PT110231B - Potenciadores de mtor e suas utilizações para melhorar a qualidade e função do esperma durante o armazenamento - Google Patents

Potenciadores de mtor e suas utilizações para melhorar a qualidade e função do esperma durante o armazenamento Download PDF

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Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO INSERE-SE NA ÁREA DAS TECNOLOGIAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA, EM PARTICULAR NO QUE RESPEITA AOS MEIOS DE ARMAZENAMENTO DE ESPERMA, E DESCREVE POTENCIADORES DE MTOR, PREFERENCIALMENTE O ACTIVADOR DE MTOR MHY 1485, COMO SUPLEMENTO PARA MEIOS DE ARMAZENAMENTO, EM QUE OS REFERIDOS MEIOS SUPLEMENTADOS AUMENTAM A MOTILIDADE E VIABILIDADE DO ESPERMA DURANTE O ARMAZENAMENTO DE CURTA DURAÇÃO À TEMPERATURA AMBIENTE, ENQUANTO MANTÊM AS TAXAS METABÓLICAS, SEM ALTERAR O SEU POTENCIAL DE FERTILIZAÇÃO (CAPACITAÇÃO) E INTEGRIDADE DO ADN.

Description

DESCRIÇÃO
POTENCIADORES DE mTOR E SUAS UTILIZAÇÕES PARA MELHORAR A QUALIDADE E FUNÇÃO DO ESPERMA DURANTE O ARMAZENAMENTO
CAMPO DE INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito ao campo das tecnologias de reprodução assistida, em particular a um meio de armazenamento de esperma para aumentar a qualidade e função do esperma.
TÉCNICA ANTERIOR
Nas últimas décadas, o número de indivíduos que procuram técnicas de reprodução assistida (TRA) tem aumentado (Elder e Dale, 2010) . A qualidade do esperma é um fator muito importante no laboratório de fertilização in vitro (FIV), pois a infertilidade masculina é responsável por até 30% dos casos de infertilidade e as opções de tratamento baseiam-se principalmente em técnicas de melhoria da qualidade do esperma (OMS 2010). Em relação à biologia reprodutiva masculina, grandes esforços estão sendo feitos para prolongar a viabilidade do esperma armazenado, pois é um fator chave para o sucesso da TRA (Jackson, Bormann et al. 2010) . A criopreservação e a refrigeração do esperma têm sido altamente debatidas, e tem sido proposto que a manutenção do esperma à temperatura ambiente (TA) por periodos de curto de tempo pode ser uma alternativa eficaz para evitar o rápido declínio da viabilidade do esperma após armazenamento em ambiente refrigerado (Sato e Ishikawa 2004). Vários meios de armazenamento destinados a manter a sobrevivência dos espermatozóides à TA estão comercialmente disponíveis. No entanto, na maioria dos casos, a viabilidade do esperma após o armazenamento nesses meios ainda está longe do ideal. O estabelecimento da composição ideal para o armazenamento do esperma é de extrema relevância, uma vez que essas células são altamente dependentes do suprimento de substratos exógenos e, devido às suas altas taxas metabólicas, produzem quantidades elevadas de ERO (Sato e Ishikawa, 2004) . A possibilidade de utilizar substâncias para melhorar a viabilidade, morfologia e metabolismo do esperma seria um passo importante no tratamento da fertilidade masculina.
O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é uma serina/treonina proteína quinase multifuncional altamente conservada que regula vários eventos celulares cruciais. No entanto, embora tenha sido sugerido que o mTOR integra e medeia os sinais em todo o sistema reprodutor masculino, há falta de evidência para o seu papel na espermatogénese (Oliveira, Cheng et al. 2017) . Os nossos primeiros resultados foram obtidos nas células testiculares somáticas e mostraram que o mTOR controla o consumo de glicose e o equilíbrio redox em células de Sertoli humanas. Assim, parece que a mTOR desempenha um papel central no suporte nutricional da espermatogénese (Jesus, Oliveira et al. 2016) .
Além disso, Aparicio et al. (2016) mostraram que proteínas relacionadas com autofagia e reguladores a montante estão presentes e funcionais em espermatozóides humanos. A modificação da expressão de proteínas mitocondriais após a ativação/inibição da autofagia (utilizando um inibidor de mTOR de alta concentração, Rapamicina) pode estar a indicar que uma forma especializada de autofagia chamada mitofagia, que regula a função do esperma, tal como motilidade e viabilidade, pode estar a cooperar com a apoptose. No entanto, o facto de um meio de armazenamento comercial poder ser suplementado com o ativador de mTOR MHY 1485 em baixa concentração para aumentar a motilidade e viabilidade do esperma durante o armazenamento de curta duração à temperatura ambiente, enquanto mantém as taxas metabólicas e sem alterar seu potencial de fertilização (capacitação) e a integridade do ADN, nunca foi divulgado antes.
Melhorar os meios de armazenamento de esperma disponíveis a fim de aumentar a qualidade do esperma após o armazenamento é, portanto, uma necessidade há muito sentida no tratamento da infertilidade utilizando Tecnologias de Reprodução Assistida.
PROBLEMAS TÉCNICOS RESOLVIDOS
Como detalhado abaixo, a presente invenção é dirigida para o problema de armazenar esperma para técnicas de reprodução assistida, e propõe uma solução alternativa que proporciona qualidade e função do esperma aumentadas.
A presente invenção descreve o activador de mTOR MHY 1485 como suplemento para meios de armazenamento, em que os referidos meios suplementados aumentam a motilidade e viabilidade do esperma durante o armazenamento de curta duração à temperatura ambiente, enquanto mantêm as taxas metabólicas, sem alterar o seu potencial de fertilização (capacitação) e integridade do ADN.
A utilização de ativadores de mTOR melhora, assim, os parâmetros específicos de qualidade de esperma, mantendo sua integridade e qualidade durante o armazenamento de curta duração à TA. Esta descoberta é de extrema relevância, uma vez que tem grande impacto no armazenamento de esperma à temperatura ambient/corporal, mas também em outras aplicações onde o controlo da fisiologia do esperma é essencial. Esta invenção melhora os meios de armazenamento de esperma disponíveis e é extremamente valiosa no tratamento da infertilidade utilizando Tecnologias de Reprodução Assistida, e para aumentar a qualidade do esperma após o armazenamento à temperatura ambiente/corporal.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 - Viabilidade dos espermatozóides humanos após armazenamento durante 120 minutos a 37°C. Os espermatozóides foram armazenados em Meio de Preparação de Esperma (ORIGIO, Mâlov, Dinamarca) não suplementado (Controlo) ou suplementado com um ativador de mTOR (MHY 1485). Os espermatozóides foram também incubados com um inibidor de mTOR (Rapamicina; Rap) como controlo negativo. A viabilidade foi avaliada pelo método de coloração com eosina-nigrosina. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (n=12); Resultados significativos (P < 0,05) são indicados como *-vs. Controlo.
Figura 2 - Motilidade dos espermatozóides humanos após armazenamento durante 120 minutos a 37°C. Os espermatozóides foram armazenados em Meio de Preparação de Esperma (ORIGIO, Mâlov, Dinamarca) não suplementado (Controlo) ou suplementado com um ativador de mTOR (MHY 1485). Os espermatozóides foram também incubados com um inibidor de mTOR (Rapamicina; Rap) como controlo negativo. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (n=12); Resultados significativos (P < 0,05) são indicados como *-vs. Controlo.
Figura 3 - Metabolismo dos espermatozóides humanos durante o armazenamento durante 120 minutos a 37 °C.
Os espermatozóides foram armazenados em Meio de Preparação de Esperma (ORIGIO, Mâlov, Dinamarca) não suplementado (Controlo) ou suplementado com um ativador de mTOR (MHY 1485). Os espermatozóides foram também incubados com um inibidor de mTOR (Rapamicina; Rap) como controlo negativo. 0 consumo de glicose e produção de lactato do esperma foram avaliados por ressonância nuclear magnética de 1H. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (n=12); Resultados significativos (P < 0,05) são indicados como *-vs. Controlo.
Figura 4 - Capacitação de espermatozóides humanos após armazenamento durante 120 minutos a 37°C. Os espermatozóides foram armazenados em Meio de Preparação de Esperma (ORIGIO, Mâlov, Dinamarca) não suplementado (Controlo) ou suplementado com um ativador de mTOR (MHY 1485). Os espermatozóides foram também incubados com um inibidor de mTOR (Rapamicina; Rap) como controlo negativo. A capacitação do esperma foi avaliada por avaliação dos níveis de fosfotirosina do esperma após 180 minutos de incubação em Meio de Capacitação de Esperma (LifeGlobal Europe, Bruxelas, Bélgica). Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (n=12); Resultados significativos (P <0,05) são indicados como *-vs. Controlo.
Figura 5 - Fragmentação do ADN de espermatozóides humanos após armazenamento durante 120 minutos a 37°C. Os espermatozóides foram armazenados em Meio de Preparação de Esperma (ORIGIO, Mâlov, Dinamarca) não suplementado (Controlo) ou suplementado com um ativador de mTOR (MHY
1485). Os espermatozóides foram também incubados com um inibidor de mTOR (Rapamicina; Rap) como controlo negativo. A fragmentação do ADN foi avaliada utilizando um kit Halosperm G2 (HALOTECH, Madrid, Espanha). Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (n=12); Resultados significativos (P < 0,05) são indicados como *vs . Controlo.
Figura 6 - Danos oxidativos em espermatozóides humanos às proteínas (carbonilação) e lípidos (peroxidação) após armazenamento durante 120 minutos a 37°C. Os espermatozóides foram armazenados em Meio de Preparação de Esperma (ORIGIO, Mâl0v, Dinamarca) não suplementado (Controlo) ou suplementado com um ativador de mTOR (MHY 1485) . Os espermatozóides também foram incubados com um inibidor de mTOR (Rapamicina; Rap) como controlo negativo. A carbonilação de proteínas foi avaliada por imunotransferência de um anticorpo @DNP específico (SigmaAldrich, St. Louis, MO, EUA) . A peroxidação de lípidos foi avaliada por imunotransferência de um anticorpo @HNE específico (Merck Millipore, Temecula, EUA) . Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (n=12) ; Resultados significativos (P < 0,05) são indicados como *-vs. Controlo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito a uma composição para potenciar a qualidade e função do esperma caracterizada por compreender um activador de mTOR.
Numa forma de realização preferida, o activador de mTOR é MHY 1485.
A presente invenção também diz respeito a um suplemento para potenciar a qualidade e função do esperma para meios de armazenamento de esperma caracterizado por compreender um activador de mTOR.
Numa forma de realização preferida, o activador de mTOR é MHY 1485.
Numa forma de realização mais preferida, o suplemento é adequado para armazenamento à temperatura ambiente ou temperatura corporal.
Noutra forma de realização mais preferida, o suplemento é adequado para armazenamento de curta duração. A invenção também diz respeito a um meio de armazenamento que melhora a qualidade e função do esperma, caracterizado por compreender um ativador de mTOR.
Numa forma de realização preferida, o activador de mTOR é MHY 1485.
Numa forma de realização mais preferida, a quantidade de MHY 1485 no meio de armazenamento é de 2 mg/mL.
Numa forma de realização ainda mais preferida, o meio de armazenamento é adequado para armazenamento à temperatura ambiente ou temperatura corporal.
A invenção também diz respeito a um método para aumentar a probabilidade de fertilização por uma célula de esperma compreendendo o armazenamento do esperma num meio de armazenamento suplementado com um activador de mTOR e utilizando posteriormente o esperma armazenado numa tecnologia de reprodução assistida.
Numa forma de realização preferida, o meio de armazenamento é suplementado com MHY 1485.
Numa forma de realização mais preferida, a quantidade de MHY 1485 adicionada ao meio é de 2 mg/mL.
EXEMPLO
Avaliámos a utilização de um ativador de mTOR (MHY 1485) como aditivo durante o armazenamento de esperma a 37°C. Adicionámos o ativador de mTOR (concentração de 2 mg/mL) a um meio de armazenamento de esperma comercial (Sperm Preparation Médium®; Origio, Malov, Dinamarca) e armazenámos a suspensão de espermatozóides (2 milhões de espermatozóides por mL) em microtubos (a 37°C em incubadora com 5% de C02) durante até 120 minutos, avaliando os parâmetros chave de qualidade e o grau de dano oxidativo a essas células em intervalos regulares (0, 30 e 120 minutos) . Foram avaliados os principais parâmetros de qualidade do esperma, ou seja, a viabilidade do esperma e motilidade do esperma, utilizando métodos padrão, conforme descrito pelas diretrizes da Organização Mundial da Saúde, com a supervisão de um embriologista certificado. Também avaliámos os danos oxidativos ao ADN do esperma (fragmentação do
ADN), proteínas (carbonilação de proteínas) e lípidos (peroxidação de lípidos). A fragmentação do ADN do esperma foi avaliada usando o kit Halosperm® (Halotech ADN SL, Madri, Espanha). A carbonilação de proteínas e peroxidação de lípidos do esperma foram avaliadas utilizando anticorpos específicos (ABCAM®, Cambridge, EUA) contra grupos 2,4dinitrofenol e grupos anti-4-hidroxinonenal (respectivamente). As alterações metabólicas dos espermatozóides também foram avaliadas por meio da técnica de ressonância magnética de protões (1H-RMN), utilizando um espectrómetro Varian de 600 MHz equipado com sonda de deteção indireta de 3 mm com gradiente z (Varian, Paio Alto, EUA) . No fim do armazenamento, avaliámos o potencial de capacitação dos espermatozóides, incubando as células em meio comercial (Lifeglobal®, Guilford, EUA) e avaliando os níveis de 3nitrotirosina utilizando anticorpos específicos (ABCAM®, Cambridge, EUA). Foi utilizado um inibidor de mTOR (rapamicina numa concentração de 0,1 pg/ml) como controlo negativo .
O armazenamento de espermatozóides a 37°C causou uma diminuição na sua viabilidade logo após 30 minutos. A suplementação do meio de armazenamento comercial com o ativador de mTOR manteve a percentagem de esperma viável em níveis semelhantes aos do tempo zero (Figura 1).
Além disso, a motilidade dos espermatozóides foi progressivamente diminuída durante o armazenamento, com o ativador de mTOR sendo capaz de manter o esperma com motilidade (Figura 2) e sustentar seu potencial de capacitação. Quando aspectos básicos do metabolismo do esperma foram avaliados, como o consumo de hexoses e a produção de lactato, não foram observadas diferenças após 30 minutos de armazenamento (Figura 3).
Esses resultados foram ainda mais promissores ao se considerar os 120 minutos de armazenamento do esperma, visto que o ativador de mTOR foi capaz de preservar a viabilidade do esperma e seu potencial de capacitação (Figura 4), mantendo uma motilidade mais elevada. Nestes espermatozóides armazenados na presença do ativador de mTOR durante 120 minutos, o consumo de glicose foi mantido, enquanto a produção de lactato foi aumentada.
Digno de nota é que os danos oxidativos do esperma não foram aumentados, com o ADN permanecendo totalmente intacto após o tratamento (Figura 5) . O dano oxidativo das proteínas do esperma (carbonilação de proteínas) bem como o dano oxidativo dos lípidos (peroxidação de lípidos) também não foram aumentados nas amostras armazenadas na presença do ativador mTOR durante 120 minutos (Figura 6) .
Referências
I. M. Aparicio, J. Espino, I. Bejarano, A. Gallardo-Soler, M. L. Campo and G. M. Salido (2016). Autophagy-related proteins are functionally active in human spermatozoa and may be involved in the regulation of cell survival and motility. Scientific Reports 6: 33647.
J. A. Pariente2, F. J. Peha4 & J. A. Tapial Elder, K. and B. Dale (2010). In-vitro fertilization, Cambridge
University Press.
Jackson, R. E., C. L. Bormann, P. A. Hassun, A. M. Rocha, E. L. Motta, P. C. Serafini and G. D. Smith (2010) . Effects of semen storage and separation techniques on sperm ADN fragmentation. Fertility and sterility 94 (7) : 2626-2630.
Jesus, T. T., P. F. Oliveira, J. Silva, A. Barros, R. Ferreira, M. Sousa, C. Y. Cheng, B. M. Silva and M. G. Alves (2016). Mammalian target of rapamycin Controls glucose consumption and redox balance in human Sertoli cells. Fértil. Steril. 105(3): 825-833.e823.
Oliveira, P. F., C. Cheng and M. G. Alves (2017) . Emerging Role for Mammalian Target of Rapamycin in Male Fertility. Trends in Endocrinology & Metabolism: DOI: 10.1016/j.tem.2016.1012.1004.
Sato, M. and A. Ishikawa (2004). Room temperature storage of mouse epididymal spermatozoa: exploration of factors affecting sperm survival. Theriogenology 61(7-8): 1455-1469.
WHO (2010). WHO laboratory manual for the examination and Processing of human semen.

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Utilização de uma composição caracterizado por compreender um ativador de mTOR para potenciar a qualidade e função do esperma.
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o activador de mTOR ser MHY 1485.
  3. 3. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a composição estar compreendida num suplemento para potenciar a qualidade e função do esperma para meios de armazenamento de esperma..
  4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o suplemento ser adequado para armazenamento à temperatura ambiente ou temperatura corporal.
    Utilização de acordo com as reivindicações de a 4 caracterizado por o suplemento ser adequado num armazenamento de 120 minutos.
  5. 6. Um meio de armazenamento de esperma para potenciar a qualidade e função do esperma, caracterizado por ser suplementado com um activador de mTOR.
  6. 7. Um meio de armazenamento de esperma para potenciar a qualidade e função do esperma de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o activador de mTOR ser
    MHY 14 8 5.
  7. 8. Um meio de armazenamento de esperma para potenciar a qualidade e função do esperma de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a quantidade de MHY 1485 s e r d e 2 m g / m.L .
  8. 9. Um. meio de armazenamento de esperma para potenciar a qualidade e função do esperma de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-8, caracterizado por o meio de armazenamento ser adequado para armazenamento à temperatura ambiente ou temperatura corporal.
  9. 10. Um meio de armazenamento de esperma para potenciar a qualidade e função do esperma de acordo com as reivindicações 6-9, caracterizado por o meio de armazenamento ser adequado num armazenamento de 120 minutos.
  10. 11. Um método para potenciar a qualidade e função do esperma durante o armazenamento, caracterizado por se depositar o esperma em meio de armazenamento suplementado com um ativador de mTOR.
  11. 12. Um método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o activador de mTOR ser MHY 1485.
  12. 13. Um método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a quantidade de MHY 1485 no meio de armazenamento ser de 2 mg/rnL.
  13. 14. Um método cie acordo corri as reivindicações 11-
    13, caracterizado por o esperma ser armazenado à temperatura ambiente ou temperatura corporal.
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