ５分間作動させた。電気泳動後、一方
のゲルはタンパク質バンドを検出するためにクーマシー
ブルーを用いて染色させ、他方のゲルは厚さが０．５cm
の薄片に切断した。活性な精子運動能促進性タンパク質
を溶離させるために、各々のゲル薄片をＲＰＳ培地(pＨ
７．３５)０．５ml中に４℃において一夜分散させた。
染色後、ゲルはＲf値がそれぞれ０．３および０．６の
２つの主要なタンパク質バンドを示した。活性測定によ
り、Ｒf値が０．６のタンパク質バンドが精子運動能促
進性タンパク質の主要な活性成分であることが判明し
た。分取のために、数本のゲルチューブを精製処理に使
用し、Ｒf値が０．６のタンパク質バンドを各々のゲル
から溶離させた。捕集したフラクションをアミコン(４m
icon)社製ＰＭ−１０膜を用いる濾過処理によって濃縮
させ、−７０℃で保存した。特に言及しない限り、全て
の精製処理過程は０〜４℃でおこなった。これらの精製
処理により精子運動能促進性タンパク質は見掛けの均質
性まで精製された(約６００倍の精製度)。単離精製され
たファクターのタンパク質１mgあたりの比活性は約１１
００ユニットであった。血清２００mlから得られた純粋
な精子運動能促進性タンパク質の収量は７mgであり、そ
の活性の全回収率は約２０％であった。
４３．５分であり、その主要なピークは約６０％の活性
な精子運動能促進性血清タンパク質を示した。このタン
パク質は７．５％天然のポリアクリルアミドチューブを
用いるゲル電気泳動法[ラエンムリＵ.Ｋ．、ネイチャ
ー、第２２７巻、第６８０頁〜第６８５頁(１９７０年)
参照]によってさらに精製した。試料を適用する前に、
ゲルはあらかじめ５分間作動させた。電気泳動後、一方
のゲルはタンパク質バンドを検出するためにクーマシー
ブルーを用いて染色させ、他方のゲルは厚さが０．５cm
の薄片に切断した。活性な精子運動能促進性タンパク質
を溶離させるために、各々のゲル薄片をＲＰＳ培地(pＨ
７．３５)０．５ml中に４℃において一夜分散させた。
染色後、ゲルはＲf値がそれぞれ０．３および０．６の
２つの主要なタンパク質バンドを示した。活性測定によ
り、Ｒf値が０．６のタンパク質バンドが精子運動能促
進性タンパク質の主要な活性成分であることが判明し
た。分取のために、数本のゲルチューブを精製処理に使
用し、Ｒf値が０．６のタンパク質バンドを各々のゲル
から溶離させた。捕集したフラクションをアミコン(４m
icon)社製ＰＭ−１０膜を用いる濾過処理によって濃縮
させ、−７０℃で保存した。特に言及しない限り、全て
の精製処理過程は０〜４℃でおこなった。これらの精製
処理により精子運動能促進性タンパク質は見掛けの均質
性まで精製された(約６００倍の精製度)。単離精製され
たファクターのタンパク質１mgあたりの比活性は約１１
００ユニットであった。血清２００mlから得られた純粋
な精子運動能促進性タンパク質の収量は７mgであり、そ
の活性の全回収率は約２０％であった。
【００２１】実施例２ 食肉処理場から入手したバッファローの血液をクエン酸
ナトリウム２．６％溶液を保有するコニカルフラスコ内
に捕集し、血液の凝固を防止した。遠心分離処理(６５
００gで５分間)によって血球から血漿を分離させた。血
漿(４００ml)を実施例１に記載のようにして硫酸アンモ
ニウムを用いる分画処理に付した。活性な精子運動能促
進性タンパク質フラクションを１０mＭのＴris−ＨＣl
(pＨ８．３)に対する透析処理に付した後、ジエチルア
ミノエチルセルロースクロマトグラフィー処理に付し
た。この樹脂は１０mＭのＴris−ＨＣl(pＨ８．３)を用
いて平衡化させた。試料(５０ml)を通過させた後のカラ
ム(３０×１．５cm)は平衡化用緩衝液８０mlで洗浄した
後、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．５Ｍおよび１
Ｍの濃度のＴris−ＨＣl(pＨ８．３)８０mlを用いる溶
離処理に順次付した。活性測定の前、各々のフラクショ
ンは１０mＭのＴris−ＨＣl(pＨ７．４)に対する透析処
理に付した。活性な精子運動能促進性タンパク質の主要
フラクション(約８５％)は樹脂に結合しなかった。ジエ
チルアミノエチルセルロースクロマトグラフィー処理に
よって保持されなかったフラクションはポリエチレング
リコール化合物によって濃縮させた後、１０mＭの酢酸
ナトリウム緩衝液(pＨ５．６)に対する透析処理に付し
た。透析処理に付した精子運動能促進性タンパク質は、
あらかじめ１０mＭの酢酸ナトリウム(pＨ５．６)を用い
て平衡化させたカルボキシメチルセルロースカラム(３
０×１cm)上でのイオン交換クロマトグラフィー処理に
付した。試料(１０ml)を通過させた後のカラムは１０m
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５．６)３０mlを用いて洗
浄した。次いで、このカラムはＮaＣlを０．１Ｍ、０．
２Ｍおよび０．５Ｍの濃度で含有する１０mＭの酢酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ５．６)３０mlを用いる溶離処理に
順次付した後、さらに１ＭのＮaＣlを含有する酢酸ナト
リウム緩衝液３０mlを用いる溶離処理に付した。
ナトリウム２．６％溶液を保有するコニカルフラスコ内
に捕集し、血液の凝固を防止した。遠心分離処理(６５
００gで５分間)によって血球から血漿を分離させた。血
漿(４００ml)を実施例１に記載のようにして硫酸アンモ
ニウムを用いる分画処理に付した。活性な精子運動能促
進性タンパク質フラクションを１０mＭのＴris−ＨＣl
(pＨ８．３)に対する透析処理に付した後、ジエチルア
ミノエチルセルロースクロマトグラフィー処理に付し
た。この樹脂は１０mＭのＴris−ＨＣl(pＨ８．３)を用
いて平衡化させた。試料(５０ml)を通過させた後のカラ
ム(３０×１．５cm)は平衡化用緩衝液８０mlで洗浄した
後、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．５Ｍおよび１
Ｍの濃度のＴris−ＨＣl(pＨ８．３)８０mlを用いる溶
離処理に順次付した。活性測定の前、各々のフラクショ
ンは１０mＭのＴris−ＨＣl(pＨ７．４)に対する透析処
理に付した。活性な精子運動能促進性タンパク質の主要
フラクション(約８５％)は樹脂に結合しなかった。ジエ
チルアミノエチルセルロースクロマトグラフィー処理に
よって保持されなかったフラクションはポリエチレング
リコール化合物によって濃縮させた後、１０mＭの酢酸
ナトリウム緩衝液(pＨ５．６)に対する透析処理に付し
た。透析処理に付した精子運動能促進性タンパク質は、
あらかじめ１０mＭの酢酸ナトリウム(pＨ５．６)を用い
て平衡化させたカルボキシメチルセルロースカラム(３
０×１cm)上でのイオン交換クロマトグラフィー処理に
付した。試料(１０ml)を通過させた後のカラムは１０m
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５．６)３０mlを用いて洗
浄した。次いで、このカラムはＮaＣlを０．１Ｍ、０．
２Ｍおよび０．５Ｍの濃度で含有する１０mＭの酢酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ５．６)３０mlを用いる溶離処理に
順次付した後、さらに１ＭのＮaＣlを含有する酢酸ナト
リウム緩衝液３０mlを用いる溶離処理に付した。
【００２２】活性な精子運動能促進性タンパク質の主要
フラクションは１ＭのＮaＣlを含有する１０mＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ５．６)によって溶離された。得ら
れた活性な精子運動能促進性タンパク質は、１０mＭの
Ｔris−ＨＣl(pＨ７．４)に５０mg／mlの濃度で懸濁さ
せたアルミナゲル(シグマ・ケミカル社製)１０mlと混合
し、該混合物は氷温度で４５分間撹拌し、得られた懸濁
液を遠心分離処理(５００gで１０分間)に付した。上澄
み(非吸着フラクション)を廃棄し、精子運動能促進性タ
ンパク質を１Ｍ Ｔris−ＨＣl(pＨ７．４)を用いてペ
レットから溶離させた。得られたタンパク質をポリエチ
レングリコール化合物を用いて濃縮させた後、２mＭエ
タノールアミン−ＨＣl(pＨ９．４)に対する徹底的な透
析処理に付した。このタンパク質はＰＢＥ９４(ファー
マシア社製ポリバッファー交換体を用いる等電点クロマ
トグラフィーによってさらに精製した。この場合、イオ
ン交換樹脂であるポリバッファー交換体(ＰＢＥ９４)カ
ラム(１５×１cm)は上記の緩衝液を用いてあらかじめ平
衡化させた後、該タンパク質の精製処理に使用した。該
カラムに試料を通過させた後、平衡化用緩衝液を用いて
カラムを洗浄した。精子運動能促進性タンパク質はポリ
バッファー９６−ＨＣl(pＨ７．０)(ファーマシア社製)
を用いて溶離させた(各々のフラクションの体積は４．
５mlであった)。活性フラクションを捕集し、ポリエチ
レングリコール化合物を用いて濃縮させた後、０．１５
４ＭのＮaＣlを含有する１０mＭリン酸カリウム緩衝液
に対する徹底的な透析処理に付した。全ての精製過程は
０〜４℃でおこなった。このファクターは約２５％回収
率で約４００倍に精製された。単離された精子運動能促
進性タンパク質の純度は約７０％であった。血漿４００
mlから約１４mgの部分的に精製された精子運動能促進性
タンパク質が得られた。
フラクションは１ＭのＮaＣlを含有する１０mＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ５．６)によって溶離された。得ら
れた活性な精子運動能促進性タンパク質は、１０mＭの
Ｔris−ＨＣl(pＨ７．４)に５０mg／mlの濃度で懸濁さ
せたアルミナゲル(シグマ・ケミカル社製)１０mlと混合
し、該混合物は氷温度で４５分間撹拌し、得られた懸濁
液を遠心分離処理(５００gで１０分間)に付した。上澄
み(非吸着フラクション)を廃棄し、精子運動能促進性タ
ンパク質を１Ｍ Ｔris−ＨＣl(pＨ７．４)を用いてペ
レットから溶離させた。得られたタンパク質をポリエチ
レングリコール化合物を用いて濃縮させた後、２mＭエ
タノールアミン−ＨＣl(pＨ９．４)に対する徹底的な透
析処理に付した。このタンパク質はＰＢＥ９４(ファー
マシア社製ポリバッファー交換体を用いる等電点クロマ
トグラフィーによってさらに精製した。この場合、イオ
ン交換樹脂であるポリバッファー交換体(ＰＢＥ９４)カ
ラム(１５×１cm)は上記の緩衝液を用いてあらかじめ平
衡化させた後、該タンパク質の精製処理に使用した。該
カラムに試料を通過させた後、平衡化用緩衝液を用いて
カラムを洗浄した。精子運動能促進性タンパク質はポリ
バッファー９６−ＨＣl(pＨ７．０)(ファーマシア社製)
を用いて溶離させた(各々のフラクションの体積は４．
５mlであった)。活性フラクションを捕集し、ポリエチ
レングリコール化合物を用いて濃縮させた後、０．１５
４ＭのＮaＣlを含有する１０mＭリン酸カリウム緩衝液
に対する徹底的な透析処理に付した。全ての精製過程は
０〜４℃でおこなった。このファクターは約２５％回収
率で約４００倍に精製された。単離された精子運動能促
進性タンパク質の純度は約７０％であった。血漿４００
mlから約１４mgの部分的に精製された精子運動能促進性
タンパク質が得られた。
【００２３】得られた高分子タンパク質のアミノ酸組成
の分析例を以下の表１に示す。アミノ酸分析は「マテリ
アルズ・アンド・メソッズ」セクションに記載の方法に
よっておこなった。
の分析例を以下の表１に示す。アミノ酸分析は「マテリ
アルズ・アンド・メソッズ」セクションに記載の方法に
よっておこなった。
【表１】
【００２４】
【発明の効果】食肉処理場(畜殺場)の廃棄物を入手源と
するバッファローの血清／血漿から単離される本発明に
よる新規なタンパク質はヒトおよび家畜等のその他の種
属の精子の運動能を効果的に刺激促進するので、ヒトの
不十分な精子運動能に起因する不妊症の治療や家畜の繁
殖改良等において特に有用である。
するバッファローの血清／血漿から単離される本発明に
よる新規なタンパク質はヒトおよび家畜等のその他の種
属の精子の運動能を効果的に刺激促進するので、ヒトの
不十分な精子運動能に起因する不妊症の治療や家畜の繁
殖改良等において特に有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゴパル・チャンドラ・マジュムデル インド700032ウエスト・ベンガル、カル カッタ、ジャダヴプル、ラジャ・スボド ー・チャンドラ・マリック・ロード４ 番、インディアン・インスティテュー ト・オブ・ケミカル・バイオロジー (72)発明者 マヒトシュ・マンダル インド700032ウエスト・ベンガル、カル カッタ、ジャダヴプル、ラジャ・スボド ー・チャンドラ・マリック・ロード４ 番、インディアン・インスティテュー ト・オブ・ケミカル・バイオロジー (72)発明者 サスワティ・バネルジェー インド700032ウエスト・ベンガル、カル カッタ、ジャダヴプル、ラジャ・スボド ー・チャンドラ・マリック・ロード４ 番、インディアン・インスティテュー ト・オブ・ケミカル・バイオロジー (56)参考文献 Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，Ｖｏｌ. 41，Ｎｏ．６（1989）ｐ．983−989 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 253，Ｎｏ．19（1978）ｐ．6744−6750 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/47 C07K 1/16 - 1/26 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (17)
- 【請求項１】 食肉処理場の廃棄物を入手源とするバッ
ファローの血清／血漿から単離される６６ｋＤａの分子
質量を有する精子運動能促進性高分子タンパク質。 - 【請求項２】 アスパラギン酸、グルタミン酸およびロ
イシンの含有量が多い請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項３】 アスパラギン酸とアスパラギンを約１０
％含有する請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項４】 グルタミン酸とグルタミンを約９％含有
する請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項５】 ロイシンを約１１％含有する請求項１記
載のタンパク質。 - 【請求項６】 ３．７の等電点を有する請求項１記載の
タンパク質。 - 【請求項７】 Ｍｇ２＋に依存する請求項１記載のタン
パク質。 - 【請求項８】 熱安定性（１００℃で５分間の安定度：
６０％）である請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項９】 糖タンパク質である請求項１記載のタン
パク質。 - 【請求項１０】 糖側鎖が活性にとって必須である請求
項１記載のタンパク質。 - 【請求項１１】 バッファロー、ヒト、非去勢雄牛、ヤ
ギ、非去勢雄羊、ラットおよびハムスターの精子の前進
運動能を刺激する請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項１２】 その抗体が、ヤギ、非去勢雄牛、雌牛
およびヒトの血液中の精子運動能促進性のタンパク質／
類似タンパク質の存在と関連するこれらの種の血清と交
差反応する請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項１３】 食肉処理場の廃棄物を入手源とするバ
ッファローの血清／血漿を分画処理に付し、次いでクロ
マトグラフィーまたは電気泳動法によって該分画処理物
から精子運動能促進性タンパク質を精製することを含む
精子運動能促進性タンパク質の調製方法。 - 【請求項１４】 分画処理を８０％飽和濃度までの濃度
の硫酸アンモニウムを用いておこなう請求項１３記載の
方法。 - 【請求項１５】 タンパク質の精製をイオン交換クロマ
トグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、等電点クロ
マトグラフィーまたは高性能液体クロマトグラフィーに
よっておこなう請求項１３記載の方法。 - 【請求項１６】 クロマトグラフィーに用いるイオン交
換樹脂がカルボキシメチル−セルロース／セファデック
ス、ジエチルアミノエチル−セルロース／セファデック
スおよびポリバッファー交換体（ＰＢＥ９４樹脂）から
選択される請求項１３記載の方法。 - 【請求項１７】 クロマトグラフィーに用いる溶離液が
ｐＨが６．９〜７．５でイオン強度が５０〜１００ｍＭ
のリン酸塩緩衝液である請求項１３記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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